«М.Э. Ламберова ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА В двух частях Часть 2 Допущено научно-методическим советом БТИ АлтГТУ для внутривузовского использования в качестве учебного пособия для самостоятельной подготовки к практическим ...»

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Бийский технологический институт (филиал)

федерального государственного бюджетного образовательного

учреждения высшего профессионального образования

«Алтайский государственный технический университет

им. И.И. Ползунова»

М.Э. Ламберова

ФЕРМЕНТАТИВНАЯ КИНЕТИКА

В двух частях

Часть 2 Допущено научно-методическим советом БТИ АлтГТУ для внутривузовского использования в качестве учебного пособия для самостоятельной подготовки к практическим занятиям по специальным курсам для студентов направлений подготовки 240700.62 и 260100.62 всех уровней и форм обучения Издательство Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова УДК 663.15 (075.8) Л Рецензенты: Е.Н. Широкова, к. т. н., зав. кафедрой перерабатывающей промышленности АКГБУ СПО «Алтайский колледж промышленных технологий и бизнеса», А.Н. Паседкина, к. б. н., доцент кафедры ОХЭТ БТИ АлтГТУ Ламберова, М.Э.

Ферментативная кинетика: учебное пособие. В 2 ч. Ч. 2 / Л М.Э. Ламберова; Алт. гос. техн. ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт.

гос. техн. ун-та, 2013. – 100 с.

Настоящее учебное пособие содержит теоретические сведения о физических и химических способах иммобилизации ферментов на нерастворимых носителях и практические – о математических моделях для расчетов скорости гетерогенных ферментативных реакций. Рассмотрено влияние на общую скорость процесса геометрии и других свойств носителей, а также массопередачи, диффузии и внешних условий рН, температуры и т.д. Кроме того, показано применение ферментов в биотехнологическом производстве и медицине.

УДК 663.15 (075.8) Рассмотрено и одобрено на заседании научно-методического совета Бийского технологического института Протокол № 7 от 25.06.2013 г.

© Ламберова М.Э., © БТИ АлтГТУ,

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

1 Теоретическая часть

1.1 Применение гидролитических ферментов

1.1.1 Гидролиз крахмалосодержащих материалов................ 1.1.2 Гидролиз целлюлозосодержащих материалов.............. 1.1.3 Гидролиз белковых веществ

1.1.4 Применение эстераз

1.1.5 Ферментные смеси, пектиновые ферменты и другие пути использования ферментов

1.2 Области применения ферментативных реакций в растворах

1.2.1 Применение ферментов в медицине

1.2.2 Применение негидролитических ферментов в промышленности

1.3 Технологические процессы с участием иммобилизованных ферментов

1.3.1 Методы иммобилизации ферментов

1.3.2 Промышленные процессы на иммобилизованных ферментах

1.3.3 Применение иммобилизованных ферментов в медицине и биохимическом анализе

1.3.4 Утилизация и регенерация кофакторов

2 Практическая часть

2.1 Ферментативные реакции в гетерогенных системах............ 2.2 Кинетика реакций, катализируемых иммобилизованными ферментами

2.2.1 Влияние внешнего сопротивления массопередаче....... 2.2.2 Моделирование диффузии и реакций внутри частицы катализатора

2.2.3 Одновременное сопротивление массопередаче в граничном слое и внутри частицы катализатора................ 2.2.4 Влияние ингибиторов, температуры и рН на каталитическую активность и инактивацию иммобилизованных ферментов

Литература

ВВЕДЕНИЕ

В данном учебном пособии мы рассмотрим некоторые примеры практического применения ферментов, системы гетерогенного катализа и различные типы и методы получения иммобилизованных ферментных катализаторов. Кинетические параметры таких биокатализаторов зависят от массопередачи, диффузии и от природы биохимических реакций, поэтому важно знать совместное влияние этих факторов на свойства катализаторов.

Все применяющиеся в практике ферменты получают из природных источников. Хотя ферменты синтезируются в любой живой клетке, конкретный фермент целесообразно выделять только из одного источника – растения, животного или микроорганизма. Выделенные из животных ферменты могут иметь сравнительно высокую стоимость.

Выделение растительных ферментов (например, папаина из папайи) обычно проще, но сырье является продовольственным. Из-за быстрого самовоспроизведения микроорганизмов по сравнению с растениями и животными микробиологические процессы проще приспособить к спросу на ферменты. С другой стороны, ферменты для производства пищевых продуктов или лекарственных препаратов могут производиться только с помощью безопасных микроорганизмов.

Все ферменты подразделяют на две категории – внеклеточные и внутриклеточные. К первой категории относятся ферменты, выделяемые клеткой в среду, где они расщепляют питательные полимерные вещества до низкомолекулярных соединений, которые могут проникать в клетку через клеточную стенку. Внутриклеточные ферменты в нормальных условиях сконцентрированы в объеме клетки и в среду не транспортируются; для их выделения необходимо дезинтегрировать клетки путем размола или другим способом.

Для некоторых областей применения ферментов необходимы чистые препараты. Например, глюкозооксидаза, применяющаяся для обессахаривания яиц (в производстве яичного порошка) не должна содержать протеолитических ферментов, а также чистые ферменты применяются в клинической диагностике и в процессах, связанных с производством и обработкой пищевых продуктов. А в других случаях используются ферментные препараты, содержащие в разном соотношении различные ферменты. Это необходимо учитывать при расчете кинетики катализируемых ими процессов.

1 ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ

1.1 Применение гидролитических ферментов Кинетика ферментативных реакций, как правило, изучалась на наиболее чистых препаратах ферментов в растворах. В ходе таких исследований применялось минимальное число субстратов (лучше всего один), а также строго контролировались параметры среды в отношении содержания активаторов (Са2+, Мg2+ и т.п.), кофакторов и ингибиторов.

Результаты таких исследований наиболее достоверно отражают кинетику ферментативных реакций. В то же время многие из ферментных препаратов, применяемых в промышленности, очищены в гораздо меньшей степени (таблица 1) [1].

Катализируемые гидролитическими ферментами реакции лежат в основе не только макроскопических процессов (порча пищевых продуктов, ожижение крахмала или обработка сточных вод), но и в химии процессов дозревания неспелых плодов, лизисе (автолизе) отмерших клеток, созревания мяса, производства сыра, предотвращении образования осадка в пиве, текстурировании кондитерских изделий, обработке ран или расшлихтовке текстиля.

Таблица 1 – Ферменты, применяемые в промышленности Фермент Источник Применение Примечание Важность Кислотоустой- Aspergillus Улучшение амилаза Продолжение таблицы Амило- Aspergillus Протеазы из организмов животных и растений -Химо- Желудок Применяется трипсин животных в медицине Панкре- Поджелу- качества кормов;

атиче- дочная мягчение кожи;

БромеАнанас, фицин аза Протепищеварения и устойчивая, ++ аза Продолжение таблицы аза Некоторые другие промышленно важные ферменты ГлюПревращение ся компаcoagulans, ArthrobacизомеNovo, ICI, раза наза ГлюTakamine козо- Продолжение таблицы Каталаза раза АдеAspergillus Превращение Содержится в аминаза Лакказа Продолжение таблицы таза Одни ферменты катализируют гидролиз разных гликозидных связей, а другие могут расщеплять только единственный олигомер глюкозы. Название фермента еще не определяет его субстратную специфичность. Названия большинства ферментов связаны с катализируемыми ими реакциями, а не с их химической структурой [5].

Поскольку в этом случае не существует правила «один фермент – одна реакция», то катализирующие одну и ту же реакцию ферменты, выделенные из различных растительных или животных источников, не всегда имеют одну и ту же структуру, и кинетика соответствующих реакций также может быть различной. Отсюда следует, что максиконстанта Михаэлиса Km, рН оптимумальная скорость реакции ма стабильности и активности и другие свойства фермента будут определяться его природой, то есть источником его выделения.

Многие гидролазы компартментализованы в тех или иных структурных элементах клетки, отделенных от цитоплазмы мембранами.

Такая локализация гидролаз защищает важные биополимеры цитоплазмы от деструкции. Грамположительные бактерии выделяют в среду множество гидролаз. У грамотрицательных бактерий надежным хранилищем для различных гидролаз служит ограниченное двумя мембранами периплазматическое пространство наружной оболочки.

В клетках эукариот гидролазы могут локализоваться в ограниченных мембраной органоидах – лизосомах, в периплазме (в микроорганизмах типа дрожжей) или выделяться в среду. Большинство используемых в промышленности гидролитических ферментов представляет собой внеклеточные продукты жизнедеятельности микроорганизмов.

Некоторые гидролазы также обнаружены и в цитоплазме, где они в метаболических циклах помогают клетке полностью использовать все внутренние ресурсы. Внутриклеточные гидролазы важны также в методах генетической инженерии.

Поскольку вода является универсальным субстратом с концентрацией равной приблизительно 55 М, а гидролитические ферменты обычно катализируют реакции деградации, например превращение крахмала в сахара, белков в полипептиды, липидов в глицерин, жирные кислоты и фосфат, то ниже будут рассматриваться различные типы полимерных субстратов. В некоторых методах синтеза полипептидов в средах с низким содержанием воды природные протеазы используются в качестве конденсирующих агентов. В специфических условиях протеазы могут иногда катализировать и обратную реакцию синтеза.

Для бродильных производств важное значение имеют такие соединения класса гидролаз, как -глюкозидаза, -фруктофуранозидаза, -галактозидаза, амилазы, гемицеллюлазы, протеолитические ферменты, пектолитические ферменты, -глюкозидаза (3.2.1.20, -D-глюкозидглюкогидролаза) – фермент, катализирующий расщепление мальтозы с образованием глюкозы (старое название фермента – мальтаза). Он содержится в плесневых грибах, дрожжах, бактериях.

-Галактозидаза (3.2.1.22, -D-галактозидгалактогидролаза) расщепляет мелибиозу с образованием галактозы и глюкозы, разлагает также рафинозу на галактозу и сахарозу. Содержится в пивных дрожжах, ферментном препарате, получаемом из плесневого гриба Aspergillus oryzae.

-Фруктофуранозидаза (3.2.1.26, -D-фруктофуранозидфруктогидролаза) расщепляет сахарозу на фруктозу и глюкозу, действует также на рафинозу, разлагая ее на фруктозу и мелибиозу (старое название фермента – сахараза, инвертаза). -Фруктофуранозидаза содержится в дрожжах, плесневых грибах и высших растениях.

1.1.1 Гидролиз крахмалосодержащих материалов Амилазы, находящие широкое применение, представляют собой ферменты, которые гидролизуют гликозидные связи в крахмале и родственных полимерах глюкозы.

Крахмал (С6Н10О5)n является самым распространенным запасным углеводом растений (картофель, зерновые злаки и др.). В растениях крахмал накапливается в виде зерен различной формы и величины от 0,002 до 0,15 мм. Размер зерна крахмала определяют по длине его наибольшей оси. Крахмальное зерно состоит из концентрических слоев, представляющих собой радиально расположенные кристаллические мицеллы. Природный крахмал, содержащийся в растениях в неизмененном виде, называют нативным крахмалом.

Крахмал представляет собой белый порошок; плотность безводного крахмала от 1,633 до 1,648, воздушно-сухого (10,0–20,0 % воды) от 1,5 до 1,6. С йодом дает характерное синее окрашивание. Эта реакция очень чувствительна и позволяет обнаруживать даже незначительные количества крахмала. Крахмал является типичным гидрофильным коллоидом. Состоит из двух полисахаридов: амилозы и амилопектина.

Их соотношение в крахмале растений обычно составляет 1:4. Известны сорта кукурузы, в которой нет амилозы, а в некоторых бобовых растениях ее содержание в крахмале доходит до 75,0 %. Амилоза и амилопектин построены из остатков D-глюкозы.

Н ОН Н ОН Н ОН

Молекула амилозы – это длинная неразветвленная цепь с -1,4-гликозидными связями между остатками D-глюкопиранозы.

Молекулярная масса амилозы 3105 – 1106.

Молекула амилопектина имеет разветвленное строение. Остатки D-глюкопиранозы в линейных участках амилопектина связаны, как и в амилозе, -1,4-гликозидными связями, а в точках разветвления имеются -1,6-гликозидные связи. Точки ветвления встречаются в среднем через 25 глюкозных остатков. Молекулярная масса амилопектина – до нескольких миллионов единиц.

Кроме того, в нативном крахмале содержатся минеральные вещества (от 0,2 до 0,7 %) – преимущественно соли фосфорной кислоты, и высокомолекулярные жирные кислоты (до 0,6 %), представленные пальмитиновой, стеариновой и др.

Крахмал, амилоза и амилопектин нерастворимы в холодной воде, этиловом спирте и эфире. Амилоза легко растворима в теплой воде и образует растворы невысокой вязкости. Амилопектин растворяется в воде при нагревании под давлением и дает очень вязкие растворы.

Растворы амилозы очень нестойкие, и при стоянии из них выделяются кристаллические осадки. Амилопектин дает чрезвычайно стойкие растворы. Амилоза дает с йодом синюю окраску, а амилопектин синефиолетовую.

В теплой воде крахмал набухает и превращается в гель. Степень набухания крахмала зависит от температуры. Так, кукурузный крахмал при температуре 55 °С почти не набухает, при 80 °С крахмальные зерна набухают и увеличиваются в размере в 25 и более раз, а при 120 °С структура крахмальных зерен кукурузы полностью нарушается.

При постепенном нагревании с водой крахмал превращается в вязкий коллоидный раствор, называемый крахмальным клейстером.

Увеличение вязкости клейстера происходит за счет амилопектина, который сильно набухает, но не растворяется, а амилоза растворяется.

Температура, при которой крахмальный клейстер приобретает наибольшую вязкость, называется температурой клейстеризации. Она неодинакова для крахмалов из разного сырья: для ячменного – от 60 до 80 °С, кукурузного – от 65 до 75 °С, пшеничного – от 54 до 62 °С, ржаного – от 50 до 55 °С, картофельного – от 59 до 64 °С.

Добавление нейтральных солей и щелочей снижает температуру клейстеризации. В присутствии сахара температура клейстеризации повышается. При нагревании до 110 °С клейстер начинает разжижаться, при 120–130 °С становится жидким.

При кипячении с кислотами крахмал превращается в глюкозу. Под действием фермента амилазы, содержащейся в проросшем зерне (солоде), крахмал расщепляется с образованием мальтозы в качестве конечного продукта; при гидролизе крахмала ферментом глюкоамилазой, содержащейся в плесневых грибах Aspergillus awamori, Aspergillus batatae и дрожжеподобных грибах Endomycopsis bispora, получается глюкоза.

В качестве промежуточных продуктов при гидролизе крахмала образуются полисахариды различной молекулярной массы, называемые декстринами. На первой стадии гидролиза образуются амилодекстрины, близкие по размерам и свойствам к крахмалу. При дальнейшем гидролизе молекулярная масса декстринов уменьшается, изменяется их окраска в реакции с йодом и растворимость в этиловом спирте (таблица 2).

Гидролиз крахмала амилолитическими ферментами может быть представлен схемой:

Крахмал Растворимый крахмал Декстрины (амило-, эритро-, ахроо-, мальто-) Мальтоза Глюкоза.

Под действием кислот и амилолитических ферментов крахмал гидролизуется до сахаров и поэтому процесс называют осахариванием.

Амилазы гидролизуют нативный крахмал, крахмальный клейстер и растворимый крахмал. Действие амилазы на целые или механически поврежденные крахмальные зерна незначительно, значительно быстрее амилазы действуют на крахмальный клейстер и растворимый крахмал.

Таблица 2 – Растворимость декстринов в этиловом спирте и их окраска в реакции с йодом Группа декстринов Окраска с йодом Амилодекстрины Фиолетово-синяя в 25%-ном, осаждаются Эритродекстрины Красно-бурая 55%-ном, осаждаются Ахроодекстрины Не окрашиваются Мальтодекстрины Не окрашиваются Известно три типа амилаз:

-амилаза, -амилаза и глюкоамилаза.

-Амилаза (3.2.1.1, -1,4-глюкан-4-глюканогидролаза) содержится в плесневых грибах, бактериях, в проросшем зерне ячменя, ржи, пшеницы. -Амилаза (3.2.1.2, -1,4-глюканмальтогидролаза) содержится в зерне ячменя, ржи, пшеницы. Глюкоамилаза (3.2.1.3, -1,4-глюканглюкозидгидролаза) содержится в плесневых грибах.

- И -амилаза существенно отличаются устойчивостью к кислотности среды (рН) и к нагреванию. К повышению кислотности среды более чувствительна -амилаза. Оптимальная зона рН для -амилазы около 5,7, для -амилазы – около 4,8. Доведение величины рН среды до 3,3 при температуре 0 °С ведет почти к полной инактивации -амилазы;

в этих же условиях -амилаза практически сохраняет активность.

К действию тепла более устойчива -амилаза. Оптимальная температура ее действия выше, чем -амилазы. Оптимальная температура действия -амилазы ячменя – от 51 до 60 °С, ржи – от 54 до 63 °С, -амилазы ячменя – 48 °С, ржи – 51 °С. При нагревании раствора, содержащего -амилазу, до 70 °С в течение 15 мин активность ее снижается незначительно; -амилаза в этих условиях инактивируется полностью. Различные -амилазы отличаются по устойчивости и нагреванию или, как говорят, по термолабильности. Самой лабильной, то есть быстрее всего разрушающейся при нагревании, является -амилаза плесневых грибов, на втором месте зерновая -амилаза (-амилаза проросшего зерна – солода) и наиболее устойчива к нагреванию бактериальная -амилаза.

- И -амилаза существенно различаются между собой по характеру действия на крахмал. При обработке -амилазой вязкость растворов снижается за счет неупорядоченного разрыва любых -1,4-гликозидных связей; по этой причине -амилазу часто называют разжижающим крахмал ферментом. -амилаза может атаковывать -1,4-связи только на невосстанавливающих концевых участках полимерной цепи, поэтому при гидролизе линейных полимеров этим ферментом всегда образуется мальтоза. По этой причине -амилазу называют также осахаривающим ферментом. - И -амилазы разрывают только 1,4-связь, а 1,6-связь ими не затрагивается.

При действии на крахмал -амилазы образуется преимущественно мальтоза и небольшое количество декстринов; -амилаза расщепляет крахмал с образованием главным образом декстринов и небольшого количества мальтозы. При совместном действии - и -амилаз на крахмал примерно 80 % его превращаются в мальтозу и около 20 % – в декстрины. Если удалять образующуюся мальтозу (например, сбраживая ее дрожжами), то 92–95 % крахмала превращается в мальтозу.

Оставшиеся неосахаренными декстрины называют предельными декстринами (конечные декстрины, фосфодекстрины). Эти декстрины расщепляются под действием фермента олиго-1,6-глюкозидазы (3.2.1.10, декстрин-6-гликаногидролаза, старое название – декстриназа). Этот фермент катализирует разрыв -1,6-связей и превращает предельные декстрины в мальтозу.

Глюкоамилаза (амилоглюкозидаза) – осахаривающий фермент, гидролизует крахмал до глюкозы, атакует прежде всего невосстанавливающие концевые -1,4-связи крахмала, гликогена, декстринов и мальтозы; амилоглюкозидаза гидролизует также -1,6-связи, но со значительно меньшей скоростью. Глюкоамилаза характеризуется высокой кислотоустойчивостью. Если целью процесса является получение глюкозы, а не мальтозы, то применяют смесь ферментов или последовательную обработку -амилазой и глюкоамилазой; такие процессы применяются на спиртоводочных заводах (в отличие от пивоваренных предприятий), в производстве концентрированных растворов глюкозы (кукурузной патоки) и кристаллической глюкозы (таблица 3).

Амилаза из Clostridium acetobutylicum участвует в микробиологическом превращении полисахаридов в бутанол и ацетон.

Таблица 3 – Области наиболее широкого применения амилазных ферментов Производство глюкозы и патоки частичного гидролиза крахмала Пивоварение Производство фруктовых соков нерастворимых Бумажная промышленность Текстильная промышленность Продолжение таблицы Кондитерская промышленность изделий необходимой Препараты амилазы, используемые человеком для пищевых целей, обычно получают из зерновых культур, в первую очередь из ячменя, пшеницы, ржи, овса, кукурузы, сорго и риса.

В амилазах зерна отношение осахаривающей и разжижающей ферментативных активностей зависит не только от типа растения, но и от состояния зерен, в первую очередь от того, проросли они или нет. В производстве солода (размягченных проросших зерен ячменя), применяемого в пивоварении, непроросшие зерна ячменя хранят в условиях высокой влажности и соответствующей температуры, способствующих их быстрому прорастанию, причем одновременно в них возрастает содержание -амилазы. Затем проросшие зерна высушивают в режиме, соответствующем типу солода; в сухом препарате амилазная активность не проявляется, но ферменты не подвергаются необратимой инактивации.

Высушенный и измельченный солод с гидролитической активностью используют затем для превращения крахмала в сахара, которые впоследствии могут быть переработаны путем спиртового брожения дрожжами либо молочнокислого брожения бактериями.

Другие перечисленные в таблице 1 карбогидразы также расщепляют гликозидные связи. Сообщалось, например, что комбинированное применение пуллуланазы, которая селективно расщепляет 1,6-гликозидные связи боковых цепей, и амилазы повышает выход глюкозы из крахмала. В производстве мороженого обычно используют лактазу, расщепляющую лактозу на более сладкие моносахариды глюкозу и галактозу. Родственный фермент инвертаза гидролизует сахарозу и полисахариды, содержащие -D-фруктофуранозильные связи. Свое название этот фермент получил после того, как было установлено, что гидролиз сахарозы в растворах и образование глюкозофруктозного раствора сопровождается изменением направления вращения плоскости поляризации света. Частично или полностью гидролизованный раствор сахарозы обладает двумя ценными для кондитерской промышленности качествами – он несколько более сладок, чем исходный раствор, и не кристаллизуется при упаривании до значительно более высоких концентраций.

1.1.2 Гидролиз целлюлозосодержащих материалов Целлюлоза (клетчатка) (С6Н10О5)n является составной частью клеточной стенки растений. В древесине содержится 40–50 % целлюлозы на сухое вещество. Каждая молекула целлюлозы представляет длинную неразветвленную цепь из глюкозных остатков, соединенных -1,4-гликозидными связями. В воде целлюлоза нерастворима и только набухает в ней. При кипячении с минеральными кислотами (серной, соляной) целлюлоза превращается в глюкозу.

Гемицеллюлозы (полуклетчатки), как и целлюлоза, являются составными частями межклеточной стенки – мембраны растительных организмов. Они содержатся в значительном количестве в соломе, древесине, кукурузных початках, в отрубях. Заметные количества гемицеллюлоз содержатся в зернах злаков. Гемицеллюлозами называют совокупность полисахаридов клеточной стенки растений, которые можно экстрагировать водными растворами щелочей. В воде гемицеллюлозы нерастворимы. В состав гемицеллюлоз входят гексозаны и пентозаны. Гемицеллюлозы гидролизуются кислотами легче, чем целлюлоза; при гидролизе образуются пентозы (арабиноза или ксилоза) и гексозы (манноза, галактоза и др.). Важной составной частью гемицеллюлоз ячменя является -глюкан, выделенный в чистом виде путем осаждения 20%-ным раствором сульфата аммония. Остатки глюкозы в -глюкане связаны гликозидными связями -1,3 и -1,4.

Гемицеллюлазы (цитазы) – ферменты, катализирующие гидролиз гемицеллюлоз, образуются при проращивании зерна, а также плесневыми грибами, в частности грибом Trichothecium roseum.

Лигнин (C9H10O2, C10H12O3, C11H14O4) – вещество, характеризующее одеревеневшие стенки растительных клеток. Сложное полимерное соединение в клетках сосудистых растений и некоторых водорослей.

Ферментные препараты, используемые для деполимеризации целлюлозы и обычно называемые целлюлазой, представляют собой сложную смесь многих ферментов. Природа входящих в состав целлюлазы ферментов и их относительные количества зависят от типа микроорганизма, из которого была выделена целлюлаза и от процесса получения ферментного препарата. Вся биомасса и промышленные отходы различных производств различаются по ряду свойств, в том числе по степени кристалличности и удельной поверхности, а также по химическому составу. Некоторые методы предварительной обработки позволяют модифицировать эти субстраты и тем самым снизить их устойчивость к гидролизу. Таким образом, скорость гидролиза целлюлозных материалов и выходы продуктов в каждом конкретном процессе зависят от совокупности нескольких факторов: во-первых, от природы и свойств субстрата, во-вторых, от результатов предварительной обработки и, в-третьих, от степени активности и специфичности индивидуальных ферментов, входящих в состав целлюлазы.

В настоящее время наиболее тщательно изучены и охарактеризованы целлюлазные системы, продуцируемые грибами Trichoderma.

Как показано на рисунке 1, в состав этих систем входят три типа ферментов, действующих на различные субстраты и образующих различные продукты реакции.

Рисунок 1 – Схема взаимодействия субстратов, целлюлаз и продуктов реакции в ходе биологической деградации целлюлозы ( основная реакция; – – побочная реакция;

На рисунке 1 также указаны пути ингибирования индивидуальных ферментов по принципу обратной связи. Кинетика каждой стадии системы реакций подчиняется уравнению Михаэлиса–Ментен со строго конкурентным или неконкурентным ингибированием. Целлюлазы с различными свойствами и активностями продуцируют и другие микроорганизмы, в том числе плесени Fusarium solani, Aspergillus niger, Penicillium funicolsum, Sporotrichum pulverulentum, Cellulomonas sp., Clostridium thermocellum, Clostridium thermosaccharolyticum.

В таблице 4 приведены дополнительные сведения о целлюлазной системе из Trichoderma viride. Для определения специфических активностей применяются различные «стандартные» субстраты.

Немаловажны и размеры молекул ферментов, сравнимые с размерами микрофибрилл природной целлюлозы.

Таблица 4 – Свойства различных типов ферментов в целлюлазной системе Trichoderma viride субстрат целлюлоза (КМЦ) Ингибиторы Целлобиоза Молекулярная масса Расчетный диаметр сферической молекулы, – выпускаемая промышленностью кристаллическая целлюлоза, прошедшая стадию кислотной обработки.

Скорость гидролиза зависит главным образом от степени кристалличности целлюлозы. Соответствующие выражения, описывающие кинетику гидролиза с учетом степени кристалличности, рассмотрим ниже, в примере 1.

Сначала рассмотрим основные химические и физические методы предварительной обработки лигноцеллюлозных материалов. Изучение методов химической обработки древесины дает представление о влиянии лигнина на устойчивость целлюлозных материалов к ферментативному гидролизу. В бумажной промышленности для растворения лигнинов и пектинов измельченную древесину подвергают сульфитной варке (обработке водным раствором гидросульфита, содержащим свободный SO2) или сульфатной варке (обработке водным раствором NаОН и Na2S) при повышенных температуре и давлении (крафтпроцесс). Путем такой обработки четырех различных пород древесины в различных условиях были получены целлюлозные массы с различным содержанием лигнина, которые затем были обработаны серной кислотой для гидролиза веществ целлюлозной природы. Результаты этого эксперимента (рисунок 2) наглядно показывают, что способность целлюлозы к гидролизу в первую очередь зависит от количества оставшегося лигнина. Для разрушения лигнина применяют и другие методы, в том числе обработку газообразным SO2, минеральными кислотами и специфическими ферментами, которые продуцируются рядом грибов, например Sporotrichum pulverulentum и Pleuroitus ostreatus.

Рисунок 2 – Результаты экспериментального изучения влияния степени делигнификации на гидролизуемость целлюлозы из четырех Структуру целлюлозы, в том числе такие ее характеристики, как степень кристалличности, удельная поверхность, степень полимеризации, можно изменить с помощью предварительной обработки, например путем размола на шаровой или роликовой мельнице, -облучения, пиролиза, обработки кислыми или щелочными реагентами.

Рассмотрим кинетику изменения степени кристалличности целлюлозы при кислотной обработке древесины. Как показано на рисунке 3а, влияние предварительной обработки на кристалличность лучше всего контролировать методом рентгеноструктурного анализа, который позволяет определить параметр, называемый индексом кристалличности (Crl) и рассчитываемый по эмпирическим формулам где I(am) (am – аморфный) и I(002) – интенсивности дифракции при 2 равном 18,5° и 22,5 соответственно.

Значения Crl не являются точной мерой содержания кристаллической фракции; тем не менее индекс Crl удобен для оценки изменения степени кристалличности и средних размеров кристаллитов в различных целлюлозных материалах. Приведенные на рисунке 3а экспериментальные данные наглядно показывают, что при многократной обработке на роликовой мельнице степень кристалличности целлюлозы снижается.

Рисунок 3 – Изменение характера дифракции рентгеновского излучения целлюлозой типа авицель после многократных пропусканий через двухроликовую мельницу (на кривых указано число пропусканий) (а); после обработки целлюлазой из Trichoderma reesei (на кривых указано время инкубирования в часах) (б).

Для расчета индекса кристалличности Crl использовались интенсивности при углах дифракции 2 равных 18,5° и 22,5°.

Ранее, при обсуждении структуры целлюлозы и активности целлюлазных ферментных систем, мы уже упоминали, что скорость гидролиза аморфных и паракристаллических участков, целлюлозы должна быть выше скорости гидролиза кристаллической целлюлозы. То есть снижение степени кристалличности целлюлозы должно сопровождаться повышением скорости ее ферментативного гидролиза. Действительно, такая зависимость была обнаружена, в частности, при изучении гидролиза тех же целлюлозных материалов, которые исследовались в эксперименте, изображенном на рисунке 3а, под действием суммарного препарата целлюлаз из Trichoderma reesei МСG-77 (таблица 5).

Таблица 5 – Влияние числа пропусканий через роликовую мельницу на кристаллическую структуру целлюлозы типа авицель и средние кинетические параметры ее гидролиза под действием целлюлазы из Trichoderma reesei Число В таблице 5 приведены кажущиеся средние значения параметров в обычном уравнении Михаэлиса–Ментен; их определяли, допустив, что при измерении начальной скорости реакции целлобиоза в смеси отсутствовала. Расчеты изменения скорости ферментативного гидролиза целлюлозных материалов во времени осложняются тем, что в ходе таких процессов меняется также относительное содержание кристаллической и аморфной фракций субстрата (рисунок 3б).

В примере 1 рассмотрим принципы моделирования в применении к системам такого рода.

Пример 1. Влияние степени кристалличности целлюлозы на скорость ее ферментативного гидролиза Для изучения гидролиза целлюлозы ферментными системами типа целлюлазы разработано несколько математических моделей кинетики этих процессов. В одной из них наибольшее внимание уделяется влиянию кристалличности; в этом подходе принимается, что ферменты целлюлазы (их сумма обозначается здесь символом Е) адсорбируются на целлюлозе в состоянии Е* Допуская, что адсорбция фермента носит равновесный характер и что концентрация фермента в растворе достаточно низка (на практике e0 < 0,5 мг белка в 1 мл реакционной смеси), получим Описание модели завершается еще двумя допущениями, согласно которым адсорбированный фермент катализирует гидролиз аморфной (Sa) и кристаллической (Sс) целлюлозы в соответствии со следующими уравнениями параллельно осуществляющихся реакций, адсорбированная и свободная целлюлазы связываются с инертным материалом целлюлозного субстрата, а также с продуктом реакции Применив ко всем фермент-субстратным комплексам приближение квазистационарного состояния и суммируя концентрации всех форм фермента, получим следующее выражение для начальной скорости гидролиза чистой целлюлозы (sx = 0) при низкой концентрации фермента и в отсутствие продукта реакции (р = 0) где s (s = sа+sс) – общая концентрация целлюлозы. Зависимость кажущихся максимальной скорости и константы Михаэлиса от начального индекса кристалличности Сrl0 [Сrl0 = sс0/(sa0 + sс0)] и констант скоростей элементарных реакций можно выразить следующим образом где Цифры указывают число предварительных пропусканий субстрата через роликовую мельницу. Характер дифракции рентгеновского излучения субстратами представлен на рисунке 3а.

Выражения (9) и (10) свидетельствуют о зависимости начальной скорости реакции от начальной кристалличности субстрата Crl0, константа скорости реакции псевдопервого порядка и велилинейно зависят от Crl0; это дает возможность проверить чина 1/ соответствие описанной модели экспериментальным данным (рисунок 4).

Рисунок 4 – Экспериментальное определение зависимости кажущихся кинетических параметров и от начальной степени кристалличности субстрата Большинство данных хорошо согласуется с описанной моделью;

наибольшее отклонение обнаружено в случае константы скорости реакции псевдопервого порядка для целлюлозы типа солка-флок.

Из механизма процесса видно, что начальная скорость гидролиза должна зависеть от всех параметров, входящих в состав этого уравнения. Более того, соответствующее выражение для зависимости скорости реакции гидролиза целлюлозы в реакторе периодического действия от времени будет сложнее, поскольку в нем необходимо учитывать и ингибирование процесса продуктом реакции (7). При расчете изменения концентрации субстрата во времени следует учитывать и тот факт, что субстрат представляет собой смесь кристаллической и аморфной форм, гидролизующихся с различными скоростями. Следовательно, описывающее кинетику гидролиза выражение должно отражать два параллельных процесса с двумя различными субстратами, причем эти процессы взаимосвязаны, поскольку относительные количества аморфной и кристаллической целлюлозы также не постоянны во времени, о чем свидетельствует изменение индекса кристалличности.

Этот пример иллюстрирует только некоторые из тех многочисленных затруднений, которые встречаются при моделировании биологических субстратов и катализаторов. В примере рассматривали некоторый идеализированный субстрат целлюлозной природы. Такое допущение позволяет оценить влияние кристалличности на ход гидролиза, определить соответствующие кинетические параметры и рассчитать закономерность изменения кристалличности субстрата в реакторе периодического действия. Все приведенные экспериментальные данные были получены с использованием одного и того же целлюлазного ферментного комплекса, поэтому описанная модель вообще не учитывает влияние индивидуальных ферментов, входящих в состав комплекса, и их относительное содержание в комплексе. При сравнении с данными, полученными в ходе изучения целлюлаз из других источников, необходимо будет учесть относительное содержание различных ферментов в комплексе и их активности. В идеальном варианте в результате ряда экспериментальных исследований и разработки соответствующих математических моделей типа рассмотренной выше можно получить разностороннюю информацию о превращениях, происходящих в системе целлюлоза – целлюлаза, и на этой основе разработать некоторую общую модель, которая более полно отражала бы свойства субстратов и ферментов этой системы.

Существуют и другие физические и химические методы деградации целлюлозы. Так, в последние годы были разработаны усовершенствованные процессы кислотного гидролиза целлюлозы, отличающиеся применением более высоких температур и сокращенным временем обработки и позволяющие получать необходимые продукты деградации при минимальном количестве побочных веществ. Другой метод переработки целлюлозы базируется на ее пиролитической деградации.

Изучаются, разрабатываются или уже применяются также методы переработки лигноцеллюлозы, основанные на шнековой экструзии, обработке гетерогенными катализаторами, газификации в псевдоожиженном слое и на самом старом способе переработки путем сжигания.

Задача 1. Кинетика гидролиза целлюлозы. Гидролиз целлюлозы протекает с участием солюбилизирующего фермента, фермента, образующего дисахарид целлобиозу, и гидролизующей этот дисахарид -глюкозидазы (см. рисунок 1). Первые два фермента ингибируются целлобиозой (будем считать, что целлобиоза представляет все олигомерные ингибиторы), поэтому упрощенная схема реакций будет выглядеть следующим образом Здесь [G2] и G2 – нерастворимая целлюлоза и растворимая целлобиоза соответственно, а Е – фермент, катализирующий наиболее медленную стадию образования целлобиозы.

А. Можно допустить, что в отсутствие -глюкозидазы глюкоза не образуется. Найдите соответствующие выражения, исчерпывающе описывающие зависимость g2 от времени для случаев конкурентного и неконкурентного ингибирования.

Б. Покажите, что по графику зависимости g2/t от (1/t)ln(s0/g2) можно различить системы без ингибирования, с конкурентным ингибированием и неконкурентным ингибированием. Почему в этом случае лучше применять g2, а не концентрацию непрореагировавшего субстрата? Экспериментально показано, что описанная система ингибируется неконкурентно. Подтвердите это математически.

1.1.3 Гидролиз белковых веществ Множество ферментов, селективно атакуют азотсодержащие соединения, особенно белки. Эти ферменты находят и разнообразные практические применения. Как и амилазы, протеазы разделяются на ферменты, гидролизующие концевые группы (экзопептидазы), и ферменты, расщепляющие внутренние пептидные связи (эндопептидазы).

Поскольку ферменты сами являются белками, протеолитические ферменты часто синтезируются сначала в неактивной форме. Неактивная форма фермента или хранится в клетке, или транспортируется от места ее синтеза к тому центру, где этот фермент необходим в активной форме; в частности, в клетке транспортируются неактивные формы пепсина, трипсина, химотрипсина и карбоксипептидазы. Активация этих протеолитических ферментов осуществляется по одному из двух путей (рисунок 5).

а) Из предшественников Пепсиноген Пепсин + X Химотрипсиноген Химотрипсин Прокарбоксипептидаза Карбоксипептидаза б) В присутствии ионов металлов Глицилглициндипептидаза (неактивная) + Со2+ + Мg2+ Глицилглициндипептидаза (активная) Лейцинаминопептидаза (неактивная) + Мn2+(или Мg2+) Лейцинаминопептидаза (активная) Рисунок 5 – Активация протеолитических ферментов:

а – образование активных ферментов из предшественников;

б – образование активных ферментов в присутствии ионов металлов Активация пепсина и трипсина происходит автокаталитически:

неактивный предшественник фермента является субстратом для активной формы, поэтому в результате реакции образуется большее количество активной формы фермента. Интересен и тот факт, что после превращения неактивного трипсина или пепсина в активную форму дальнейшее автокаталитическое расщепление фермента не наблюдается.

Для активации второй группы ферментов экзопептидаз необходимы ионы одного или нескольких определенных металлов. Стандартный метод определения потребности ферментов и других компонентов клетки в ионах металлов заключается в изучении изменения активности раствора фермента в процессе диализа.

В промышленных масштабах протеазы выделяют из организмов животных (из поджелудочной железы), высших растений (из соков и латексов), а также из дрожжей, плесеней и бактерий. Некоторые из протеаз и области их применения перечислены в таблице 1.

Свободные протеазы применяются в производстве моющих средств, в химической чистке, при мягчении мяса, в сыроделии (только реннин), дублении кож, извлечении серебра из фотографических пленок и бумаг, производстве препаратов для пищеварения, а также в медицине при лечении воспалительных процессов и вирулентных ран. В качестве добавок к моющим средствам ферменты применялись начиная уже с 1913 г., однако особенно резкий рост потребления протеаз в производстве детергентов наблюдался в конце 60-х гг. XX века.

Ферменты, способствующие удалению загрязнений белковой природы, представляют собой смесь нейтральной и щелочной бактериальных протеаз, активных в интервале рН от 6,5 до 10,0 при температурах от 30 до 60 °С. Наибольшего уровня производство ферментов для этих целей достигло в 1969 г., когда с ферментными добавками выпускалось 30,0–75,0 % всех моющих средств в Западной Европе и 40,0 % в США. Затем, однако, Федеральная комиссия по торговле США высказала опасение, что такие детергенты оказывают вредное воздействие на здоровье человека, и в 1970–1971 гг. производство бактериальных протеолитических ферментов резко сократилось. Последовавшее позднее снятие предупреждения Федеральной комиссии и внедрение усовершенствованных методов производства, при которых образование ферментных аэрозолей сводится к минимуму (путем «парафинирования»), способствовали частичному восстановлению спроса на бактериальные протеазы для детергентов. В 1980 г. в США таких протеаз было произведено на сумму около 6 млн долларов.

Различные методы мягчения разделанных мясных туш с помощью специальных агентов основаны на протеолитической активности относительно недорогих и устойчивых к действию тепла растительных протеаз папаина и бромелаина. Процесс «созревания» целых туш проводят до их разделки и расфасовки путем контролируемого автолиза при температуре 15 °С с одновременным облучением ультрафиолетом, выполняющим роль гермицидного препарата и предотвращающим рост микроорганизмов на поверхности туш.

Сырые ферментные препараты поджелудочной железы различных животных содержат все пищеварительные протеазы, в том числе трипсин, а также липазы и амилазы. Эти смеси, обладающие мощной гидролитической активностью, используются для обезволашивания (удаления волос) шкур животных и одновременного гидролиза других неколлагеновых белков. Поскольку пепсин гидролизует и коллаген (фибриллярный белок, являющийся основой кожного покрова животных), его нельзя применять при выделке кож.

В молочной промышленности широко применяется только один фермент – реннин. Реннин отщепляет гликопептид от растворимого казеината кальция и таким образом превращает его в относительно малорастворимый параказеинат кальция, осаждающийся в виде творожного сгустка. Превращать казеинат кальция в параказеинат могут и другие протеазы, однако катализируемый ими протеолиз обычно на этом не останавливается, а поскольку продукты более глубокой деградации казеина обладают большей растворимостью, то творожный сгусток в этих условиях не образуется. Нехватка животного реннина стимулировала разработку методов получения аналогичных бактериальных ферментов, и последние уже применяются в сыроделии.

Для получения реннина с помощью микроорганизмов применяются также методы генетической инженерии.

Протеолитические ферменты применяются в медицине и клинической практике как пищеварительные средства, а также при лечении тяжелых ран. Поскольку ферменты представляют собой белки, то способствующие пищеварению ферменты применяют только в капсулах, предохраняющих ферменты от кислой среды желудка, которая неминуемо вызвала бы их денатурацию. Из ферментов, перечисленных в таблице 1, нет ни одного, который был бы выделен из организма человека. Введение протеаз животных человеку (трипсин свиньи, например, отличается от трипсина человека) применяется также для подавления воспалительных процессов в тканях; реакция иммунной системы человека минимальна в случае высокоочищенных кристаллических препаратов ферментов. В отличие от живых мертвые клетки обычно не способны защищать себя от действия протеаз. На этом различии основано применение растворов протеаз для лечения вирулентных или сочащихся ран; протеазы способствуют размягчению омертвевшей ткани и клеток, облегчая тем самым дренаж ран и ускоряя их заживление.

Протеолитические ферменты, особенно трипсин, подавляют воспалительные процессы и опухоли, связанные с внутренними повреждениями и инфекциями. Их действие основано на растворении тромбов и осадков внеклеточных белков, или на локальной активации других защитных систем организма, выполняющих те же функции, или на обоих этих факторах одновременно. Протеолитические ферменты тормозят развитие или полностью излечивают ряд тяжелых инфекционных заболеваний, приводящих к накоплению в легких слизи.

Задача 2. Автокатализ. Принять, что в периодическом процессе кинетика автокаталитической активации пепсина (см. рисунок 5) описывается уравнением Михаэлиса–Ментен [1].

А. Покажите, что максимальная скорость активации достигается при уравнением В. Для указанной автокаталитической системы начертите график зависимости 1/ от 1/s в координатах Лайнуивера–Бэрка. График какой другой зависимости был бы более удобным?

1.1.4 Применение эстераз Ферменты этой группы расщепляют сложноэфирные связи с образованием спирта и кислоты или катализируют обратную реакцию Наиболее важной подгруппой эстераз являются липазы, гидролизующие жиры до глицерина и жирных кислот H C OCOR H C OH R COOH H C OCOR H C OH R COOH Панкреатическая липаза, выделяемая в пищеварительный тракт после нейтрализации желудочной кислотности, расщепляет непереваренные жиры до жирных кислот; при этом образуются и промежуточные продукты гидролиза – моно- и диглицериды. Нерастворимость высокомолекулярных жиров служит причиной того, что липазы проявляют каталитический эффект только на границе раздела фаз вода–липид.

Специфичность липаз, так же как и специфичность второй группы эстераз, называемых алиэстеразами, невысока. Липазы активны при гидролизе высокомолекулярных жиров и не действуют на жиры, построенные из карбоновых кислот с короткой углеводородной цепью.

Последние, напротив, легко гидролизуются алиэстеразами, не активными по отношению к высокомолекулярным жирам. Активность липаз повышается в присутствии поверхностно-активных веществ (например, желчных кислот, которые стабилизируют высокую удельную поверхность жиров в эмульсиях) и ионов кальция, которые, очевидно, связывают образующиеся жирные кислоты путем осаждения или образования комплексов. Связывание жирных кислот выводит их из сферы реакции; в противном случае они действуют как ингибиторы.

В аэробных процессах очистки сточных вод, происходящих в природных условиях и применяющихся в методе активного ила, для поддержания необходимых форм жизни нужен постоянный приток достаточного количества кислорода. Поскольку транспорт кислорода через жировые пленки затруднен, то на установках приходится постоянно освобождать поверхность аэрируемых вод от таких пленок. Содержащую большое количество жиров собранную жидкость затем инкубируют с микроорганизмами, способными продуцировать внеклеточные липазы. Образование нефтяных или жировых пленок на больших площадях природных водоемов приводит к резкому снижению концентрации растворенного кислорода и таким образом к гибели всех организмов, не способных существовать в анаэробных условиях.

В мясной промышленности путем обработки отрубов липазными препаратами, вызывающими частичный гидролиз жиров, можно производить нежирные мясные продукты. В процессе переработки пищевых продуктов или бытовых и промышленных отходов водостоки иногда забиваются смесями нерастворимых веществ, содержащими белки, жиры и углеводы. Для предотвращения или ликвидации таких пробок успешно применяются смеси протеаз, различных карбогидраз и липаз.

Ко второй группе эстераз относят фосфатазы, которые являются неотъемлемыми элементами внутриклеточных биосинтетических путей метаболизма, в которых используется химическая свободная энергия, высвобождающаяся при окислении клеточного питания.

1.1.5 Ферментные смеси, пектиновые ферменты и другие пути использования ферментов Вместо индивидуальных ферментов часто целесообразнее использовать их смеси. Компоненты смеси могут принадлежать к одному и тому же типу (- и -амилазы или трипсин и химотрипсин) или к разным классам ферментов (экстракты поджелудочной железы, представляющие собой смесь трипсина, липазы и амилазы). Так, использование специальных смесей различных амилаз позволяет повысить выход осахаренного крахмала в производстве спирта, а смесь амилаз с меньшим содержанием -амилазы, позволяющую понизить вязкость растворов крахмала без существенного осахаривания, целесообразнее применять при расшлихтовке текстиля. Экстракты поджелудочной железы животных содержат смесь пищеварительных ферментов, выполняющих многие функции ферментного комплекса панкреатической жидкости человека. Например, препарат, выпускаемый в США в промышленном масштабе в качестве добавки к моющим средствам, содержит смесь бактериальных протеаз и амилаз; сообщалось, что этот препарат эффективнее протеаз при удалении некоторых типов загрязнений.

В ограниченных масштабах применяются и другие гидролитические ферменты; кроме того, разрабатываются новые перспективные процессы с использованием гидролаз (таблица 6).

Таблица 6 – Некоторые области применения гидролаз Пенициллинацилаза производства полусинтетических Лактаза Гидролиз лактозы в молоке, сыворотке Рибонуклеаза Получение 5'-нуклеотидов из РНК Декстраназа Удаление зубных бляшек Изоамилаза Производство мальтозы из крахмала Продолжение таблицы Кератиназа Обработка шерсти, щетины, кожи Танназа Деструкция дубильных кислот в продуктах Окисление галактозы до галактуроновой кислоты с последующей поликонденсацией приводит к образованию полигалактуроновых кислот, которые являются основным структурным элементом ряда природных материалов растительного происхождения – пектинов. В пектинах карбоксильные группы часто этерифицированы до карбометоксильных. Фермент пектинметилэстераза (пектинэстераза, гидролизующая пектаза) (из фруктов) гидролизует карбометоксильные группы, а полигалактуроназы (пектиназы, пектолазы) (из грибов) расщепляют гликозидные связи в пектинах.

Пектолитические ферменты широко применяются в двух отраслях пищевой промышленности – в производстве соков и виноделии.

После первичной переработки фруктов и овощей получаются очень вязкие соки, что приемлемо для соков из томатов и цитрусовых, но нежелательно для яблочного и других соков. Путем контролируемого частичного гидролиза пектинов можно получить продукт с необходимой текучестью, достаточно вязкий, чтобы не происходило осаждения нерастворимых веществ. В производстве яблочного сока применяют более глубокий гидролиз пектинов, благодаря чему облегчается фильтрование, обеспечивающее необходимую прозрачность сока. Если соки будут использовать в производстве желеобразных продуктов, то их обрабатывают только пектинэстеразой. Образующиеся полигалактуроновые кислоты затем желатинизируют ионами кальция.

В виноделии добавление смеси пектолитических ферментов к раздавленному винограду приводит к повышению выхода сока, более эффективному экстрагированию красящих веществ из кожуры, а также ускоряет процессы фильтрования и отжима. Обработка пектиновыми ферментами уже перебродившего виноградного сока ускоряет процесс отделения вина от дрожжей и осадка, повышает его прозрачность и стабильность (в основном за счет снижения концентрации суспендированных белков в готовом вине). Как в первой, так и во второй области применения пектолитические ферменты создают необходимую вязкость и фильтруемость полупродуктов, что положительно сказывается на экономичности процессов и на внешнем виде готовой продукции.

Пектолитические ферменты применяют для обработки древесины хвойных пород. Свежесрубленная древесина, например, норвежской ели не поддается пропитке химическими консервантами. Предварительная обработка пектолитическими ферментами повышает проницаемость древесины и эффективность химической пропитки.

1.2 Области применения ферментативных реакций в растворах Рассмотренные выше сферы применения гидролаз доминировали раньше и преобладают сейчас в биохимической технологии с использованием ферментов. В пищевой, фармацевтической и биохимической отраслях применяются также и другие ферментативные процессы.

1.2.1 Применение ферментов в медицине В таблице 7 приведен краткий перечень самых распространенных и наиболее перспективных в медицине ферментов.

Таблица 7 – Ферменты, применяемые в медицине Трипсин Глюкозооксидаза Определение глюкозы в крови и моче Лизоцим (не гидролизуюрассеянного склероза, кожных заболеваний щийся трипсином, химотрипсином и папаином) Гиалуронидаза транспорту различных веществ);

(из семенников вводится с другими препаратами быка) (антибиотиками, адреналином, гепарином, Пищеварительные ферменты (смеси амилаз, липаз, протеаз и целлюлаз) Стрептокиназа Противовоспалительное средство Стрептодорназа гидролизует ДНК, снижает вязкость Пенициллиназа Продолжение таблицы Урокиназа Активатор тканевого Растворение тромбов в кровеносных сосудах плазминогена Аспарагиназа Противоопухолевое средство В защитных жидкостях организма, например в слизи носовой полости и слезах, содержится фермент лизоцим, гидролизующий мукополисахариды клеточных стенок ряда (грамположительных) бактерий.

Этот фермент применяется в качестве антибактериального средства и может выполнять также другие каталитические функции.

Начальные стадии ряда заболеваний, а также внутренние травмы сопровождаются понижением или повышением концентраций некоторых ферментов в таких легко поддающихся анализу жидкостях организма, как лимфа, кровь или моча. Наличие данного фермента легко установить с помощью соответствующего субстратного теста. Таким образом, определение ферментативной активности в жидкостях организма можно использовать в качестве средства диагностики. Данные об изменении концентрации тех или иных ферментов в сыворотке крови дают полезную информацию при диагностировании целого ряда заболеваний, связанных с нарушениями функций сердца, поджелудочной железы, патологическими изменениями в мышечных и костных тканях, а также с ростом злокачественных опухолей.

L-аспарагиназа катализирует гидролиз L-аспарагина Для некоторых типов опухолевых клеток L-аспарагин является незаменимым питательным веществом; L-аспарагиназа разрушает аспарагин и тем самым может тормозить рост таких клеток.

Е. соli продуцирует две различные аспарагиназы, из которых только одна проявляет антилимфомную активность.

Проницаемость клеточных мембран и составляющих их структурных элементов для многих веществ сравнительно низка; в случае клеток высших животных это свойство мембран обусловлено наличием очень вязкой полигиалуроновой кислоты. Эффективность некоторых лекарственных препаратов и местных анестетиков, например в стоматологии, повышается при одновременном введении гиалуронидазы, частично разрушающей этот мембранный барьер.

Некоторые одноклеточные организмы продуцируют пенициллиназу (или -лактамазу) и таким образом защищают себя от летальных доз пенициллиновых антибиотиков. Организм человека не вырабатывает пенициллиназу, поэтому аллергическую реакцию на введенный больному пенициллин можно снять путем инъекции раствора пенициллиназы, которая в идеальном варианте превращает этот антибиотик в вещество, не вызывающее аллергии.

Глюкозооксидаза катализирует окисление глюкозы до глюконовой кислоты Глюкоза + О2 + Н2О глюконовая кислота + Н2О2.

Образующаяся при этом Н2О2 обнаруживается с помощью индикатора, поэтому глюкозооксидазу можно использовать в качестве чувствительного реагента на глюкозу, определяемую в крови или моче.

1.2.2 Применение негидролитических ферментов в промышленности Фермент глюкозооксидаза применяется при необходимости деструкции глюкозы или связывания кислорода. Так, сухой яичный порошок при хранении темнеет в результате взаимодействия глюкозы с белками. Добавление глюкозооксидазы предотвращает эту реакцию (браунинг-реакцию, или реакцию Майяра). Обескислороживание с помощью глюкозооксидазы применяется в производстве и при хранении безалкогольных напитков на основе апельсинового сока, консервированных напитков, порошкообразных сухих пищевых продуктов, майонеза, соусов для салатов и расфасованного сыра, когда в присутствии кислорода образуются продукты окисления, имеющие неприятный запах; для связывания кислорода в упаковку с сыром добавляют не только глюкозооксидазу, но и глюкозу. Ферментные добавки длительно связывают кислород, проникающий через упаковочные материалы, и способствуют увеличению срока годности расфасованных пищевых продуктов, так как при температуре их хранения ферментативная активность сохраняется достаточно долго. Образующийся в процессе катализируемой глюкозооксидазой реакции пероксид водорода обладает бактерицидными свойствами. Если же его наличие по каким-либо причинам нежелательно, то в систему добавляют еще каталазу, которая катализирует реакцию В присутствии каталазы эта реакция протекает очень быстро / = 1,2 107(сМ)–1, = 107 М). Она используется также в некоторых средствах для крашения волос.

В таблице 8 перечислены некоторые другие области применения негидролитических ферментов.

Таблица 8 – Перспективные области применения негидролитических ферментов L-яблочной кислоты с помощью фумаразы L-аспарагиновой кислоты с помощью аспартазы с помощью микробных ферментов с помощью микробных ферментов Фруктозы с помощью глюкозоизомеразы Фруктозы с помощью сорбитдегидрогеназы Разделение DL-аминокислот с помощью иммобилизованной Из рацемата аминоацилазы L-тирозина с помощью тирозинИз L-дигидроксифенилаланина фенол-лиазы L-дигидроксифенилаланина с помощью трансаминазы L-триптофана с помощью Из индола, пировиноградной L-лизина с помощью группы ферментов Полиненасыщенные жирные десатуразы жирных кислот Галактонолактозы с помощью и галактозооксидазы Одним из перспективных ферментов, в частности, является глюкозоизомераза, превращающая глюкозу во фруктозу. Ряд приведенных в таблице 8 процессов осуществляются с помощью иммобилизованных ферментов.

1.3 Технологические процессы с участием иммобилизованных ферментов Под иммобилизацией понимают способы трансформации ферментов путем закрепления на нерастворимых носителях, обеспечивающие возможность их использования в непрерывных процессах. Необходимость в иммобилизации может возникнуть по целому ряду причин.

Во-первых, иммобилизованные индивидуальные ферменты удерживаются в реакторе, в то время как растворимые ферменты обычно переходят в смесь, содержащую продукт реакции. В результате ценные ферменты необратимо теряются, и в реактор приходится вводить дополнительные количества биологического катализатора; к тому же фермент может оказаться нежелательной примесью и его придется отделять от конечного продукта реакции. Во-вторых, по сравнению с растворимыми биологическими катализаторами иммобилизованные ферменты часто сохраняют активность в течение более длительного периода. В-третьих, иммобилизованные ферменты можно локализовать в соответствии с последовательностью осуществляемых ими каталитических превращений, что будет способствовать повышению эффективности многостадийного процесса.

Указанные характеристики иммобилизованных ферментов свидетельствуют о том, что их применение целесообразно в случае переработки больших количеств субстрата и (или) в случае высокой стоимости фермента. Кроме того, возможность сконцентрировать фермент в определенном объеме и придать ему любую форму позволяет найти новые уникальные сферы применения иммобилизованных биологических катализаторов. Следующий раздел будет посвящен изучению методов иммобилизации ферментов, а затем мы рассмотрим пути применения иммобилизованных ферментов и перспективы их дальнейшего промышленного использования.

1.3.1 Методы иммобилизации ферментов Существует много методов иммобилизации ферментов. От метода иммобилизации зависят свойства полученного биокатализатора.

Таким образом, выбор конкретного способа иммобилизации зависит от целого ряда факторов и параметров каталитического процесса, в том числе от общей каталитической активности, эффективности использования катализатора, его способности подвергаться инактивации и регенерации и, конечно, от его цены. В связи с проблемой захоронения отходов производства, а также в зависимости от предполагаемой области использования получаемых продуктов следует принимать во внимание и токсичность реагентов, применяемых в реакциях синтеза иммобилизованных ферментов.

Все методы иммобилизации ферментов можно разделить на две группы: химические методы, основанные на создании ковалентных связей между ферментом и носителем, и физические методы, основанные на более слабых взаимодействиях или на включении ферментов в какую-либо оболочку или матрицу (рисунок 6).

Рисунок 6 – Некоторые методы иммобилизации ферментов:

Ферменты можно превратить в иммобилизованную форму посредством адсорбции на различных носителях (таблица 9); целесообразность применения этого метода иммобилизации обусловлена тем, что в ряде случаев катализатор удается сравнительно просто регенерировать путем десорбции отработанного фермента и адсорбции новой порции активного биокатализатора.

Таблица 9 – Носители для адсорбции ферментов Физическая адсорбция Модифицированные носители: таннинаминогексилцеллюлоза, конканавалин А – сефароза Катионообменники: карбоксиметилцеллюлоза, Ионное Анионообменники: диэтиламиноэтилцеллюлоза, связывание Свойства иммобилизованного фермента определяются как свойствами фермента, так и характеристиками носителя или матрицы и методикой иммобилизации.

Выбор носителя для химической или адсорбционной иммобилизации фермента зависит, прежде всего, от свойств его поверхности. Способен ли фермент адсорбироваться на этой поверхности? Есть ли у носителя функциональные группы, связывающие фермент? Если поверхность носителя не удовлетворительна в этом отношении, то можно ли химически модифицировать или иным образом трансформировать поверхность носителя, чтобы облегчить связывание фермента?

В таблице 10 перечислены некоторые носители, используемые для иммобилизации ферментов путем создания ковалентных связей, и приведены функциональные группы, участвующие в этих связях. В качестве носителей иммобилизованных ферментов применяются также керамические материалы, стекло и оксиды ряда металлов.

Таблица 10 – Носители для ковалентного связывания ферментов Целлюлоза (–ОН) (биогель, энзакрил) (ароматические Карбоксиметилцеллюлоза (–СООН) Агароза (сефароза) (–ОН) Декстран (сефадекс) (–ОН) Описание методики ковалентной иммобилизации фермента часто начинается со стадии модификации или активации поверхности носителя. В случае неорганических носителей для этой цели широко применяется силанизация, то есть обработка поверхности кремнийорганическими реагентами (например, (СН3СН2О)3Si(СН2)3R, где R – чаще всего NН2). Обработанный таким способом носитель содержит на поверхности аминогруппы, которые (как и аминогруппы других носителей) можно перевести в альдегидные группы конденсацией с глутаровым альдегидом, или в ариламинные группы с помощью n-нитробензоилхлорида, или в карбоксильные группы конденсацией с янтарным ангидридом. Другой способ модификации поверхности носителей основан на введении гибких, сравнительно длинных цепей (например, остатка н-пропиламина). Ввиду отсутствия пространственных препятствий последующее присоединение фермента к этим гибким группировкам позволяет в основном сохранить нативную структуру фермента, что в свою очередь способствует сохранению и стабилизации его каталитической активности. С помощью подобных модификаций можно также изменять гидрофобность или гидрофильность поверхности носителя.

На рисунке 7 суммированы типичные реакции иммобилизации ферментов с участием функциональных групп на поверхности носителей, в том числе перечисленных в таблице 9.

Каждая из указанных реакций протекает только в строго определенных условиях, в частности при заданных величинах рН, ионной силы и концентраций реагентов. Химическая природа функциональных групп на поверхности носителя определяет и функциональные группировки белка, с участием которых он образует ковалентные связи.

Из-за большого числа методов поверхностной модификации носителей иммобилизацию определенного фермента на конкретном носителе можно осуществить несколькими способами. Конденсация фермента с носителем не должна затрагивать аминокислотные остатки, входящие в активный центр фермента или расположенные вблизи него.

Решая вопрос о выборе носителя и способе модификации его свойств, учитывают взаимодействие между поверхностью носителя и реакционной смесью, из-за которого непосредственно примыкающие к носителю и к ферменту слои реакционной смеси могут существенно отличаться по своим свойствам от основного объема реакционной смеси.

Вокруг частиц носителя с ионизированными группами образуется зона с повышенной концентрацией противоположно заряженных ионов, что приводит к существенному изменению зависимости наблюдаемой каталитической активности от рН жидкой фазы в сравнении с аналогичной зависимостью для ферментативной реакции в растворе (рисунок 8).

1) Диазо-метод 4) Карбодиимидный метод можно осуществлять также конденсацию г руппы Рисунок 7 – Методы ковалентного связывания ферментов после модификации поверхности носителя Рисунок 8 – Различные зависимости каталитической активности от рН свободного фермента и фермента, иммобилизованного на ионизированном носителе: cубстрат – этиловый эфир ацетил-L-тирозина; 1 – химотрипсин (свободный);

2 – ЕМА-химотрипсин (иммобилизованный на отрицательно заряженном носителе – сополимере этилена с метакриловой кислотой);

3 – полиорнитилхимотрипсин (иммобилизованный на положительно Аналогично гидрофобные или гидрофильные свойства носителя влияют на локальные концентрации растворенных веществ и растворителей в соответствии с их гидрофобностью (или гидрофильностью).

Другая важная функция поверхности носителя связана с ее прямым или косвенным влиянием на молекулярное окружение фермента.

В какой-то степени фермент всегда взаимодействует с поверхностью носителя на молекулярном уровне и в то же время контактирует с реакционной средой, на которую так же, как только что было показано, влияет носитель. Молекула фермента построена таким образом, что она принимает определенную конформацию и проявляет соответствующую активность только в свойственной ей природной среде. Путем подбора носителя для иммобилизации фермента можно как сохранить свойственное данному ферменту окружение, так и направленно изменить его с тем, чтобы повлиять на активность, а также на селективность и стабильность фермента. Большое внимание уделяется изучению взаимодействий ферментов с их окружением на молекулярном уровне и выяснению возможности использования таких взаимодействий для углубления наших знаний о поведении ферментов в природных условиях и для оптимизации биокаталитических процессов.

На активность и другие параметры иммобилизованного фермента оказывают влияние также физические и механические свойства носителя. Пористость носителя и распределение пор по размерам определяют количество фермента, которое может быть иммобилизовано на этом носителе, и доступность субстрата для молекул фермента, связанных с внутренними поверхностями. Механическая прочность носителя в существенной степени влияет на возможность его использования в реакторах определенных конструкций. Например, в реакторе с перемешиваемой взвесью твердого катализатора нецелесообразно использовать носители, склонные к механическому истиранию, а легко сжимаемые материалы нельзя применять в насадочных колоннах крупномасштабных производств. Важна и способность носителя к набуханию.

Для создания ковалентных связей между молекулами ферментов можно использовать некоторые реагенты, содержащие две (или более) функциональные группы. Из таких реагентов чаще всего применяют глутаровый альдегид, образующий межмолекулярные (и, возможно, внутримолекулярные) связи с участием аминогрупп фермента В качестве бифункциональных реагентов используют бисдиазобензидин, цианурхлорид и гексаметилендиизоцианат.

Сшитые поперечными связями ферменты обычно представляют собой желатинообразную массу, механические свойства которой не отвечают требованиям большинства процессов. Как показано на рисунке 9, адсорбция фермента на носителе и последующая его сшивка бифункциональными реагентами улучшает механические свойства катализатора и облегчает доступ субстрата к ферменту.

Метод иммобилизации фермента путем его включения выгодно отличается относительной независимостью от природы фермента и возможностью применения одной методики для иммобилизации различных ферментов, а также сравнительно небольшими нарушениями нативной структуры фермента. Методы включения можно разделить на две группы: к первой группе относят методы, основанные на включении фермента в полимерную матрицу, а ко второй – методы, в которых раствор фермента отделяют мембраной, проницаемой для субстратов и (или) продуктов реакции, но непроницаемой для фермента.

Чаще всего фермент иммобилизуют в трехмерной полимерной решетке полиакриламидного геля путем полимеризации акриламида в присутствии сшивающих мономеров и фермента (Е) (см. рисунок 9).

Как указано на рисунке, инициатором полимеризации может быть персульфат калия (K2S2O8), а ее ускорителем – -диметиламинопропионитрил (DMAPN). С помощью этих реагентов можно получать гели иммобилизованных ферментов с диаметром пор от 100 до 400 нм, которые удерживают ферменты, имеющие диаметр молекул от 300 до 2000 нм.

В альтернативном способе иммобилизации раствор фермента отделяют мембраной таким образом, чтобы фермент постоянно находился в объеме, ограниченном этой полупроницаемой мембраной.

Биологическим прототипом этого метода иммобилизации являются лизосомы, в которых сконцентрированы гидролитические ферменты, вызывающие при попадании в цитоплазму мгновенную гибель клетки.

В одном из вариантов этого способа, называемом микрокапсулированием, ферменты заключают в крохотные капсулы диаметром до 300 мкм.

Капсулы заключены в сферические мембраны с порами, через которые в любом направлении могут транспортироваться небольшие молекулы субстратов и продуктов реакции и в то же время не могут проникать ферменты и другие высокомолекулярные соединения.

Известны два метода изготовления полупроницаемых микрокапсул. В первом методе формируют постоянную полимерную мембрану. Для этой цели на границе раздела двух фаз – органической и водной, содержащей фермент, проводят реакцию сополимеризации.

Если в качестве одного из реагентов взять водонерастворимый мономер, а в качестве другого – мономер, обладающий заметной растворимостью в той и другой фазах, то их сополимеризация будет осуществляться только вблизи границы раздела фаз.

Устойчивые полимерные микрокапсулы можно получить также путем коацервации, то есть выделения из раствора полимера микрокапель новой жидкой фазы, обогащенной полимером. Неустойчивые микрокапсулы получают эмульгированием водного раствора фермента в присутствии ПАВ; при этом образуются капсулы, заключенные в мембрану из ПАВ, которые добавляют к водному раствору субстрата.

Оба метода микрокапсулирования выгодно отличаются высокой удельной поверхностью катализатора и повышением специфичности.

Полимеризация K2 S2 O8 –СН2–СН–СН2–СН–СН2–СН–СН2–СН–СН2– –СН2–СН–СН2–СН–СН2–СН–СН2–СН–СН2– Рисунок 9 – Метод иммобилизации фермента путем его включения в полимер. Полимерная матрица представляет собой полиакриламид, Характерная величина составляет 2500 см2 на 1 мл суспензии фермента. Изготавливают также мембраны, селективно пропускающие одни субстраты и задерживающие другие. Эти методы применимы к любым ферментам. В то же время мембрана представляет собой препятствие для массопередачи, поэтому «коэффициент эффективности»

заключенных в микрокапсулу ферментов может быть очень низким.

Кроме того, эти методы вообще неприменимы, если размеры молекулы субстрата сравнимы с размерами молекулы фермента.

Для иммобилизации ферментов можно использовать и устройства, основанные на ультрафильтрации через полупроницаемые мембраны, которые не мешают обмену молекулами небольшого диаметра между раствором фермента и соседним раствором. На рисунке изображена принципиальная схема непрерывной ультрафильтрации.

Рисунок 10 – Локализация фермента в масштабе всего реактора.

Полупроницаемая мембрана удерживает фермент и другие высокомолекулярные соединения в реакторе В то же время, в отличие от метода микрокапсулирования, в этом случае площадь поверхности, разделяющей два раствора, невелика, и к тому же здесь возникает опасность индуцированной потоком денатурации фермента. Скорость массообмена через мембрану довольно низка, что может лимитировать скорость всего процесса. К преимуществам метода иммобилизации ферментов с помощью полупроницаемых мембран можно отнести возможность применения практически любого фермента и смесей любых ферментов, а также высокомолекулярных или нерастворимых субстратов (по отношению к которым связанные с полимерными носителями ферменты обычно малоэффективны). В реакциях гидролиза полимеров через полупроницаемые мембраны проникают только низкомолекулярные соединения, а все вещества с относительно большой молекулярной массой остаются в растворе фермента. На этом принципе основан метод регулирования молекулярно-массового распределения продуктов реакции на выходе из реактора.

Изучен целый ряд вариантов принципиальной схемы, изображенной на рисунке 10. Так, вместо реактора с перемешиванием можно использовать трубчатый реактор. Блок с одной полупроницаемой мембраной можно заменить на устройство с множеством параллельных пустотелых нитей, в котором один поток направляется во внутреннюю полость нитей, а другой – в омывающий нити объем.

Важнейшие характеристики различных методов иммобилизации ферментов суммированы в таблице 11.

Таблица 11 – Сравнение основных характеристик различных методов иммобилизации ферментов Методика ФерментаУмерен- Высотивная Низкая Высокая Высокая активность Здесь под «ферментативной активностью» понимается собственная каталитическая активность иммобилизованных ферментов по отношению к активности тех же ферментов в растворе. В общем случае методы химической иммобилизации снижают активность ферментов, поскольку создающиеся в процессе иммобилизации ковалентные связи могут в какой-то мере нарушать третичную структуру, свойственную нативным белкам. С другой стороны, ковалентные связи обеспечивают надежное, прочное связывание фермента, а иногда снижают скорость его инактивации и изменяют специфичность в нужном направлении.

Иммобилизация ферментов путем их включения или адсорбции обычно в меньшей степени сопровождается нарушением их структуры, и поэтому свойства иммобилизованных такими методами ферментов мало отличаются от их свойств в растворах. На практике в силу эффектов массопередачи соответствующие параметры иммобилизованного фермента могут иметь совсем другие значения.

Диффузионные эффекты сильнее проявляются в случае сшитых поперечными связями и включенных ферментных катализаторов и в меньшей степени – у ферментов, иммобилизованных на носителях.

1.3.2 Промышленные процессы на иммобилизованных ферментах Катализаторы на основе иммобилизованных ферментов уже используются в той или иной мере в ряде крупномасштабных промышленных производств. К важным областям применения иммобилизованных ферментов относятся производство сиропа с высоким содержанием фруктозы из кукурузного крахмала и производство L-аминокислот путем разделения рацемических смесей (состоящих из L- и D-изомеров). В производстве полусинтетических пенициллинов применяют иммобилизованную пенициллинацилазу.

Сахар (сахарозу) нельзя заменить D-глюкозой, поскольку глюкоза менее сладка. К тому же кристаллизация концентрированных растворов глюкозы может затруднить их последующую переработку и хранение. Эти проблемы могут быть устранены, если глюкозу частично изомеризовать во фруктозу с помощью фермента глюкозоизомеразы При 50 °С константа равновесия этой реакции близка к единице, и изменение температуры практически не влияет на нее, поскольку теплота реакции изомеризации составляет всего лишь приблизительно 1 ккал/моль. Поэтому продуктом реакции является смесь глюкозы и фруктозы в отношении приблизительно 1:1. Такая смесь значительно более сладка, чем чистая глюкоза, и может заменять сахар в различных областях, в том числе в производстве безалкогольных напитков, приготовлении различных пищевых продуктов и в хлебопекарной промышленности. Еще более сладкие смеси можно получать путем хроматографического разделения продуктов изомеризации, приводящего к обогащению смеси фруктозой.

Глюкозоизомераза представляет собой внутриклеточный фермент, продуцируемый рядом микроорганизмов, из которых используются главным образом некоторые штаммы Arthrobacter и Streptomyces.

Необходимость дезинтеграции клеток достаточно мягкими методами, не вызывающими необратимую инактивацию фермента, приводит к существенному повышению стоимости глюкозоизомеразы по сравнению, например, с внеклеточными гидролазами. К тому же глюкозоизомераза очень чувствительна к ряду ингибиторов. Оба этих фактора предполагают целесообразность иммобилизации глюкозоизомеразы и ведения процесса в строго контролируемых условиях. Изучены различные методы иммобилизации глюкозоизомеразы, в том числе и метод, основанный на применении содержащих фермент целых клеток, закрепленных в коллагене или с помощью какого-либо другого флокулирующего и связывающего агента. Такой прием может служить примером еще одного подхода к иммобилизации внутриклеточных ферментов, заключающегося в иммобилизации продуцирующих этот фермент клеток (обычно обработанных с целью снижения сопротивления клеточных мембран массообмену) или лизатов таких клеток.

На рисунке 11 приведена схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы при использовании иммобилизованной глюкозоизомеразы.

Рисунок 11 – Схема процесса производства кукурузного сиропа Здесь необходимость множества операций разделения и обработки промежуточных продуктов между стадиями осахаривания и изомеризации диктуется свойствами ферментных систем. Для повышения термической устойчивости -амилазы, применяемой для гидролиза крахмала при температуре около 105 °С, добавляют ионы кальция, которые ингибируют глюкозоизомеразу, и поэтому их связывают ионообменными смолами прежде, чем декстрозный раствор поступит в реактор изомеризации.

Пример 2. Параметры процесса изомеризации глюкозы в реакторе в присутствии иммобилизованной глюкозоизомеразы. Для выбора типа катализатора, конструкции реактора и условий каталитического процесса в реакторе потребовалось тщательное изучение множества взаимосвязанных параметров. В таблице 12 перечислены некоторые из параметров и критериев, которые учитывались ранее при проектировании реакторов для получения кукурузного сиропа с высоким содержанием фруктозы с помощью иммобилизованной глюкозоизомеразы.

Таблица 12 – Параметры, изучавшиеся в ходе проектирования ферментера с иммобилизованной глюкозоизомеразой 2 Стабильность фермента в процессе работы ферментера (время жизни катализатора) и зависимость инактивации от времени 3 Производительность в используемом диапазоне времени 4 Оптимальная концентрация субстрата 5 Влияние концентрации олигосахаридов 6 Влияние растворенного кислорода 7 Минимальное и максимальное время контакта с субстратом 8 Образование побочных продуктов реакции 9 Чувствительность к изменению рН и температуры 10 Устойчивость при хранении 11 Вымывание фермента 12 Рост микроорганизмов (если наблюдается) 13 Характеристики потока на выходе из реактора (состав, цвет, запах, содержание белков, рН и т.п.).

14 Размер, форма частиц и их распределение по размерам 15 Насыпная масса в сухом и влажном виде Продолжение таблицы 16 Набухание 17 Сжимаемость 19 Истирание частиц 20 Перепад давлений 21 Тип потока (восходящий или нисходящий) 22 Уплотнение слоя 23 Осевая дисперсия и каналообразование 24 Распределение времени пребывания 25 Расслаивание 26 Отношение длины к диаметру 27 Минимальная скорость начала псевдоожижения В таблице 13 указаны основные свойства катализатора, выбранного в ходе разработки проекта компанией Н.J. Неinz Соmpany.

Таблица 13 – Физические и каталитические свойства иммобилазы – катализатора с глюкозоизомеразной активностью (продукт фирмы IСI) Форма катализатора Сухие гранулы Размер частиц, меш (цилиндрические гранулы диаметром Объемная плотность в сухом состоянии, г/см Объемная плотность во влажном состоянии, г/см Характерный размер пор, мкм 0, Производительность обогащенного фруктозой сиропа на Объем пустот в слое, % Около 45, Единица активности определяется как количество катализатора, способное превратить 10–9 молей субстрата в 1 мин при 60 С и рН 8,0.

Выбранный размер частиц катализатора удовлетворяет двум взаимоисключающим требованиям: с одной стороны, частицы катализатора достаточно малы, чтобы скорость диффузии не лимитировала скорость всего процесса, а с другой – их размеры достаточно велики, чтобы свести к минимуму перепад давлений на реакторе колонного типа со слоем иммобилизованного фермента.

Оптимальные условия реакции приведены в таблице 14. Необходимо обеспечить высокое содержание глюкозы в поступающей в реактор смеси; присутствие в ней более 10,0 % олигосахаридов существенно снижает активность фермента. Большой диапазон времени контакта катализатора с субстратом объясняется постепенной инактивацией катализатора. С течением времени активность фермента падает и при постоянной скорости потока реагентов степень превращения субстрата постепенно снижается. Для обеспечения качества продукции по мере инактивации фермента время его контакта с субстратом увеличивают путем уменьшения скорости потока.

Таблица 14 – Условия реакции изомеризации глюкозного сиропа в ферментерах колонного типа в слое иммобилизованного фермента Содержание сухого вещества, % Содержание глюкозы в исходной смеси, % Требования к исходной фильтрованием, обработкой Активатор Время контакта фермента с субстратом, ч Размеры реактора колонного типа определяются гидромеханическими свойствами слоя катализатора. При нисходящем потоке реакционной смеси слой иммобилизованного фермента способен сжиматься под давлением, в результате сопротивление потоку возрастает.

На рисунке 12 изображена зависимость перепада давлений на колонне от высоты слоя катализатора при максимальной скорости потока, допустимой в случае свежего катализатора.

Рисунок 12 – Зависимость перепада давления в колонне от высоты слоя катализатора; колонна с нисходящим потоком раствора заполнена гранулами иммобилизованной глюкозоизомеразы Если перепад давления на колонне превышает 0,2 кг/см2, то сопротивление колонны резко возрастает. Отсюда следует, что максимальная высота слоя катализатора должна составлять около 4,6 м. Учитывая известное время контакта катализатора с субстратом и заданную производительность всей установки, можно определить размеры необходимых колонных реакторов и их число. В силу инактивации катализатора устанавливают несколько колонн, так чтобы они инактивировались (и заменялись) последовательно; это позволит максимальным образом использовать катализатор и обеспечить постоянную высокую производительность установки в целом.

Потребность в L-аминокислотах для производства пищевых продуктов и в медицинских целях постоянно возрастает. В связи с этим большое внимание уделяется разработке как микробиологических, так и химических методов получения L-аминокислот. Недостатком химических методов является рацемическая смесь синтетических аминокислот. D-изомеры не имеют питательной ценности, поэтому желательно получать только физиологически активные L-аминокислоты.

Процесс разработан фирмой Tanabe Seiyaku Co., Ltd. (Осака, Япония), в котором впервые в промышленном масштабе применялись иммобилизованные ферменты, и результаты были опубликованы в печати (рисунок 13).

Рисунок 13 – Ферментеры колонного типа с иммобилизованным ферментом, применяющиеся фирмой Tanabe Seiyaku Co., Ltd.

Основой процесса является метод разделения оптических изомеров в соответствии со следующей реакцией, катализируемой ферментом аминоацилазой DL–R–CH–COOH + H2O L–R–CH–COOH + D–R–CH–COOH Реакцию осуществляют в ферментере колонного типа с иммобилизованной аминоацилазой (см. рисунок 13), затем главный продукт реакции L-аминокислоту отделяют от негидролизованной D-ациламинокислоты на основе их различной растворимости. Затем D-ациламинокислоту рацемизуют до DL-ациламинокислоты и ее снова направляют в колонну с аминоацилазой. Схема процесса приведена на рисунке 14.

Рисунок 14 – Технологическая схема процесса с применением иммобилизованной аминоацилазы фирмы Tanabe Seiyaku В таблице 15 суммированы выводы о свойствах различных форм иммобилизованных ферментов. Эти данные еще раз говорят о том, что при подборе катализатора для промышленного использования помимо начальной активности необходимо учитывать другие факторы.

В итоге была выбрана аминоацилаза, иммобилизованная ионными связями на DЕАЕ-сефадексе, в силу высокой активности, простоты получения, возможности регенерации и устойчивости катализатора.

В 1978 г. представители компании Tanabe Seiyaku сообщили, что этот катализатор используется уже более пяти лет без какого-либо механического разрушения и снижения (связывающей) активности.

В 1983 г. было опубликовано сообщение о первом промышленном процессе с применением ферментов, иммобилизованных полупроницаемыми мембранами, – процессе превращения с помощью ацилазного фермента N-ацетил-DL-метионина в L-метионин.

Таблица 15 – Свойства различных форм аминоацилазы (субстрат – ацетил-DL-метионин) Еактивации, ккал/моль [Co ]opt, мкмоль/ч Методика получения щие силы нерации 1.3.3 Применение иммобилизованных ферментов в медицине и биохимическом анализе В настоящее время известно более сотни врожденных метаболических заболеваний человека; многие из этих дефектов связаны с отсутствием активности какого-либо одного конкретного фермента, имеющегося в организме здоровых людей. Например, фенилкетонурия (болезнь, приводящая к задержке умственного развития), как полагают, вызывается недостатком фермента, превращающего фенилаланин в тирозин. В настоящее время терапевтический способ лечения фенилкетонурии сводится к специальной диете, не содержащей фенилаланина.

Альтернативным способом лечения могло бы быть введение недостающего фермента, однако фермент с такой же активностью, выделенный из животных, вызывает резкую иммунологическую реакцию организма человека. Эту проблему, возможно, удастся решить, заключив фермент в микрокапсулы, волокна или гель. Иммобилизованный таким образом фермент уже не вызовет защитной реакции иммунной системы, и в то же время небольшие молекулы субстрата смогут контактировать с ферментом, проникая через стенки микрокапсулы, волокна или гель.

Защищенные мембранами ферменты не подвергаются действию антител, но в то же время концентрация биокатализаторов на поверхности природных мембран снижает эффективность массообмена, а следовательно, и скорость утилизации субстрата.

Вариант изложенного выше подхода был положен в основу одного из предполагаемых проектов компактной искусственной почки. Согласно этому проекту, уреазу и ионообменную смолу или активированный уголь помещают в одну микрокапсулу; образующийся в процессе разложения мочевины аммиак адсорбируется внутри микрокапсулы Мочевина мочевина HCO + NH адсорбция на смоле Из попыток применения иммобилизованных ферментов в мелкомасштабном производстве следует отметить их использование для трансформаций стероидов Так, например, применяемый при лечении артрита кортизол можно получать из дешевого предшественника 11-дезоксикортизола в колонне с иммобилизованной 11--гидроксилазой, затем кортизол можно перевести в еще более ценный лекарственный препарат преднизолон в реакторе со слоем иммобилизованной '-дегидрогеназы.

Подавляющее большинство трансформаций стероидов в промышленном масштабе осуществляют микробиологическим путем.

Иммобилизованные ферменты широко применяются в аналитической биохимии. Одним из примеров – электроды с иммобилизованными ферментами, осуществляющие непрерывный контроль (мониторинг) за низкими концентрациями биохимически важных веществ.

В электроде для определения мочевины (рисунок 15) иммобилизованная уреаза разлагает мочевину на ионы, которые могут быть обнаружены обычными электрохимическими методами.

Рисунок 15 – Электрод для определения мочевины:

уреаза иммобилизована в геле, нанесенном на поверхность Электроды с иммобилизованными ферментами (рисунок 16) позволяют автоматизировать стандартные биохимические анализы.

Такая автоматизированная система может применяться, например, для определения концентраций глюкозы или лактата с помощью иммобилизованной глюкозооксидазы или лактатдегидрогеназы.

На этом принципе основаны конструкции ферментных электродов для определения многих биологически важных соединений (таблица 16).

Риунок 16 – Схема автоматической системы для определения глюкозы (с помощью иммобилизованной глюкозооксидазы) или лактата (с помощью иммобилизованной лактатдегидрогеназы) Таблица 16 – Применение иммобилизованных ферментов в химических процессах и потенциальные сферы их использования Тип катализируемой Иммобилизован- Область Окисление– восстановление Продолжение таблицы Миграция групп Декстрансукраза Миграция групп Полинуклеотид- Получение Продолжение таблицы (асимметрический Аспартаза Лиазные реакции Изомеризация Для изучения ферментативных реакций в мембранах был разработан метод флуориметрии на поверхностях для непосредственного определения концентрации различных ферментов, субстратов и кофакторов.

Использование иммобилизованных биохимических соединений в аффинной хроматографии основано на чрезвычайно высоком сродстве определенных веществ, находящихся в растворе, к иммобилизованному соединению, что позволяет выделять, очищать и анализировать ингибиторы ферментов, кофакторы, антигены, антитела и другие вещества (см. рисунок 16).

1.3.4 Утилизация и регенерация кофакторов В отсутствие кофакторов только два класса ферментов из шести способны проявлять каталитическую активность.

Для широкомасштабного промышленного использования ферментов четырех других классов необходимо располагать эффективными способами получения, разделения и выделения достаточных количеств органических кофакторов. Более того, для эффективной утилизации и регенерации коферментов необходимы специальные реакторы и каталитические установки.

Если фермент и кофермент помещены в полые волокна с полупроницаемыми стенками, через которые могут проникать и субстрат, и продукты реакции, то ферментативную реакцию можно провести без потери фермента и кофермента. На рисунке 17 приведена схема лабораторного реактора, основанного на таком принципе.

Рисунок 17 – Схема лабораторного реактора с полыми полупроницаемыми волокнами, где осуществляется непрерывный процесс, катализируемый фермент-коферментной системой В таком реакторе, в частности, изучали протекающую в присутствии NAD двустадийную реакцию окисления этанола.

При достаточной активности и стабильности каталитической системы подобная схема может быть взята за основу и при проектировании более крупномасштабного процесса.

Этанол + NAD+ ацетальдегид + NADH + Н+ Ацетальдегид + NAD+ ацетат + NADH + Н+ Этот процесс может протекать непрерывно только при условии постоянной регенерации NAD+ путем окисления NADH; для этой цели в реакционную смесь, находящуюся внутри полых волокон, добавляли фермент диафоразу (из сердца свиньи). Диафораза катализирует окисление NADH кислородом, причем в процессе регенерации кофактора NAD+ образуется также Н2О2. Поскольку пероксид водорода инактивирует многие ферменты, ферментную систему дополняют еще ферментом каталазой. Такой подход может быть распространен и на другие ферментативные реакции. Но если молекулярная масса субстрата близка молекулярной массе кофермента (коферментов) и ферментов, то потребуется некоторая модификация схемы. Если же и молекулы кофермента относительно невелики, то устранить их потерю за счет ультрафильтрации можно, например, путем ковалентного связывания с растворимым полимером типа полиэтиленгликоля, декстрана или полилизина.

Теперь рассмотрим такие катализируемые фермент-коферментной системой процессы, в которых ферменты и (или) соответствующие коферменты связаны с нерастворимыми носителями. Любой катализатор такого типа должен обеспечивать и физический контакт фермента с коферментом, и возможность регенерации кофактора. Можно наметить три различных подхода к решению такого типа задач.

Можно иммобилизовать кофермент, а фермент и все необходимые для регенерации вещества вводить в растворенном виде. Тогда в реакционной смеси на выходе из реактора будут содержаться все реагенты, за исключением кофермента.

Можно иммобилизовать фермент, а кофермент оставить в растворе, следовательно, он перейдет и в продукты реакции. Другие ферменты и субстраты, необходимые для регенерации кофермента, можно вводить в реактор в виде раствора. В альтернативном варианте процесс регенерации может осуществляться в отдельном реакторе, в котором также могут использоваться иммобилизованные ферменты.

Можно соединить молекулы фермента и кофермента длинной гибкой цепью и затем иммобилизовать этот комплекс фермент– кофермент («кофермент на привязи»).

В промышленном производстве выбор между первым и вторым подходами определяется технологическими и экономическими факторами: легкостью осуществления, эффективностью и стоимостью процессов выделения и повторного использования фермента, кофермента и (или) системы его регенерации. Если повторное использование компонентов реакционной смеси невозможно, то первый подход более целесообразный, поскольку большинство коферментов намного дороже любого другого компонента смеси.