Выделяют провоспалительные и противовоспалительные цитокины.

Установлено, что в основе острых и хронических заболеваний лежит нару­ шение баланса между синтезом этих двух групп цитокинов. Однако до сих пор чрезвычайно актуальными являются исследования, направленные на ре­ шение основного вопроса - о причинах перехода состояния инфицированности в воспалительный процесс (Земсков A.M. и соавт., 2006; Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2006).

С 80-х годов XX века и по настоящее время отмечен значительный про­ гресс в изучении этиологических факторов воспалительных заболеваний жен­ ской репродуктивной системы (Соловьева И.В. и соавт., 1991; Ермошенко Л.В., 1992; Кира Е.Ф., Цвелев Ю.В., 1992; Сарываш Г., 1995; Кажина М.В., Михалыдевич Г.Н., 1995; Занько С.Н., Косинец А.Н., 1995; Яковлева Л.М., 1998; Занько С.Н., Супрун Л.Я., 1998; Канашкова Т.А. и соавт., 1999; Cravello L., 1998; Taradii N.N. et al., 2003; Mardh P.A., 2004; Bayer-Garner LB., 2004;

Гуртовой Б.Л. и соавт., 2004; Савельева Г.М., Бреусенко В.Г., 2005). Такая возможность появилась благодаря разработке пункционных методов забора проб непосредственно из очага воспаления, усовершенствованию основных технологий культивирования анаэробных бактерий, хламидий, микоплазм, ви­ русов (Фесюк Т.Н., 1992; Бухарин О.В. и соавт., 1998; Janier М., 1998; Brook I., 2002; Simms I. et al., 2003). В настоящее время в развитии сальпингоофоритов возрастает роль условно-патогенной микрофлоры и смешанных инфекций (бактериально-хламидийной, бактериально-микоплазменной), что затрудня­ ет выбор правильной тактики антибактериальной терапии (Савельева И.С., 1996). Выявлено, что ассоциация микробов и активация условно-патогенной микрофлоры отмечается на фоне значительного снижения защитных сил орга­ низма (Савельева Г.М. и соавт., 1997; Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2006).

По мнению Сухих Г.Т., Ванько Л.В. (2006), острый воспалительный про­ цесс в придатках матки сопровождается повышением уровня продукции цитокинов типа Th2 (ИЛ-4, ИЛ-6 и ИЛ-10), в то время как экспрессия генов цитокинов типа ТЫ (ФНОа, ИЛ-1|3 и ИФН-у) существенно не отличается от нормы.

Уровень продукции мРНК ИЛ-12, являющегося индуктором экспрессии генов цитокинов типа ТЫ, в воспаленных придатках матки был повышен. Количест­ во мРНК ИЛ-8 в воспаленных отделах маточных труб может быть увеличено по сравнению с нормой в среднем в 90 раз.

Известно, что морфофункциональные изменения придатков матки при остром воспалении, полнокровие капилляров и вен, отек, кровоизлияние, ми­ грация лейкоцитов в мозговом веществе возникают на 3 - 5 сутки с момента инфицирования (Радионченко А.А., Тихоновская О.А., 1991; Шатунова Е.П., 1999). При хроническом процессе в яичнике обнаруживают периваскулярный склероз как мозгового, так и коркового слоя, наклонность к врастанию в толщину коркового слоя зародышевого эпителия и образование кист, вы­ стланных кубическим или цилиндрическим эпителием при отсутствии клеточ­ ной инфильтрации (Радионченко А.А., Тихоновская О.А., 1991). Для воспале­ ния придатков матки характерны не только локальные структурные измене­ ния, но и нарушения гонадотропной функции гипофиза, гипофункция коры надпочечников, гипотиреоз, что является одним из важных факторов, опреде­ ляющих развитие вторичной иммунной недостаточности (Бойчук А.В., 1997;

Курганов С.А., 1998; Можейко Л.Н. и соавт., 1999).

Лекарственное лечение является одним из основных видов терапии сальпингоофоритов и поэтому широко используются в гинекологической практи­ ке. Основой медикаментозной терапии являются антибактериальные препара­ ты, которые применяются с учетом их спектра действия и чувствительности патологической микрофлоры. Кроме того, в общую схему лечения включают­ ся десенсибилизирующие средства, витамины, болеутоляющие препараты, биогенные стимуляторы, инфузионная и дезинтоксикационная терапия (Бодяжина В.И. и соавт., 1990; Лоуренс Д.Р., Бенитт П.Н., 1991; Ермошенко Л.В., 1992; Nasraty S., 2003; Sulak Р J, 2003; Haggerty C.L. et al., 2003).

Лечение острых и обострения хронических воспалительных заболева­ ний органов репродуктивной системы - достаточно трудная задача, поэтому ведется поиск новых высокоэффективных комбинаций препаратов и путей их введения (Занько С.Н. и соавт., 1996; Пипикина О.Л., 1996; Овсянникова Т.В., 1997; Пекарев О.Г., 1997; Фрейдович А.И.,1997; Зуев В.М., 1998; Фролова Т.М., Свито Г.К., 1998; Краснощекова И.Ю., 2000; Романова А.П., Календарева О.Ф., 2000; Simms L, 1999; Hollier L.M., Workowski К., 2003; Lauper U., Schlatter С, 2005; Бутырина Е.А., 2005). Так, при тяжелых инфекциях при­ датков матки рекомендуется применять две комбинации: цефалоспорин второго поколения, например, цефокситин или цефотетан плюс доксициклин, или же клиндамицин плюс гентамицин (Кузьменко Е.Л., 2003). Схема сочетания клиндамицина с гентамицином остается «золотым стандартом для лечения смешанных инфекций». Она обладает широким спектром противомикробной активности, включая анаэробные бактерии (Кузьменко Е.Л., 2003).

При тяжелых гнойных инфекциях придатков матки часто используют внутривенную инфузию препаратов, с помощью которой в течение короткого промежутка времени удается достичь высокой концентрации антибиотиков в очаге воспаления. Прерывистое внутривенное введение препарата струйно или в виде короткой инфузии (20-30 минут) предпочтительнее непрерывного внутривенного капельного введения.

Помимо внутривенного введения препаратов, возможны внутриартериальные или эндолимфатические инфузии (Выренков Ю.Е. и соавт., 1998), од­ нако, их применение в широкой гинекологической практике ограничено из-за технической сложности выполнения.

Доказано, что воспалительные заболевания органов женской репродук­ тивной системы сопровождаются развитием иммунопатологической недоста­ точности, что способствует хронизации процесса и его устойчивости к тради­ ционной антибиотикотерапии (Батырова А.К., 1993; Шурлыгина А.В. и со­ авт., 1994; Занько С.Н. и соавт., 1996; Ермошенко Б.Г., 1997). Поэтому необ­ ходима оптимизация комплексного лечения сальпингоофоритов с преимуще­ ственным воздействием на различные звенья иммунитета.

В комплекс лечения органов репродуктивной системы для устранения воспалительных процессов у женщин в малом тазу рекомендуется проведение базисного лечения с использованием антибактериальных препаратов: цефазолина, цефобида, гентамицина, метронидазола и других антибактериальных лекарственных средств, для профилактики кандидамикоза следует применять нистатин, кетоконазол, бактисубтил. Полезно назначение ферментных препаратов гиалуронидазного действия - трипсина, вобэнзима, биогенных стиму­ ляторов (алоэ, ФИБС), десенсибилизирующих средств (клемастин, лоратидин, эриус), нестероидных противовоспалительных препаратов.

В качестве иммуномодулирующих воздействий апробировано назначе­ ние: нуклеината натрия, миелопида, тимусных препаратов, особенно имунофана, ридостина, интерферона альфа-2Ь (виферона), кипферона, комплексно­ го иммуноглобулинового препарата, амиксина, лейкинферона, интерлейкинаронколейкина), циклоферона. Обязательна вспомогательная терапия с ис­ пользованием витамина Е, панангина, пищевых добавок, милайфа, превентана, цыгапана (Алешкин В.А. и соавт., 1996;МакаровОВ.исоавт., 1999; Аксененко В.Л., 1998; Хамадьянова А.Г., 1998, 1999; Евсеева А.А. и соавт., 1998; Гриневич Ю.А., Чеботарев В.Ф., 1989; Бакшеев В.И. и соавт., 1991; Дячук А.В., 1992;

Машковский М.Д., 1993, 2003; Zemskov A. et al, 1990; Zemskov V., Zemskov A., 1991; Земсков B.M. и соавт., 2002; Арион В.Я., 1987; Кузник Б.И. и соавт., 1989, 1995; Дергачева Т.И., 1992; Ермошенко Л.В. и соавт., 1992).

Удовлетворительные результаты комплексной противовоспалительной терапии больных с обострением хронического сальпингоофорита достигнуты при использовании таких препаратов, как «Вобензим» и «Пангематоген сухой F» (Иванюта Л.И., 1998; Левицкий Е.Ф. и соавт., 1999).

В последнее время приобрел широкую известность в гинекологической практике димексид. Выбор димексида в качестве приоритетного препарата, прежде всего, обусловлен высокой чувствительностью к нему бактериальной флоры, выявленной у больных, страдающих воспалительными заболеваниями придатков матки. Также димексид имеет тропность к воспалительным тканям и накапливается в них в большем количестве, чем в здоровых, способствует на­ коплению в воспалительных тканях антибиотиков и восстанавливает чувстви­ тельность микроорганизмов, резистентных к антибактериальным препара­ там (Новиков Д.К. и соавт., 1998). Для нормализации микробиоциноза влага­ лища при воспалительных заболеваниях придатков матки на втором этапе ле­ чения после димексида применяли биопрепараты на тампонах, вводимых во влагалище - лактобактерин, ацилакт, бифидин - по 2-3 дозы в день. Курс ле­ чения продолжался 7-10 дней (Герасимович Г.И. и соавт., 1997).

В терапии воспалительных заболеваний органов репродуктивной систе­ мы у женщин видное место занимают болеутоляющие методы. Устранение боли необходимо потому, что ее длительное существование оказывает отри­ цательное влияние не только на нервную и сердечно-сосудистую системы, но также на деятельность многих других органов и систем. Правильно проведен­ ные психотерапия, иглорефлексотерапия и местное лечение (в частности, фи­ зиотерапевтическое) способствует снижению болевых ощущений или их пре­ кращению (Занько С.Н. и соавт., 1998). Кроме того, в настоящее время в ги­ некологии широко и эффективно используется лазеротерапия острых и хро­ нических заболеваний гениталий, лапароскопические методы лечения органов малого таза и брюшины (Кулаков В.И., Адамян Л.В., 1995; Занько С.Н. и со­ авт., 1998).

Отсутствие эффекта (или недостаточный эффект) от применения кон­ сервативной терапии является показанием для хирургического лечения. В него входят оперативная или диагностическая лапароскопия, дренирование гной­ ных тубоовариальных образований под контролем трансвагинальной эхогра­ фии или лапаротомии. В последние годы для лечения абсцедирующих форм воспалительных заболеваний придатков матки с успехом применяют методику пункционного дренирования гнойных полостей, осуществляемого через пе­ реднюю брюшную стенку или задний свод влагалища под контролем трансва­ гинального ультразвукового сканирования или компьютерной томографии, что позволяет улучшить результаты лечения и во многих случаях избежать травматического оперативного вмешательства (Стрижаков А.Н. и соавт., 1994; Стрижаков А.Н., Подзолкова Н.М., 1996; Савельева Г.М. и соавт., 1997).

Как известно, иммунологические механизмы являются одними из ве­ дущих в развитии таких гинекологических заболеваний, как острый и хрони­ ческий сальпингоофориты (Козаченко В.П. и соавт., 1994; Матвеева Н.К. и соавт.. 1995; Оспельникова Т.П., 1998; Земсков A.M. и соавт., 2003, 2005;

Сухих Г.Т., Ванько Л.В., 2006). Так, иммунный статус больных хрониче­ ским сальпингоофоритом в стадии обострения характеризуется дефицитом Тклеточного, активизацией гуморального иммунитета (Дубоссарская З.М., 1989, 1989а; Дубоссарская З.М., Кузнецов В.П., 1991), снижением фагоцитар­ ной и функциональной активности нейтрофилов (Медведева И.Н., 2002).

Кроме того, в остром периоде болезни у женщин с сальпингоофоритом регистрируются умеренный лейкоцитоз за счет сдвига в сторону палочкоядерных нейтрофилов, эозинофилов, моноцитов, умеренная выраженная лимфопения, снижение абсолютного числа CD4+, CD3+, CD22+, CD 16+лифоцитов, процента клеток, экспрессирующих ранние (CD25) и поздние маркеры активации, клеток индукторов фактор апоптоза (CD95), повышение концентрации в сыворотке крови иммуноглобулина А, снижение фагоцитар­ ной активности (фагоцитарного показателя, фагоцитарного числа) и функ­ циональной активности (спНСТ, акНСТ) нейтрофилов. В сыворотке крови у данной категории больных обнаруживается значительное повышение содер­ жания маркеров воспаления, провоспалительных цитокинов (ФНО-а, ИЛ-1(3, ИЛ-6) и компонентов комплемента (СЗ и С4), а также накапливается содер­ жание продуктов ПОЛ - малонового диальдегида, диеновых конъюгатов при снижении активности каталазы (Земсков A.M. и соавт., 2003, 2006).

Известно, что обычная базисная терапия без включения иммунотропных средств, не устраняет ВИН, что и приводит, по мнению Лебедева К.А. и Понякиной И.Д. (1990), в ряде случаев к хронизации процесса. В настоящее время в связи с увеличением частоты смешанных инфекций на фоне сниженного иммунитета, повышения роли вирусов в возникновении заболеваний, интерес к применению интерферонов в терапии воспалительных заболеваний женской половой сферы значительно возрос (Трунов А.Н., Батырова А.К., 1994; ХамадьяноваА.У., 1998,1999).

Установлено, что развитие иммунопатологического состояния снижает сопротивляемость организма больных и может явиться причиной персистирующего течения воспалительного процесса (Цанава P.M., 1988; Новиков Д.К.

и соавт., 1998). Особенностью острого воспаления является значительное увеличение клеток, несущих маркеры В-лимфоцитов и мононуклеаров, уве­ личение общего числа положительных корреляционных связей между иммунокомпетентными клетками. Это свидетельствует о напряжении иммунной системы, что оказывает не защитное, а повреждающее действие (Земсков A.M. и соавт., 1999) и как следствие — способствует хронизации воспали­ тельного процесса. Причины хронического течения заболевания связаны с врожденной или приобретенной функциональной неполноценностью клеток - эффекторов воспаления. При хроническом воспалении изменения иммунно­ го гомеостаза более глубокие, заключающиеся в полном разрушении струк­ туры корреляционных связей между иммунокомпетентными клетками. Разви­ вается аутоиммунная реакция, которая приводит к поддержанию патологиче­ ского процесса (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Савельева Г.М., 1987;

Пересада О.В., 1988, 1991; Погодин O.K., 1991; Терешин А.Т., 1991, 1995; Теплова С.Н., 1998).

Необходимо отметить, что на ранних этапах воспалительного процесса может происходить активация Th2, синтезирующих цитокины, которые супрессируют клеточный иммунитет (ИЛ-4, ИЛ-10 и трансформирующий фак­ тор роста), понижают функциональную активность ТЫ и фагоцитарных кле­ ток, играющих ведущую роль в элиминации условно-патогенных внеклеточ­ ных бактерий. Митогены, продуцируемые микроорганизмами или инфициро­ ванными клетками, преимущественно активируют CD5 - В-клетки; длитель­ ная последующая сверхпродукция ИЛ-10 может привести к направлению всех эффекторных реакций по Тп2-типу, с высокими титрами поликлональных ан­ тител и малой или отсутствием продукции ИФН-у и других провоспалительных цитокинов. Эти условия позволяют микроорганизмам персистировать и способствуют длительной дисрегуляции иммунных реакций на собственные антигены, что может вызвать развитие хронической стадии аутоиммунитета.

В то же время чрезмерное повышение активности ТЫ, увеличивающих продукцию провоспалительных цитокинов (ИЛ-1р, ИЛ-6 и ФНОа), может явиться серьезным осложнением инфекционного процесса. Повышение уровня провоспалительных цитокинов ФНОа, ИЛ-1(3 и ИФН-у, играющих важную роль в патогенезе инфекционных заболеваний, является главной причиной септического шока. При сепсисе уровень ФНОа в крови может достигать нг/мл.

Таким образом, персистирующее течение хронического сальпингоофорита связано с гиперпродукцией AT и иммунных комплексов, повышенной экспрессией HLA - АГ плюс врожденная или приобретенная недостаточность Т-звена иммунитета, Тх - индукторов и Т-супрессоров (CD4, CD8) (Погодин O.K., 1991; Погодин O.K. и соавт., 1991; Козаченко В.П. и соавт., 1994; Стрижаков А.Н. и соавт., 1994,1996; Матвеева Н.К. и соавт., 1995; Медведева И.Н., 2001; Медведева И.Н. и соавт., 2001, 2001а, 20016, 2001 в; Медведева И.Н., 2002; Кузьменко Е.Л., 2003; Земсков A.M. и соавт., 2003). Обычное лечение этих заболеваний, без включения иммунотропных средств, не устраняет ВИН (Козаченко В.П. и соавт., 1994; Лавриненко Е.Т., 1998; Труфакин В.А. и со­ авт., 1999; Земсков A.M. и соавт., 2003), что приводит к увеличению частоты и длительности рецидивов хронических воспалительных заболеваний жен­ ской половой сферы, прежде всего, вульвовагинитов, сальпингоофоритов, цервицитов. В связи с этим в последние годы широкое распространение в ле­ чении этих заболеваний нашли иммунорегулирующие средства.

1.2. Основные принципы иммунотерапии острых и обострения хронических воспалительных заболеваний органов репродук­ тивной системы.

Иммунная система в настоящее время рассматривается как система контроля, обеспечивающая индивидуальность и целостность организма - в результате её способности отличать собственные структуры организма от ге­ нетически чужеродных, а также перерабатывать и элиминировать последние (Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1983; Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990, 1997; Петров Р.В., Лебедев К.А., 1985; Петров Р.В., 1987; Фрейдлин И.С., 1998; Frew A J., Kay А.В., 1990; Н. Kita et al., 1991; Frank M.M., 1991; Weller P., 1994; Wardlaw A., 1996; Yudin M.H. et al., 2003; Borish L.C., Steinke J.W., 2003). Местный иммунитет представляет собой первую линию защиты от бо­ лезнетворных агентов, попадающие в женские половые органы (Ганковская Л.В., 1993; Дергачева Т.И., 1999; Дергачева Т.И. и соавт., 1999; Макарова О.В. и соавт., 1999; Медведев Б.И. и соавт., 2000). Главной его функцией яв­ ляется локализация внедрения возбудителя, выяснение его антигенной струк­ туры и сигнализация об этом периферическим и центральным органам им­ мунной системы (Петров Р.В., 1987, 1999).

По современным представлениям (Stiehm E.R., 1984; Петров Р.В., 1987;

Петров Р.В. и соавт., 1992, 1995, 1997, 1999; Земсков A.M. и соавт., 1997, 2002, 2003; Лесков В.П. и соавт., 1997; Соколов Е.И., 1998; Фрейдлин И.С., 1998; Михайленко А.А., Покровский В.И., 1998; Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000), кроме вторичной иммунной недостаточности (ВИН), выделяют первичную иммунную недостаточность (ПИН). ПИН характеризуется гене­ тически детерминированными дефектами с вовлечением в процесс Т- или Всистем иммунитета, в результате чего развивается функциональный дефицит этих систем. Все разнообразие ПИН и ВИН разделяют на три основные кате­ гории: 1) комбинированная недостаточность клеточного и гуморального им­ мунитета; 2) недостаточность клеточного иммунитета; 3) недостаточность выработки антител (Земсков A.M. и соавт., 1997, 2002, 2003). Самым слож­ ным и прогностически неблагоприятным заболеванием является тяжелая комбинированная иммунная недостаточность (ТКИН). Наиболее типичным проявлением всех форм иммунной недостаточности является развитие не­ прерывно рецидивирующих инфекционно-воспалительных заболеваний с быстрым формированием очагов хронической инфекции, неэффективностью проводимой терапии, летальностью, развитием онкологических и аутоим­ мунных заболеваний. В основном, при вторичной иммунологической недос­ таточности дефект иммунной системы состоит в нарушении хелперной и супрессорной функции Т-лимфоцитов со снижением числа Т-клеток, выходом в периферическую кровь большого количества предшественников Т-клеток, в появлении на мембране лимфоцитов новых антигенных детерминант. Поэто­ му, необходимость своевременной диагностики ВИН, в том числе, при вос­ палительных заболеваниях женской половой сферы диктуется важностью более ранней и адекватной терапии иммунологической недостаточности (Земсков A.M. и соавт., 2003, 2005).

В настоящее время известно много определений иммунного профиля (статуса), из них наиболее известной является дефиниция Р.В. Петрова (1984). Это определение было рабочим в настоящем исследовании. К сего­ дняшнему дню предложено много тестов оценки иммунного статуса (Петров Р.В. и соавт., 1984, 1992, 1994, 1997; Лебедев К.А., Понякина И.Д, 1990, 1997; Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н., 1995; Новиков Д.К., Новикова В.И., 1996; Хаитов P.M. и соавт., 1998). В России на текущий момент, общеприня­ той является двухэтапная система оценки параметров иммунологической ре­ активности (Петров Р.В. и соавт., 1984, 1984а, 1992, 1994).

Появление нового направления в лечении острых и обострения хрони­ ческих воспалительных заболеваний женской половой сферы связано с от­ крытием "четвертого фактора болезни", приобретенной или вторичной им­ мунной недостаточности (Петров Р.В., 1987; Хаитов P.M. и соавт., 1996; Зем­ сков А.М. и соавт., 2002-2007; Михайленко А.А., Покровский В.И., 1998; Но­ виков Д.К. и соавт., 1998; Сапин М.Р., 1999).

В современной клинической иммунологии под термином "иммуномодуляция" понимаются препараты, корригирующие процессы иммунитета (иммуномодулятор, иммунокорректоры) (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1997).

В соответствии с этим определением препараты делятся на иммуностимуля­ торы и иммуносупрессоры. По мнению P.M. Хаитова, Б.В. Пинегина (1997, 1999), следует выделить третью группу препаратов этого класса - собственно иммуномодуляторы, т.е. вещества, оказывающие разнонаправленное дейст­ вие на иммунную систему в зависимости от ее исходного уровня. Таким образом, в зависимости от эффекта действия иммуномодуляторы можно разде­ лить на иммуносупрессоры, иммуностимуляторы и собственно иммуномоду­ ляторы (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996).

По данным P.M. Хаитова, Б.В. Пинегина (1996), современные иммуно­ модуляторы по происхождению можно разделить на три группы: экзогенные (микробные, растительные); эндогенные (иммунорегуляторные пептиды, цитокины); химически чистые и синтетические (аналоги иммуномодуляторов эндогенного происхождения; известные лечебные препараты, обладающие иммуномодулирующими свойствами; вещества, полученные с помощью на­ правленного химического синтеза). По мнению J. Hadden (1993), иммуности­ муляторы, разрешенные к медицинскому применению в западных странах и Японии (биостим, лентинан, тимостимулин, тимомодулин, ромуртид, бронхо-ваксом и др.), в основном, используются при лечении хронических ин­ фекций и рака. В России спектр показаний к назначению иммуномодулято­ ров значительно шире - помимо инфекционных, часто аутоиммунные и ал­ лергические процессы (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996).

Фармакологическая иммунокоррекция остается одной из ведущих в со­ временной иммунотерапии различных заболеваний человека, в том числе, вос­ палительных заболеваний органов репродуктивной системы (Leisis R.S., 1987; Jshitsuka Н., 1989; Kniker W.T,1989; Georgiw Vossil St., 1990, 1991;Knof P., 2000; Koval'chuk L.V. et al., 2004; Norman P.S., 2004) В настоящее время единой классификации иммунотропных средств не существует (Лазарева Д.Н., Алехин А.К., 1985; Арион В.Я., 1987; Гриневич Ю.А., Чеботарев В.Ф., 1989; Чучалин А.Г., 1989; Йегер Л., 1990; Яковлев и соавт., 1990, 1991; Ширинский B.C., Жук Е.А., 1990, 1991, 1992, 1993; Земсков В.М., 1991; Кетлинский С.А. и соавт., 1992, 1998; Земсков В.М., Земсков A.M., 1996; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996; Земсков A.M. и соавт., 1997; Лесков В.П. и соавт., 1997; Соколов Е.И., 1998; Хавинсон В.Х., 1998; Караулов А.В. и соавт., 1999,2002; Сепиашвили Р.И., 2002).

Основным вопросом иммунотропной терапии является определение клинических и иммунологических показаний к ее применению (Кузник Б.И.

и соавт., 1989, 1995; Ширинский B.C., Жук Е.А., 1994; Земсков В.М., Земсков A.M., 1996; Лесков В.П. и соавт., 1997; Петров Р.В. и соавт., 1997; Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996, 1997; Аксененко В.Л., 1998; Соколов Е.И., 1998;

Смирнов B.C., Фрейдлин И.С., 2000; Земсков A.M. и соавт., 2003). Противо­ показаниями к проведению иммунотропной терапии служат нормальное со­ стояние иммунной системы, индивидуальная непереносимость иммуномодулятора, беременность (Чернушенко Е.Ф., 1992).

С целью исключения проведения иммунокоррекции при транзиторных состояниях A.M. Земсковым (1986) предложена специальная формула расчета степени иммунодефицита или гиперфункции иммунной системы. По ней вы­ деляют три степени СИН или ГИС. По данным A.M. Земскова (1986), у боль­ шинства больных БА отмечается II или III степень СИН (ГИС), что требует подключения к обычному лечению одного или комбинации двух и более иммуномодуляторов.

Клинические признаки ВИН в настоящее время принято объединять в следующие клинические синдромы: инфекционный, аллергический, аутоим­ мунный, иммунопролиферативный (Земсков A.M. и соавт., 1997). Необходи­ мо помнить, что наибольшую эффективность от назначения иммуномодуляторов с иммуностимулирующими свойствами, по мнению P.M. Хаитова, Б.В.

Пинегина (1996), следует ожидать при ВИН. Иммуномодулирующую тера­ пию подразделяют на экстраиммунную и собственно иммунотерапию (Хаи­ тов P.M., Пинегин Б.В., 1996).

Экстраиммунная терапия включает в себя снижение антигенной на­ грузки на организм, в том числе гипоаллергенную диету; лечение хрониче­ ских очагов инфекции; антибиотикотерапию с одновременным использова­ нием лактобифидумбактерина и методов специфической иммунотерапии (стафилококковый анатоксин, антифагин и др.); проведение специфической десенсибилизации (специфическая иммунотерапия), а также неспецифичесой гипосенсибилизации препаратами у-глобулина, гистоглобулина, пентоксила;

применение витаминов, микроэлементов, адаптогенов и многое другое. Та­ ким образом, экстраиммунная терапия заключается в назначении комплекса неспецифических воздействий и средств, направленных на улучшение обще­ го состояния организма (Хаитов P.M., Пинегин Б.В., 1996, 1997).

Известно, что основными методами иммунокоррекции в гинекологии яв­ ляются трансфузиологические методы иммунокоррекции (препараты иммуног­ лобулинов, плазмы, поливинилпирролидон, трансфузии концентратов лимфо­ цитов); фармакологические методы иммунокоррекции (препараты бактериаль­ ного и растительного происхождения, липополисахариды, вакцины, препараты синтетические и полусинтетические, вилочковой железы, интерфероны); иммунокоррекция методами экстракорпоральной детоксикации (плазмаферез, гемосорбция, плазмоиммуносорбция), экстракорпоральная иммунофармакотерапия и др. (Воробьев А.И. и соавт., 1984, 1997; Лопаткин Н.А., Лопухин Ю.М., 1989;

Лесков В.П. и соавт., 1993, 1997; Выренков Ю.Е. и соавт.,1998).

В ряде случаев при проведении лечения ВИН требуется сочетанное на­ значение иммуномодуляторов (Лазарева Д.Н., Алехин Е.К., 1985; Алехин Е.К., Лазарева Д.Н., 1994; Земсков A.M. и соавт., 1994, 2002, 2003). A.M.

Земсков и соавт. (1994) под комбинированной иммунокорригирующей тера­ пией понимают последовательное или одновременное применение несколь­ ких иммуномодуляторов, обладающих различным механизмом действия, с целью устранения иммунологических расстройств. Основанием для выбора слагаемых комбинированной модуляции служат особенности нарушений иммунной системы и комбинированного действия препаратов (Земсков A.M.

и соавт., 1997, 1999, 2002, 2003).

Следует напомнить, что список иммуномодуляторов в настоящее время насчитывает свыше 200 наименований и продолжает увеличиваться (Карау­ лов А.В. и соавт., 1999; Земсков A.M. и соавт., 2002-2007). В отличие от обычных лекарственных средств, иммунотропные препараты, разрешенные к клиническому применению, должны обладать соответствующей (паспортной) активностью, не вызывать злокачественного перерождения клеток, му­ таций, не обусловливать канцерогенных эффектов других препаратов и воз­ действий, легко метаболизироваться и выводиться из организма, не вызывать чрезмерной сенсибилизации и не потенцировать ее у других медикаментов, не индуцировать иммунопатологических реакций. Весьма желательно отсут­ ствие привыкания, оральный метод введения, иммуномодулирующие свойст­ ва, естественное происхождение и высокая совместимость с другими препа­ ратами данного и иного вида (Земсков A.M. и соавт., 2002, 2003).

A.M. Земсковым, В.М. Земсковым (1999, 2002, 2003) разработаны ос­ новные принципы назначения иммунокорректоров при иммунопатологии, которые и были применены в проведенном исследовании.

По данным Ф.И. Ершова (1995, 1996), из синтетических препаратов по химическому составу и механизмам действия выделяют четыре группы про­ тивовирусных средств: 1) химиопрепараты; 2) интерфероны; 3) индукторы интерферонов; 4) иммуномодуляторы.

Механизм действия химиопрепаратов заключается в избирательном по­ давлении отдельных этапов репродукции вирусов без существенного наруше­ ния жизнедеятельности клеток макроорганизма. В настоящее время к химиотерапевтическим противовирусным препаратам относятся аномальные нуклеозиды (азидотимидин, ацикловир, рибавирин и др.), производные адамантана (ремантадин и др.), синтетические аминокислоты (амбен, аминокапроновая кислота), аналоги пирофосфата (фоскарнет) и относемикарбозоны (марборан), а также, вирулицидные (оксолин, теброфен, флюреналь) и прочие препараты (арбидол, пандовир, хельпин). Недостатком большинства перечисленных про­ тивовирусных химиопрепаратов является их эффективность, в основном, при лечении гриппа и герпеса и неэффективность в терапии других вирусных ин­ фекций. Другим существенным недостатком химиопрепаратов является фор­ мирование резистентных штаммов вирусов, что приводит к снижению эффек­ та лечения инфекционных заболеваний, вызываемых вирусами. Интерфероны (ИФН) в отличие от химиопрепаратов лишены данных недостатков (Ершов Ф.И., 1995, 1996; Малашенкова И.К. и соавт., 1998). Они обладают универ­ сально широким спектром противовирусной активности и не вызывают фор­ мирование резистентных форм вирусов. ИФН блокируют начало трансляции, т.е. синтез вирусспецифических белков, распознавая и дискриминируя вирус­ ные информационные РНК от клеточных. Отсюда следует универсальность антивирусного действия интерферонов. Препараты ИФН делятся по составу на а-, Р- и у-интерфероны, а по времени создания - на природные человече­ ские лейкоцитарные интерфероны (ИФН первого поколения) и рекомбинантные ИФН второго поколения (реаферон). ИФН широко используются в лече­ нии вирусных инфекций, онкологических заболеваний и других форм патоло­ гии (Малашенкова И.К. и соавт., 1998).

Новой и, по мнению Ф.И. Ершова (1995, 1996), весьма перспективной группой противовирусных препаратов являются индукторы ИФН. Препараты обладают универсальным противовирусным действием подобно ИФН. За по­ следние годы накоплены данные об их клинической эффективности при ме­ стном применении (грипп, герпес и др.).

Таким образом, за последние 30 лет проблема неспецифической иммуностимуляции значительно продвинулась вперед, пройдя путь по меткому выражению J.W. Hadden (1993) (цит. по Хаитову P.M., Пинегину Б.В., 1996, 2002) от подхода «удар ногой по плохо работающему телевизору» (примене­ ние грубых микробных смесей и экстрактов) до более продуманной страте­ гии с использованием большого набора иммунофармакологически активных препаратов, действующих на различные компоненты иммунной системы.

Однако современные схемы неспецифической иммунокоррекции име­ ют определенные недостатки, связанные с особенностями методик оценки иммунного статуса, невозможностью сохранения во всех случаях иммуно­ коррекции паспортной профильности используемых модуляторов, сложно­ стью оценки клинической и иммунологической эффективности иммунотропной терапии и т.д. Это определяет необходимость проведения исследований в данном направлении, в том числе при воспалительных заболеваниях органов репродуктивной системы.

По мнению одного из ведущих специалистов в области акушерства и гинекологии, академика РАМН Г.Т. Сухих (цит., по Г.Т. Сухих, Л.В. Ванько, 2006), анализ результатов определения в периферической крови ТЫ и Th свидетельствует о повышении содержания ТЫ-лимфоцитов у женщин с ост­ рыми воспалительными заболеваниями придатков матки, что обусловливает выбор метода лечения с необходимостью воздействия как на инфекционный агент, так и на иммунную систему пациентки.

При выигрыше в прямом бактерицидном или бактериологическом дей­ ствии использование антибиотиков, особенно длительное, может приводить к снижению функции врожденного или приобретенного иммунитета и разви­ тию на этом фоне вторичной иммунной недостаточности. Наиболее перспек­ тивным направлением иммунотерапии Г.Т. Сухих (2006) считает воздействие на системный иммунитет - иммуномодуляцию. Исследования последних лет показали, что при острых инфекциях иммунотерапия должна применяться одновременно с этиотропными средствами. При этом следует применять иммунорегуляторные пептиды, стимулирующие преимущественно врожденный иммунитет - клетки моноцитарно-макрофагальной системы. В настоящее время врач располагает большим набором иммунотропных лекарственных средств, направленных на восстановление нарушенного иммунитета. При обострении хронических инфекциях лечение должно начинаться с восста­ новления иммунной системы больной, т.е. с назначения иммунокорригирующих средств, а этиотропные препараты применять через 2-3 нед., так как большинство хронических инфекций женских половых органов вызываются условно-патогенными возбудителями на фоне характерных признаков ВИН.

В идеале оценка иммунного статуса, применение иммунокорригирующей те­ рапии и иммунореабилитации должны являться одной из составляющих ком­ плекса профилактических или лечебных мероприятий, направленных на нормализацию иммунных реакций при острой и хронической инфекционной патологии органов репродуктивной системы у женщин.

1.3. Иммунотропное средство глутоксим и его характеристика.

По мнению P.M. Хаитова, Б.В. Пинегина (1996, 1997, 1998, 2001, 2003), в настоящее время в учении об иммуномодуляторах происходят существен­ ные изменения, заключающиеся в переходе от эмпирического подхода как к поиску, так и к более научно обоснованному назначению иммуномодуляторов. Эти изменения можно обозначить как качественные. Они заключаются в следующем: 1) использование химически чистых (или охарактеризованных) и/или синтетических аналогов биологически активных природных веществ вместо целых микробных клеток или грубых экстрактов из центральных или периферических лимфоидных органов; 2) применение синтетических иммуномодуляторов, не имеющих природных аналогов (синтетические полиэлек­ тролиты); 3) включение в терапию рекомбинантных цитокинов — естествен­ ных регуляторов иммуногенеза; 4) поиск веществ, которые с той или иной степенью специфичности действуют как индукторы естественных регулято­ ров иммуногенеза - цитокинов; 5) направленный синтез новых химических соединений, обладающих тропностью по отношению к иммунной системе.

В настоящее время перспективными в иммунотерапии различных забо­ леваний, в том числе воспалительных заболеваний органов женской репро­ дуктивной системы являются такие лекарственные средства, как Деринат и Суперлимф (Чадаев А.П. и соавт., 1996; Манзаев Ч.И., 1998; Манухин И.Б. и соавт., 1999; Ромашкина Т.С. и соавт., 1999; Ромашкина Т.С., 1999; Медведе­ ва И.Н. и соавт., 2001; Медведева И.Н., 2002).

По мнению A.M. Земскова и соавт. (2002, 2003, 2004), в современной клинической иммунологии большое значение имеет развитие адресной иммунокоррекции с учетом зависимости иммунной реактивности от сопутст­ вующей патологии, характера действия традиционных лекарственных средств, иммунотропных средств, как отдельно, так и в комбинации и т.д.

Конечной целью данного метода иммунотерапии является разработка инди­ видуализирующих подходов к назначению иммунотропной терапии.

Несомненный интерес представляет изучение влияния Глутоксима у больных сальпингоофоритами. Это связано с тем, что в настоящее время в лечении воспалительных заболеваний органов репродуктивной системы все большее место занимает иммунотропная терапия (Масталиева В.Я. и соавт., 1989; Козаченко В.П. и соавт., 1994; Матвеева Н.К. и соавт., 1995; Мамиствалова Л.Р., 1999, 1999а; Медведева И.Н. и соавт, 2001; Медведева И.Н., 2002;

Земсков A.M. и соавт., 2003; Гридина С.А., 2005). В настоящее время Глутоксим применяется в лечении туберкулеза (Кноринг Б.Е. и соавт., 2003), при псориазе (Новиков А.И., Кононов А.В., 2003), при заболеваниях мочеполовой системы (Сарвилина И.В., 2003) и других заболеваний. Препарат представля­ ет собой прозрачную бесцветную жидкость (по 1 мл - 10мг ( 1 % раствор), 20мг (1% раствор), по 2 мл - 30 мг и 60 мг(3% раствор). Глутоксим - это иммуномодулятор с системным цитопротекторным действием. Относится к классу тиопоэтинов. Обладает модулирующим действием на внутриклеточ­ ные процессы тиолового обмена, играющего важную роль регуляции генети­ ческих и метаболических процессов в клетках и тканях. Механизмом дейст­ вия является регуляция окислительно-восстановительных реакций клеток.

Новый уровень окислительно-восстановительных систем и динамики фосфорилирования ключевых белков сигнал-передающих систем и транскриптационных факторов (NFkB и АР-1), в первую очередь, иммунокомпетентных клеток, определяет иммуномодулирующий и системный цитопротекторный эффект препарата. Глутоксим оказывает дифференцированное воздействие на нормальные и трансформированные клетки. В нормальных клетках препа­ рат стимулирует процессы пролиферации и дифференцировки, в трансфор­ мированных клетках индуцирует процессы апоптоза (генетически програм­ мированную гибель клетки). Препарат обладает высокой тропностью к клет­ кам центральных органов иммунологической защиты и лимфоидной ткани, усиливает костномозговое кроветворение (эритропоэз, лимфопоэз, гранулоцитопоэз, моноцитопоэз), активирует фагоцитоз, в т.ч. в условиях вторичной иммунной недостаточности. Восстанавливает в периферической крови уро­ вень нейтрофилов, моноцитов, лимфоцитов и функциональную активность макрофагов. Препарат оказывает стимулирующее действие на каскадные ме­ ханизмы фосфатной модификации ключевых белков сигнал-передающих систем, инициацию системы цитокинов (в том числе эндогенной продукции ИЛ-1, ИЛ-6, TNF, IFN), эритропоэтина, воспроизведение эффектов ИЛ-2 по­ средством экспрессии его рецепторов. Показания:- профилактика и лечение ВИН, связанных радиационными, химическими и инфекционными фактора­ ми; - восстановление подавленных иммунных реакций и угнетенного состоя­ ния костномозгового кроветворения; - в качестве гепатопротекторного сред­ ства при острых и хронических гепатитах В и С; - повышение устойчивости организма к различным воздействия (инфекция, интоксикация, радиация); потенцирование лечебных эффектов антибактериальной терапии хрониче­ ских обструктивных заболеваний легких; - тяжелые, распространенные фор­ мы туберкулеза различной локализации (в составе комплексной терапии); туберкулез, резистентный к лекарственной терапии; - лечение токсических осложнений противотуберкулезной терапии; - заболевания мочеполовой сис­ темы (хронический пиелонефрит, гломерулонефрит); - профилактика после­ операционных гнойных осложнений. Режим дозирования: Взрослым препа­ рат вводят в/в, в/м и п/к в дозе 5-40 мг ежедневно в зависимости от тяжести заболевания. Курсовая доза - 50-300 мг. При необходимости проводят по­ вторный курс лечения через 1-6 мес. С профилактической целью препарат применяют в/м в дозе 5-10 мг ежедневно в течение 10 дней. В качестве рас­ творителя следует использовать изотонический раствор натрия хлорида или 5% раствор глюкозы. Побочное действие: возможно, в отдельных случаях повышение температуры тела (37,1-37,5°С), болезненность в месте введения препарата (для уменьшения болезненности возможности введение препарата одновременно с 1-2мл 0,5% раствора новокаина). Противопоказания:

- беременность; - лактация (грудное вскармливание); - повышенная чувствитель­ ность к компонентам препарата. Беременность и лактация: Клинические ис­ следования применения препарата Глутоксим при беременности и в период лактации не проводились.

Таким образом, из представленных литературных данных следует, что вопросы выбора и назначения профильной иммунотропной терапии с ис­ пользованием Глутоксима в лечении острого и хронического сальпингоофорита требуют дальнейшего изучения. Это и определило актуальность темы нашего исследования.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Диссертация выполнена на базах кафедр микробиологии, вирусологии и иммунологии (зав. каф. заслуженный деятель науки РФ, доктор медицин­ ских наук, профессор A.M. Земсков) ГОУ ВПО «Воронежской государствен­ ной медицинской академии им. Н.Н. Бурденко Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ректор - доктор медицинских наук, профессор И.Э. Есауленко), городской клинической больницы скорой медицинской помощи № 10 «Электроника» (гл. врач доктор медицинских на­ ук, профессор Е.А. Назаренко), ГУЗ «Воронежский областной клинический диагностический центр (гл. врач доктор медицинских наук, профессор С.Л. Петросян).

2.1. Объем и характеристика материала исследования Объектом обследования явились женщины с острым сальпингоофоритом (ОСО) и обострением хронического сальпингоофорита (ОХСО). По­ скольку обязательным условием отбора пациенток первой и второй групп было наличие в анамнезе заболевания эпизодов обострения воспаления с оп­ ределенной долей условности ОСО или ОХСО можно считать стадиями од­ ного патологического процесса.

Для объективности исследования консервативное лечебное пособие, лабораторный скрининг, сроки забора диагностического материала, методы математической обработки полученных данных были стандартизированы.

Все пациенты с ОСО или ОХСО были разделены на четыре равные, рандомизированные по возрасту, тяжести заболевания, группы, получавшие стандартное лечение. Соответственно по 20 человек с острым и обострением хронического сальпингоофорита дополнительно получали модулятор глутоксим в стандартных дозировках и схемах по 10 мг в/м. Курсовая доза 50 мг.

У больных до и через три недели после начала дифференцированного лечения проводили рутинные лабораторные и иммунологические тесты I-1I уровня обследования.

2.2. Методы исследования.

При поступлении в стационар все больные прошли комплексное обсле­ дование, включающее в себя тщательный сбор анамнеза жизни, заболевания, объективную оценку общеклинического состояния.

2.1.1. Методы лабораторных исследований.

Диагностика воспалительных заболеваний женской половой сферы ос­ нована на сборе анамнестических данных, оценке субъективных и объектив­ ных симптомов заболевания. Методы лабораторной диагностики при иссле­ дуемых заболеваниях включают: цитологическое (микроскопическое) иссле­ дование мазков окрашенных по Романовскому-Гимзе; микробиологическое исследование — выделение чистых культур условно-патогенной флоры и их ассоциаций с инфекционными микроорганизмами.

Для назначения лечения и адекватного выбора препарата в каждом слу­ чае определяли чувствительность выделенной флоры к антибиотикам.

Для контроля качества проведенного лечения пациенткам проводили кольпоскопическое исследование на аппарате Carlzeiss Gena 121- KSK. Ульт­ развуковое исследование органов малого таза проводилось на аппарате Sonoace pico при поступлении в стационар и после курса лечения, как крите­ рий излеченности.

Исследование проводилось при поступлении в стационар (до начала лечения), в ходе лечения и при выписке из стационара от 3 до 5 раз.

Распределение пациенток по возрасту представлено в таблице 1.

2.2.2. Методы исследования иммунной системы.

Исследование иммунной системы проводилось тестами I I I уровней по 2.2.2.1. Выделение лимфоцитов из периферической крови человека.

До лечения и через 3-4 недели все пациенты подверглись иммунологи­ ческому обследованию тестами I-II уровней по Р.В.Петрову с дополнитель­ ной оценкой рутинных лабораторно-клинических показателей. Полученные данные подвергались математической обработке.

Принцип метода заключается в том, что клетки крови имеют различ­ ную плотность, и это свойство позволяет отделить лимфоциты от других кле­ ток путем их центрифугирования.

Методика:

1) к 0,5 мл разведенного: 24 гепарина добавляют 5 мл венозной крови, перемешивают, разводят взятую кровь физиологическим раствором (1:3) и к 5 мл крови добавляют 10 мл физиологического раствора;

2) в центрифужную пробирку наливают 3 мл рабочего фиколлверографина, на него наслаивают разведенную кровь и центрифугируют минут с ускорением 300 g (1500 об/мин) 3) по окончании центрифугирования незамедлительно собирают с ин­ терфазы лимфоцитарное "кольцо", лимфоциты трижды промывают физиоло­ гическим раствором (1-2 мл, центрифугирование с ускорением 200 g ( об/мин) 1-й раз 45 минут, 2-ой и 3-ий - 10-15 минут), ресуспендируют в 1 мл физиологического раствора и подсчитывают количество лимфо цитов в ка­ мере Горяева;

4) получают суспензию лимфоцитов с концентрацией 4-20 млн клеток в мл, выделенных в градиенте фиколл-верографина.

2.2.2.2. Определение популяций CD 3, CD 19, CD 4 и CD 8 с помощью моноклональных антител в цитотоксическом тесте.

Для проведения данного исследования использовали отечественные моноклональные антитела фирмы "МедБиоСпектр" (г.Москва).

Методика постановки непрямой реакции поверхностной иммунофлюоресценции:

1) в центрифужную пробирку вносят 50 мкл предварительно подготов­ ленной суспензии лимфоцитов, содержащей 4-20 млн клеток в 1 мл и 20 мкл рабочего раствора моноклональных антител, инкубируют в течение 30 минут при комнатной температуре;

2) затем клетки трижды отмывают в мл физиологического раствора (центрифугирование с ускорением 200 g (1000 об/мин) 1-ый раз 45 минут, 2ой и 3-ий - 10 - 15 минут);

3) супернатант тщательно удаляют, а клеточный осадок суспензируют в 20 мкл рабочего раствора FITC - коньюгата вторичных антител, инкубируют в течение 30 минут при 4°С, после чего трижды промывают физиологиче­ ским раствором (см.п.2);

4) полученный после центрифугирования осадок переносят на пред­ метное стекло, высушивают на воздухе и фиксируют 96% спиртом;

5) учет результатов проводят методом флуоресцентной микроскопии с применением набора фильтров возбуждающего света, конденсоров, запи­ рающих светофильтров, предназначенных для работы с ФИТЦ и ТРИТЦ, ис­ пользуют объектив 90 х и окуляр 7 - 10 х;

6) результаты реакции учитывают в течение 24 часов после ее выпол­ нения, препараты предохраняют от воздействия прямого интенсивного света, микроскопирование производят в тщательно затемненном помещении;

7) при работе с люминесцентным микроскопом объектив осторожно помещают в лунку на стекле, используя 50% раствор глицерина, приготов­ ленного на фосфатном буфере, в качестве иммерсионной среды;

8) в одном образце- просчитывают 200 - 500 лимфоцитов, положитель­ ным результатом являются светящиеся по перифериям (в форме кольца) клетки;

9) в ходе исследования определяют количество популяций и субпопу­ ляций лимфоцитов, выраженное в процентах, а затем вычисляют их абсо­ лютные значения по формуле где А - количество лейкоцитов в периферической крови; В - процент лимфоцитов в периферической крови; С - процент популяций (субпопуля­ ций) лимфоцитов в мазке, который определен с помощью моноклональных антител.

2.2.2.3. Определение уровня циркулирующих иммунных комплексов спектрофотометрическим методом по Haskova.

Принцип метода заключается в том, что раствор полиэтиленгликоля способен осаждать из сыворотки агрегированные иммунные комплексы. Из­ менение плотности раствора регистрируется на спектрофотометре.

Методика:

1) в сухую чистую пробирку берут 5 мл венозной крови, помещают ее на 30 минут при 37°С в термостат, затем центрифугируют с ускорением 200g (1000 об/мин) 10 минут, собирают сыворотку;

2) сыворотка разводится : 3 буфером: к 0.1 мл сыворотки добавляют 0, мл боратного буфера, температуре в течение часа;

4) затем фотометрируют на спектрофотометре при длине волны 450 нм в кювете с длиной оптического пути в 1 см. Результаты выражают средней величиной экстинции:

2.2.2.4. Количественное определение сывороточных иммуноглобули­ нов классов А, М, G методом радиальной иммунодиффузии в геле.

В основу этого метода положен метод G.Mancini, принцип которого со­ стоит в измерении диаметра кольца преципитации, образующегося при вне­ сении исследуемой сыворотки в лунки с моноспецифической сывороткой, вырезанные в слое агара. Диаметр кольца преципитации прямо пропорцио­ нален концентрации исследуемого иммуноглобулина. Содержание иммуног­ лобулинов определяют относительно контрольной сыворотки крови человека с известной концентрацией иммуноглобулинов.

Для исследования уровня иммуноглобулинов сыворотки применяют моноспецифические сыворотки против иммуноглобулинов человека произ­ водства НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН г.Москва. Для постановки реакции использовался агар фирмы "Difco", приго­ товленный на веронал-мединаловом буфере (рН 8,56 ± 0,04).

Методика:

1) на стеклянную пластинку (90 х120 мм), покрытую тонкой агаровой пленкой, помещают латунную П-образную рамку толщиной 1 мм, простран­ ство между пластинками заливают смесью агара и моноспецифической сы­ воротки равномерным слоем:

2) после застывания в слое агара с моноспецифической сывороткой вы­ резают лунки диаметром 2 мм на расстоянии 5 мм, делают несколько рядов лунок;

3) в лунки первого ряда вносят по 2 мкл контрольной сыворотки, не разведенной и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Лунки следующих рядов заполняют испытуемыми препаратами;

4) пластины выдерживают во влажной камере в течение 24 ч, а пласти­ ны с aHTH-IgM(H) сывороткой - 48 ч.; затем их окрашивают раствором амидошварца и измеряют диаметры колец преципитации с помощью линейки Behrinsverke; 5) уровень иммуноглобулинов определяют по калибровочной кривой, выражающей зависимость между уровнем иммуноглобулинов и диа­ метром колец преципитации.

2.2.2.5 Определение фагоцитарной активности нейтрофилов.

Методика:

1) к 5 мл венозной крови добавляют 2 капли гепарина (500 ЕД в мл), перемешивают, ставят в термостат на 30 минут, после чего собирают пипет­ кой с оттянутым носиком лейковзвесь на границе между плазмой и эритроцитарной массой, переносят в пробирку и отмывают путем центрифугирова­ ния с ускорением 200 g (1000 об/мин) в течение 10 минут;

2) для определения фагоцитарной активности в центрифужную пробир­ ку вносят ОД мл 1% полистирольного латекса и ОД мл гепаринизированной крови, смесь пипетируется и инкубируется в термостате при 37°С 30 минут (в течение времени инкубации на 10-й и 20-й минутах про бирки необходимо достать из термостата и встряхнуть 40-50 раз);

3) по истечении времени инкубации пробирки вынимаются из термо­ стата, еще раз встряхиваются и центрифугируются 5 минут с ускорением g (1000 об/мин), после чего осторожно вынимаются из центрифуги, надосадочный слой отсасывается в количестве 100 мкл (ОД мл), осадок ресуспензируют;

4) из осадка готовят мазки, их высушивают, фиксируют 96% этанолом и окрашивают заливной краской Романовского на фосфатном буфере в тече­ ние 30 минут:

5) после окрашивания мазки просматривают под микроскопом в им­ мерсионной системе (считают не менее 200 клеток) и производят расчет по­ казателей фагоцитоза:

- фагоцитарный индекс - процент клеток, вступивших в фагоцитоз, от общего их числа; - фагоцитарное число - среднее число бактерий, поглощен­ ных активным нейтрофилом.

2.2.2.6. Определение метаболической активности фагоцитов при помощи НСТ-теста.

Принцип метода основан на восстановлении поглощенных фагоцитами растворимого красителя нитросинего тетразолия (НСТ) в нерастворимый темно-синий диформазан под влиянием Н2О2.

Методика:

1) п.5.1. - п.5.3. повторить;

2) предметные стекла обезжиривают смесью Никифорова (этанол и эти­ ловый эфир 1:1) и натирают сухой марлей;

3) на стекле карандашом ограничивают 2 круглых участка диаметром см, первый участок подписывают "N" - (НСТ - спонтанный), второй "NL" (НСТ-активированный); на первый участок наносят 50 мкл 0,075% раствора НСТ, на второй - 50 мкл 0,075% раствора НСТ с добавлением фагоцитозного латекса, при этом на каждый участок добавляют 100 мкл гепаринизированной крови, все перемешивают;

4) стекла помещают во влажную камеру в термостат при 37°С строго на 20 минут, после чего кровь со стекол смывают теплым физиологическим рас­ твором;

5) приготовленные мазки высушивают, фиксируют 96% этанолом и ок­ рашивают по Филлипсону;

6) в каждом мазке подсчитывают 100 нейтрофилов, среди которых оп­ ределяют процент клеток, содержащих отложения диформазана для спонтан­ ного и активизированного латексом тестов:

7) индекс активации нейтрофилов (Ja) рассчитывают по формуле:

2.2.2.7. Концентрация цитокинов и интерлейкинов ИЛ-4, ИЛ-8.

Концентрацию цитокинов: интерлейкинов -4,8 (ИЛ-4,8) в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом на наборах фирмы «Протеи­ новый контур» (СПб, Россия) для ИЛ-4 и «Цитокин» (СПб, Россия) для ИЛ- в соответствии с рекомендациями прилагаемых инструкций, спектрофотометрической оценкой и расчетом концентрации с помощью программы «Mi­ crosoft Excel».

2.3. Методы математической обработки.

Для принятия решения об использовании метода статистической обра­ ботки данных, полученных при обследовании пациентов предварительно оценивали распределение показателей на параметрические и непараметриче­ ские. Исходя ив этого выбирали адекватный математический критерий.

Нормальность распределения показателей определяли с вычислением параметров Pi и (Зг по следующим формулам:

Где Xj - значение параметра X = — У Xj'(X-X)2- среднее значение параметра Если значения Pi и (32 специальной диаграмме попадали в зону нор­ мального распределения, то данные показатели относились к параметриче­ ским (А.В.Гаспаров, В.И.Шаповалов, 1978, Н.К.Милюна, 1974), если они вы­ ходили за ее пределы, то считались непараметрическими.

Нормальность распределения и вариации значений параметров так же определяли по критерию Колмогорова-Смирнова (Боровиков В.М., 2001;

Гласе Дж, Стенли Дж, 1976) и коэффициенту вариации (Гланц С, 1998; Кокс Д., Стелл Э., 1984).

Как показала математическая обработка, изучаемые параметры - коли­ чество лейкоцитов, лимфоцитов, эозинофилов, базофилов, нейтрофилов, мо­ ноцитов, носителей маркеров CD3+, CD4+, CD8+, CD +, концентрация иммунных глобулинов в сыворотке крови классов G, А, М, ЦИК, относились к нор­ мальному распределению, следовательно для статистического анализа было допустимо использование параметрического критерия.

Для определения оптимального количества пациентов в группе (репре­ зентативность выборки) использовалась формула:

(А.М.Земсков и соавт., 1999, цитировано по Л.Е.Холодову и В.П.Яковлеву), где величины Ml и М2 - средние значения показателей в группе, С { и (У 2 - средние квадратические отклонения.

При анализе иммунограмм рассчитывалась степень иммунологиче­ ских расстройств (А.М.Земсков, 1999) по следующей формуле:

Если выявлялись изменения параметров до 33%, то это определялось, как I степень, от 34 до 66% — II степень, выше 66% — III степень иммунных расстройств, которая при получении знака «—» характеризовалась как имму­ нологическая недостаточность (СИН), а со знаком «+» — гиперфункция им­ мунной системы (ГИС).

Поскольку анализ средних величин показателей является неточным, т.к.

усредняет варианты параметров отдельных лиц в группе, а они могут быть весьма различны, применялся частотный анализ (А.М.Земсков, 1999).

Частотный анализ позволяет выявить количество пациентов, имеющих II и III степень иммунных расстройств по определенным показателям иммунограммы.

Для сравнения клинико-иммунологической эффективности воздействий применялась ранговая оценка (А.М.Земсков, 1994).

Суть метода заключается в том, что анализируются показатели у боль­ ных, получающих разные варианты лечения, сравниваются между собой, наибольшие их изменения в позитивную сторону измеряются 1 рангом, затем 2 и так далее. Минимальная сумма рангов характеризует максимальный эф­ фект воздействия.

Коэффициент диагностической ценности (Kj) рассчитывали по сле­ дующей формуле (А.Л. Горелик, В.А. Скрипкин, 1974):

где д — среднее квадратичное отклонение, Mi и М2 — средние арифметические величины показателей.

Чем меньше величина Kj, тем в большей степени данный показатель отличается от заданного уровня.

Применяя коэффициент диагностической ценности определяли форму­ лу расстройств иммунной системы (ФРИС), определяя диагностически зна­ чимые параметры по их динамике от уровня нормы и дисперсии (Земсков A.M. с соавт, 1999).

Тот же коэффициент использовался для составления формулы мишеней иммунокоррекции (ФМИ) на основе вариаций от фоновых значений показа­ телей у больных до лечения.

С помощью формулы:

где Рисх — исходное значение параметра, Ртт - тоже после традици­ онного лечения, Ри - после традиционного лечения с модулятором выявляли "собственный" эффект иммуномодулятора (Земсков A.M. с соавт.

1999).

Для сравнения клинико-иммунологической эффективности воздействия применялась ранговая оценка (A.M. Земсков, 1994).

Суть метода заключается в том, что анализируются показатели у боль­ ных, получающих разные варианты лечения, сравниваются между собой, наибольшие их изменения в позитивную сторону измеряются 1 рангом, затем 2, и так далее. Минимальная сумма рангов характеризует максимальный эф­ фект воздействия.

Для выявления взаимосвязей между иммунологическими и гематоло­ гическими показателями использовали коэффициент корреляции, который требует определения ковариации cov(x,y)=Mxy-MxMy и дисперсии признаков.

На практике они обычно неизвестны. Информация о признаках х,у обычно представлена выборкой (x b yi)...(x n y n ), которую получают, отбирая п объектов и измеряя значения их признаков. По выборке можно найти I выборочный аналог теоретического коэффициента корреляции - коэффициент корреляции выборки.

Коэффициент корреляции выборки вычисляется по формуле, в числи­ теле которой выборочный аналог математических ожиданий двух наборов данных, в знаменателе - произведение выборочных аналогов дисперсии.

Корреляционный анализ позволяет установить, ассоциированы ли на­ боры данных по величине. Если большие значения из одного набора данных были связаны с большими значениями другого набора, то это свидетельство­ вало о положительной корреляции; малые значения одного набора, связан­ ные с большими значениями другого - об отрицательной корреляции; данные двух диапазонов никак не связанные - о корреляции, близкой к нулю.

Для наглядного изображения состояния иммунного и гематологическо­ го статусов в различные сроки обследования в работе применялись линейнокруговые диаграммы.

Статистическая обработка данных проводилась на ПЭВМ с процессо­ ром Pentium с помощью пакета статистических программ SPSS и электрон­ ных таблиц Excel 7.0 в среде WINDOWS. Различия сравниваемых величин определяли по критерию Стьюдента и считали достоверными при рQ Рис. 1. Динамика показателей иммуно-лабораторного статуса у женщин с острым салыгингоофоритом от уровня нормы до начала лечения.

Обозначения: CD3 - ; CD4 - ; CD8 - ; CD1 I B - ; CD 16 - ; CD 19 - клетки, носители соответствующих маркеров; IgA - ; IgM - ; IgG - иммунные гло­ булины классов А. М, G ; ЦИК - циркулирующие иммунные комплексы; ФП - фагоцитарный показатель; ФЧ - фагоцитарное число; НСТ сп - спонтан­ ный НСТ-тест ; НСТ ак - активированный НСТ-тест; ФНО-альфа - афактор некроза опухоли;

ИЛ-4 - ; ИЛ-б - ; ИЛ-18 - интерлейкины; Лейк. - лейкоциты; Лимф. лимфоциты; Нейтр. нейтрофилы; Мон - моноциты. Нормализованные пара­