«Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ ...»

   

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

НАУКИ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ СИБИРСКОГО

ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Федосеева Лариса Абрамовна

Экспрессия ключевых генов ренин-ангиотензиновой системы у гипертензивных крыс НИСАГ 03.02.07 – генетика

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

д.б.н., проф. А.Л.Маркель д.б.н., проф. Г.М.Дымшиц Новосибирск 2 

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ................................................. ВВЕДЕНИЕ............................................................... ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................... 1.1. Артериальная гипертония............................................... 1.1.1. Моногенные, или менделевские формы гипертонии....................... 1.1.2. Полигенные формы артериальной гипертонии. Гипертоническая болезнь, или эссенциальная гипертония........................................................ 1.1.3. Изучение гипертонии на животных моделях.............................. 1.1.3.1. Крысы НИСАГ..................................................... 1.1.4. Стресс как фактор, провоцирующий развитие артериальной гипертонии...... 1.2. Физиологические системы и их роль в повышении АД...................... 1.2.1. Симпатоадреналовая система и контроль артериального давления........... 1.2.2. Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС): ее роль в регуляции АД и в формировании гипертензивного статуса............................................ 1.2.2.1. Регуляция циркулирующей РАС – классические пути.................... 1.2.2.2. Основные компоненты РАС.......................................... 1.2.2.2.1. Ренин............................................................ 1.2.2.2.2. Ангиотензиноген.................................................. 1.2.2.2.3. Ангиотензин-превращающий фермент (АСЕ).......................... 1.2.2.2.4. Ang II и его рецепторы............................................. 1.2.2.2.5. «Новые» компоненты РАС.......................................... 1.2.2.3. Локальные тканевые РАС............................................ 1.2.2.3.1. Почечная РАС.................................................... 1.2.2.3.2. РАС в сердце..................................................... 1.2.2.3.2.1. Функции кардиальной РАС....................................... 1.2.2.3.3. РАС мозга....................................................... 1.2.2.3.3.1. Функции мозговой РАС.......................................... 1.2.2.3.4. Адренальная РАС................................................. 1.2.2.3.4.1. Функции РАС в надпочечнике..................................... 1.2.2.3.5. Сосудистая РАС.................................................. 1.2.2.3.5.1. Функции сосудистой РАС......................................... 1.2.2.3.6. Другие тканевые РАС.............................................. 3  1.2.2.4. Значение внутриклеточной РАС...................................... 1.2.3. Циклооксигеназы и синтез простагландинов............................. 1.2.3.1. Структура и клеточный синтез ПГ.................................... 1.2.3.2. Формы циклооксигеназ.............................................. 1.2.3.3. Рецепторы простаноидов............................................. 1.2.3.4. Регуляция циклооксигеназ........................................... 1.2.3.4.1. Регуляция СОХ на уровне транскрипции.............................. 1.2.3.4.2. Регуляция циклооксигеназ на пост-транскрипционном пре-трансляционном уровне........................................................................ 1.2.3.4.3. Регуляция циклооксигеназ на пост-трансляционном уровне.............. 1.2.3.5. Циклооксигеназы и простаноиды в здоровье и болезни................... 1.2.3.5.1. COX-1 и COX-2 в центральной нервной системе....................... 1.2.3.5.1.1. Простагландины в ЦНС........................................... 1.2.3.5.1.2. Простагландины и стресс – связь с ГГАС и СНС...................... 1.2.3.5.2. СОХ-2 и синтез простагландинов в надпочечниках..................... 1.2.3.5.3. СОХ-2 в почках.................................................. 1.2.3.5.3.1. Почечные эффекты простагландинов.............................. 1.2.3.5.4. Сердечнососудистая система и простагландины....................... 1.3. Современные представления о механизмах возникновения гипертонии........ 1.3.1. Гипотеза единого пути развития эссенциальной гипертонии............... 1.4. Заключение.......................................................... ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.................................... 2.1.Материалы........................................................... 2.2. Праймеры........................................................... 2.3.Экспериментальные животные.......................................... 2.3.1.Артериальное давление............................................... 2.7.1. Построение калибровочных кривых при ПЦР в реальном времени.......... 2.7.2. Определение относительных уровней мРНК методом ПЦР в реальном времени с 2.9. Определение нуклеотидной последовательности 5’-области гена Lngfr........ 3.1.1.1. Экспрессия генов РАС в почках молодых (1,5 мес) крыс................. 3.1.1.2. Уровень мРНК генов РАС в почках зрелых (4 мес) крыс в покое и при водной 3.4.2.2. Уровень мРНК генов РАС у зрелых (4 мес) крыс в покое и при водной 3.1.3.1.2. Уровень мРНК генов РАС в продолговатом мозге..................... 3.1.3.2.1. Уровень мРНК генов РАС в гипоталамусе в покое и при водной депривации..

3.4.3.2.2. Уровень мРНК генов РАС в продолговатом мозге..................... 3.1.4.2. Уровень мРНК генов РАС у зрелых (4 мес) крыс в покое и при водной 3.2. Экспрессия гена Th у крыс линий WAG и НИСАГ в состоянии покоя и стресса 3.3. Экспрессия гена Cох-2 у крыс линий WAG и НИСАГ в состоянии покоя и стресса 3.3.1.2. Уровень мРНК гена Cох-2 в почках взрослых крыс...................... 3.3.2.2. Уровень мРНК гена Cох-2 в продолговатом мозге....................... 3.4. Поиск корреляций в экспрессии изучаемых генов у молодых крыс WAG и НИСАГ 3.4.1. Корреляции в уровнях мРНК одноименных генов в разных органах........ 3.4.2. Корреляции в уровнях мРНК генов, относящихся к разным системам, внутри 3.4.3. Корреляции в уровнях мРНК генов разных органов и систем............... 3.5. Секвенирование кодирующего сигнальный пептид фрагмента гена Ngfr крыс 4.3. Секвенирование кодирующего сигнальный пептид фрагмента гена Ngfr;

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГ – артериальная гипертония АД – артериальное давление АКТГ – адренокортикотропный гормон ГГАС – гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальная система КРГ – кортикотропин рилизинг гормон ЛПС – липополисахарид НИСАГ (ISIAH) – линия крыс с наследственной индуцируемой стрессом артериальной гипертонией ПГ – простагландин РАС – ренин-ангиотензиновая система САС – симпатоадреналовая система СНА – симпатическая нервная активность СНС – симатическая нервная система ЦНС – центральная нервная система ЮГ – юкстагломерулярные (клетки, аппарат) AA – арахидоновая кислота ACE – angiotensin converting enzyme (ангиотензин-превращающий фермент) ACEI – ингибитор АСЕ Ac-SDKP – гематопоэтический фрагмент acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (субстрат АСЕ) Agt – ангиотензиноген Agt – ген ангиотензиногена Agtr1a, Agtr2 – гены рецепторов ангиотензина 1А- и 2-го типа Ang – ангиотензин ARB – блокатор рецептора АТ AT1A и AT2 – рецепторы ангиотензина 1А- и 2-го типа B2 – рецептор брадикинина COX – простагландин-эндопероксид-Н-синтаза, PGH-синтаза, КФ 1.14.99. Cox-2 – ген циклооксигеназы- CVO – циркумвентрикулярные органы DOCA – дезоксикортикостерон ацетат DTT – дитиотрейтол ENaC – эпителиальный натриевый канал GPCR – 7-трансмембранные, сопряженные с G-белком рецепторы GR – глюкокортикоидный рецептор ICV – интрацеребровентрикулярное (введение) IEG – «немедленно-ранние» гены, «гены быстрого реагирования»

IL – интерлейкин JAK – Янус-киназа LVH – гипертрофия левого желудочка сердца MAPK – митоген-активируемая протеин-киназа MD – плотное пятно (в почке) MR – минералокортикоидный рецептор NOS – NO-синтаза NTS – ядро одиночного пути (солитарного тракта) PRR – рецептор проренина/ренина PVN – паравентрикулярное ядро гипоталамуса ROS – активные формы кислорода Rpl30 – ген рибосомного белка большой субъединицы RVLM – ростральная вентролатеральная область мозга SDS – додецил-сульфат натрия SFO – субфорникальный орган SOCS – супрессор сигнальных путей цитокинов SON – супраоптическое ядро SPGNs – sympathetic postganglionic neurons – симпатические постганглионарные нейроны STAT – сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции TH – тирозин-гидроксилаза Th – ген тирозин-гидроксилазы TNF- – цитокин фактор некроза опухолейVP – вазопрессин VSMC - клетки гладкой мускулатуры сосудов WAG – Wistar Albino Glaxo – нормотензивная линия крыс

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение механизмов артериальной гипертонии актуально ввиду широкого распространения этого заболевания, являющегося одной из главных причин нетрудоспособности и смертности среди населения Земли. Разработанные в последние десятилетия методы позволили перейти от эмпирического описания к выяснению глубоких генетических и биохимических причин, лежащих в основе гипертонической болезни, а также к пониманию того, что спектр этих причин многообразен. Генетические факторы дают существенный вклад в регуляцию артериального давления (АД): считается, что 30-60% наблюдаемых вариаций в АД определяются генотипом. Факторы среды и питания, различный стиль жизни также играют роль в патогенезе первичной гипертонии как важные, но поддающиеся модификации факторы риска, и определяют оставшуюся часть вариации АД.

Немалую роль в развитии болезненного состояния играет стресс, в том числе эмоциональный, особенно в тех случаях, когда стрессирующее воздействие падает на почву генетической предрасположенности. Адекватная модель такого состояния – линия крыс с наследственной индуцируемой стрессом артериальной гипертонией (НИСАГ) – позволяет исследовать механизмы возникновения и развития стресс-чувствительной формы артериальной гипертонии.

За годы, прошедшие с момента создания линии НИСАГ, у этих животных были исследованы физиологические функции таких систем ответа на стресс, как гипоталамогипофизарно-адренокортикальная (ГГАС) и симпатоадреналовая (САС), а также транскрипционная активность их ключевых генов. Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС) получила меньше внимания исследователей, хотя в последние годы все более активно изучается функция секреции альдостерона надпочечниками.

Однако авторы обзоров литературы, посвященных гипертонии, сходятся во мнении, что развитие гипертонической болезни, независимо от исходной причины, непременно затрагивает механизмы водно-солевого обмена, а значит, и систему, непосредственно с ним связанную – РАС. Более того, в последние десятилетия усилилось понимание значимости не только системной, но и локальных РАС – в почках, сердце, надпочечниках и едва ли не в первую очередь в мозге, – функции которых могут как влиять на формирование гипертонического статуса, так и меняться под его воздействием. Поэтому анализ активности РАС в органах, связанных с сердечнососудистым гомеостазом, должен быть одним из приоритетных направлений в исследовании природы артериальной гипертонии.

Экспрессию генов РАС у крыс НИСАГ до сих пор изучали в основном на уровне белковых продуктов (например, определения активности ренина или АСЕ). Но транскрипционную активность генов РАС (за исключением ренина) в почке крыс этой линии, как и в других органах, связанных с водно-солевым обменом и кардиоваскулярным гомеостазом, не исследовали. Более того, не была исследована и экспрессия генов РАС у молодых крыс в период становления гипертонии.

Согласно современным концепциям (Johnson et al., 2008), развитие гипертонии проходит через две фазы. Во время первой фазы гипертония соль-резистентна и ренин-зависима, а почки функционируют нормально. Ранняя гипертония ассоциирована с низким объемом крови, повышенным уровнем ренина плазмы и гиперактивной симпатической нервной системой.

Спустя время, вазоконстрикторные ответы ведут к развитию прегломерулярной артериолопатии и кортикальной почечной ишемии. Последствием этого является как сокращение почечной фильтрации, так и рост тубулярной абсорбции натрия, что ведет к повышению АД.

Известно, что у крыс других линий с низкорениновой формой гипертонии в раннем возрасте экспрессия ренина в почке повышена (Gomez et al., 1988; Sassard et al., 2003), а короткая блокада РАС приводит к долговременному снижению АД и задержке формирования гипертензивного статуса. Показано, что воздействие антигипертензивных средств на крыс НИСАГ в препубертатном возрасте (до 6 нед) также смягчает проявления гипертонии в последующем (Филюшина и др., 2007). Исходя из этих данных, кажется необходимым изучать функционирование РАС не только на взрослых животных, но и на крысах в критическом возрасте формирования гипертензивного статуса.

Невозможно рассматривать действие РАС изолированно, вне связи с другими физиологическими системами. Так, симпатическая нервная система управляет экспрессией ренина в почке и сама, в свою очередь, зависит от уровня Ang II как в циркуляционном русле, так и в структурах мозга. В лаборатории эволюционной генетики ИЦиГ СО РАН было показано, что базальный уровень адреналина в надпочечниках у крыс линии НИСАГ повышен (Маркель и др., 2006; Markel et al., 2007). Это заставляет полагать, что у крыс этой линии присутствуют изменения в цепи биосинтеза катехоламинов. В работе Бузуевой и сотр. (2006) показана повышенная гормон-синтетическая активность хромаффинных клеток уже у 3недельных крысят НИСАГ.

Высокая симпатическая нервная активность, стимулирующая РАС и ведущая к развитию гипертонии, может иметь причиной особенности формирования симпатической нервной системы. Так, у крыс широко известной гипертензивной линии SHR выявлены гипериннервация сосудистой ткани и гипертрофия симпатических ганглиев, причиной чего может являться изменение восприимчивости симпатических нервов к фактору роста нервов NGF (Nemoto et al., 1994) из-за точечной мутации в нуклеотидной последовательности, соответствующей сигнальному пептиду, гена Ngfr (рецептора NGF низкой аффинности). С локусом этого гена у крыс SHR ассоциировано высокое АД (Hilbert et al., 1991), а у молодых крыс НИСАГ – повышение АД при стрессе (Редина и др., 2003), поэтому можно предположить наличие сходной мутации у животных этих двух линий. Выявить такую мутацию можно методом секвенирования соответствующего участка.

Ранее была показана повышенная активность ГГАС у крыс линии НИСАГ. Реакция ГГАС на стресс и секреция глюкокортикоидов требуют посредников-простагландинов, чей синтез может модулироваться главным эффектором РАС ангиотензином II и его рецепторами.

Секреция ренина в почке также регулируется простагландинами – продуктами действия фермента циклооксигеназы (СОХ)-2. Но система биосинтеза простагландинов у крыс НИСАГ до сих пор оставалась вне внимания исследователей, за исключением работы Амстиславского и соавт. (Amstislavsky et al., 2005), где иммуногистохимически и методом полуколичественной ПЦР показано снижение уровня мРНК и белка СОХ-2 в почке крыс НИСАГ.

Учитывая все вышесказанное, для изучения были выбраны, помимо генов РАС, ключевые гены систем биосинтеза катехоламинов (ген тирозин-гидроксилазы Th) и простагландинов (ген циклооксигеназы Сох-2).

У генетической модели стресс-индуцируемой гипертонии – крыс НИСАГ определить транскрипционную активность генов ренин-ангиотензиновой системы и связанных с ее функционированием генов тирозин-гидроксилазы и циклооксигеназы-2 в условиях покоя и стресса 17-часовой водной депривации.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать транскрипционную активность ключевых генов РАС (Ren, Ace, Ace2, Agt, Agtr1a и Agtr2) в почке, миокарде, отделах мозга (гипоталамус и продолговатый мозг) и надпочечнике у молодых (6 недель) и взрослых (4 мес) крыс линии НИСАГ и контрольной нормотензивной линии WAG.

2. Сравнить уровень экспрессии генов РАС (Ren, Ace, Ace2, Agt, Agtr1a и Agtr2) в почке, миокарде, гипоталамусе и надпочечнике взрослых крыс линий НИСАГ и WAG в условиях покоя и мягкой (17 часов) водной депривации.

3. В качестве показателя активности катехоламинергической системы изучить транскрипционную активность гена Th, кодирующего тирозин-гидроксилазу, в отделах мозга и надпочечнике у крыс линий WAG и НИСАГ в возрасте 6 недель и 4 мес. Сравнить уровень экспрессии гена Th у взрослых крыс линий НИСАГ и WAG в условиях покоя и водной депривации в гипоталамусе и надпочечнике.

4. Провести у крыс НИСАГ поиск мутации в гене Ngfr, аналогичной влияющей на иннервацию сосудистой стенки у крыс SHR.

5. В качестве показателя активности системы биосинтеза простагландинов изучить транскрипционную активность гена Cox-2, кодирующего циклооксигеназу-2, в почке, отделах мозга и надпочечнике у крыс линий WAG и НИСАГ в возрасте недель и 4 мес. Сравнить уровень экспрессии гена Сох-2 в почке, гипоталамусе и надпочечнике взрослых крыс линий НИСАГ и WAG в условиях покоя и водной Научная новизна работы. В работе впервые:

проведено комплексное исследование транскрипционной активности генов локальных (тканевых) РАС у молодых (1,5 мес) и взрослых (4 мес) крыс линий НИСАГ и WAG методом ПЦР в реальном времени. Показана повышенная транскрипционная активность гена Ren в почке, а также гена Agt в гипоталамусе и продолговатом мозге у молодых крыс НИСАГ.

Показан дисбаланс экспрессии генов ангиотензиновых рецепторов в мозге и надпочечниках. У взрослых крыс НИСАГ показано снижение транскрипционной активности почечной РАС, а также рост экспрессии Асе в миокарде, характерный для сформировавшейся левожелудочковой гипертрофии.

катехоламинов – тирозин-гидроксилазы Th у молодых крыс НИСАГ в гипоталамусе и у взрослых – в продолговатом мозге.

Показано повышенное содержание мРНК Сох-2 в гипоталамусе, продолговатом мозге и надпочечниках молодых крыс НИСАГ.

При водной депривации обнаружен рост экспрессии гена Th в гипоталамусе, а также рост уровня мРНК Сох-2 в почках и его снижение – в надпочечнике у крыс НИСАГ, тогда как у крыс WAG реакция на этот стресс проявляется в росте экспрессии гена Agtr1a в надпочечнике и Ren – в гипоталамусе.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Работа расширяет имеющиеся представления о роли и механизмах участия локальных (тканевых) РАС, и прежде всего РАС мозга, в становлении стресс-чувствительной формы артериальной гипертонии. Данные об особенностях экспрессии генов РАС, а также генов Th и Сох-2, у гипертензивных животных могут быть использованы при разработке мер профилактики и лечения гипертонической болезни.

Положения, выносимые на защиту:

1. Транскрипционная активность ключевого гена РАС почки, ренина (Ren), повышена у молодых и снижена у взрослых крыс НИСАГ.

2. В гипоталамусе и продолговатом мозге молодых крыс НИСАГ повышена транскрипционная активность генов РАС, что ведет к активации симпатической нервной системы и к росту АД. Дисбаланс экспрессии рецепторов ангиотензина II в гипоталамусе и продолговатом мозге, как и снижение уровня экспрессии Асе2 в гипоталамусе, также связаны с ростом АД.

3. Экспрессия генов РАС в мозговых структурах интактных взрослых крыс НИСАГ не отличается от таковой у крыс WAG, за исключением гена Асе2. Стресс обезвоживания снижает уровень экспрессии Ren в гипоталамусе у крыс WAG, но не 4. В миокарде взрослых крыс НИСАГ повышена экспрессия гена Асе, что характерно для левовентрикулярной гипертрофии, и эта экспрессия снижается при стрессе обезвоживания.

5. В надпочечниках молодых крыс НИСАГ снижена экспрессия гена Agtr2, что способствует повышению АД. У взрослых интактных крыс различия отсутствуют, но стресс обезвоживания снижает экспрессию Agtr1a только у крыс WAG.

6. У крыс НИСАГ повышена транскрипционная активность гена Th в структурах мозга. Стресс обезвоживания у взрослых крыс НИСАГ увеличивает уровень экспрессии Th в гипоталамусе.

7. У крыс нормотензивной линии WAG и гипертензивной линии НИСАГ последовательность, кодирующая сигнальный пептид рецептора LNGFR, не содержит мутации, найденной у крыс линии SHR.

8. Система биосинтеза простагландинов активирована в мозговых структурах и надпочечниках у молодых, но не у взрослых, крыс НИСАГ. Это может являться одним из начальных этапов активации ГГАС. У интактных взрослых крыс НИСАГ уровень мРНК Сох-2 понижен в почках, но стресс обезвоживания приводит к его росту.

9. Анализ корреляций экспрессии изучаемых генов у молодых крыс НИСАГ и WAG указывает на значительную разницу между линиями животных в связях между транскрипционной активностью генов различных систем и органов.

Апробация результатов.

Материалы диссертации обсуждены на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (г. Новосибирск, 2008), Сибирском физиологическом съезде (г.

Барнаул, 2008), V съезде ВОГИС (г. Москва, 2009), XXII Cъезде физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Волгоград, 2013), Школе молодых ученых «Геномика и биология клетки»

(г. Москва – Звенигород, 2010), конференциях «Фундаментальные науки – медицине» (г.

Новосибирск, 2008, 2010, 2012, 2013), «Медицинская геномика и протеомика» (г. Новосибирск, 2009), «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (г. Санкт-Петербург, 2010, 2011), «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (г. Курск 2011), отчетной сессии Института цитологии и генетики СО РАН (г. Новосибирск, 2013).

По результатам исследования опубликовано 8 печатных работ в рецензируемых изданиях, из них 6 – в отечественных, входящих в список ВАК, и 2 – в зарубежных. Кроме того, опубликовано 6 статей в сборниках трудов конференций и 10 тезисов.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из оглавления, списка сокращений, введения, обзора литературы, описания используемых материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы. Работа изложена на 262 страницах, содержит 48 рисунков и таблицы. Библиографический указатель литературы включает 993 источника, из них отечественных и 961 зарубежных.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Артериальная гипертония (АГ) – это патология, основным симптомом которой является стойкое повышение артериального давления, которое наблюдается не только во время физической активности, но и в покое, что приводит в конечном итоге к поражениям органов как самой сердечно-сосудистой системы, так и других органов-мишеней (почек, мозга). Термин «высокое артериальное давление» (гипертензия) адекватно описывает временное состояние, вызываемое стрессом или физической нагрузкой, в то время как «гипертония» - это более подходящий термин для постоянного болезненного состояния (Nakayama, 2005). При гипертонии состояние постоянно повышенного артериального давления обусловлено в первую очередь повышенным сосудистым сопротивлением в системной циркуляции.

Гипертония – одна из ведущих причин нетрудоспособности, заболеваемости и смертности среди населения; это наиболее распростаненное хроническое заболевание в мире (Рис. 1.1). Она является одной из главных причин появления таких осложнений как мозговой инсульт, инфаркт миокарда и почечная недостаточность (NIH, 2004; WHO, 2012).

Рис. 1.1. Смертность от 20 лидирующих факторов риска в мире в 2002 году (по ASH, 2007, с модификациями).

Согласно сегодняшнему пониманию, артериальное давление (АД) – это тонко регулируемый физиологический количественный показатель, на который влияет множество регуляторных факторов, действие которых, в конечном счете, интегрируется на уровне целого организма для обеспечения адекватного кровотока во всех тканях и органах, несмотря на широко различающиеся местные метаболические потребности (Rosskopf et al., 2007).

Вариабельность АД в человеческой популяции описывается нормальным распределением. Учитывая это непрерывное распределение уровней АД, классификация гипертонии как дискретного свойства требует определения пороговых значений АД, при которых повышается кардиоваскулярный риск или становятся необходимы терапевтические вмешательства. Повышенным считается систолическое давление от 140, а диастолическое – от 90 мм рт.ст. (NCHS, 2011).

Обширные литературные данные показывают, что генетические факторы дают существенный вклад в регуляцию АД. Наблюдается корреляция между значениями АД родителей и потомков, и документально подтверждено, что сходство значений АД внутри семей сильнее, чем между семьями (Longini et al., 1984). Наблюдения за монозиготными близнецами демонстрируют более значительные совпадения, чем у гетерозиготных близнецов.

Наблюдения за приемными детьми также показали, что внутрисемейные совпадения уровней АД не являются просто следствием сходных условий жизни, поскольку биологические братья и сестры имели более высокий уровень совпадений, чем приемные (Rice et al., 1989). Факторы среды и питания, различный стиль жизни также дают свой вклад в патогенез первичной гипертонии как важные, но поддающиеся модификации факторы риска. Считается, что 30-60% наблюдаемых вариаций в АД определяются генотипом (Garcia et al., 2003), причем это влияние имеет полигенную основу и определяется действием пяти, десяти или даже большего числа генов, каждый из которых дает только весьма ограниченный вклад. Средовые влияния, включая питание, определяют оставшуюся часть вариации АД (Rosskopf et al., 2007). Таким образом, мы стоим перед сложным взаимодействием повышающих и снижающих АД генов, многие из которых обладают плейотропными эффектами, в сочетании с множеством экзогенных факторов. Кроме того, первичная гипертония тесно связана с множеством других заболеваний, включая метаболический синдром, диабет второго типа, преэклампсию или почечные заболевания.

1.1.1. Моногенные, или менделевские формы гипертонии Моногенные, или менделевские, формы гипертонии – это крайне редкие нарушения.

Подробное описание моногенных форм гипертонии можно найти, например, в обзорной статье Rosskopf и соавт. (Rosskopf et al., 2007). Среди них – излечимый глюкокортикоидами альдостеронизм, кажущийся избыток минералокортикоидов (AME), синдром Лиддля, мутации минералокортикоидного рецептора, синдром Гордона (псевдоальдостеронизм 2 типа) и другие.

Помимо моногенных форм гипертензивного синдрома, для которых гипертония – это лидирующий симптом, существуют и другие сложные генетические синдромы, которые сопровождаются повышением АД, например, семейная феохромоцитома. Интересно, что большинство идентифицированных мутаций, вызывающих гипертонию, так или иначе, затрагивают почечный гомеостаз Na+. Повышенная задержка натрия почкой сопровождается ростом реабсорбции воды, приводя к увеличению внутрисосудистого объема. В свою очередь, рост сердечной нагрузки (preload – т.е. объем венозной крови, возвращаемой в сердце) повышает минутный объем крови и АД. Таким образом, большинство описанных генетических отклонений при моногенных формах артериальной гипертонии связаны с почечной регуляцией обмена соли и воды. Это позволяет рассуждать о том, что в полигенной гипертонии генетические отклонения в почечных механизмах могут также иметь ключевое значение.

1.1.2. Полигенные формы артериальной гипертонии. Гипертоническая болезнь, Эссенциальная гипертония составляет около 90-95% всех случаев гипертонии у людей (Rassler, 2010). В отличие от редких случаев моногенной гипертонии, первичная, или эссенциальная гипертония определяется полигенными механизмами, мозаикой нейральных, гормональных и клеточных отклонений с сильным влиянием условий жизни и факторов среды.

У большинства таких пациентов гипертония имеет полигенную основу и проявляет различные свойства. В частности, проявления соль-чувствительности отличаются в широких пределах, подразделяя гипертоников на соль-чувствительных и соль-резистентных. В литературе утверждения, касающиеся процента соль-чувствительных пациентов, колеблются между 30% и 70% (Weinberger, 1996; Frohlich, 2005) Есть свидетельства, что вклад определенных генетических полиморфизмов меняется в зависимости от этнической принадлежности. За последнее десятилетие многие гены были включены в список генов-кандидатов гипертонической болезни.

Невероятное количество денег и человеческих усилий затрачено на изучение генетической базы гипертонии. Два из таких исследований опубликованы как статьикомпаньоны (Newton-Cheh et al., 2009; Levy et al., 2009). Список учреждений, уже не говоря о соавторах, занятых в этих работах, исчисляется десятками и сотнями. Обычным результатом подобных исследований, посвященных геномным ассоциациям, является вывод о том, что не существует такой вещи как «ген или гены гипертонии» в популяции в целом. Также становится ясно, что поиск генетической основы гипертонии, а точнее сказать, регуляции кровяного давления, находится в самом начале пути. Авторы этих статей указывают, что для каждого аллеля, для которого обнаружена ассоциация с изменением кровяного давления, реальный вклад в это изменение составляет не более 0.05–0.5 mm Hg. Даже при сочетании нескольких аллельных вариантов АД меняется лишь на 4–6 mm Hg и составляет менее 5–10% вариации.

Возможно, что при более точном генетическом анализе определенных аллелей эти ассоциации станут несколько сильнее. Тем не менее, конечная цель поиска генетических вариантов – привести к более специфическим или даже к совершенно новым терапевтическим подходам – зачастую остается в области мечты. Прежде всего, гипертония может быть конечным результатом действия множества механизмов, и их проявление может иметь различное количественное значение для каждого пациента. Факторы окружающей среды взаимодействуют с генетическим фоном. Таким образом, генетический подход далеко не всегда способен привести к клинически значимым результатам. Этот путь исследования может объяснить лишь малую долю популяционных рисков, хотя может оказаться значительно полезнее при поиске индивидуального подхода к терапии и мишеней для новых антигипертензивных стратегий лечения (Mann, 2010).

Использование экспериментальных животных может дать существенный вклад в понимание патогенеза заболевания. Хотя животные модели полностью не могут повторить клиническую картину болезни человека, они позволяют получать информацию о специфических событиях и чертах, а также контролировать происходящие изменения при вмешательствах, часто инвазивных, которые трудно или вообще невозможно применить в клинических исследованиях. Главными преимуществами животных моделей являются использование контрольных групп и возможность задания условий, при которых результаты могут меняться после изменения одного или нескольких факторов. Ограничения же происходят из различий между патологиями человека и животных. Могут оказаться важными анатомические различия между филогенетически далекими видами, они могут отвечать различным патофизиологическим механизмам, а ответ на фармакологическое воздействие может происходить различными путями. Поэтому экстраполяция экспериментальных результатов на человеческую патологию должна приниматься с осторожностью (Chorro et al, 2009).

Первоначально гипертоническую болезнь моделировали путем хирургического вмешательства либо химических воздействий. К таким экспериментальным моделям относится в первую очередь модель почечной ишемии при стенозе почечной артерии у собак, описанная впервые Гольдблаттом еще в 30-е годы прошлого столетия (Bader, 2010). В других экспериментальных моделях повышения АД добиваются введением вазоконстрикторного пептида ангиотензина (Ang) II, или дезоксикортикостерон ацетата (DOCA) в сочетании с высокосолевой диетой, либо блокадой синтеза NO (Gross, 2009; Bader, 2010).

Однако любая такая экспериментальная модель всегда подразумевает внешнее вмешательство. Для понимания механизмов возникновения и развития гипертонической болезни более адекватными были бы модели, в которых исходно к болезни приводят внутренние (в том числе генетические) причины,. Для этого были селектированы линии лабораторных животных, и прежде всего крыс, с исходно высоким АД. К таким линиям относятся крысы SHR, которые были выведены по признаку высокого АД без провокативных стимулов Okamoto и Aoki (Okamoto, Aoki, 1963) в Киото, Япония.

Еще до достижения полного инбридинга, одна сублиния крыс SHR с исключительно высоким АД оказалась предрасположенной к инсультам (SHRSP). Хотя очень высокое АД является несомненным фактором развития инсультов у крыс SHRSP, вероятно, присутствуют и дополнительные генетические факторы, помимо влияющих на АД, что было показано на поколении F1 и бэккроссах из SHR и SHRSP (Nagaoka et al., 1976). Еще одна линия крыс на основе SHR – SHROB (Spontaneously Hypertensive Obese) – была получена из потомства от скрещивания самки SHR и нормотензивного самца Sprague Dawley (Koletsky et al., 2003). Эта линия характеризуется не только ожирением, но и гипертензией и нефропатией.

Соль-чувствительные (S) и соль-резистентные (R) крысы Dahl были выведены по признаку повышения их АД на фоне высокосолевой (8% NaCl) диеты. Эти крысы обозначаются как DS (Brookhaven) для соль-чувствительных и DR (Brookhaven) для соль-резистентных крыс Dahl. Крысы DS становятся гипертензивными и при нормальном, и даже при низком уровне соли, но только в возрасте нескольких месяцев. В отличие от них, крысы DR остаются нормотензивными даже при высокосолевой диете (Rapp 1982; Bashyam, 2007).

Крысы Sabra, подверженные гипертензии (SBH), и Sabra, устойчивые к гипертензии (SBN), были выведены на основе ответа АД на одностороннюю нефрэктомию, воздействие DOCA и 1% NaCl в питье (Ben-Ishay et al., 1972.).

Лионские линии крыс (Lyon) были селектированы по высокому (LH) или низкому (LL) АД, и третья линия (LN) была отобрана по нормальному давлению, без специальных провоцирующих воздействий (Dupont et al., 1973). По некоторым сообщениям, АД у крыс LL и LN было одинаковым и более низким, чем у крыс LH (Sassard et al., 1997).

На высокое и низкое давление без провоцирующих факторов селектированы миланские линии (MHS и MNS) (Bianchi et al., 1974) и новозеландские (GH) (Rapp, 2000).

В Праге проводили селекцию крыс с целью получения гипертриглицеридемической модели, которая оказалась также гипертензивной, что привело к получению Пражских гипертензивных (PHR) и Пражских нормотензивных крыс (PNR). Обе линии ведут начало от единственной пары производителей крыс Вистар и проявляют относительно мягкую гипертонию с систолическим давлением около 170 мм рт.ст. (Heller et al., 1993).

Наконец, крысы Цукера – генетическая модель ожирения – также могут развивать индуцированную диетой гипертонию. Диета с умеренно-высоким содержанием жиров, вероятно, индуцирует нарушения в продукции NO, что, в свою очередь, ведет к сользависимому росту артериального давления у этих крыс (Morrison et al, 2007).

За последнее десятилетие список генетических моделей гипертонии пополнился новыми линиями (Gross, 2009; Bader, 2010), в том числе за счет трансгенных животных. Наиболее обычные трансгенные модели гипертонии включают манипуляции с ренин-ангиотензиновой системой. И наиболее часто упоминаемые среди них – это трансгенные по мышиному ренину крысы (Gross, 2009). Крысы TGR(mREN2)27 экспрессируют мышиный ренин в экстраренальных тканях, что ведет к повышенному локальному синтезу Ang II и росту концентраций альдостерона (Mullins et al.,1990). Гетерозиготные крысы TGR(mREN2) становятся гипертензивными и проявляют все признаки гипертонического повреждения органов, такие как кардиальная гипертрофия и фиброз, а также почечные нарушения (Bhm et al., 1996). Они стали часто используемой моделью гипертонии с систолическим давлением около 240 мм рт.ст. Гомозиготные крысы TGR(mREN2)27 еще более гипертензивны, и часто погибают в возрасте 12 недель (Lee et al.,1996a). Тем не менее, они используются в качестве модели сердечной недостаточности для изучения генетической предрасположенности к этой болезни (Sharma et al., 2004). Хотя данная модель далека от человеческой гипертонии, она делает возможным анализ in vivo последствий острой, моногенной активации РАС и позволяет идентифицировать тип гипертензивных нарушений при такой активации (Dornas & Silva, 2011).

Значительно большее количество трансгенных моделей гипертонии получено на мышах.

Среди них – животные, конститутивно экспрессирующие рецептор ангиотензина АТ1А; со сверхэкспрессией Ang II в сердце, почках или других органах; мыши, нокаутные по eNOS, по отдельным типам рецепторов эндотелина, брадикинина, витамина D, Ang II, адренорецепторам, глюкокортикоидному рецептору и т.д. (Gross, 2009). Существуют дважды- и трижды-нокаутные мыши, как и животные, несущие два, три и более трансгенов. Так, гипертензивные мыши Tsukuba экспрессируют полную РАС человека. Это модель гипертонии и атеросклероза с высокими уровнями циркулирующих Ang II и альдостерона (Tordjman et al., 2007).

Сегодня существует немало линий крыс и мышей, моделирующих развитие гипертонии.

Однако ни одна из полученных на сегодняшний день линий животных не представляет всех механизмов развития данного заболевания, поскольку гипертония может иметь разную этиологию. Каждая генетическая модель соответствует какой-либо одной форме артериальной гипертонии. В результате многолетней селекции в Институте цитологии и генетики СО РАН получена линия крыс с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертонией (линия НИСАГ, или ISIAH) (Markel et al., 1999). Крысы линии НИСАГ представляют одну из наиболее удобных моделей для изучения развития гипертонической болезни под влиянием психоэмоционального стресса, который является важнейшим фактором формирования артериальной гипертонии человека.

Известно, что уровень стресса определяется как интенсивностью стимуляции (стрессора), так и чувствительностью или восприимчивостью организма к этой стимуляции, то есть фактически взаимодействием средовых и организменных, в том числе и генетических, факторов. Поэтому для создания экспериментальной модели стресс-чувствительной артериальной гипертонии проводилась работа по генетической селекции линии крыс, отличающихся повышенной чувствительностью к действию эмоциогенных стимулов, которая выражалась бы в увеличении АД (Markel, 1992). Важно отметить, что несмотря на то, что селекция велась на повышение АД при стрессе, результатом ее явилось также увеличение базального АД, которое достигло 160-170 мм рт. ст. Действие эмоционального стресса (рестрикция) приводит у крыс селекционированной линии к повышению АД еще на 35-40 мм рт. ст., в результате чего оно достигает 200 мм рт.ст. Таким образом, полученная линия крыс моделирует такое состояние, при котором имеется выраженная генетическая предрасположенность к развитию артериальной гипертонии при условии действия мягкого эмоционального стресса.

За прошедшие годы были исследованы многие физиологические и биохимические характеристики данной линии. Показано, что крысы НИСАГ характеризуются повышенной поведенческой активностью в незнакомой обстановке (тест открытого поля), что свидетельствует об их повышенной психологической возбудимости (Маркель и др., 2002).

Отмечены изменения в концентрации и скорости обмена норадреналина, дофамина (Гордиенко и др., 1993; Маркель и др., 2006) и серотонина в отделах мозга, участвующих в регуляции артериального давления и стресс-реактивности (Маркель и др., 2002). Изменены концентрации и соотношения 1-, 2- и -адренорецепторов в данных отделах мозга (Маркель, Шишкина, 1992). Внутримозговое введение фармакологических агентов, избирательно стимулирующих 1-адренорецепторы, крысам НИСАГ приводит к повышению артериального давления, в то время как у контрольных крыс такая стимуляция сопровождается его снижением (Маркель и др., 2002). У гипертензивных крыс также изменена реакция гипоталамо-гипофизарноадренокортикальной системы (ГГАС) на стимуляцию 1-адренорецепторов головного мозга (Naumenko et al., 1989). Отсюда было сделано заключение, что изменение норадренергической регуляторной системы головного мозга у крыс НИСАГ может быть ответственно как за повышение АД, так и за изменение стрессовой реактивности. С особенностями функции норадренергической системы мозга связано, вероятно, повышение симпатической нервной активности у крыс НИСАГ. Это находит выражение в увеличении концентрации адреналина в мозговом слое надпочечников и повышении активности основных ферментов его биосинтеза (Маркель и др., 2002; Маркель и др., 2006). Отмечена гиперплазия мозгового вещества надпочечников у взрослых гипертензивных животных с выраженной АГ (Бузуева и др., 2006).

Но наиболее характерные структурные изменения в надпочечниках крыс НИСАГ описаны в клубочковой зоне коры, продуцирующей минералокортикоиды (Бузуева и др., 1998; Бузуева и др., 2000). Амстиславский и др. (Amstislavsky et al., 2005) также указывают на увеличение размеров коры надпочечников. Эти гипертрофические изменения предотвращаются превентивным воздействием в препубертатный период эналаприла – ингибитора АСЕ (Бузуева, 2006) либо лозартана – блокатора рецепторов ангиотензина II (Бузуева и др., 2007), что указывает на роль РАС в развитии гипертрофии клубочковой зоны коры надпочечников у гипертензивных крыс НИСАГ. Интересно, что теразозин (-адреноблокатор), наоборот, оказал на эту зону стимулирующее влияние (Бузуева и др., 2007). Вместе с тем, введение теразозина в раннем онтогенезе снижает реакцию АД взрослых крыс на хронический стресс и оказывает протекторное действие на надпочечник гипертензивных животных, причем в большей степени на хромаффинные клетки мозгового вещества и в меньшей – на кору (Бузуева и др., 2010).

Сетчатая зона коры надпочечников у крыс НИСАГ претерпевает гипотрофические изменения (Бузуева и др., 2008) в период, предшествующий установлению высокого АД, и сопровождает развитие гипертонии у этих животных.

Позднее была исследована секреторная активность коры надпочечника у гипертензивных крыс НИСАГ в сравнении с нормотензивными крысами линии WAG.

Получено прямое подтверждение повышения этой активности у крыс линии НИСАГ, в состоянии покоя связанное в основном с усилением биосинтеза глюкокортикоидных гормонов (Антонов и др., 2010). Однако при стрессе отмечается усиленная реакция альдостерона, что позволяет сделать вывод о существенном участии альдостерона в патогенезе стрессчувствительной артериальной гипертонии (Антонов и др., 2011).

Изменения функции ГГАС у крыс НИСАГ касаются как регуляторных, так и периферических её звеньев (Маркель и др., 2002). Базальная экспрессия гена, кодирующего ключевой регуляторный пептид проопиомеланокортин (ПОМК) в гипофизе, повышена (Хворостова и др., 2001). Эта система может быстро мобилизоваться и при некоторых видах стресса, что выражается в росте уровня мРНК гена КРГ в гипоталамусе и содержания АКТГ в ткани гипофиза (Хворостова и др., 2003). Гормональный ответ на эмоциональный стресс со стороны коры надпочечников у крыс НИСАГ может значительно превышать таковой у нормотензивных крыс: уровень кортикостерона у животных гипертензивной линии превышает таковой у контрольных крыс WAG, уже начиная с 5-й минуты воздействия (Хворостова и др., 2002; Хворостова и др., 2003).

Со стороны сердечнососудистой системы у крыс НИСАГ были отмечены типичные для гипертонической болезни изменения: гипертрофия миокарда левого желудочка, характерные изменения сосудов (Шмерлинг и др., 1996; Коростышевская и др., 2001). Нарушения функции сердца были зафиксированы на ЭКГ (Маханова и др., 1997). Крысы линии НИСАГ склонны к возникновению инфарктов миокарда, которые легко могут быть спровоцированы инъекцией адреналина (Якобсон и др., 1995).

В работе Антонова и др. (Антонов и др., 2009) проведен анализ содержания альдостерона и глюкокортикоидов при экспериментальном инфаркте миокарда (ЭИМ). В остром периоде ЭИМ у крыс НИСАГ наблюдается резкое увеличение не кортикостерона, как это должно быть при выраженном стрессе, а альдостерона. Авторы считают это фактором экстракардиальной компенсации сердечной недостаточности, более выраженной у гипертензивных крыс. При выраженном кардионекрозе происходит первоначальный сдвиг стероидогенеза в сторону синтеза альдостерона, а не глюкокортикоидов, за счет активации ренин-ангиотензин-альдостероновой системы (РАС).

У крыс НИСАГ найдены также биохимические изменения на уровне клеточных мембран и связанные с этим нарушения транспортных функций: снижение активности фермента – почечной Na,K-АТФазы, регулирующего транспорт ионов Na+ и К+, и изменения электролитного состава тканей и плазмы крови, что также характерно для гипертонической болезни (Лопина и др., 1991).

Анализ экспрессии генов методом ПЦР (Amstislavsky et al., 2005) показал ее снижение в почках взрослых крыс для генов NO-синтазы 1-го типа, циклооксигеназы СОХ-2 и ренина, в то время как экспрессия тубулярных генных продуктов, связанных с транспортом натрия, была повышена. Эти данные указывают на тенденцию к сохранению повышенного объема плазмы почкой.

Множественность отмеченных изменений вовсе не означает, что за каждым из них стоит свой генетический дефект (мутация). Многие изменения являются вторичными и возникают вследствие формирования патологического процесса, наподобие цепной реакции, некоторые же являются следствием повышения АД, например, гипертрофия левого желудочка, которая помогает сердцу преодолевать повышенное давление крови в аорте. В связи с этим, поиск первичных причин или генов, детерминирующих развитие артериальной гипертонии, представляет сложную задачу. Однако сочетание методов классической генетики с использованием экспериментальных моделей животных и современных молекулярногенетических подходов позволяет выявлять генетические факторы, отвечающие за возникновение и развитие разных форм гипертонической болезни (Lapteva et al., 1998;

Кривенко и др., 1998; Редина и др., 2009).

Одним из подходов, использованных для идентификации генов, ответственных за стресс-зависимую артериальную гипертонию, было исследование генов, которые заведомо могут участвовать в регуляции артериального давления (“гены-кандидаты”) (Редина и др., 2003). С этой целью на популяции гибридов, полученных от скрещиваний гипер- и нормотензивных крыс (НИСАГ и WAG), исследовали полиморфизм микросателлитных последовательностей ДНК, маркирующих определенные участки генома. Исследован полиморфизм маркеров, локализованных в различных хромосомах крысы. В частности, сегрегационный анализ показал, что величина прироста АД при стрессе у молодых (3 мес) крыс ассоциирована с полиморфизмом района, включающего ген рецептора фактора роста нервов (Ngfr, 10-я хромосома). Известно, что этот фактор может играть существенную роль в онтогенетическом развитии норадренергических нервных структур, принимающих участие в регуляции АД. Кроме того, указанный район включает большое число генов, кодирующих регуляторные белки: цитокины, STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription), SOCS (Suppressor Of Cytokine Signaling), орексин и некоторые другие. Интересно, что по мере взросления крыс в патогенез гипертонической болезни включается уже другой генетический локус, где расположен ген, кодирующий субъединицу фермента Na,K-АТФазы, участвующей в регуляции водно-солевого баланса. Полиморфизм по этому локусу оказался связанным с уровнем АД у взрослых крыс. При этом влияние отличий по локусу гена Ngfr ослабевает.

Наблюдается своеобразная “эстафета” генетико-физиологических механизмов в процессе формирования патологии (Редина и др., 2003).

Созданная в ИЦиГ СО РАН новая модель артериальной гипертонии – крысы линии НИСАГ – даёт возможность интенсивного исследования этиологии и патогенеза, а также методов профилактики и лечения стресс-чувствительной формы гипертонической болезни, которая развивается при взаимодействии таких факторов как генетическая предрасположенность и эмоциональный стресс.

1.1.4. Стресс как фактор, провоцирующий развитие артериальной гипертонии Стресс, с одной стороны, – это важная адаптивная функция, которая ведет к повышению вероятности выживания, приспосабливая к чрезвычайным и опасным ситуациям. С другой стороны, стресс может быть крайне вреден, будучи избыточным (Селье, 1982). В частности, индивидуум, неспособный справиться со стрессом, подвержен множеству заболеваний. Тем не менее, когда ГГАС, симпатоадреналовая и центральная катехоламинергическая системы активируются многократно в течение долгого периода времени, ответ становится не только адаптивным, но также и дезадаптивным (Chrousos & Gold, 1992; McEwen, 1998). Длительный стресс повышает аллостерическую нагрузку (McEwen & Stellar, 1993; Seeman et al., 1997) и дает основной вклад в развитие сердечно-сосудистых нарушений и психических болезней. Стресс также повышает восприимчивость организма к инфекциям, аутоиммунным заболеваниям, синдрому хронического ожирения и раку. Более того, стресс может влиять на развитие хронических заболеваний. Например, стресс неблагоприятно действует на поддержание надлежащего уровня глюкозы в крови при диабете. Предполагается, что около двух третей заболеваний либо являются стресс-индуцированными, либо связаны со стрессом (Sabban, 2007).

Современные концепции рассматривают стресс как осознанно или неосознанно ощущаемую угрозу гомеостазу (McEwen & Stellar, 1993; Goldstein & McEwen, 2002), при которой ответ имеет степень специфичности, зависящую, среди прочего, от специфических (особых) проблем для гомеостаза, от восприятия стрессора организмом, и от осознанной способности бороться с ним (Goldstein & Kopin, 2007). Стресс определяется как условие, когда ожидания, генетически ли программируемые, установленные предыдущим обучением или выведенные из обстоятельств, не соответствуют текущим или предполагаемым восприятиям внутренней или внешней среды, и это расхождение между наблюдаемым или ощущаемым, с одной стороны, и ожидаемым или запрограммированным, с другой, приводит к соответствующим определенному образцу ответам (Goldstein & Kopin, 2007) 1.2.1. Симпатоадреналовая система и контроль артериального давления Артериальное давление меняется существенно в связи с поведением, но среднее за сутки АД точно и тонко регулируется. Сосудистое сопротивление и сердечный выброс (cardiac output) – две переменные, которые контролируются автономной нервной системой, и именно их производной является АД. Гипертония – это, по определению, хроническое повышение среднесуточного давления, и болезнь многими авторами трактуется как нейрогенная, поскольку это нарушение автономной нервной системы, а не первичный сосудистый или почечный дефект (Guyenet, 2006). Это нарушение может происходить из афферентного плеча системы (например, барорецепторов, хеморецепторов и почечных афферентов) или из ее центрального сегмента.

Баросенситивные симпатические эфференты находятся под контролем артериальных барорецепторов. Эта группа эфферентов играет доминирующую роль как в кратковременной, так и в долговременной регуляции АД. Уровень их активности в покое – наиболее критичный параметр для долговременного контроля. Эта фоновая активность устанавливается основной сетью нейронов, расположенных в ростральной вентро-латеральной медулле (RVLM), спинном мозге, гипоталамусе и ядре одиночного пути (NTS) (Guyenet, 2006). Три центральных области контроля — RVLM, NTS и гипоталамус — регулируют барочувствительные симпатические эфференты, а следовательно, и АД. Лимбические, кортикальные и структуры среднего мозга отвечают за быстрые изменения симпатического тонуса, связанные с поведением. Принято считать, что эти изменения не ассоциированы с долгосрочной регуляцией АД, возможно, за исключением обусловленной стрессом гипертонии.

Многие изменения в мозге (включая хирургическое повреждение, сверхэкспресссию NO-синтазы и специфическую для мозга экспрессию различных компонентов РАС) приводят к долговременным изменениям АД, демонстрируя, что ЦНС в норме дает вклад в долговременную регуляцию АД (Guyenet, 2006). Тот факт, что почечная денервация или специфические повреждения мозга снижают или предотвращают развитие гипертонии (DiBona & Kopp, 1997; Jacob et al., 2005), также показывает, что ЦНС через иннервацию почки участвует в гипертоническом процессе. Тем не менее, точная роль ЦНС в долговременном контроле АД еще не до конца понята.

Повышенная симпатическая нервная активность (СНА) присутствует в большинстве форм гипертонии человека (Schlaich et al., 2004), и причинная связь подтверждается хорошо задокументированной антигипертензивной эффективностью симпатолитических лекарств (например, антагонистов адренорецепторов). Тем не менее, повышенная СНА не может быть единственным механизмом, участвующим в нейрогенной гипертонии, и как подъем СНА повышает среднесуточное АД, не установлено. Наиболее часто предполагаемый механизм – это переустановка почечной АД-натрийуретической связи до более высоких уровней АД либо путем роста симпатического тонуса в почке, либо посредством гормонов, продукция которых отчасти контролируется автономной нервной системой (например, Ang II). Рассматриваются и нарушения в нейральном контроле сердца и кровеносных сосудов (Guyton, 1991; DiBona & Kopp, 1997; Guyenet, 2006).

1.2.2. Ренин-ангиотензин-альдостероновая система (РАС): ее роль в регуляции АД и Учитывая ведущую роль РАС в долгосрочной регуляции АД и объема жидкости, а также в качестве мишени при лечении гипертонии, достаточно привычно рассматривать компоненты РАС как гены-кандидаты при гипертонической болезни. В условиях сниженного почечного перфузионного давления, потери соли или объема жидкости, либо при симпатической активации, ренин выбрасывается из юкстагломерулярных (ЮГ) клеток в почках (Рис. 1.2). Он расщепляет неактивный пептид ангиотензиноген (Agt), синтезируемый в печени, до ангиотензина I, который превращается в Ang II конвертирующим ферментом (АСЕ). Ang II связывается со своими специфическими рецепторами на клетках гладкой мускулатуры сосудов, вызывая вазоконстрикцию, и в клубочковой зоне надпочечников, индуцируя секрецию альдостерона. Вазоконстрикция и опосредованная альдостероном реабсорбция натрия противодействуют начальному падению почечного перфузионного давления.

Ангиотензинпревращающий Рис. 1.2. Классические представления о ренин-ангиотензиновой системе.

1.2.2.1. Регуляция циркулирующей РАС – классические пути В классической РАС Ang II образуется и действует системно (Рис. 1.2). Ренин попадает в плазму в первую очередь из ЮГ клеток на афферентных артериолах почек (Carey & Siragy, 2003a; Schnermann et al., 1997). Хотя циркулирующий активный ренин и проренин высвобождаются в основном из почек, другие ткани также секретируют проренин в циркуляционное русло, и проренин может конвертироваться в ренин ограниченным протеолизом, таким как трипсиновая активация в циркуляции (Sealey et al., 1986). Agt первично образуется и конститутивно секретируется клетками печени в циркуляцию, делая возможным системное образование Ang II по всему циркуляционному руслу (Brasier & Li, 1996). В классическом представлении о РАС ренин не является сигнальной молекулой; он расщепляет Agt, единственный известный белок-предшественник ангиотензиновых (Ang) пептидов, образуя декапептид Ang I. Ang-превращающий фермент (ACE) гидролизует неактивный Ang I в биологически активный Ang II (Soubrier et al., 1993). В отличие от ренина и Agt, которые имеют относительно долгое время полужизни в плазме, Ang II расщепляется за секунды пептидазами, называемыми ангиотензиназами, по различным аминокислотным сайтам, образуя фрагменты, в основном дез-аспартил-Ang II (Ang III), Ang (1–7) и Ang (3–8).

Подавляющее большинство сердечно-сосудистых, почечных и надпочечниковых эффектов Ang II опосредуется рецепторами 1-го типа (AT1), которые широко распространены в этих тканях, позитивно сопряжены с протеин-киназой С (РКС) и негативно – с аденилат-циклазой (De Gasparo et al., 2000). Рецепторы АТ1 опосредуют сокращение гладких мускулов сосудов, секрецию альдостерона, дипсогенный ответ, почечную реабсорбцию натрия, прессорные и тахикардиальные ответы. Ang II также связывается с другим рецептором, 2-го типа (AT2). Еще до недавнего времени клеточные сигнальные механизмы и функции АТ2 были неизвестны (De Gasparo et al., 2000).

У человека и крысы ренин кодируется единственным геном, и рениновая мРНК в ЮГ клетках почечных афферентных артериол транслируется с образованием проренина, состоящего из 401 аминокислотного остатка (Carey & Siragy, 2003a). В эндоплазматическом ретикулюме ЮГ клеток 20-звенный сигнальный пептид отрезается от проренина, который упаковывается в секреторные гранулы в аппарате Гольджи, где происходит дальнейший процессинг в активный ренин путем отделения 46-звенного пептида от N-конца молекулы.

Зрелый, активный ренин – это гликозилированная карбоксипептидаза (аспартил-протеаза) с молекулярной массой около 44 kDa. Активный ренин секретируется из ЮГ клеток в процессе экзоцитоза. Неактивный проренин секретируется конститутивно через клеточную мембрану.

Проренин превращается в активный ренин при помощи трипсин-подобного активирующего фермента (Hsueh & Baxter, 1991).

Большинство видов имеют только один рениновый ген (Ren-1c), хотя некоторые виды мышей имеют два рениновых гена (Ren-1d и Ren-2 гены). Как проренин, так и ангиотензиноген экспрессируются в разных тканях, хотя ренин-продуцирующие клетки в почках – главные сайты конверсии проренина в активный ренин (Campbell, 2003).

У взрослых нестрессированных животных ренин синтезируется и секретируется почечными ЮГ клетками. Однако при нарушении гомеостаза число клеток, которые экспрессируют и секретируют ренин, возрастает и распространяется за пределы ЮГ области;

результатом этого становится увеличение циркулирующего ренина и переустановка гомеостаза.

Рост числа рениновых клеток, процесс, называемый «рекрутированием» (recruitment), достигается де-дифференцировкой и ре-экспрессией ренина в клетках, происходящих из рениновой линии. Многие работы указывают на cAMP как на центральный и обычный фактор регуляции ренинового фенотипа клеток (Lopez & Gomez, 2010) не только во время физиологического состояния, но в феномене рекрутирования (Friis et al., 2002; Morris et al., 2004; Sinn et al., 1999). cAMP вовлечен в три главных механизма контроля синтеза и секреции ренина: почечного 1-адренорецептора (через почечные симпатические нервы и стимуляцию циркулирующих катехоламинов), внутрипочечного барорецептора и механизма macula densa (Lopez & Gomez, 2010).

Повышенное артериальное давление, Ang II и цитокины могут по принципу обратной связи приводить к ингибированию экспрессии гена ренина посредством NFB-независимого механизма, включающего рениновый энхансер и ингибирование транскрипции, опосредованной cAMP-отвечающим элементом (cAMP–response element, CRE) (Itani et al., 2009).

Ang II может стимулировать продукцию цитокинов в различных типах клеток, и цитокины числятся среди ингибиторных сигналов, регулирующих транскрипцию ренина (Hoch et al., 2009; Todorov et al., 2004; Liu et al., 2006). Цитокины – мощные модуляторы экспрессии ренина (см. обзор Pan & Gross, 2005).

Аgt – единственный предшественник ангиотензиновых пептидов и кодируется единственным геном. Agt, синтезируемый в печени, обеспечивает большую часть системно циркулирующих Ang-пептидов, но также синтезируется и конститутивно секретируется в других тканях, включая мозг, сердце, сосуды, почки и жировую ткань. Этот гликопротеин содержит последовательность ангиотензина на своем N-конце. Agt – это альфа-2-глобулин и субстрат для ренина. Он член семейства ингибиторов сериновых протеаз, или серпинов, хотя и неизвестно, чтобы Agt взаимодействовал с каким либо еще ферментом помимо ренина (Doolittle et al., 1983; Cuadra et al., 2010). Поскольку Agt – член семейства серпинов, это приводит к мнению, что как Agt, так и дез-(Ang I)-ангиотензиноген ингибируют ангиогенез (Celerier et al., 2002).

Исследования с ингибиторами ренина показали главную роль ренина в генерации циркулирующих ангиотензиновых пептидов, хотя и другие ферменты могут играть роль в тканях, особенно в очагах воспаления. Секретированный ренин в циркуляционом русле разрезает Agt с N-конца, образуя декапептид Ang I (Navar et al., 1997). Концентрация Agt в циркуляции высока, более чем в 1000 раз превышая концентрации в плазме Ang I и Ang II (Navar & Nishiyama, 2001). Хотя существуют некоторые видовые вариации, изменения в активности ренина таким образом определяют скорость образования Ang I в плазме из огромных запасов циркулирующего Agt (Ichihara et al., 2004; Paul et al., 2006): у крыс концентрации Agt в плазме измеряются в наномолях на литр; концентрации Ang I и Ang II выражаются в пикомолях на литр, указывая на то, что концентрация активного Ang II в плазме – лишь малая фракция доступного Ang II в форме Agt. Таким образом, даже относительно малые изменения в скоростях образования Ang I и Ang II могут приводить к большим абсолютным различиям в циркулирующих концентрациях (Kobori et al., 2007). Ренин синтезируется и сохраняется в существенных количествах в гранулах ЮГ клеток и секретируется в ответ на различные стимулы (Schweda & Kurtz, 2004; Paul et al., 2006; Kobori et al., 2007). Поэтому заметные изменения в уровнях ренина плазмы могут происходить быстро, приводя к изменениям в образовании Ang I. Концентрации Agt в плазме близки к константе Михаэлиса для протеолитической активности ренина, так что изменения в концентрациях субстрата также могут влиять на скорость образования Ang I; тем не менее, изменения в синтезе Agt происходят медленно, и поэтому в меньшей степени отвечают за динамическую регуляцию Ang I и Ang II в плазме, чем ренин (Deschepper, 1994; Brasier & Li, 1996; Kobori et al., 2007).

1.2.2.2.3. Ангиотензин-превращающий фермент (АСЕ) Действие АСЕ можно рассматривать как стадию активации в каталитическом каскаде формирования Ang II из Ang I. Хотя доступны свидетельства иных путей для биосинтеза Ang II (Sadjadi et al., 2005; Tokuyama et al., 2002), ACE, вероятно, представляет главный, если не единственный фермент, отвечающий за образование Ang II при нормальных физиологических условиях у человека и других видов. Трудно представить, что АСЕ не имеет иных субстратов чем Ang I, но первичная роль АСЕ – это производство Ang II. Несомненно, идентификация АСЕ и характеризация его ферментативных свойств должны рассматриваться как важное достижение в нашем понимании РАС и сердечно-сосудистых заболеваний, поскольку они ведут к успешной разработке ингибиторов АСЕ в лечении гипертонии и почечной болезни (Chappell, 2007). ACE – это дипептидил-карбоксипептидаза, мономерный гликопротеин с молекулярной массой в 180 kDa. Фермент отрезает два остатка от карбоксильного конца различных пептидов.

ACE существует в двух формах: растворимой и связанной с мембранами. Большая часть АСЕ связана с мембраной и локализована на плазматических мембранах разных клеточных типов, включая сосудистые эндотелиальные клетки, клетки эпителия почечных проксимальных трубочек и нейроэпителиальные клетки.

Ang I легко превращается в Ang II благодаря не только циркулирующей АСЕ, но также присутствию АСЕ в эндотелиальных клетках сосудистого русла, включая легкие (Navar et al., 1997; Ichihara et al., 2004; Paul et al., 2006). Хотя другие пути формирования Ang II были идентифицированы в некоторых тканях, циркуляционные уровни Ang II отражают преимущественно следствие действия энзиматического каскада ренина – АСЕ на Agt (Erds, 1990; Johnston, 1994; Kobori et al., 2007). Результирующий рост Ang II плазмы приводит к заметным действиям во всем организме через активацию рецепторов (Timmermans et al., 1993;

Paul et al., 2006).

АСЕ участвует в метаболизме многих пептидных гормонов (Skidgel & Erdos, 2004). В случае Ang (1–7), ACE метаболизирует пептид до Ang (1–5), функционально неактивного продукта (Chappell et al., 1998a; Deddish et al., 1998; Rice et al., 2004). АСЕ может также участвовать в метаболизме других пептидов, включая кинины, вещество Р и гематопоэтический фрагмент acetyl-Ser-Asp-Lys-Pro (Ac-SDKP). Так, ACE инактивирует два вазодилятаторных пептида, брадикинин (ВК) и каллидин (Linz et al., 1995). В общих чертах, ВК – мощный вазодилятатор и ингибитор клеточного роста, проявляющий натрийуретические свойства в почках (Scicli & Carretero, 1986). ВК расслабляет кровеносные сосуды путем стимуляции NO и cGMP, а также высвобождением вазодилятаторных простаноидов, простагландина Е2 и простациклина (Carey & Siragy, 2003a, Linz et al., 1995). ВК (1–9) очень быстро метаболизируется АСЕ в двуступенчатом процессе до неактивных фрагментов ВК (1–7) и ВК (1–5). АСЕ, таким образом, повышает продукцию потенциального вазоконстриктора Ang II, в то же время деградируя вазодилятатор ВК, NO и вазодилятаторные эйкозаноиды – физиологические антагонисты Ang II. Таким образом, когда используют ингибитор АСЕ (ACEI) для лечения гипертонии, не только ингибируется синтез Ang II, но также проявляется эффект роста содержания BK, NO и простагландинов (Carey & Siragy, 2003a). Ингибирование АСЕ ассоциировано с повышением циркуляционных и тканевых уровней ВК (1–9), и его почечное содержание выше в тканях мышей – нокаутов по АСЕ (Campbell et al., 2004).

Cообщалось, что функциональная активность Ang (1–7), при определенных условиях, зависит от повышенной секреции ВК (Fernandes et al., 2001). Более того, антагонист его рецептора В2, HOE140, блокирует выброс NO непептидным агонистом Ang (1–7), AVE0991 (Wiemer et al., 2002). Аналогично Ang (1–7), циркуляционные уровни Ac-SDKP заметно возрастают при ингибировании АСЕ, и фермент разрезает связь Lys-Pro тетрапептида (Azizi et al., 1997;

Raousseau et al., 1995). Хотя в настоящее время нет доказательств роли Ac-SDKP в регуляции АД, пептид проявляет мощные антифибротические и противовоспалительные свойства (Chappell, 2007).

Ингибиторы АСЕ могут индуцировать клетко-специфичные сигналы, вызывая конформационные изменения в связанном с мембраной АСЕ (Benzing et al., 1999). Две киназы, c-Jun киназа и MAP-киназа-киназа 7, ассоциированы с внутриклеточной частью АСЕ, и ингибиторы АСЕ повышают фосфорилирование и ядерный перенос фосфорилированной c-Jun киназы (Kohlstedt et al., 2002). Кроме того, ингибиторы АСЕ или пептиды Ang (1–9) и Ang (1–7) индуцируют ассоциацию АСЕ и рецептора В2, что предотвращает быстрое снижение содержания комплекса лиганд-рецептор, тем самым потенциируя действие брадикинина (Burckle et al., 2006; Chen et al., 2005).

Традиционно Ang II рассматривается как главный биоактивный эффектор РАСиндуцированных гемодинамических и воспалительных изменений в различных органах, включая сердце, почки, мозг и сосуды (Burnier & Brunner, 2000; Brown & Vaughan, 2000).

Циркулирующий или локально продуцируемый Ang II опосредует стимуляцию синтеза внеклеточного матрикса, гипертрофию, индукцию хемокинов, генерацию активных форм кислорода, апоптоз и пролиферацию клеток гладкой мускулатуры сосудов (VSMC), сопровождаемые ингибированием генерации NO (Рис. 1.3) (Burnier & Brunner, 2000; Ruster & Wolf, 2006). Тем не менее, копятся доказательства того, что и альдостерон per se, помимо его влияния на почечный уровень натрия, является важным медиатором кардиоваскулярных и почечных повреждений (Рис. 1.3) (Epstein et al., 2006; Williams & Williams, 2003).

Для Ang II есть два главных рецептора, рецепторы 1 типа (AT1) и 2 типа (AT2), принадлежащие к классу 7-трансмембранных, сопряженных с G-белком рецепторов (GPCR).

Мыши и крысы, но не человек, имеют две формы рецептора АТ1, обозначаемые как AT1A и AT1B, со сходными свойствами.

Канонические биологические действия Ang II производятся в первую очередь через рецепторы AT1 и AT2 (Fyhrquist & Saijonmaa, 2008). У человека большая часть биологических функций Ang II опосредована рецепторами АТ1, которые повсеместно экспрессируются в сосудах, почках (ЮГ и мезангиальные клетки) и сердце. Рецепторы АТ1 отвечают за сокращения гладкой мускулатуры сосудов, секрецию альдостерона, почечную реабсорбцию натрия, прессорный, дипсогенный и тахикардиальный ответы (Carey & Siragy, 2003a).

Стимуляция рецептора АТ1 активирует фосфолипазы A2, C, D, приводя к росту содержания внеклеточного Ca2+ и ингибированию аденилатциклазы (De Gasparo et al., 2000;

Thomas, 1999). Рецепторы AT1 также активируют внутриклеточные сигнальные пути, традиционно связанные с рецепторами факторов роста и цитокинов (т.е. стимуляцию тирозинкиназной активности, фосфорилирование тирозина и активацию сигнальных путей фосфолипазы C-1, МАР-киназы и JAK-STAT), и недавние исследования подтвердили, что эти действия могут быть опосредованы отчасти взаимодействием между АТ1 и рецепторами эпидермального фактора роста (EGF) (Thomas et al., 2002; Kagiyama et al., 2002).

Рис. 1.3. Эффекты Ang II (А) и альдостерона (В) (по Abassi et al., 2009, с модификациями).

Функции рецептора АТ2 до наступления последней декады были во многом неясны, но предполагалось, что они во многом противоположны функциям АТ1. Большой прогресс в их понимании достигнут в последние годы, что позволяет отнести достаточно давно известный рецептор АТ2 к так называемым «новым» членам РАС (см. ниже). Активация рецептора АТ ведет к возрастанию уровней оксида азота (NO) и ВК, и тем самым – к повышению концентрации cGMP и вазодилятации (Fyhrquist & Saijonmaa, 2008).

Была показана гетеродимеризация рецепторов АТ1 и АТ2 на фетальных фибробластах и образцах миометриальных биопсий от беременных и небеременных женщин (AbdAlla et al., 2001b). Рецептор АТ2 связывается напрямую с рецептором АТ1, тем самым противодействуя сигнальным путям и функциям рецептора АТ1. Результаты этих исследований согласуются с концепцией, что рецептор АТ2 стабилизирует структурно рецептор АТ1 таким образом, что тот больше не подвергается требуемым конформационным изменениям, чтобы активировать Gбелки (AbdAlla et al., 2001a). По-видимому, рецептор АТ2 может быть прямым и специфическим антагонистом рецептора АТ1 в процессе, независимом от активации и сигнальных путей АТ2 (AbdAlla et al., 2001b).

биосинтетические пути, добавив не только сложности, но и возможностей для понимания функций РАС как в норме, так и при патологии (Рис. 1.4). В частности, в дополнение к Ang II, был идентифицирован широкий спектр биоактивных ангиотензиновых пептидов, таких как гептапептид ангиотензин III (Ang III), гексапептид ангиотензин IV (Ang IV) и ангиотензин (1–7) [Ang (1–7)] (Haulica et al., 2005; Carey & Siragy, 2003a). Последний синтезируется с помощью АСЕ2, нового члена РАС и гомолога АСЕ, нечувствительного к ингибиторам АСЕ (ACEi) (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000). По меньшей мере 4 рецептора взаимодействуют с этими ангиотензиновыми пептидами: AT1, AT2, AT4 и Mas (Santos et al., 2003; Moeller et al., уравновешивающий действия Ang II в сердце, кровеносных сосудах и почках, возможно, через свой собственный рецептор. Пептид Ang (1–7) связывается с рецепторами Mas, которые опосредуют вазодилятацию и антипролиферативные функции, вероятно, через NO-зависимый механизм (Fyhrquist & Saijonmaa, 2008; Santos et al., 2008). Биология Ang IV пока изучена слабо (Fyhrquist & Saijonmaa, 2008).

Ренин, который прежде считался только ферментом, может быть прямым клеточным медиатором со своим собственным рецептором. Оказалось, что рецептор АТ2 также уравновешивает действие Ang II через рецептор АТ1 и содействует по меньшей мере некоторым из полезных эффектов блокады рецептора АТ1 при помощи опосредованной АТ продукции BK, NO и cGMP. Наконец, прямое физическое взаимодействие рецептора АТ1 с другими рецепторами на клеточной мембране может приводить к активации или ингибированию функций АТ1 (Carey & Siragy, 2003a).

Рис. 1.4. Обновленные представления о РАС (по Carey & Siragy, 2003a, с модификациями).

Интересно, что спектр новых пептидов РАС продолжает расширяться, показывая, что пептид, содержащий на две аминокислоты больше чем Ang I, додекапептид ангиотензин (1–12) [ProAng-12, или Ang (1–12); у крысы: Asp1-Arg2-Val3-Tyr4-Ile5-His6-Pro7-Phe8-His9-Leu10Leu11-Tyr12], также может быть ключевым игроком в регуляции сердечно-сосудистых функций (Nagata et al., 2006b; Varagic et al., 2008). Додекапептид продуцирует прессорные ответы как в изолированной аорте крысы, так и, причем острые, у интактных крыс Wistar – явление, которое подавляется при совместном воздействии ингибитора АСЕ и блокатора рецептора АТ1 (ARB).

Недавняя идентификация Ang (1–12) в некоторых органах и тканях крысы (Nagata et al., 2006b) поддерживает идею о том, что выражение «ренин-ангиотензиновый каскад» следовало бы заменить на «ангиотензиноген-ангиотензиновый каскад», чтобы отразить факт, что Ang II может быть получен с участием и/или без участия ренина. Химаза может превращать пептид Ang (1–12) в Ang II без участия ренина (Prosser et al., 2009). Этот фермент экспрессируется в клетках мышечной ткани, и его содержание повышается во время терапии ингибиторами АСЕ (Dell’Italia & Husain, 2002). Chappell и сотр. (Chappell et al., 2007) нашли, что в сыворотке Ang II образуется исключительно из Ang (1–12) с помощью ACE, а почечная активность неприлизина превращает Ang (1–12) в Ang (1–7). Оба этих пути не зависят от рениновой активности. Более того, показано (Trask et al., 2008), что Ang (1–12) может метаболизироваться в Ang I, Ang II и Ang (1–7) в изолированных сердцах из пяти различных нормотензивных и гипертензивных линий крыс. Взятые вместе, эти данные обеспечивают убедительное доказательство того, что Ang (1–12) может быть альтернативным предшествующим субстратом для образования биоактивных ангиотензиновых пептидов в сердце, почках и циркуляции, что может зависеть от локализации одного из действующих на него ферментов, АСЕ, но не ренина.

Рецептор АТ2. Как было упомянуто выше, вторым важным (и клонированным) рецептором Ang II является рецептор АТ2. АT2 – это рецептор класса GPCR, состоящий из аминокислотных остатков. Он имеет некоторую (34%) гомологию аминокислотной последовательности с рецептором АТ1 (Mukoyama et al., 1993).

Из обзора в обзор повторяется фраза о том, что «рецептор АТ2 высоко экспрессируется в фетальных мезенхимальных тканях как грызунов, так и человека; однако в течение нескольких дней после рождения экспрессия рецептора АТ2 быстро падает до очень низких уровней».

Тщательный литературный поиск указывает на то, что данное утверждение основывается на нескольких работах 1991 года (см. у Gallinat et al., 2000) и с тех пор кочует по большинству обзорных работ, посвященных экспрессии генов РАС и рецепторов Ang II, в частности.

Недавние исследования (Gao, Zucker, 2011) выявили различные профили изменения содержания рецепторов ангиотензина у крыс и мышей во время развития, что противоречит взглядам, упомянутым выше. Используя Вестерн-блот-анализ, исследователи убедительно показали, что в стволе мозга, печени и почках взрослых крыс и мышей наблюдаются уровни экспрессии белка, значительно большие для АТ2, но намного меньшие для АТ1, по сравнению с эмбрионами или новорожденными животными (Yu et al., 2010). Был показан постепенный рост экспрессии АТ2 в стволе мозга в процессе созревания от плода до взрослого животного.

авторадиографических данных не до конца ясна. Авторадиография – это классический метод определения связывания рецептора и лиганда, который является высокочувствительным, но его точность сильно зависит от специфичности используемых агонистов или антагонистов. В упомянутых исследованиях (Millan et al., 1991; Cook et al., 1991) изучали связывание на уровне целого животного, а не избранных областей мозга. Более того, эти результаты основывались в первую очередь на изменениях в связывании в ответ на антагонисты АТ1 или АТ2, в то время как в работе Yu и др. (2010) использовали специфические антитела для оценки экспрессии белка в различных областях мозга.

Так или иначе, но белок рецептора ясно определяется Вестерн-блотом в зрелых почках, сердце и кровеносных сосудах. В почке взрослых рецептор АТ2 экспрессируется в клубочковых эпителиальных клетках, кортикальных канальцах и интерстициальных клетках (Ozono et al., 1997). В сердце рецептор локализуется в предсердии и вентрикулярном миокарде и в клетках гладкой мускулатуры коронарных артерий (Wang et al., 1998b). В человеческом сердце рецептор АТ2 доминирует над рецептором АТ1 (Carey & Siragy, 2003a). По-видимому, следовало бы говорить не о снижении, а скорее о перераспределении рецептора АТ2 в тканях в процессе взросления, поскольку заметные количества его выявляются у взрослых животных также в медулле надпочечников и многих структурах мозга (Lenkei et al., 1996). Экспрессия рецептора АТ2 активируется снижением соли и ингибируется Ang II и такими факторами роста как фактор тромбоцитного происхождения и эпидермальный ростовой (Ozono et al., 1997; Ichiki et al., 1995a). АТ2 также активируется инсулином и IGF-I (Carey & Siragy, 2003b).

Клеточные сигнальные пути, участвующие в активации рецептора АТ2, не до конца ясны, но, вероятно, включают G-белок-зависимые и -независимые пути (Berry et al., 2001).

Cтимуляция рецептора АТ2 активирует фосфотирозиновые фосфатазы, особенно серин/треонин-фосфатазу 2А, протеинкиназа-фосфатазу и SHP-1-тирозин-фосфатазу, приводя к инактивации МАРК, особенно p42 и p44 MAPK (ERKs) (Horiuchi et al., 1999). Существуют также свидетельства, что рецептор АТ2 активирует фосфолипазу А2 и генерацию простагландинов и стимулирует продукцию церамидов (De Gasparo et al., 2000; Berry et al., 2001). В отличие от АТ1, рецептор АТ2 не интернализуется в ответ на связывание агониста, подтверждая, что может оставаться доступным на плазматической мембране без десенситизации для долгосрочных биологических ответов (Csikos et al., 1998).

Рецептор АТ2 определяет, по крайней мере частично, некоторые из полезных эффектов блокады АТ1 в кровеносных сосудах, сердце и почках (Carey et al., 2000). Например, гипотензивное действие блокады АТ1 лозартаном полностью блокируется ингибированием рецептора АТ2 у крыс с реноваскулярной гипертонией. Также рецептор АТ2 определяет гипотензивный ответ на блокаду АТ1 вальсартаном у нормальных крыс с ограничением соли в диете. Блокада рецептора АТ1 повышает почечное содержание BK, NO и cGMP, и эти ответы исчезают при конкурентной блокаде рецептора АТ2 (Carey & Siragy, 2003a). Гипотензивный ответ на блокаду АТ1 также полностью блокируется подавлением либо рецептора В2, либо NOсинтазы (Carey & Siragy, 2003a). В сердце протективные эффекты антагонистов рецептора АТ во время острой сердечной недостаточности или инфаркта миокарда по меньшей мере частично опосредуются рецептором АТ2 (Xu et al., 2002). Когда рецептор АТ1 блокирован в почке, петля отрицательной обратной связи, по которой АТ1 ингибирует секрецию ренина из ЮГ клеток, подавляется, приводя к повышению секреции ренина и уровня Ang II (Carey & Siragy, 2003a).

Если рецептор АТ1 блокирован, Ang II может связываться только с неблокированным рецептором АТ2. Эти характеристики блокады рецептора АТ1 могут отвечать за параллельный рост стимуляции рецептора АТ2 и, тем самым, за наблюдаемые полезные эффекты. Все вместе взятые, имеющиеся наблюдения подтверждают концепцию, что активация АТ2 определяет по крайней мере некоторые полезные эфффекты блокады АТ1 через сигнальные пути BK/NO/cGMP. Во многих случаях экспериментальные свидетельства доказывают, что рецептор АТ2 проявляет протективные свойства только при блокаде рецептора АТ1. Эта парадигма открывает возможности для потенциальных синергичных терапевтических эффектов агонистов рецептора АТ2 в сочетании с блокаторами АТ1.

Ангиотензин превращающий фермент 2. Почти через 50 лет после открытия АСЕ новый гомолог этого фермента под названием АСЕ2 был идентифицирован двумя отдельными группами (Donoghue et al., 2000; Tipnis et al., 2000). Активность АСЕ2 не снижается ингибиторами АСЕ, и фермент не проявляет тех же каталитических свойств. АСЕ2 содержит единственный цинк-зависимый каталитический центр, который соответствует Стерминальному домену соматического АСЕ. АСЕ2 – это цинк-содержащая металлопротеаза, состоящая из 805 аминокислотных остатков со значительной гомологией с АСЕ. В отличие от АСЕ, однако, АСЕ2 функционирует как карбоксипептидаза, а не дипептидилкарбоксипептидаза, и проявляет активность, отщепляя один аминокислотный остаток на карбоксильном конце различных пептидов. Оригинальные работы рассматривали Ang I как пептидный субстрат для АСЕ2, исходя из гомологии с АСЕ и существующих данных о независимых от AСЕ путях, однако АСЕ2 превращает Ang I в нонапептид Ang (1–9) (Donoghue et al., 2000). Этот продукт до сих пор не известен своей функциональной активностью, но может служить как субстрат для дальнейшего превращения в Ang II или Ang (1–7) (Li et al., 2004). Кроме того, АСЕ2 расщепляет Ang II до Ang (1–7), и BK до неактивного метаболита [des-Arg9]-BK (Chappell, 2007). В отличие от АСЕ, АСЕ2 не конвертирует Ang I в Ang II, и его ферментативная активность не подавляется ACEI. Поэтому АСЕ2 эффективен как ингибитор образования Ang II, стимулируя альтернативные пути деградации Ang I. АСЕ2 локализован на клеточных мембранах кардиомиоцитов, почечных эндотелиальных и тубулярных клеток (Donoghue et al., 2000).

ACE2 высоко эффективен в конверсии Ang II до Ang (1–7), более чем в 400 раз превышая эффективность конверсии Ang I в Ang (1–9). Последующие кинетические исследования более 120 пептидов выявили, что превращение Ang II в Ang (1–7) значительно преобладает над таковым для Ang I. ACE2 проявляет в 500 раз большее соотношение kcat/Km для Ang II, чем для Ang I, и имеет наивысшую эффективность среди известных Ang (1–7)образующих ферментов. (Vickers et al., 2002).

Аналогично АСЕ, АСЕ2 существует как в растворимой, так и в ассоциированной с мембраной форме с высокой экспрессией в почке, сердце, мозге, легких и яичках (Harmer et al., 2002). Хотя у различных видов наблюдается значительная активность циркулирующего АСЕ2, уровни АСЕ2 в плазме довольно низки (Elased et al., 2006; Rice et al., 2006).

Рецептор проренина/ренина. Открытие рецептора ренина добавило интриги в сложную биологию РАС. Если до того считалось, что ренин выполняет единственную функцию лимитирующего фермента в активации РАС, то теперь он оказался еще и лигандом для белка, названного рецептором проренина/ренина (PRR), который связывает ренин и проренин независимо от их биологической активности. PRR – это 350-аминокислотный белок с одним трансмембранным доменом, который специфически связывается с ренином и проренином. PRR – трансмембранный рецептор, в изобилии экспрессирующийся в мезангиальных клетках, сердце, мозге, адипозной ткани и клетках гладкой мускулатуры коронарных и почечных артерий (Fyhrquist & Saijonmaa, 2008; Nguyen et al., 2002). Проренин составляет 70–90% всего циркулирующего ренина у нормальных субъектов и до 95% – у диабетиков (Fyhrquist & Saijonmaa, 2008; Nguyen et al., 2002; Nguyen, 2006). Проренин, каталитически неактивный зимоген, связывается с PRR и индуцирует рост каталитической эффективности конверсии Agt в Ang I, что дает вклад в локальную продукцию Ang II и его системный уровень (Jan Danser et al., 2007). Кроме того, связывание (про)ренина с его рецепторами инициирует внутриклеточный сигнальный путь, ассоциированный с активацией MAPK, и фосфорилирование белка HSP27, ведущие к усилению синтеза ДНК, ингибитора активатора плазминогена 1 (PAI-1), коллагена-1, фибринонектина и трансформирующего фактора роста -1 (TGF-1), которые стимулируют сосудистый фиброз, т.е. ремоделирование, в различных болезненных состояниях (Nguyen et al., 2002;  Nguyen et al., 2003; Fisher & Hollenberg, 2005; Feldt et al., 2008; Ichihara et al., 2006;

Batenburg & Jan Danser, 2008). Эти недавние открытия могут иметь значение для фармакологии прямых рениновых ингибиторов (DRIs).

Приведенные данные поддерживают возможность прямой функциональной роли проренина и ренина. Проренин и ренин могут быть не только аспартилпротеазами, но также и гормонами со специфическими клеточными действиями. Прямая функциональная роль рецептора PRR может давать вклад в генерацию клеточных ангиотензинов в сердце, почках и/или периферических кровеносных сосудах и может иметь отношение к патофизиологии повышенной тканевой активности РАС в процессе таких заболеваний как гипертония, преэклампсия и сахарный диабет.

Связывание ренина с PRR повышает его Аng I-генерирующую активность, в то время как связывание проренина позволяет «неактивному» рениновому предшественнику становиться полностью ферментативно активным. Таким образом, система (про)ренинового рецептора может рассматриваться как обладающая двумя функциями: ангиотензин-независимой, связанной с индуцированными PRR внутриклеточными сигнальными путями и их последующими эффектами, и ангиотензин-зависимой, связанной с возросшей каталитической активностью связанного с рецептором (про)ренина (Nguyen & Danser, 2008).

Открытие PRR подтвердило гипотезу Tigerstedt и Bergman, высказанную более века назад, что ренин является гормоном (Tigerstedt & Bergman, 1898, цит. по Nguyen & Danser, 2008). Как упомянуто недавно (Luft & Weinberger, 2008), будущее исследований ренина «явно не выглядит унылым» и не оставит исследователей без дела.

До недавнего времени предполагалось, что Ang II, считающийся главным эффектором РАС, проявляет свои свойства только как циркулирующий гормон посредством рецепторов двух подтипов. Однако реальность не столь проста. Постепенно возникает расширенный взгляд на РАС, и представление о РАС как эндокринной системе должно было быть модифицировано с открытием, что уровни Ang II много выше в тканях, чем в плазме, и что воздействие на гипертензивных пациентов ингибиторов АСЕ было эффективным, даже когда концентрации ренина и Ang II в циркуляции были нормальными (Skrbic & Igic, 2009). В результате возникла новая концепция: что РАС оперирует как на системном (эндокринно), так и на тканевом (локально, паракринно/аутокринно) уровнях и что существует множество систем контроля (Dzau, 1988). Так, помимо ее классических и почечных акций, РАС участвует во множестве функций, включая действие на ЦНС (т.е. регуляция потребления воды и соли). Несердечнососудистые эффекты РАС включают патофизиологические изменения, ассоциированные с клеточным ростом и дифференцировкой, нормальным развитием органов, репродукцией и апоптозом (Igic & Behnia, 2007).

Сдвиг парадигмы произошел в последние годы от подчеркивания роли системной циркулирующей РАС в регуляции баланса жидкости и электролитов, артериального давления и патофизиологии сердечнососудистых и почечных болезней к фокусированию на локальных тканевых РАС. Исследования продемонстрировали важность тканевых РАС в мозге, сердце, периферических сосудах, надпочечниках и почке (Cuadra et al., 2010; Yim & Yoo, 2008; Rosivall, 2009; Paul et al., 2006; Bader & Ganten, 2008) (Рис. 1.5).

Существенным требованием к тканевой РАС является то, что все компоненты, необходимые для биосинтеза активного пептидного продукта, Ang II, производятся в ткани.

Хотя некоторые из компонентов могут захватываться тканью из циркуляции, даже в присутствии локальной системы, тканевая генерация de novo Ang II и его взаимодействие с рецепторами на тех же (аутокринно) или соседних (паракринно) клетках определяет локальную систему. Экспрессия различных компонентов РАС была локализована во многих органах и системах (Рис. 1.5).

Интерес недавно был также обращен на возможность полностью внутриклеточной РАС, так называемой интракринной гормональной системы, в которой ни один из компонентов не секретируется во внеклеточное пространство для выполнения биологического действия (Re, 2003).

Рис. 1.5. Сайты экспрессии различных компонентов РАС. Классические сайты синтеза для системной РАС выделены (по Lavoie & Sigmund, 2003, с модификациями).

Ренин. Хотя ренин был идентифицирован в надпочечнике и мозге в конце 60-х – начале 70-х (Ryan, 1967; Ganten et al., 1971), именно внутрипочечная РАС была первой описанной функциональной тканевой РАС. Первые наблюдения были в экспериментах in vivo, в которых внутрипочечное подавление блокаторами рецепторов Ang II приводило к сильному росту почечного протока плазмы, скорости гломерулярной фильтрации и экскреции натрия и воды (Kimbrough et al., 1977; Levens et al., 1981). Позднее было показано, что все компоненты РАС присутствуют в почке и, особенно, что мРНК ренина, Agt и ACE локализованы в почке (Gomez et al., 1988; Bruneval et al.,1986). Эти наблюдения, вместе с открытием, что рецепторы Ang II локализованы в почечных артериолах, клубочковых мезангиальных клетках и на базолатеральной и апикальной мембранах клеток проксимальных канальцев, согласовались с первичной ролью Ang II как паракринной субстанции в контроле почечной функции (Terada et al., 1983). Местонахождение мРНК и белков отдельных компонентов РАС подробно описанo в многочисленных обзорах (Bader & Ganten, 2008; Braam & Koomans, 2006; Carey & Siragy, 2003a; Ichihara et al., 2004; Kobori et al., 2007; Navar et al., 2011; Rosivall, 2009; Yim & Yoo, 2008). Помимо классических путей РАС, рецепторы (про)ренина и химаза также включены в локальное формирование Ang II в почке (Kobori et al., 2007).

АСЕ. Соматическая АСЕ в почках – в первую очередь мембранный протеин с гликозилфосфатидил-инозитольным «якорем», и большую часть фермента составляют обе каталитические области, обращенные во внеклеточное пространство. АСЕ локализован во всей почке с высокой концентрацией в сосудистых эндотелиальных клетках, проксимальных канальцах и интерстициальных клетках. АСЕ также секретируется с апикальной поверхности эпителиальных клеток в просвет проксимальных канальцев и, вероятно, дает вклад в уровень фермента в моче (Hattori et al., 2000). Превращение мембранной формы АСЕ в растворимую существенно не меняет ее субстратные предпочтения или каталитические свойства фермента.

Хотя значимость этого события еще не до конца понятна, оно может быть необходимо для транспортировки АСЕ к более дистальным областям нефрона, где наблюдается дефицит пептидазной активности для дискретной продукции Ang II (Marques et al., 2003).

Внутрипочечная АСЕ участвует в прямом образовании Ang II из Ang I. Воздействие на почки ингибиторами АСЕ снижает интерстициальные уровни Ang II и уменьшает АД. Более того, в модели нехватки АСЕ в тканях с сохранением уровня фермента в циркуляции, почечный уровень Ang II оказался значительно редуцирован (Modrall et al., 2003). Интересно, что внутрипочечный уровень Ang I был также заметно снижен у мышей с отсутствием АСЕ в тканях, в то время как концентрация Ang (1–7) сохранялась (Modrall et al., 2003).

Ang II. Почечная межклеточная жидкость содержит высокий уровень (наномоли) Ang II, и поскольку уровень Ang II в интерстиции в 1000 раз выше, чем в плазме, принято считать, что большая часть интраренального Ang образуется именно внутри почки (Nishiyama et al., 2002a).

Кроме того, циркулирующий Ang II активно захватывается в клетках проксимальных канальцев по AT1-зависимому механизму. Следовательно, Ang II компартментализуется в почечной интерстициальной жидкости и отделах проксимальных канальцев в куда более высоких концентрациях, чем в те, что существуют в циркуляции (Kobori et al., 2007). Ang II может стимулировать биосинтез почечной мРНК и белка Agt (Kobori et al., 2001). Таким образом, предполагается, что Ang II способен автоамплифицировать активацию почечной РАС.