«М.Э. Ламберова ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА В двух частях Часть 2 Допущено научно-методическим советом БТИ АлтГТУ для внутривузовского использования в качестве учебного пособия для самостоятельной подготовки к практическим ...»

Альтернативный подход заключается в иммобилизации живых клеток и последующем использовании природных систем синтеза и регенерации кофакторов. На практике трудно обеспечить стабильность иммобилизованных клеток и введение необходимых ферменткоферментных систем в легкоиммобилизуемые активные клетки. Проблема решается методами генетической инженерии, внедряя в геном подходящей клетки ген, синтезирующий необходимый фермент; тогда клетка будет функции хранилища кофактора и системы его регенерации. Другая проблема связана с регуляцией транспорта через оболочку клетки: живая клетка должна пропускать внутрь клетки субстраты, выделять во внеклеточную среду продукты реакции и в то же время не должна терять свои ферменты, кофакторы и другие вещества.

2 ПРАКТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

2.1 Ферментативные реакции в гетерогенных системах Некоторые клеточные ферменты связаны с мембранами клетки.

Аналогичные структуры имеются и в эукариотах; в митохондриях, например, со сложной системой внутренних мембран связаны ферменты, отвечающие за сложную последовательность реакций. На рисунке 18 показано, что в природе и в биотехнологии возможны многие другие сочетания различных физических состояний фермента и субстрата. Здесь мы рассмотрим кинетику ферментативных реакций между растворами ферментов и нерастворимыми субстратами, а затем изучим реакции растворимых субстратов, катализируемые связанными с носителями ферментами.

Рисунок 18 – Находящиеся в различных физических состояниях ферменты катализируют превращения различных форм субстратов Если субстрат одновременно может существовать в нескольких фазах, то иногда ферментативной реакции подвергается только та его часть, которая находится в растворе. Примером могут служить данные, приведенные на рисунке 19.

Рисунок 19 – Ферментативная реакция осуществляется только с растворенной формой субстрата Поскольку все вещества в той или иной степени растворимы в воде, то небольшое количество субстрата всегда будет находиться в растворе и, следовательно, подвергаться действию фермента. В то же время скорость этого процесса может быть настолько мала, что не имеет практической ценности.

Другим примером (рисунок 20) является реакция гидролиза метилбутирата под действием панкреатической липазы – фермента в пищеварительном тракте человека и способного расщеплять жиры.

Рисунок 20 – Реакция на поверхности раздела двух жидких фаз Здесь реакция не идет до тех пор, пока в реакционной смеси не сформируется нерастворимая форма субстрата в виде небольших капель. Этот фермент способен проявлять свою активность только на границе раздела двух жидких фаз. Учитывая возможность денатурации фермента за счет поверхностного натяжения, как и в случае упоминавшегося выше метода пенного фракционирования в присутствии детергентов, поверхностное натяжение на жировых каплях может существенно снизиться вследствие адсорбции желчных кислот – природных ПАВ, выделяемых в пищеварительный тракт.

Другие ферменты активны в отношении как растворимой, так и нерастворимой форм субстрата (рисунок 21).

Рисунок 21 – Зависимость скорости разрушения твердого субстрата (тиогеля) от концентрации е0 фермента в растворе Например, протеолитический фермент трипсин способен расщеплять как свободный лизоцим, так и лизоцим, адсорбированный на поверхности носителя. Сам лизоцим также может взаимодействовать с растворимыми и «нерастворимыми» субстратами. Лизоцим активно разрушает стенки бактериальных клеток, в то же время он способен катализировать и расщепление растворимых олигомеров, образующихся из полимеров клеточной стенки.

Взаимодействие растворенного фермента с нерастворимым субстратом путем адсорбции на его поверхности может быть описано с помощью особого варианта рассмотренных ранее кинетических уравнений [1]. В отличие от предыдущих случаев, когда скорость реакции возрастала пропорционально общей концентрации фермента, здесь при повышении концентрации фермента скорость реакции сначала возрастает, а затем приближается к некоторой предельной величине. Такое поведение фермент-субстратной системы наглядно иллюстрируется приведенными на рисунке 21 данными, отражающими кинетику гидролиза твердого блока белка (в данном случае тиогеля – сшитого поперечными связями желатина) под действием трипсина.

Разработку достаточно обоснованной модели для кинетики гетерогенной реакции начнем с допущения, обратного тому, которое было положено в основу анализа скоростей ферментативных реакций в растворе – теперь мы будем считать, что фермент адсорбируется на субстрате. Обозначив символом А вакантные центры на поверхности субстрата, можно написать следующее уравнение Если общее число молей центров адсорбции на поверхности субстрата в расчете на единицу объема реакционной смеси принять равным а0, то Из уравнения (13) и уравнения равновесной адсорбции фермента (12) следует, что где Теперь допустим, что реакция завершается необратимым расщеплением комплекса ЕА Следовательно, По условиям модели е обозначает концентрацию свободного фермента, которая в начале эксперимента связана с общей концентрацией фермента е0 соотношением Если начальная концентрация фермента значительно превышает начальную концентрацию субстрата (е0а0), то с хорошей степенью приближения можно считать, что поэтому Для реакций с твердыми субстратами ситуации, когда е0 а0, не являются исключением. Например, результаты, приведенные на рисунке 21, были получены в эксперименте, в котором отношение е0:а0 составляло около 4000. Этим гетерогенные реакции резко отличаются от реакций в растворах, когда s0 обычно значительно больше, чем е0.

Из уравнения (19) следует, что график зависимости 1/ от 1/е (в двойных обратных координатах Лайнуивера–Бэрка) должен представлять собой прямую линию, как и показано на рисунке 22.

Рисунок 22 – а – зависимость скорости деструкции твердого субстрата (тиогеля) (1/ ) от концентрации трипсина (1/е0) в растворе в координатах Лайнуивера–Бэрка; б – зависимость скорости (частиц поли--гидроксибутирата) раствором фермента (деполимеразы Здесь прямая на рисунке 22а выражает в другой форме те же данные, которые были приведены на рисунке 21а, на рисунке 22б отражены аналогичные результаты, полученные для другой системы растворимый фермент – нерастворимый субстрат.

Многие источники питательных веществ для микроорганизмов представляют собой твердые частицы (в потоках сточных вод, озерах, хранилищах компоста и т.д.). Очевидно, что адсорбции и транспорту растворенных питательных веществ через клеточные мембраны должен предшествовать гидролиз этих частиц внеклеточными ферментами.

Точно так же гидролиз целлюлозы ферментами типа целлюлаз требует предварительного расщепления нерастворимых частиц, поэтому надо полагать, что рассмотренная в этом разделе кинетика гетерогенных ферментативных реакций окажется пригодной для расчетов реакторов с такого типа субстратами.

В заключение следует подчеркнуть, что область применения рассмотренной кинетической модели не ограничивается твердыми субстратами; она использовалась и для описания нерастворимых жидких субстратов, диспергированных в растворе фермента (например, системы, кинетика которой изображена на рисунке 20). Кроме того, здесь мы не принимали во внимание различий в концентрациях реагентов в основной массе жидкой фазы и на границе раздела фаз. Последнюю систему рассмотрим детально ниже.

Задача 3. Нерастворимые субстраты. В результате смешения водной суспензии однородных по размерам частиц желатина (полиглицина) и порошкообразного протеолитического фермента получена смесь, содержащая а объемных частей желатина и е молей фермента в литре суспензии.

А. Приняв, что первоначальный размер частиц равен d0 и что единственным продуктом реакции является глицин, найдите выражения, описывающие зависимость скорости образования глицина и изменения размера частиц от времени. Примите также, что скорость реакции при s0е0 выражается уравнением Михаэлиса–Ментен, то есть где sа – площадь поверхности субстрата на единицу объема реакционной смеси.

Б. Из проявленной фотопленки необходимо выделить серебро путем ферментативного гидролиза связывающего серебро желатина.

Определите минимальное время контакта фотопленки с раствором фермента, за которое гидролизуется весь желатин.

Задача 4. Ферментативные реакции с несколькими субстратами. В промышленных ферментных реакторах в реакционной смеси часто присутствует несколько субстратов одновременно.

А. Покажите, что в системе с двумя субстратами скорость превращения S1 и S2 выражается уравнением и что таким образом каждый субстрат является конкурентным ингибитором другого субстрата.

Б. Найдите общее выражение, описывающее общую скорость реакции одного фермента с m субстратами одновременно.

2.2 Кинетика реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами Для проектирования реакторов с иммобилизованными ферментными катализаторами необходимо хорошо знать кинетические свойства иммобилизованных ферментов. Наблюдаемые каталитические свойства отдельной частицы катализатора на основе иммобилизованного фермента или реактора, в котором ферменты удерживаются полупроницаемой мембраной, определяются взаимосвязанным сочетанием двух процессов – транспорта субстрата и каталитической ферментативной реакции. В этом подразделе основное внимание будет уделено изучению взаимосвязи между массопередачей и каталитической реакцией и ее влияния на каталитическую активность отдельной частицы иммобилизованного фермента.

Изучение путей взаимодействия массопередачи и биохимических процессов, определяющего общую активность, инактивацию и другие параметры иммобилизованного ферментного катализатора, начнем со схемы, приведенной на рисунке 23.

На этой схеме изображено поперечное сечение тонкого слоя иммобилизованного фермента, контактирующего с обеих сторон с раствором субстрата. Вдали от катализатора концентрация субстрата и другие параметры, например рН, имеют те же значения, что и во всей реакционной среде. Эти параметры определяют методами аналитической химии. Поскольку субстрат трансформируется внутри иммобилизованного фермента и здесь же образуется продукт реакции, между раствором вдали от катализатора и активными центрами иммобилизованного фермента возникают градиенты концентраций. В частности, субстрат должен транспортироваться из раствора к наружной поверхности катализатора.

В отсутствие перемешивания этот процесс осуществляется за счет молекулярной диффузии. Обычно скорость транспорта субстрата к поверхности катализатора повышают путем перемешивания или создания потока его раствора.

Рисунок 23 – Схема массопередачи и биохимических превращений в двустороннем слое иммобилизованного фермента: в верхней части показаны явления, которые обусловливают специфические профили изменения концентраций субстрата и продукта реакции, изображенные в средней части, которые описываются количественно с помощью параметров, перечисленных в нижней части схемы Если активный фермент находится только на поверхности иммобилизованного фермента или если субстрат не может проникнуть внутрь частицы катализатора, то следует учитывать только эту внешнюю массопередачу. Часто, однако, фермент равномерно распределен по всему объему проницаемой для субстрата матрицы. В таком случае каталитическая активность большей частью сосредоточена и распределена внутри гранулы катализатора, и субстрат, очевидно, должен диффундировать в гранулу до некоторого активного центра, где и осуществляется реакция. Тот же путь в обратном направлении, должны проходить и продукты реакции. В таких случаях необходимо учитывать как внешнюю массопередачу, так и процессы диффузии внутри частицы катализатора.

Как показано на рисунке 23, реакция в слое иммобилизованного фермента протекает со скоростью, определяемой концентрациями внутри этого слоя. В силу градиентов концентрации локальные скорости реакции изменяются в зависимости от положения центра реакции, а общая скорость превращения субстрата представляет собой сумму всех локальных скоростей трансформации субстрата внутри проницаемого катализатора. В стационарном состоянии эта общая скорость равна скорости транспорта субстрата к катализатору. В общем случае скорость всего процесса зависит как от скорости транспорта, так и от собственной скорости каталитической реакции.

Эти взаимосвязанные процессы играют большую роль в реакциях, катализируемых иммобилизованными ферментами и иммобилизованными клетками. В то же время их роль часто не учитывалась как в теоретических исследованиях, так и в разработке путей практического применения иммобилизованных биокатализаторов. Поэтому здесь подробно будут рассмотрены основные принципы и методы математического моделирования процессов на иммобилизованных ферментах, а также его результаты.

2.2.1 Влияние внешнего сопротивления массопередаче Чтобы было легче усвоить некоторые основные понятия и специфическую терминологию, начнем с самого простого варианта. Предположим, что фермент иммобилизован только на наружных поверхностях носителя, имеющего форму пластины. В этом случае мы должны рассматривать только массопередачу из раствора к поверхности носителя и реакцию на этом носителе.

Одна из традиционных моделей, которую биохимики называют диффузионным слоем Нернста, а технологи – стоячей пленкой, или граничным слоем, приводит к выражению для потока субстрата из жидкой фазы, выраженному в молях в единицу времени: на единицу поверхности к границе раздела фаз (в биохимии называют пулом) где s – концентрация субстрата на границе раздела фаз, – концентрация субстрата в жидкой фазе, – коэффициент массопередачи, который зависит от физических свойств среды, а также от гидродинамических условий вблизи границы раздела фаз и возрастает при повышении скорости потока через реактор колонного типа с насадкой иммобилизованного фермента. Его определяют по известным корреляциям.

В стационарном состоянии субстрат не может аккумулироваться на поверхности катализатора, поэтому скорость поступления субстрата за счет массопередачи должна быть равна скорости его расхода в реакции на поверхности катализатора. Если допустить, что скорость у ферментативной реакции на поверхности (выраженная в молях в единицу времени на единице поверхности) подчиняется уравнению Михаэлиса–Ментен, то получим Число необходимых для описания системы параметров, ) можно уменьшить до двух (Dа и ) путем введения (,, следующих безразмерных переменных С учетом этих параметров уравнение материального баланса по субстрату примет вид Здесь необходимо подчеркнуть физический смысл параметра Dа, числа Дамкелера максимальная скорость массопередачи Так, если Dа 1, то максимальная скорость массопередачи намного превышает максимальную скорость реакции (низкое сопротивление массопередаче, лимитируемый реакцией режим). Если же сопротивление массопередаче велико, то этот фактор ограничивает скорость всего процесса, а Dа 1 (лимитируемый диффузией режим).

Алгебраическим преобразованием уравнения (23) получим квадратное уравнение, из которого определим х аналитическим путем где Dа + 1.

В уравнении (25) знаки «+» и «–» применяются при > 0 и < соответственно. Если = 0, то =. Используя это выражение для, можно с помощью правой или левой части уравнения (25) оценить безразмерную наблюдаемую скорость реакции.

Следует помнить, что в общем случае зависимость от не выражается уравнением Михаэлиса–Ментен. Кроме того, уже нельзя считать равным s1/2, когда ровно в два раза меньше наблюдаемой максимальной скорости реакции, поскольку величина s1/2 зависит от Dа.

Тем не менее параметр s1/2 часто называют кажущейся константой Михаэлиса и используют для оценки влияния массопередачи.

Если перед исследователем стоит только задача определения, s1/2 такое упрощение может оказаться удобным, но в общем случае оно может привести к серьезным ошибкам. Например, можно прийти к выводу, что наблюдаемой скорости реакции соответствует следующее некорректное уравнение В конкретном случае это уравнение может даже удовлетворительно описывать наблюдаемую кинетику процесса, но в целом оно неверно, поскольку в нем не учтена зависимость жидкой среды и гидродинамических свойств слоя вблизи границы раздела фаз. Как показывают экспериментальные данные, такая зависимость может резко изменять кинетику процесса (рисунок 24).

В химической технологии влияние массопередачи на общую скорость реакции традиционно выражают через коэффициент эффективности, физический смысл которого определяется следующим образом наблюдаемая скорость в отсутствии сопротивления массопередаче (при = ) Поэтому 1, и, таким образом, в общем случае повышение сопротивления массопередаче будет сопровождаться снижением наблюдаемой активности катализатора.

Если бы кинетика процесса подчинялась уравнению Михаэлиса– Ментен, то при потоке идеального вытеснения наклон всех кривых на рисунке 24 был бы одинаков и равен.

Изменение наклона с изменением скорости потока свидетельствует о значительном влиянии массопередачи на кинетику процесса в целом.

Рисунок 24 – Экспериментальное обнаружение взаимосвязи между скоростью трансформации субстрата ( =, где и – концентрации субстрата в исходной смеси и в продуктах реакции соответственно) и скоростью потока (указана цифрами на кривых (мл/ч)) в реакторе со слоем иммобилизованного фермента (изучалась реакция гидролиза этилового эфира бензоил-L-аргинина фицином на карбоксиметилцеллюлозе) На рисунке 25 приведены результаты эксперимента, подтверждающие такую зависимость.

Рисунок 25 – Экспериментальный метод обнаружения эффектов внешней диффузии; здесь – скорость реакции при высоких скоростях потока через насадочную колонну (изучалась реакция гидролиза 410–4 М раствора n-нитроанилида N-бензоил-DL-аргинина иммобилизованным трипсином при рН 8 и 25 °С) Если параметр Dа близок нулю (очень медленная по сравнению с максимальной скоростью массопередачи реакция), то, согласно уравнению (23), х приближается к единице, и, следовательно, для лимитируемого реакцией режима (Dа 0) В этом случае кинетика процесса не отличается от истинной, проводится в условиях, когда Dа 1; только тогда будут устранены маскирующие диффузионные эффекты.

Сведения о собственной кинетике ферментативной реакции необходимы также при разработке и проектировании реакторов с иммобилизованными ферментами, поскольку только таким путем можно достаточно надежно учесть влияние свойств жидкой среды, формы носителя фермента и характеристик смешения. Разработано много типов экспериментальных реакторов, предназначенных для изучения реакций обычного гетерогенного катализа в лимитируемом реакцией режиме.

Такие реакторы применяли и для исследования кинетики реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами (рисунок 26).

Рисунок 26 – Реактор с рециркуляцией для изучения влияния внешней массопередачи на кинетику реакций, катализируемых В целях минимизации сопротивления массопередаче во всех этих реакторах вблизи катализатора создавались высокие скорости потока (большие, малые Dа). Что касается иммобилизованных ферментов, то такой подход имеет несколько недостатков. Во-первых, гидродинамическое воздействие может вызвать частичную или даже полную денатурацию ферментов, связанных с носителем. Во-вторых, механическое перемещение одних частиц катализатора относительно других может приводить к потере фермента за счет истирания.

В системах, в которых скорость процесса зависит как от биохимической реакции, так и от массопередачи, лимитируемый диффузией режим возникает тогда, когда значительно больше, то есть при Dа 1. Для лимитируемого диффузией режима (Dа, ограничен) путем ряда преобразований уравнения (25), включая разложение в ряд квадратного корня, можно получить следующие выражения Таким образом, при очень больших значениях Dа реакция имеет первый порядок по общей концентрации субстрата и ее скорость совершенно не зависит от собственных параметров катализатора и. В такой ситуации собственные кинетические параметры иммобилизованных ферментов вообще не проявляются. В лимитируемом диффузией режиме, например, при заданном наблюдаемая активность постоянна, даже если ферменты на границе раздела фаз на самом деле теряют активность, в частности за счет изменения в неблагоприятную сторону температуры, рН или других условий процесса. Поэтому изучение скорости денатурации иммобилизованного фермента должно проводиться только в условиях, максимально приближенных к лимитируемому реакцией режиму.

Задача 5. Маскирование инактивации иммобилизованного фермента массопередачей. Рассмотрим иммобилизованный фермент, необратимо теряющий свою активность в соответствии с уравнением.

В простейшей модели инактивации молекулы активного фермента (Еа) претерпевают необратимые структурные или химические изменения, приводящие к неактивной форме (Еi) Скорость этой реакции пропорциональна концентрации активной формы фермента Примем, что в реакционной смеси нет ни субстрата, ни продукта реакции, ни ингибитора, ни иного эффектора. Тогда в закрытой системе при эффективном перемешивании изменение концентрации активной формы фермента во времени будет описываться уравнением Решив это дифференциальное уравнение, получим Примем, что превращение субстрата является реакцией приблизительно первого порядка.

А. Предположим, что фермент иммобилизован на наружной поверхности непроницаемого для субстрата твердого носителя и что при t = 0 число Дамкелера Da велико. Начертите графики зависимости коэффициента эффективности и скорости реакции от времени. Какие ошибочные выводы относительно влияния иммобилизации на стабильность фермента можно сделать, если не ввести соответствующие поправки на эффекты массопередачи?

Б. Ответьте на тот же вопрос в другой ситуации, когда фермент иммобилизован внутри проницаемой для субстрата пластины. Примите, что внешнее сопротивление массопередаче относительно невелико.

2.2.2 Моделирование диффузии и реакций внутри частицы катализатора Ферменты также иммобилизуют путем связывания с внутренними поверхностями пористых носителей или путем включения в матрицы, через которые может диффундировать субстрат. В таких системах для расчета наблюдаемой скорости трансформации субстрата необходимо знать профиль изменения его концентрации в частице катализатора.

Для этого сначала надо найти уравнение материального баланса в стационарном состоянии для тонкого слоя проницаемого катализатора.

Предположим, что фермент иммобилизован в грануле, форму которой можно считать сферической. Тогда необходимый тонкий слой будет заключен между двумя концентрическими сферами радиусов r и r + dr соответственно (рисунок 27). Толщина этого слоя настолько мала, что все условия внутри него можно считать постоянными независимо от положения.

Рисунок 27 – Схема сферической проницаемой гранулы Символами диффузии субстрата и локальную скорость его трансформации соответственно. Оба этих параметра принципиально отличаются от аналогичных параметров для процессов в растворе, существенна и количественная разница между ними.

Рассмотрим сначала эффективный коэффициент диффузии, учитывая, что скорость диффузии любых веществ через носитель зависит от следующих факторов:

1. Часть поперечного сечения частицы катализатора занята молекулами твердого носителя и поэтому не может использоваться для диффузионного транспорта субстратов (соответствующий параметр – пористость частицы р).

2. Сеть пор переплетена очень сложным образом, поэтому диффузия может происходить только в разрешенных, часто меняющихся направлениях (соответствующий параметр – коэффициент извилистости ).

3. Поры могут иметь очень небольшой диаметр, сравнимый с размерами молекул субстрата (ограниченная диффузия; соответствующий параметр ).

Эффективный коэффициент диффузии можно выразить через эти параметры Здесь – коэффициент диффузии субстрата в жидкой реакционной среде. Параметр пористости р необходимо определять экспериментально для каждого конкретного носителя. Для коэффициента извилистости обычно принимают значения, расположенные в диапазоне от 1,4 до 7,0. Что касается ограниченной диффузии, то соответствующий параметр в первом приближении можно оценить, воспользовавшись следующим уравнением и – (эквивалентный) радиус молекул субстрата и хагде рактеристический радиус поры соответственно. Неопределенность всех параметров в правой части уравнения (30) является причиной того, что найти достоверное значение расчетным путем очень трудно.

Поэтому предпочтительнее оценивать на основе экспериментального изучения общей кинетики процесса. Этот метод мы рассмотрим позднее, после анализа взаимного влияния диффузионных и химических процессов внутри частицы иммобилизованного фермента.

Следует отметить также, что массопередача внутри частицы может зависеть от химии ее внутренних поверхностей и от наличия ионизированных групп. Более того, если в реакции участвуют или образуются ионизированные соединения, то внутри частицы катализатора могут создаваться градиенты электрического потенциала, которые будут изменять скорости транспорта заряженных веществ.

Если допустить, что собственная кинетика локальной ферментативной реакции с участием иммобилизованного фермента подчиняется уравнению Михаэлиса–Ментен то параметр максимальной скорости в данном случае можно определить по формуле где – нагрузка носителя ферментом (количество микромолей фермента в 1 г носителя);, – удельная активность иммобилизованного фермента (число микромолей субстрата, превращаемых в 1 с 1 мкмоль фермента); – плотность частиц (количество граммов носителя в единице его объема).

Иммобилизация может изменять структуру фермента и (или) его молекулярное окружение, и, следовательно, величины, и для иммобилизованного фермента могут отличаться от соответствующих величин для фермента в растворе.

Уравнение материального баланса для стационарного состояния в тонком слое, ограниченном радиусами r и r + dr, можно записать в следующем виде в пределе при или таким образом, главное уравнение (37) для расчета скорости является дифференциальным уравнением второго порядка, к которому необходимо добавить граничные условия. Профиль изменения концентрации в частице катализатора симметричен относительно центра сферы Допускаем, что концентрация субстрата на наружной поверхности гранулы равна концентрации субстрата в жидкой среде, омывающей гранулу, тогда Наблюдаемая общая скорость утилизации субстрата частицей катализатора равна поступлению субстрата в гранулу за счет диффузии. Величина, выраженная в молях на единицу объема гранулы в единицу времени, составляет Здесь символами и обозначены объем частицы и площадь ее наружной поверхности соответственно.

Как и в предыдущем разделе, такие скорости мы будем выражать в виде безразмерного параметра, определяющего влияние диффузионных эффектов. Коэффициент эффективности определяется Если в соответствии с уравнением (32) изменяется нелинейно, то определить коэффициент эффективности аналитическим путем непросто. Для этого необходимо решить в цифровой форме задачу о граничном значении (37)–(39) и затем по уравнению (40) найти.

Такие вычисления сложны и трудоемки, поэтому выразим результаты в наиболее простой и общей форме. Для этого преобразуем уравнения в эквивалентные безразмерные выражения.

Введем параметры = и =, тогда уравнение (37) можно записать в следующей форме Здесь безразмерные параметры и определяются как Соответствующие уравнению (42) безразмерные граничные условия равны Физический смысл параметра, называемого модулем Тила, заключается в том, что квадрат модуля Тила представляет собой частное от деления скорости реакции первого порядка на скорость диффузии отклонения локальных скоростей от кинетики первого порядка, причем большие значения свидетельствуют о том, что порядок реакции приближается к нулевому.

Выразим через эти безразмерные переменные коэффициент эффективности Согласно уравнениям (42) и (44), является функцией только, и, и поэтому ( ) зависит только от и. Учитывая уравнение (45), отсюда следует, что При использовании выражения (46) для оценки коэффициента эффективности возникает проблема, связанная с тем, что собственные неизвестны. С помощью простых преобразований можно показать, однако, что при определении можно обойтись и без первого. Действительно, из уравнений (45) и (40) следует, что параметра Подстановка этого выражения в правую часть уравнения (46) приводит к уравнению (49), отражающему неявную зависимость Новый безразмерный наблюдаемый модуль Ф определяется следующим образом Ф зависит только от наблюдаемой общей скорости и не зависит от собственных кинетических параметров каталитической реакции.

На рисунке 28 приведены графики зависимости от Ф, выражаемые уравнением (48) при 0 и. Поскольку коэффициенты эффективности для промежуточных значений располагаются между кривыми для этих двух прeдельных случаев, нетрудно видеть, что коэффициент сравнительно не чувствителен к последнему собственному параметру.

Рисунок 28 – Коэффициенты эффективности иммобилизованных ферментных катализаторов с собственной кинетикой, описываемой уравнением Михаэлиса–Ментен ( = ). Определение безразмерного наблюдаемого модуля Ф дано в уравнении (49) Прежде чем перейти к изучению аналитических решений, основанных на приближенной оценке кинетики процессов, нам нужно найти выражение для, применимое при больших значениях Ф (или ) и кинетике, выражаемой уравнением Михаэлиса–Ментен. Если модуль Ф достаточно велик (Ф 3 ; см. таблицу 17), то субстрат быстрее утилизируется ферментом, чем диффундирует внутрь гранулы катализатора.

Таблица 17 – Критерий для оценки влияния эффектов массопередачи на кинетику всего процесса Ф < 0,3 ~1 Биохимическая реакция Незначительное В такой ситуации, когда скорость всего процесса определяется скоростью диффузии, можно допустить, что весь субстрат трансформируется в граничащем с наружной поверхностью тонком слое гранулы катализатора, поэтому эффектом кривизны ( ) в уравнении (37) можно пренебречь. Отсюда следует, что нения (51) и затем интегрировать по, то получим здесь и – концентрации субстрата в центре частицы (r = 0) и на ее поверхности (r = R) соответственно.

В случае лимитируемой диффузией реакции 0, что позволяет вычислить интеграл в уравнении (52). Совместное решение уравнений (40), (41) и (52) приводит к следующему выражению для коэффициента эффективности, справедливому при достаточно больших значениях Ф или (общая скорость процесса определяется диффузией):

Преобразование этого уравнения для частного случая кинетики, выражаемой уравнением Михаэлиса–Ментен (32), дает Продолжая изучение кинетики, выражаемой уравнением Михаэлиса–Ментен, отметим, что если допустить первый порядок реакции (это справедливо при ), то согласно данным, приведенным на рисунке 28, где и принимает консервативное (низкое) значение, достаточно близко приближающееся к истинному значению.

Воспользовавшись линейной зависимостью (55), мы можем решить аналитическим путем уравнения модели лимитируемого диффузией процесса; таким образом получим где С помощью уравнения (57) можно получить изображенную на рисунке 28 кривую, отвечающую реакции первого порядка, если использовать справедливую в такой ситуации зависимость Другой предельный случай кинетики Михаэлиса–Ментен характерен для реакций, порядок которых приближается к нулевому ( ); такую ситуацию можно определить следующим образом Совместное решение задачи о граничном значении (37)–(39) и функции утилизации фермента показывает, что концентрация субстрата s зависит от радиуса r Это выражение справедливо при всех неотрицательных значениях s, то есть в интервале от некоторого критического радиуса r = R до некоторого критического радиуса r =, определяемого путем решения уравнения (37) совместно с уравнением (39) при граничных условиях Это решение приводит к кубическому уравнению относительно Таким образом, если уравнение (62) имеет положительный корень, величина которого меньше единицы, то внутри гранулы катализатора существует некоторая область (от r = 0 до r = ), в которой s = 0 и = 0. В таких случаях реакция протекает только во внешнем слое частицы ( < ), так что Если не существует имеющего физический смысл решения уравнения (62), то = 1 и скорость трансформации субстрата во всем объеме гранулы катализатора одинакова.

Другим важным следствием изображенных на рисунке 28 зависимостей является малое влияние геометрии частицы катализатора на взаимозависимость и. Например, коэффициент эффективности реакции первого порядка в пластине определяется выражением где определяется по уравнению (57) при, равном половине толщины пластины. Эта функция во всем диапазоне значений отличается от функции в уравнении (56) не более, чем на 10 %.

Наибольшие отличия наблюдаются при, близком к единице; с возрастанием или убыванием эта разница быстро уменьшается.

Незначительное влияние геометрии частиц катализатора на функцию = () часто позволяет использовать следующие эмпирические корреляции для коэффициента эффективности пластины иммобилизованного фермента с собственной кинетикой, описываемой уравнением Михаэлиса–Ментен здесь – асимптотическое значение коэффициента эффективности, определяемое по уравнению (54). Эти корреляции, первоначально разработанные для катализаторов с частицами, имеющими форму пластин, можно применять и к другим симметричным геометриям частиц, используя в формулировке модуля Тила в качестве параметра характеристической длины частное от деления объема частицы на ее наружную поверхность.

Малая чувствительность функции к изменениям порядка реакции и геометрии частиц катализатора явилась основой удобного общего критерия, позволяющего различать лимитируемые реакцией и лимитируемые диффузией процессы. Этот критерий (таблица 17) сводится к единственному параметру Ф, который зависит только от наблюдаемых переменных. В небиологическом катализе параметр обычно рассматривают как меру эффективности использования катализатора. Если существенно отличается от единицы, то общая скорость процесса может быть повышена путем измельчения катализатора; при этом Ф уменьшается и, следовательно, возрастает. Такой подход применяется и в биологическом катализе, он указывает на наличие связи между размером частиц иммобилизованного фермента и максимальной эффективностью процесса.

Непосредственное изучение собственной кинетики также возможно только в тех случаях, когда фактор эффективности близок к единице. На катализаторе с достаточно малыми размерами частиц (см. задачу 6) можно экспериментально определить характер изменения скорости катализируемой иммобилизованным ферментом реакции и найти значения соответствующих кинетических параметров. Эта информация необходима для расчета наблюдаемой общей кинетики реакции на более крупных частицах катализатора. Поскольку в водных растворах эффективные коэффициенты диффузии субстрата и (или) общие концентрации субстрата обычно невелики, то лимитируемый диффузией режим, как правило, обусловливается сравнительно большими размерами частиц катализатора, что может быть необходимым или для снижения перепада давлений и сопротивления потоку в реакторах с неподвижным слоем катализатора, или для предотвращения разрушения частиц катализатора в реакторах с псевдоожиженным слоем и со взвесями катализатора. Иногда лимитируемый реакцией режим трудно воспроизвести даже в лабораторных условиях. В таких случаях данные о собственных кинетических параметрах иммобилизованного фермента приходится получать описанным выше аналитическим путем на основе экспериментальных данных, усложненных диффузионными эффектами. Как это показано в примере 3 и задаче 7, экспериментальное изучение кинетики реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами, позволяет оценить и эффективный коэффициент диффузии субстрата.

Пример 3. Определение эффективного коэффициента диффузии субстрата и собственных кинетических параметров катализатора на основе иммобилизованного фермента. В качестве исходного положения примем, что собственная кинетика каталитической реакции подчиняется уравнению Михаэлиса–Ментен. Характерные для данного катаи лизатора собственные кинетические параметры, а также эффективный коэффициент диффузии субстрата можно определить по результатам двух серий кинетических экспериментов, в одной из которых используется катализатор со сравнительно большими частицами (обеспечивающими большие значения и, следовательно, лимитируемые диффузией условия), а во второй – катализатор с гораздо более мелкими частицами (достаточно малыми, чтобы скорость трансформации субстрата определялась скоростью реакции). В каждой серии экспериментов необходимо определить значения, отвечающие различным, и затем выразить эти зависимости в графической форме в координатах Эди–Хофсти (зависимость от ). При достаточно больших значениях реакция имеет нулевой порядок во всем объеме частиц катализатора и, следовательно, коэффициент эффективности равен единице, а кривые для больших и малых частиц катализатора совпадают (это говорит о том, что в случае катализатора с большими частицами условие (62) не выполняется и что ограниченная растворимость субстрата не лимитирует эксперименты в диапазоне ). Таким образом, независимо от размера частиц кривые будут отсекать на оси абсцисс отрезок, равный С другой стороны, если внешняя концентрация субстрата и общая скорость реакции невелики, то собственный порядок каталитических реакций будет приближаться к единице. Тогда для частиц малого размера (лимитируемый реакцией режим) равно, а для больших размеров частиц иммобилизованного фермента, то есть для лимитируемого диффузией режима Следовательно, кривая зависимости от будет отсекать на оси ординат в случае мелких частиц отрезок, равный, а в случае больших частиц – отрезок, определяемый уравнением (66). Таким образом, зная размер больших частиц катализатора и величины трех отрезков, отсекаемых на осях координат кривыми зависимости от, На рисунке 29 представлены результаты применения описанной методики к -химотрипсину, иммобилизованному на активированной бромцианом сефарозе 4В. Определенные таким образом удельная активность иммобилизованного фермента qE (qE – частное от деления на число молей иммобилизованного активного фермента в единице объема катализатора) и составляют 213 мкмоль субстрата (АТЕЕ, этилового эфира N-ацетил-L-тирозина) на 1 мкмоль активного фермента в секунду и 2,6 мМ соответственно. Эти значения существенно отличаются от соответствующих параметров того же фермента в растворе, составляющих 311 мкмоль АТЕЕ на 1 мкмоль активного фермента в секунду (удельная активность) и 0,73 мМ ( ); отсюда следует, что иммобилизация заметно изменяет каталитические свойства фермента. Оценка эффективного коэффициента диффузии АТЕЕ в этом катализаторе приводит к величине 3,810–6 см2/с. Столь малое значение и высокая активность иммобилизованного фермента предполагают существенные диффузионные ограничения даже в случае катализатора с частицами радиусом 60 мкм. Определение модуля Ф этого катализатора дает величину 2,6.

иммобилизованного на больших (R = 60 мкм; ) и маленьких (R = 10 мкм; ) гранулах активированной BrCN сефарозы 4В При создании катализаторов на основе дорогих и высокоактивных металлов на носителях обычно стремятся локализовать сам катализатор в тонком наружном слое частиц носителя. Такой же подход применим и при разработке катализаторов на основе иммобилизованных ферментов: используя максимально допустимые для данного процесса размеры частиц носителя, можно обходиться минимальным количеством фермента. Существует несколько методов, пригодных для получения таких катализаторов. Было показано, что в катализаторах, полученных путем импрегнирования пористого носителя раствором фермента, распределение биокатализатора внутри частицы носителя может быть очень неравномерным. Из задачи 8 видно, что неравномерное распределение фермента влияет на кажущуюся активность и характер инактивации иммобилизованного фермента. В случае обратимой реакции минимальная концентрация субстрата внутри частицы катализатора равна его равновесной концентрации. Следовательно, при вычислении асимптотического коэффициента эффективности, например по уравнению (63), нижний предел интегрирования должен быть равен равновесному значению. Из-за различных коэффициентов диффузии разных веществ стехиометрические соотношения внутри частицы катализатора могут отличаться от стехиометрии такого же процесса в растворе. Это явление рассмотрено в задаче 9.

В системах, в которых скорость процесса определяется как диффузией, так и самой реакцией, пусть субстрат является ингибитором собственной реакции иммобилизованного фермента. Если внешняя концентрация субстрата превышает концентрацию субстрата, соответствующую максимальной скорости, то внутри частицы катализатора снижение концентрации субстрата вызовет увеличение локальной скорости реакции до значений, превышающих скорость реакции на внешней поверхности частицы. В этой ситуации при определенных условиях можно наблюдать коэффициенты эффективности, превышающие единицу. Такое поведение возможно для любой автокаталитической реакции, то есть такой системы, в которой скорость реакции возрастает.

Задача 6. Подбор биокатализатора для лимитируемого реакцией режима. Этиловый эфир ацетил-L-тирозина (АТЕЕ) гидролизуется иммобилизованным -химотрипсином с удельной объемной скоростью 18,4 мкмоль АТЕЕ в 1 см3 за 1 с. Найдено, что эффективный коэффициент диффузии АТЕЕ равен приблизительно 3,810–6 см2/с.

Биокатализатор с каким радиусом сфер надо выбрать для изучения кинетических свойств иммобилизованного фермента в лимитируемом реакцией режиме?

Задача 7. Обратимая изомеризация глюкозы в насадочной колонне. Промышленно важный процесс изомеризации глюкозы во фруктозу осуществляют в реакторе колонного типа с неподвижным слоем иммобилизованной глюкозоизомеразы; кинетика катализируемой этим ферментом реакции описывается уравнением Михаэлиса– Ментен для обратимых реакций [1].

А. Покажите, что подстановка = ( – равновесная концентрация) в указанное уравнение приводит к простому уравнению Михаэлиса–Ментен (относительно ). Как в этом уравнении будут выражены кажущиеся константа Михаэлиса ( ) и максимальная скорость ( )?

Б. Изменение в зависимости от положения в одномерном неподвижном слое катализатора с пористостью и при средней скорости потока иz может быть описано уравнением с одним краевым условием = при z = 0.

Путем интегрирования этого выражения найдите другое уравнение, определяющее параметры работы реактора через объемную производительность (), определяемую как = L(1–)/иz (частное от деления объема реактора (катализатора) на объемную скорость потока).

В. Рассмотрим медленно инактивирующийся иммобилизованный фермент, находящийся в реакторе с неподвижным слоем катализатора, описанным в части Б настоящей задачи. Если процесс инактивации подчиняется закону еактивн = е(t = 0)ехр(– ), найдите по измененным соответствующим образом данным предыдущей задачи функцию, ( )), график зависимости которой от времени t позволил f(, бы определить как, так и.

Задача 8. Иммобилизованный ферментный катализатор с неравномерным распределением фермента. Приняв, что катализируемая реакция имеет первый порядок, сравните общие скорости и коэффициенты эффективности, когда иммобилизованный в пористой пластине фермент, имеющий одно и то же число единиц ферментативной активности:

А. Распределен равномерно по всему объёму пластины.

Б. Сконцентрирован и равномерно распределен во внешнем слое пластины вблизи наружной поверхности катализатора, причем во внутренней области, толщина которой равна половине толщины пластины, фермент совершенно отсутствует.

Задача 9. Стехиометрия реакций внутри частицы катализатора. Внутри пористой частицы иммобилизованного фермента осуществляется катализируемая ферментом реакция где,, и – стехиометрические коэффициенты.

А. Используя уравнения материального баланса для субстратов и продуктов реакции, найдите выражения, определяющие концентрации всех веществ внутри частицы катализатора через концентрацию S (в той же точке частицы), концентрации на наружной поверхности частицы, а также эффективные коэффициенты диффузии субстратов и продуктов реакции.

Б. Покажите, что реагент, ограниченно растворимый в реакционной среде, будет лимитировать скорости реакций внутри частицы иммобилизованного фермента.

2.2.3 Одновременное сопротивление массопередаче в граничном слое и внутри частицы катализатора В двух предыдущих разделах мы рассматривали особые случаи взаимного влияния массопередачи и биохимической реакции, схематически изображенные на рисунке 23. В общем случае, однако, субстрат должен сначала пройти через граничный слой или стоячую пленку, а затем диффундировать в частицу катализатора, где и происходит его превращение. Одна из целей анализа этой наиболее общей ситуации будет заключаться в изыскании путей использования рассмотренных выше упрощенных моделей. Нужно знать, когда доминирует внутреннее сопротивление массопередаче, когда – внешнее сопротивление и когда нужно учитывать оба типа сопротивления.

Решение поставленных задач целесообразно начать с изучения простой модели иммобилизованного ферментного катализатора с геометрией пластины и кинетикой собственной реакции первого порядка.

Тогда уравнение материального баланса для субстрата внутри частицы в стационарном состоянии можно записать как с условием симметрии для средней линии На внешней поверхности пластины (х = L) субстрат не аккумулируется. Транспорт через эту поверхность внутрь частицы катализатора путем диффузии равен транспорту в обратном направлении через граничный слой; следовательно, граничное условие выражается следующим уравнением Совместное решение уравнений (67)–(69) позволит определить коэффициент эффективности, который может быть записан В этом выражении модуль Тила имеет тот же физический смысл, что и ранее ((57) для геометрии пластины ввели новый важный параметр Вi – число Био и определяемый удельная скорость транспорта через граничный слой удельная скорость диффузии в частице катализатора Уравнение (70) удобнее преобразовать в другую форму где (= tg /) – коэффициент эффективности катализатора в отсутствие сопротивления транспорту в граничном слое. Величину, обратную коэффициенту эффективности, можно рассматривать как меру сопротивления превращению субстрата, обусловленного требованиями к транспорту последнего. Таким образом, уравнение (72) отражает известное правило, по которому общее сопротивление равно сумме отдельных сопротивлений.

Уравнение (72) позволяет ответить на вопрос, при каких условиях можно пренебречь одним из сопротивлений. Если то можно пренебречь сопротивлением внешнего граничного слоя. Если же 1, то можно не принимать во внимание внутреннее сопротивление частицы катализатора. Во всех промежуточных случаях учитывают оба сопротивления. При больших значениях наблюдается обратная пропорциональная зависимость от. Альтернативный критерий, не требующий знания собственной константы скорости, основан на построении графиков зависимости от Ф для различных Bi; при Bi 100 влияние внешнего сопротивления незначительно.

Oценка типов массопередачи, оказывающих большое влияние на скорость всего процесса, всегда базируется на сравнительном изучении собственной скорости реакции, диффузионных эффектов в частице катализатора и внешней массопередачи.

Задача 10. Одновременная оценка параметров кинетики реакции и массопередачи. Фермент иммобилизован на поверхности непористого твердого тела. Приняв, что внешним сопротивлением массопередаче нельзя пренебречь и что собственная кинетика ферментативной реакции описывается уравнением Михаэлиса–Ментен.

А. Найдите выражение, четко определяющее коэффициенты в координатах Лайнуивера – Бэрка; с помощью этого уравнения выразите кажущиеся максимальную скорость ( ) и константу Михаэлиса ) через реальные переменные v,, (коэффициент массопередачи).

Б. Покажите, как можно графическим путем определить параметры v,,, если имеются данные для достаточно большого диапазона концентраций субстратов.

2.2.4 Влияние ингибиторов, температуры и рН на каталитическую активность и инактивацию иммобилизованных ферментов В литературе [1] были рассмотрены математические выражения, описывающие процессы инактивации ферментов и влияние различных параметров (концентраций ингибиторов и активаторов, температуры, рН, ионной силы и т.д.) на ферментативную активность в растворах.

В общем случае можно ожидать, что эти выражения будут пригодны и для описания зависимости собственной активности иммобилизованного фермента от различных параметров. В то же время, иммобилизация может сопровождаться изменением собственных свойств фермента. Так, иммобилизованные ферменты могут иметь другие константы скорости реакций; более того, иммобилизация может даже потребовать изменения формы уравнений, описывающих влияние параметров реакции на собственную активность фермента. Для определения отклика собственной каталитической активности иммобилизованного фермента на изменения параметров реакции необходимо тщательное изучение кинетики реакции с применением описанных в литературе [1] методов, позволяющих изучать только кинетическое поведение системы, а не сочетание скоростей массопередачи и каталитических реакций.

Процессы массопередачи могут оказывать влияние на взаимосвязь между кажущейся общей каталитической активностью иммобилизованного фермента и условиями среды. Все необходимые данные могут быть получены путем изучения кинетики реакций первого порядка. Прежде всего следует запомнить, что наблюдаемая общая кинетика реакций с участием иммобилизованного фермента, функционирующего в лимитируемом реакцией режиме, не отличается от собственной локальной кинетики этой ферментативной реакции.

Следовательно, изучаемая в этом режиме реакция будет иметь первый порядок, а константа скорости процесса будет равна собственной константе скорости ферментативной реакции. В случае же иммобилизованного ферментного катализатора, функционирующего в лимитируемом диффузией режиме, кажущийся порядок реакции также будет первым, но кажущаяся константа скорости будет равна квадратному корню из собственной константы скорости ферментативной реакции (в общем случае если реакция протекает по n-му порядку, то кажущийся порядок этой реакции в лимитируемых диффузией условиях будет равен (n + 1)/2). Таким образом, кажущаяся энергия активации составит лишь половину истинной энергии активации. Точно так же и влияние изменения любых параметров реакции на наблюдаемую общую кинетику процесса будет меньшим, чем действительный эффект изменения этих же параметров на локальную, собственную кинетику ферментативной реакции. Например, если процессы инактивации, введение ингибитора или изменение рН уменьшают константу скорости собственно ферментативной реакции в 4 раза, то в лимитируемых диффузией условиях наблюдаемая общая скорость процесса уменьшится только в 2 раза. Из всего сказанного следует, что при изучении влияния параметров реакции на кинетику катализируемых иммобилизованными ферментами реакций следует быть предельно внимательным. Если не соблюдены лимитируемые реакцией условия или если экспериментальные данные, полученные в условиях, когда диффузия вносит определенный вклад в течение процесса, не переработаны с целью получения сведений о собственной кинетике ферментативной реакции, то любые выводы о зависимости активности иммобилизованного фермента от условий процесса будут иметь ценность только для данной партии катализатора, только в данных условиях реакции и никоим образом не будут описывать собственное поведение иммобилизованного фермента. В таком случае любые изменения скорости потока раствора субстрата через слой катализатора, размера его частиц, структуры пор, содержания или распределения фермента в частице катализатора будут сопровождаться изменениями найденных ранее зависимостей активности катализатора от параметров процесса. Это подчеркивает важность и необходимость четкого разграничения собственных свойств иммобилизованного фермента от тех его характеристик, которые обусловлены эффектами массопередачи.

Поскольку в большинстве случаев иммобилизованные ферменты функционируют в условиях, когда диффузионные эффекты в заметной степени влияют на скорость процесса или даже определяют ее, то многие имеющиеся в литературе экспериментальные данные по определению скоростей инактивации и влияния рН и температуры на кинетику реакций, очевидно, не описывают собственные свойства иммобилизованных ферментов.

В то же время имеется множество фактов, свидетельствующих об изменении собственной кинетики инактивации ферментов после их иммобилизации. Предлагались и постулировались различные механизмы и интерпретации этого явления; некоторые из гипотез выдержали экспериментальную проверку.

Во-первых, вследствие иммобилизации ферменты удерживаются в относительно фиксированном в пространстве положении, что уменьшает вероятность таких взаимодействий между молекулами фермента, которые способствуют их инактивации за счет агрегации или автолиза (в случае протеолитических ферментов).

Во-вторых, наличие нескольких связей молекулы фермента с носителем затрудняет нарушение третичной структуры белка. Известно, что попытки создать комплементарную поверхности фермента микроструктуру носителя путем включения фермента в гель сопровождались резким повышением его стабильности. Аналогично иммобилизация стабилизирует активную форму ферментов, состоящих из нескольких субъединиц, и тем самым может замедлять инактивацию, обусловленную диссоциацией олигомерных белков.

Повышенная устойчивость иммобилизованных ферментов может быть также обусловлена благоприятным местным окружением, в меньшей степени инактивирующим белок, чем окружение в растворе. В качестве примеров можно привести носители, поверхности которых обладают буферными свойствами, или снижают местную концентрацию кислорода, или адсорбируют ферментные яды, или катализируют превращение денатурирующих веществ (например, Н2О2) в безвредные соединения. Вероятно, на стабилизацию иммобилизованных ферментов могут оказывать влияние и другие факторы.

Задача 11. Гистерезис; влияние рН на иммобилизованный папаин. Изучение рН-электрода, на поверхность которого нанесен папаин, показывает, что зависимость генерируемого на поверхности электрода рН (внутреннего рН) от рН в растворе при различных направлениях изменения рН выражается разными кривыми. В данном случае изучалась реакция гидролиза этилового эфира бензоиларгинина (ВАЕЕ) до соответствующей кислоты.

А. Приняв, что, слой фермента очень тонок и активность папаина максимальна при рН 6,0, покажите, что это явление может быть обусловлено внешним сопротивлением массопередаче.

Б. Кинетические константы этой реакции, катализируемой растворимым ферментом, при рН 6,0 и 20 °С равны: k2 = 19 ME (1 международная единица (ME) равна количеству микромолей ВАЕЕ, гидролизуемых 1 мг фермента в 1 мин), K1 = 510–3 М. Найдите величину коэффициента массопередачи иона водорода и соответствующее указанным константам значение рK2 фермента, если на поверхность электрода нанесено мг/см2 фермента и активность иммобилизованного фермента составляет только 6 % активности фермента в растворе. Во всех случаях s.

В. По найденной величине рK2 и приведенным в предыдущей части задачи параметрам вычислите коэффициенты эффективности при различных внешних рН; постройте график зависимости коэффициента эффективности от внешнего рН. Иногда коэффициент должен превышать единицу, а при некоторых рН задача должна иметь несколько решений.

Задача 12. Кинетика реакций иммобилизованных ферментов с разделением зарядов. Концентрацию заряженного вещества (субстрата, ингибитора) на заряженной матрице, например на ферментной мембране, можно выразить следующим уравнением где z – ионный заряд субстрата или ингибитора; е – заряд электрона;

– электростатический потенциал мембраны (раствор = 0). Покажите, что кажущиеся величины КS и КI определяются выражением если рассматривать концентрации в объеме всего раствора. Допуская, что в мембране имеются е, е–, е2– (е– – активная форма фермента), покажите, что максимальная начальная скорость реакции (если пренебречь влиянием массопередачи) достигается в случае матрицыносителя фермента с, определяемым уравнением где = eze/RT и = [Н+] в основной массе раствора.

Задача 13. Микрокапсулирование; -галактозидаза. Гидролиз лактозы -галактозидазой ингибируется продуктом реакции, и поэтому уравнение, выражающее скорость этой реакции, имеет форму С целью облегчения процесса выделения -галактозидазы из молока раствор фермента заключен в микрокапсулы из нитроцеллюлозы диаметром около 30 мкм.

А. Постройте график в координатах Лайнуивера–Бэрка для р = 0;

0,5; 1,5; 5,0 и 10,0 мМ (е0 = 75 мг в 100 мл) при условии, что kр = 0,57 мкмоль/(мгмин) = 0,54 мМ, = 1,5 мМ.

Б. На основе графика части А задачи, не привлекая приведенное в условии уравнение, постройте графики зависимости 1/ от 1/ для периодического процесса при следующих начальных условиях В. Покажите, что даже при максимально возможной скорости реакции в микрокапсуле в системе, описанной в части А, скорость процесса лимитируется реакцией, тo еcть диффузия субстрата и продукта реакции осуществляются быстрее, чем сама реакция.

Задача 14. Мембранный биореактор. Фермент удерживается в проточном биореакторе полупроницаемой мембраной. Активный фермент инактивируется в ходе реакции первого порядка с константой. Постоянство состава продуктов реакции обеспечивают скорости путем постепенного введения активного фермента в реактор, чтобы концентрация активного фермента в нем была постоянной, равной еа.

На мембране концентрируется гелеобразный слой фермента, увеличивающий сопротивление потоку раствора, поэтому с целью обеспечения постоянной скорости потока J реакционной смеси через мембрану приходится непрерывно регулировать падение давления на мембране.

В то же время необходимая скорость потока J может быть достигнута только в том случае, если общая концентрация фермента еtot (сумма активной и неактивной форм) не превышает некоторое максимально допустимое значение, определяемое уравнением где – концентрация насыщения фермента и – коэффициент массопередачи фермента.

А. Определите зависимость общей концентрации фермента в реакторе от времени.

Б. Если скорость потока падает ниже J, то процесс следует остановить, а реактор подвергнуть чистке. Определите максимальное время непрерывной работы реактора В. Найдите значение J, позволяющее получить максимальное количество продукта реакции за период непрерывной работы реактора Г. Решите задачу В при е0 = 50 кг/м3 (все другие параметры не изменяются).

Д. Как влияет константа скорости инактивации определяемую по условиям задачи «В»? На какие другие важные с экономической точки зрения параметры влияет ?

ЛИТЕРАТУРА

Основная 1. Ламберова, М.Э. Ферментативная кинетика / М.Э. Ламберова;

Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2013.

Ч. 1 – 77 с.

2. Грачева, И.М. Технология ферментных препаратов / И.М. Грачева, А.Ю. Кривова. – М.: Изд. «Элевар», 2000. – 512 с.

3. Лаптев, С.В. Микробиология / С.В. Лаптев, Н.И. Мезенцева, Е.П. Каменская, М.Э. Ламберова; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск:

Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2012. – 319 с.

4. Ламберова, М.Э. Моделирование биотехнологических процессов / М.Э. Ламберова, Е.А. Скиба; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2011. – 114 с.

Дополнительная 5. Бейли, Дж. Основы биохимической инженерии / Дж. Бейли, Д. Оллис. – М.: Мир, 1989. – т. 1. – 562 c.

6. Кантере, В.М. Теоретические основы технологии микробиологических производств / В.М. Кантере. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.

Ламберова Марина Эдуардовна

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА

Редактор Глядищева Е.Е.

Технический редактор Богомолова О.А.

Подписано в печать 11.12.13. Формат 6084, 1/ Усл. п. л. – 5,81. Уч.-изд. л. – 6, Печать – ризография, множительно-копировальный аппарат «RISO EZ300»

Тираж 65 экз. Заказ 2013- Издательство Алтайского государственного технического университета 656038, г. Барнаул, пр-т Ленина, Оригинал-макет подготовлен ИИО БТИ АлтГТУ Отпечатано на ИИО БТИ АлтГТУ 659305, г. Бийск, ул. Трофимова,