Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

«Иркутский государственный медицинский университет»

Министерства здравоохранения Российской Федерации

Кафедра фармацевтической и токсикологической химии

Е. А. Илларионова, Сыроватский И.П.

Токсиканты из группы барбитуратов

Учебное пособие

Иркутск

ИГМУ

2013 УДК 615.9 (075.8) ББК 52.84 я 73 И 44 Учебное пособие обсуждено на методическом совете фармацевтического факультета ИГМУ, рекомендовано к печати и использованию в учебном процессе на кафедре фармацевтической и токсикологической химии, протокол № 2 от 24 ноября 2013 г.

Авторы:

Е. А Илларионова – д-р хим. наук, профессор, зав. каф. фармацевтической и токсикологической химии ГОУ ВПО ИГМУ Минздрава России И.П. Сыроватский – канд. фарм. наук, доцент каф. фармацевтической и токсикологической химии ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России, Рецензенты:

М.В. Ясько – к-т м. наук, доцент каф. химии и биохиии ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России;

А.И. Демченко – к-т б. наук, доцент, каф. общей химии ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России;.

Илларионова, Е. А., Сыроватский И.П.

И 93 Токсиканты из группы барбитуратов: учеб. пособие / Илларионова Е. А., Сыроватский И.П.; ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России. – Иркутск, 2013. – с.

Учебное пособие охватывает важный раздел токсикологической химии, касающийся вопроса изолирования, обнаружения и количественной оценки токсикантов из группы барбитуратов.

Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Фармация».

УДК 615.9 (075.8) ББК 52.84 я © Илларионова Е. А., Сыроватский И.П. © ГБОУ ВПО ИГМУ Минздрава России, Оглавление Оглавление

Введение

Общая характеристика производных барбитуровой кислоты

Фармакологическое действие барбитуратов

Токсикокинетика и биотрансформация

Пробоподготовка исследуемого материала

Метода анализа

Тестовые задания

Рекомендуемая литература

ВВЕДЕНИЕ

Название «барбитураты» обобщает группу веществ, имеющих близкое химическое строение и оказывающих на ЦНС человека разное воздействие — от антиконвульсивного, снотворного вплоть до анальгезирующего и повышающего внутричерепное давление. Синтезировано всего около различных веществ этой группы, более 60 из них широко применялись в медицине. В настоящее время в развитых странах 20-25 наименований барбитуратов. Широко распространены их в комбинированные лекарственные средства в смеси с другими барбитуратами, например амобарбитал и секобарбитал, или с другими веществами, такими как кофеин, ацетилсалициловая кислота, эфедрин, теофиллин, кодеин. Кроме того, в медицине используется несколько близких аналогов барбитуратов, например ноксирон. В незаконном обороте наркотиков нередки случаи использования барбитуратов в смеси с героином, кокаином, амфетаминами, а также алкоголем.

Общая характеристика производных барбитуровой кислоты Первый лекарственный барбитурат — диэтилбарбитуровая кислота — был синтезирован в 1883 г., а в 1903 г. под торговым названием «Веронал» он стал использоваться в медицине. В 1912 г. в медицинскую практику вошел фенобарбитал под названием «люминал» как успокоительное и снотворное средство. 50-60-е годы XX века характеризуются пиком злоупотребления барбитуратами. За последние десятилетия терапевтическое значение эффективных, безопасных, обладающих меньшей толерантностью лекарств, например бензодиазепинов. Снижению частоты использования барбитуратов способствует большое количество побочных эффектов при их совместном приеме с другими веществами, воздействующими на ЦНС, наркотиками и алкоголем.

В соответствии с Конвенцией ООН о психотропных веществах 1971 г.

международному контролю подвергается 12 барбитуратов: аллобарбитал, амобарбитал, барбитал, бутабарбитал, буталбитал, циклобарбитал, метилфенобарбитал, пентобарбитал, фенобарбитал, секбутабарбитал, секобарбитал и винилбитал.

По своему химическому строению барбитураты разделяется на диалкилциклические производные мочевины (барбитураты) и N-ацилциклические амиды.

Общая формула барбитуратов Родоначальником этой группы веществ является барбитуровая кислота, образующаяся при конденсации мочевины и малоновой кислоты. При замене двух атомов водорода при углероде в положении 5 различными радикалами получаются многочисленные барбитураты, называемые 5,5'-дизамещенными барбитуратами. В некоторых случаях, например в метилфенобарбитале, атом водорода у азота в положении 1 может быть замещен алкильной группой.

Тиобарбитураты — это производные барбитуровой кислоты, у которых атом кислорода, присоединенный к углероду в положении 2, замещен серой. Все заместители оказывают значительное фармакологическое действие и влияют на барбитуратов, обладающих снотворным свойством, располагаются в пределах 7,78—8,30, т.е. при физиологических значениях рН (около 7,4) эти вещества примерно на 50% недиссоциированы и легко проходят через различные барьеры организма, оказывая воздействие.

Производные барбитуровой кислоты используются как в виде солей, так и в виде свободных кислот. Последние растворимы в большинстве органических растворителей, таких, как этиловый эфир, этилацетат, хлороформ и метанол, но нерастворимы в воде. В виде натриевых солей производные барбитуратов хорошо растворимы в воде и нерастворимы в органических растворителях.

Синонимы: Люминал.

Барбамил (5-изоамил-5-этилбарбитурат натрия) O Синонимы: амитал-натрий, Бензонал (1-бензоил-5-фенил-барбитуровая кислота) Гексенал (1,5-диметил-5-(циклогенсен-1-ил) барбитурат натрия) Этаминал натрия (5-Этил-5-(2-амил)-барбитурат натрия) Барбитал (5,5-диэтилбарбитуровая кислота) Бутобарбитал (5-бутил-5-этил-барбитуровая кислота) Фармакологическое действие барбитуратов В медицинской практике барбитураты используются как снотворные и седативные препараты (фенобарбитал), при лечении эпилепсии в качестве средства (тиопентал), в качестве антагонистов для подавления побочного действия стимуляторов.

У барбитуратов наблюдается значительные различия в фармакокинетике и путях биотрансформации, которые связаны с липофильностью и скоростью метаболизма конкретного вещества. Липофильные барбитураты, например наркотически активные тиобарбитураты или N-моноалкилбарбитураты типа гексобарбитала имеют очень короткую продолжительность действия.

По длительности снотворного действия барбитураты делятся на барбитураты длительного действия (веронал, фенобарбитал), барбитураты средней продолжительности действия (амобарбитал, циклобарбитал), короткого действия (тиопентал, гексобарбитал).

Длительное употребление барбитуратов или употребление их вместе с другими веществами, действующими на ЦНС, например наркотиками или алкоголем, приводит к индукции ферментов, отвечающих за их метаболизм.

Этим обусловлено развитие толерантности. Она развивается обычно в период от нескольких недель до месяцев при постоянном приеме. Важно отметить, что толерантность не приводит к повышению концентрации вещества в крови, однако она может вызвать токсические эффекты.

Прием барбитуратов в больших дозах оказывает наркотическое опьяняющее действие, подобное алкогольному. Признаки его включают эйфорию с эмоциональной неустойчивостью, вспыльчивостью, расторможенностью и агрессивностью. Другие признаки: гиперемия кожных покровов и склер, гипотония, брадикардия, снижение температуры тела, тонкий коричневатый, спаянный с эпителием налет на языке, гипосаливация, угнетение безусловных вегетативных рефлексов, мидриаз, расстройства координации, мышечная слабость, атактические расстройства (неуверенность походки, пошатывание при ходьбе, падение, неточные, порывистые, размашистые движения, множество лишних движений). Завершается опьянение общей слабостью и сном.

Барбитуровая абстиненция характеризуется развитием тяжелых, опасных для жизни расстройств. Абстинентный синдром развивается в течение первых суток с момента последнего приема снотворного. Длительность абстиненции до 4-5 недель.

артериального давления, тахикардия, недостаточность сердечно-сосудистой системы, боли в желудке, стул частый, жидкий, с тенезмами, тошнота, возможна многократная рвота; отличительный признак, не встречающийся при других видах наркоманий и токсикомании, — боли в крупных суставах (коленных, локтевых, плечевых), боли в мышцах, сон и аппетит нарушены, гипергидроз, сальность кожных покровов, головокружение, общий тремор пальцев рук, преобладание злобно-тоскливого настроение, беспокойны, не находят себе места, постоянно меняют позу, возможно развитие типичной тяжелой депрессии с суицидальными тенденциями.

Основные симптомы барбитуромании:

-отсутствие снотворного действия терапевтических доз, потребность в увеличении снотворной дозы; нарушения сна (укороченный поверхностный сон) вне приема препарата;

-психический дискомфорт вне приема барбитуратов (неудовлетворенность, пониженное настроение, навязчивые мысли, страхи, астения с непереносимостью звуков, шумов, света);

-потребность в регулярном приеме; утренний, дневной прием барбитуратов.

Меры скорой помощи включают промывание желудка, многократный прием активированного угля и другие подходы для дезактивации гастроинтестинальной системы, внутривенное введение жидкости, форсированный диурез и алкалинизация. Алкалинизация мочи создается внутривенным капельным введением раствора гидрокарбоната натрия до 1,5- л в сутки под контролем определения щелочной реакции мочи и резервной щелочности крови. В тяжелых случаях используют гемодиализ.

Смерть от передозировки — обычно в результате остановки дыхания.

Токсикокинетика и биотрансформация метаболитов, которые затем выводятся с мочой. Известно 4 основные пути метаболизма этих веществ:

1) окисление заместителей при С5 атоме углерода с образованием спиртов, фенолов, кетонов и карбоновых кислот с последующим частичным преобразованием их в глюкурониды на второй стадии метаболизма;

2) деалкилирование N-алкильных групп;

3) десульфулирование S-rpynnы тиобарбитуратов;

4) раскрытие барбитурового кольца между N1- и С6-атомами.

1) примеры окисления барбитуратов (первая стадия метаболизма) NaO NaO 2) пример деалкилирования N-алкильных производных (первая стадия метаболизма) 3) пример десульфирования (первая стадия метаболизма) 4) пример раскрытия цикла (первая стадия метаболизма) Примеры второй стадии метаболизма (реакции синтеза с глюкуроновой кислотой) Время детектирования барбитуратов в биологических жидкостях, главным образом в моче, изменяется в значительных пределах. Это связано зависит от ряда причин: принятой дозы и продолжительности употребления (хронической или острой интоксикации), совместного употребления веществ, стимулирующих или подавляющих метаболические превращения (особенностей токсикокинетики), используемого метода обнаружения конкретного определяемого вещества, рН мочи. Производные барбитуровой кислоты короткого действия, например пентобарбитал и секобарбитал, могут быть обнаружены в моче в течение 24 ч, вещества длительного действия, такие как фенобарбитал, — в течение 14 дней и более. В других объектах период детектирования может быть более продолжительным, например в волосах барбитураты обнаруживаются после разовой терапевтической дозы спустя мес и более.

Терапевтические и токсические концентрации барбитуратов в крови Вещество Пробоподготовка исследуемого материала Выделение барбитуратов из биологических жидкостей таких, как моча и кровь, обычно проводятся в несколько этапов: разрушение конъюгатов анализируемых веществ если это необходимо; выделение аналита и его метаболитов из образца; проведение дериватизации, если это необходимо. При определении барбитуратов обычно нет необходимости в проведении гидролиза конъюгатов (или конъюгатов их метаболитов). Этим барбитураты отличаются от многих других токсикантов.

При исследовании цельной крови или плазмы крови необходимым этапом является осаждение из них белков, которое, как правило, проводится либо растворителем, например ацетоном или ацетонитрилом, либо каким-либо электролитом. Последнее предпочтительнее в связи с возможным эффектом высаливания, увеличивающим степень экстракции вещества при ЖЖЭ.

осуществляется с помощью ЖЖЭ или ТФЭ. ЖЖЭ барбитуратов из мочи и растворителей при слабокислом значении рН — дихлорметана, диэтилового эфира, толуола, этилацетата, гексана и других растворителей, а также их смеси.

В последнее время наблюдается тенденция отказа от применения токсичного хлороформа. Получаемые при этом экстракты достаточно чисты и не требуют дополнительной очистки. При ТФЭ для барбитуратов чаще всего используют колонки с обращеннофазовыми силикагелями С8 (или С18) или полимерными сорбентами.

Выделение барбитуратов из биологического материала. Методы выделения барбитуратов из секционного материала были разработаны и внедрены в практику уже много десятилетий назад. С некоторыми модификациями они с успехом применяются до сих пор.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной щавелевой кислотой.

Оптимальные условия изолирования барбитуратов из биологического материала водой, подкисленной щавелевой кислотой, и способ очистки полученных вытяжек разработала М. Д. Швайкова с сотрудниками. Согласно этому методу, в коническую колбу вносят 100 г тщательно измельченных органов трупов, прибавляют 200 мл воды, подкисляют насыщенным водным раствором щавелевой кислоты до рН=2 и оставляют на 2 часа при частом перемешивании. Затем содержимое колбы переносят в стакан для центрифугирования вместимостью 500 мл и центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин). Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку и проверяют рН этой жидкости. В случае необходимости жидкость доводят до рН=2.

Содержимое делительной воронки взбалтывают с тремя порциями хлороформа (по 20, 15 и 15мл) в течение 5 мин. Если образуется эмульсия, то ее разрушают центрифугированием. Хлороформные вытяжки соединяют, доводят хлороформом до 50мл и переносят в делительную воронку, в которую прибавляют 25мл 0,1М раствора NaOH, и взбалтывают. Водную фазу отделяют от хлороформной вытяжки. Эту вытяжку взбалтывают с двумя порциями воды по 1,5 мл. Первую и вторую порции воды (по 1,5мл), которыми промывали хлороформные вытяжки, присоединяют к щелочной водной фазе. Потом водную фазу подкисляют HCl до рН=2, вносят в делительную воронку и взбалтывают с двумя новыми порциями хлороформа (по 20мл) в течение 5 мин.

Хлороформные вытяжки соединяют и доводят хлороформом до 50мл. В этих вытяжках определяют наличие и количественное содержание барбитуратов.

Изолирование барбитуратов водой, подкисленной серной кислотой.

Метод выделения барбитуратов из биологического материала, основанный на изолировании этих веществ водой, подкисленной серной кислотой, разработала В. И. Попова. Согласно этому методу, биологический материал настаивают с водой, подкисленной серной кислотой (рН=2). Полученные вытяжки освобождают от примесей методом гель-хроматографии. Для этой цели используется гель сефадекса G-25. В стакан вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 80 мл 0,02М раствора H2SO4, перемешивают и проверяют рН среды. При необходимости смесь доводят до рН=2 (по универсальному индикатору) 30 %-м раствором H2SO4. Смесь биологического материала и подкисленной воды настаивают в течение 2 ч при частом перемешивании. Затем вытяжку сливают, а биологический материал еще 2 раза настаивают с новыми порциями 0,02M раствора H2SO4 (по 80 мл) в течение 1 ч. Кислые водные вытяжки соединяют, процеживают через сложенную в три слоя марлю и центрифугируют в течение 25-30 мин.

Надосадочную жидкость (центрифугат) сливают с осадка и очищают от примесей методом гель-хроматографии. Этот метод обеспечивает хорошую очистку барбитуратов, выделенных из биологического материала. После очистки вытяжек из биологического материала с помощью метода гельхроматографии получают большие объемы элюатов, в одном миллилитре которых содержатся малые количества барбитуратов. Поэтому барбитураты, находящиеся в элюатах, подвергают экстракционному концентрированию. С этой целью объединенные кислые элюаты 3 раза взбалтывают с новыми порциями хлороформа (по 50 мл) в течение 7 мин. Хлороформные вытяжки, полученные после каждой экстракции, соединяют и на водяной бане при 70°С отгоняют из них 120-130 мл хлороформа. Оставшуюся упаренную хлороформную вытяжку при комнатной температуре выпаривают досуха.

Сухие остатки используют для идентификации и количественного определения барбитуратов при помощи соответствующих реакций и методов.

Изолирование барбитуратов подщелоченной водой. Подщелаченную воду для изолирования барбитуратов из биологического материала впервые применил П. Валов. Для осаждения примесей, переходящих из биологического материала в вытяжки, он использовал вольфрамат натрия. В настоящее время известно несколько модификаций метода Валова. Приводим одну из них, предложенную М.Д. Швайковой и соавт.

В стакан или коническую колбу вносят 100 г измельченного биологического материала, прибавляют 180 мл воды и 20 мл 10% раствора гидроксида натрия.

Содержимое стакана (или колбы) оставляют на 30 мин при частом перемешивании, а затем центрифугируют в течение 30 мин (3000 об/мин). От осадка отделяют надосадочную жидкость (центрифугат), к которой прибавляют 120 мл 10% раствора вольфрамата натрия и 1 н. серной кислоты (рН 2,0).

Жидкость нагревают на кипящей водяной бане в течение 20 мин, а затем подвергают центрифугированию в течение 30 мин. Центрифугат сливают с осадка и процеживают через ватный тампон, смоченный водой. Процеженную жидкость собирают в делительную воронку. Тампон промывают водой (10 мл).

Промывную воду тоже выливают в делительную воронку. К процеженной жидкости прибавляют равный объем диэтилового эфира и взбалтывают в течение 15 мин. Эфирный слой отделяют и взбалтывают с 50 мл 10% раствора гидроксида натрия. Щелочной водный слой отделяют, подкисляют 25% раствором серной кислоты до рН 2,0 и взбалтывают с равным объемом диэтилового эфира. Полученную при этом эфирную вытяжку используют для обнаружения и количественного определения барбитуратов.

Выделение барбитуратов из слюны, пота и волос. Слюна, пот и волосы являются альтернативными объектами исследования по сравнению с традиционными объектами — мочой и кровью. Исследование таких объектов стало возможным после внедрения в практику современных высокочувствительных методов.

Эти объекты по сравнению с кровью и мочой отличаются значительно меньшим количеством биоматериала, который можно отобрать у конкретного человека. Концентрация определяемых веществ в них гораздо ниже по сравнению с мочой, а интервал времени, в течение которого можно детектировать барбитураты в слюне и поте, очень короткий.

Исследование слюны применяется при изучении токсикокинетики барбитуратов. Пот как объект исследования имеет ряд преимуществ при расследовании причин отравления, а также тестировании лиц на прием наркотиков. Волосы — это единственный объект, позволяющий проводить исследование динамики потребления вещества в течение длительного времени.

Образцы пота отбираются на марлевый или ватный тампон, смоченный спиртом, или с помощью специальных устройств. Исследование слюны и пота после экстракции с использованного носителя или специального устройства проводится аналогично исследованию плазмы крови..

Особенностью исследования волос на барбитураты, как и на другие вещества, является необходимость перед выделением из них аналитов промывки внешней поверхности. Она необходима для удаления потожировых выделений, а также остатков веществ, выделившихся с потом. Такую промывку осуществляют в несколько этапов с применением воды и органических растворителей, например ацетона, эфира, дихлорметана, толуола. Чаще всего промытые волосы гомогенизируют различными способами и проводят либо энзиматический с применением глюкуронидазы/арилфосфатазы, либо кислотный гидролиз. После это аналиты выделяют с применением ЖЖЭ или ТФЭ. Исследование рассматриваемых объектов обычно осуществляется иммунными методами, методами ГХ-МС или ВЭЖХ-МС.

Метода анализа Для определения барбитуратов применяются различные химические, физико-химические и биологические методы. Выбор конкретного способа пробоподготовки и метода определения зависит от целей и задач исследования, образца, представленного на исследование, например неизвестный порошок или моча и волосы человека, наличия оборудования и подготовленных сотрудников, способных проводить исследование и интерпретировать полученные результаты. Как минимум для установления факта присутствия барбитуратов в различных объектах требуется получение результатов 2— независимыми методами. В число наиболее широко применяемых методов для определения барбитуратов входят химические (хромогенные реакции), иммунохимические тесты, УФ-ВИД-спектрофотомерия, ИК-Фурьеспектрометрия, ТСХ, ГХ и ВЭЖХ, а также гибридные методы: ГХ-МС и ГХИК-Фурье-спектрометрия, ВЭЖХ-МС. До недавнего времени для анализа барбитуратов широко использовались методы микрокристаллоскопии, однако в настоящее время они применяются ограниченно.

Хромогенные (цветные) реакции исследовании барбитуратов. С их помощью в анализируемом объекте обнаруживают вещества с определенной химической группой в структуре.

Преимуществами цветных реакций являются дешевизна, отсутствие необходимости использовать дорогостоящее оборудование, быстрота получения результата, проведение многих тестов в течение нескольких минут и возможность проведения одновременно большого числа тестов.

Недостатками цветных реакций при анализе барбитуратов, как и других групп веществ, являются их недостаточная селективность, относительно низкая высокоактивные реактивы, такие как соли ртути или серная кислота.

Приведенные ниже тесты используются как для скрининга медицинских препаратов или неизвестных порошков, так и для тестирования экстрактов из биологического материала. Положительный результат обеспечивается присутствием, хотя и не обязательным, в тестируемом образце вещества, имеющего в своей структуре группировку, способную взаимодействовать с использованными реагентами. Результаты тестирования сильно зависят от индивидуальной способности различать близкие оттенки цвета и профессиональной подготовленности специалиста.

Тест Дилле—Копани. Реакция с ацетатом кобальта (II) в среде метанола с добавлением изопропиламина. При наличии барбитуратов развивается фиолетовое окрашивание с различными оттенками. Предел обнаружения метода до 25 мкг в пробе.

Тест Либермана. Реакция с серной кислотой в присутствии нитрита натория.

Фенобарбитал дает красно-оранжевое окрашивание, однако схожее окрашивание дают (желтые или коричневые интенсивные цвета) вещества, имеющие фенольные групп в молекуле.

Тест нитрата ртути. К насыщенному раствору нитрата ртути (I) добавляют бикарбонат натрия до окончания выделения газа и образования желтого осадка.

Через некоторое время осадок меняет цвет на светло-коричневый. Используется только свежеприготовленный реактив (не более 1 ч). Темно-зеленое или черное окрашивание указывает на возможное присутствие вещества с имидной группировкой в кольце. Предел обнаружения барбитуратов от 1 до 5 мкг.

Иммунохимические тесты При исследовании барбитуратов ИХМ используются для проведения скрининга большого числа образцов, главным образом биологического происхождения. Получаемые при этом результаты позволяют сделать предположение о возможном наличии в тестируемом объекте вещества из группы барбитуратов без проведения внутригрупповой дифференцировки. Продолжительность исследования обычно составляет от нескольких минут до нескольких часов. К настоящему времени отечественными и зарубежными производителями налажен выпуск наборов и реактивов для ИФА, метода поляризационного флуороиммуноанализа (ПФИА), метода ингибирования латексной агглютинации, радиоиммунных методов (РИА), а также иммунохроматографические наборы. На результаты тестирования оказывает влияние тип используемого растворителя, рН среды, интенсивность излучения и температура проведения анализа. Важнейшее значение имеет реакционная способность иммунных реактивов, которые достаточно быстро, особенно при несоблюдении правил их хранения, теряют свою активность. В связи с этим при проведении тестирования конкретного биообъекта, например мочи, важно придерживаться подробной инструкции от фирмы-производителя, в которой даны четкие рекомендации по степени разбавления реактивов и образца, соотношению их объемов, условиях хранения реактивов и другая информация.

Ложные результаты могут быть получены после чрезмерного разбавления образца, добавления в него кислот или щелочей, различных поверхностноактивных веществ, окислителей (перманганата калия или гипохлорита натрия) и других веществ. Иммунохимические тесты широко применяются при исследовании биологических объектов на присутствие в них барбитуратов, однако полученные положительные результаты всегда требуют обязательного подтверждения другими методами.

Тонкослойная хроматография ТСХ широко используется для исследования барбитуратов и большого числа веществ других групп — наркотиков, лекарств, пестицидов, метаболитов Хроматографирование барбитуратов обычно осуществляют на пластинах с закрепленными слоями силикагеля с добавлением флюоресцентного индикатора или без него на стеклянных, полимерных или металлических носителях.

На пластину наносят метанольные растворы исследуемых веществ или экстракты из биологических образцов. Одновременно на эти же пластины наносят растворы аналитических стандартов сравнения. Лучшие результаты получаются при использовании растворов в концентрации около 5 мг/мл.

Системы растворителей Система А: этилацетат-метанол — 25% раствор аммиака (85:10:5).

Система В: хлороформ — ацетон (80:20).

Система С: изопропанол: хлороформ: 25% раствор аммиака (90:90:20).

Пластины просматривают в УФ-свете при 254 и 366 нм и отмечают наличие хроматографических зон. Далее пластины обрабатывают реактивом хлорида ртути с дифенилкарбазоном. Барбитураты проявляются в данных условиях в виде сине-фиолетовых пятен на розовом фоне. Предел обнаружения составляет от 1 до 5 мкг барбитурата в пятне.

Другими проявляющими реагентами могут быть: 1) 1% раствор ацетата серебра с последующей обработкой раствором дифенилкарбазона; 2) выдерживания пластин в атмосфере газообразного хлора после обработки их 2,7-дихлорфлюоресцином; 3) реактив Драгендорфа.

УФ-спектрофотометрия количественного определения барбитуратов, в том числе выделенных из биологических объектов. В растворах барбитураты в зависимости от рН среды изменяют характер поглощения УФ-света. В кислой среде и органических растворителях поглощение барбитуратов незначительно. Однако при изменении рН в их спектрах появляются интенсивные полосы поглощения вследствие лактим-лактамной таутомерии перехода лактамной формы барбитурата в лактимную при рН 9,0 (по N, - С2) и при рН 13,0 (по N, - С2 и по N3 - С4). Все 5,5-диацилзамещенные барбитураты в указанных условиях имеют максимум поглощения при рН 9,0 близкий 240 нм, при изменении рН до 13, интенсивность их поглощения снижается. При этом происходит сдвиг в более длинноволновую область к 255 нм. На рис. показаны спектры поглощения фенобарбитала в зависимости от рН среды. У N-замещенных барбитуратов, например метилфенобарбитала, может быть только одна лактимная форма и на УФ-спектре, проявляется только один максимум поглощения при 243—244 нм при рН 9,0. Повышение рН до 13,0 к изменению спектра не приводит. Тиобарбитураты обладают высокой способностью к поглощению УФ-света. Максимум поглощения в сильнощелочной среде у них составляет 303—304 нм.

УФ-спектрофотометрию используют для количественного определения барбитуратов в моче и крови при отравлениях.

Окисленные в алифатической части метаболиты барбитуратов имеют очень близкие спектры к исходным барбитуратам, поэтому результат определения — это суммарная концентрация исходного вещества и его основных метаболитов.

Продукты реакции барбитуратов с дифенилкарбазоном и солями ртути поглощают УФ-свет при 550 нм. Это поглощение при концентрациях барбитуратов в плазме крови в диапазоне от терапевтических до токсических соответствует закону Бугера—Ламберта—Бера, что позволяет использовать реакцию для определения этих веществ фотоколориметрическим способом.

ИК-Фурье-спектрометры индивидуальных барбитуратов. Метод недеструктивен и достаточно просто комбинируется с другими методами, например с ТСХ, обладает достаточно высокой чувствительностью: современные ИК-Фурье-спектрометры способны снимать спектры образцов вещества массой до 10 мкг, а при использовании специальных приспособлений и гораздо ниже.

Основные характеристические частоты ИК-спектров барбитуратов (см-1):

—NH— (деформационные колебания) — 1680—1693;

—С=0 (валентные колебания) — 1712—1725;

—CONH— (валентные колебания) — 1744—1770;

=С—N— (валентные колебания) — 1300—1320;

С=0 (деформационные колебания) — 1210—1245;

=С—Н (деформационные колебания) — 830—875.

Дополнительно тиогруппа может быть идентифицирована по 2 полосам поглощения — 1170 и 1540 см-1, фенильные заместители в положении 5 имеют полосы 1490 см-1 и между 690 и 715 см-1, аллильные радикалы — по полосам 1000 и 1540 см-1, N-метильные радикалы — по 2 полосам около 1190 см-1. В области «отпечатков пальцев» все барбитураты могут быть идентифицированы.

Газовая хроматография и хромато масс-спектрометрия Метод газовой хроматографии широко используется при исследовании барбитуратов, в том числе выделенных из биологических объектов.

Современные капиллярные кварцевые газохроматографические колонки с нанесенными на стенки неполярными силиконовыми фазами достаточно инертны и позволяют проводить исследования следовых количеств барбитуратов без дериватизации. Однако в некоторых случаях, например при проведении подтверждающего исследования методом хромато-массспектрометрии или при исследовании метаболитов барбитуратов дериватизация может быть полезна. С этой целью используют метилирующие реактивы, такие, как диазометан, гидроксиды тетраметиламмония или триметилфениламмония.

В результате их действия атомы водорода у азота в молекуле барбитурата меняются на метильную группу. При исследовании метаболитов барбитуратов применяют различные ацилирующие реактивы, например ангидриды уксусной или трифторуксусной кислоты, либо многочисленные силилирующие реактивы.

Детектирование обычно осуществляется с применением ПИД, азотнофосфорного детектора (АФД) или МС-детектора в режиме ионизации электронным ударом при 70 эВ или ИК-Фурье-детектора.

Высокоэффективная жидкостная хроматография лекарственных формах, так и выделенных из биологических объектов. Для этого чаще всего применяют обращеннофазовые колонки с сорбентами С8 или С18. В качестве подвижной фазы, используемой в изократическом или градиентном режиме, служат смеси ацетонитрила либо смеси метанола с водным буфером или смеси растворителей, например ацетонитрила, изопропанола и гексана, с фосфатным или ацетатным буфером. Лучшим выбором для детектирования барбитуратов можно считать УФ-детектор или диодную матрицу. В последнее время широкое распространение получили комбинированные методы жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии.

Масс-спектрометрия При анализе биологического материала метод масс-спектрометри обычно сочетают с методами газовой и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ГХ/МС и ВЭЖХ/МС), что позволяет максимально использовать возможности обоих методов. В неизмененном виде барбитураты имеют масс-спектры, достаточно сложно поддающиеся идентификации. В связи с этим до недавнего времени с этой целью использовали метильные или диметилные производные барбитуратов. На рисунке приведена одна из возможных общих схем основных путей фрагментации метальных производных барбитуратов. Основные пути фрагментации производных барбитуровой кислоты:

Схема фрагментация метальных производных барбитуратов Масс-спектры некоторых барбитуратов приведены в таблице Аллобарбитал 167 (100), 124 (97), 80 (68), 193 (23), 208 (2) Амобарбитал 156 (100), 141 (73), 197 (9), 198 (6), 211 (2) Буталбитал 168 (100), 167 (88), 181 (30), 141 (24), 209 (3) Бутобарбитал 141 (100), 156 (96), 98 (19), 184 (10), 197 (2) Винилбитал 157 (100), 83 (29), 71 (15), 209 (1), 195 (1) Метилфенобарбитал 218 (100), 117 (39), 146 (23), 246 (10) Пентобарбитал 156 (100), 141 (84), 69 (12), 98 (10), 197 (4) Секбутабитал 141 (100), 156 (87), 57 (27), 98 (13), 157 (12) Секобарбитал 168 (100), 167 (80), 195 (25), 141 (11), 209 (4) Фенобарбитал 204 (100), 117 (29), 232 (23), 161 (20) Циклобарбитал 207 (100), 141 (33), 236 (3), Примечание. В скобках — относительная интенсивность, %.

1. Наименьшее число ложноотрицательных результатов при проведении иммунохимических тестов при анализе барбитуратов дают а) волосы б) ногти в) моча г) слюна Укажите один правильный ответ 2. Барбитал отличается высокой степенью биотрансформации а) да б) нет Укажите один правильный ответ 3. Основное отличие при анализе крови на барбитураты от анализа мочи на барбитураты (процесс) Напишите название 4. Биотранформация барбитуратов в организме связана а) с восстановлением барбитуратов б) с деалкилированием N-алкильных производных в) с десульфированием тиобарбитуратов г) с окислением заместителей при С5 атоме углерода Укажите несколько правильных ответов 5. Основной способ выведение барбитуратов из организма а) с выдыхаемым воздухом б) с мочой в) с желчью г) с потом Укажите один правильный ответ 6. Укажите, как меняется характер спектрофотометрической кривой при изменении рН раствора с 9 до 13 приводит а) происходит смещение максимума поглощения в более коротковолновую область б) происходит смещение максимума поглощения в более длинноволновую область в) характер спектрофотометрической кривой практически не меняется от изменения рН раствора Укажите один правильный ответ 7. При отравлении барбитуратами можно ускорить процесс выведение барбитуратов и продуктов их метаболизма из организма сдвинув рН мочи а) в кислую сторону б) в щелочную сторону Укажите один правильный ответ 8. При проведении ТСХ – анализа, барбитураты можно обнаружить на пластинке обработав её а) реактивом Драгендорфа б) раствором хлорида железа (III) в) концентрированной серной кислотой г) раствором дифенилкарбазона с солями ртути Укажите несколько правильных ответов 9. Для изолирования барбитуратов из биологического материала можно использовать а) метод Валова б) метод Крамаренко в) метод Поповой г) метод Швайковой Укажите несколько правильных ответов 10. Подтверждающими методами определения барбитуратов являются а) хромогенные реакции б) ГЖХ в) ВЭЖХ г) ГХ/МС Укажите несколько правильных ответов 11. Для количественного определения барбитуратов в биологическом материале используется УФ-спектрофотометрия а) прямая б) дифференциальная Укажите один правильный ответ 12. Необходимую информацию для идентификации барбитуратов можно получить при снятии спектра при рН г) Укажите несколько правильных ответов 13. Фенобарбитал, барбамил, этаминал натрия, барбитал натрия. Исключите один лишний барбитурат из приведенного списка.

14. Барбитураты могут быть представлены в следующих формах а) кислотная б) солевая в) гидратная г) основная Укажите несколько правильных ответов 15. Барбитураты хорошо растворимы в воде и плохо растворимы в неполярных органических растворителях в () форме.

Напишите название данной формы барбитурата 16. Барбитураты имеют значение рКа в интервале а) 1- б) 3- в) 5- г) 7- 18. Для барбитуратов характерна а) кето-енольная таутомерия б) лактим-лактамная таутомерия в) имидо-имидольная таутомерия Укажите один правильный ответ 19. При значении рН водного раствора равного двум барбитураты будут находится в ионизированном состоянии а) да б) нет 20. При пероральном приеме максимальное всасывание барбамила происходит а) в полости рта б) в желудке в) в тонком кишечнике г) в толстом кишечнике Укажите один правильный ответ 21. 5-этил-5/ -(n-гидроксифенил)барбитуровая кислота является метаболитом ().

Напишите название барбитурата 22. В качестве предварительных методов качественного анализа барбитуратов используют а) ИК-спектроскопию б) ИХМ (имуннохимический метод) в) цветные реакции г) ТСХ Укажите несколько правильных ответов 23. Групповым реактивом на барбитураты является а) хлорид железа (III) б) ацетат кобальта в) конц. серная кислота г) ацетат свинца Укажите один правильный ответ 24. Пути поступления барбитуратов в организм а) перкутанно б) перорально в) парентерально г) интраназально Укажите несколько правильных ответов Ответы на тестовые задания 3 – депротеинизации 13 – фенобарбитал 23 – б

РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА

Основная литература 1. Токсикологическая химия. /под ред. Плетеневой Т.В.- М., «ГЕОТАР-Медиа», 2006.

2. Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия. /под ред. Вергейчик Е.Н..Пятигорск, 2009.

Дополнительная литература 1. Веселовская Н.В., Коваленко А.Е. Наркотики. М.: «Тиада-Х»,2000.

2. Токсикологическая химия. Метаболизм и анализ токсикантов /под ред. Н.И.

Калетиной.- М., «ГЕОТАР-Медиа», 2008.

3. Симонов Е.А., Изотов Б.Н., Фесенко А.В. Наркотики: методы анализа на коже, в её придатках и выделениях. М.: «Анахарсис», 2001.

4. Токсикологическая химия. Практикум / Плетенева Т.В. -М., «Эксмо», 2008.

Илларионова Елена Анатольевна Сыроватский Игорь Петрович Токсиканты из группы барбитуратов