На правах рукописи

Го Даньян

АНТИМИКРОБНОЕ ДЕЙСТВИЕ И ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ

ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫХ БЕЛКОВ

03.02.03- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2013

Работа выполнена на кафедре микробиологии биологического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова

Научный руководитель: доктор биологических наук, доцент Юдина Татьяна Георгиевна

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Баскова Изольда Парфирьевна

Официальные оппоненты: Полянская Любовь Максимовна доктор биологических наук, профессор Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, факультет почвоведения, кафедра биологии почв, ведущий научный сотрудник Ананьева Надежда Дмитриевна доктор биологических наук, Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, старший научный сотрудник

Ведущая организация: Федеральное государственное унитарное предприятие Государственный научно-исследовательский институт Генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Защита состоится 20 июня 2013 г. в 15.30 на заседании диссертационного совета Д.501.001.

21 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, дом 1, МГУ, корп.12, Биологический факультет, ауд. М-1.

Тел.8(495)939054-83, эл. почта [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГУ.

Автореферат разослан 20 мая 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Пискункова Нина Федоровна.

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность темы.

Многим белкам свойственна полифункциональность, то есть способность проявлять не одну, а две или более разных активностей, причем, с помощью различных механизмов. Лизоцимы полифункциональны, так как, помимо известных ферментативных активностей (мурамидазной и некоторых других), они способны и к неферментативному действию на клетки, включающему, прежде всего, связывание с цитоплазматической мембраной и нарушение её проницаемости, результатом чего является выраженный антимикробный эффект, проявляющийся и после потери их мурамидазной активности. Способность к мембранотропной активности лизоцимов и ряда других белков дали основание исследователям отнести их к группе антимикробных белков и пептидов (АМБП) – перспективной альтернативы антибиотикам для борьбы с возбудителями многих заболеваний. АМБП являются важной составляющей врождённого иммунитета (Wiesner, Vilcinkas, 2010).

Последние исследования показали сходство ряда АМБП с амилоидными белками, способными к образованию in vivo и in vitro агрегатов из фибрилл на основе перекрещивающихся -слоёв (Torrent et al., 2010, 2012). Установлена способность с-лизоцима и других белков к формированию амилоидных фибрилл (Gharibyan et al., 2007; Harris et al., 2012). Многие исследователи сходятся во мнении, что амилоидогенность - общее свойство полипептидных цепей (Dobson, 1999; Bucciantini et al., 2002). Причём, образуемые различными белками агрегаты часто токсичны (Stefani, Dobson, 2003). Цитотоксичность амилоидов играет ключевую роль при возникновении многих заболеваний (например, болезней Альцгеймера, Паркинсона, амилоидозов, диабета 2 типа) и в то же время - в борьбе с патогенными микроорганизмами. Общим свойством амилоидов также является полиморфизм, в связи с множественностью путей образования фибрилл (Gharibyan et al., 2007). Поэтому исследование антимикробного действия полифункциональных АМБП представляет значительный теоретический и практический интерес.

Уникальный представитель полифункциональных белков, родоначальник семейства i-лизоцимов - Дестабилаза-Лизоцим (Д-Л) из секрета слюнных клеток медицинской пиявки, действие которого направлено на гидролиз бета-(1,4)-гликозидных связей между N-ацетил-мурамовой кислотой и N-ацетил-глюкозамином пептидогликана бактериальной стенки, обладающий также эндо--(-Glu)-Lys–изопептидазной активностью. Д-Л способна к растворению стабилизированного фибрина и к расщеплению Д-димера (фрагмента деградации стабилизированного фибрина) до мономеров путем не протеолиза, а изопептидолиза эндо--(-Глу)-Лиз связей, соединяющих мономеры, такой механизм приводит к медленному разрушению старых, предобразованных тромбов (Баскова и др., 2000, 2008, 2010, 2012;

Завалова и др., 2010). Д-Л – высокоэффективный антимикробный агент благодаря своим ферментативной и мембранотропной активностям (Zavalova et al., 2006).

Изучение различных проявлений активности Д-Л имеет особую практическую значимость в связи с разработкой новых лекарственных средств, сочетающих тромболитические и антимикробные свойства.

Полифункциональны и Cry-белки - основной компонент кристаллических параспоральных включений энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis - высокоспецифичные токсины некоторых насекомых и других беспозвоночных. Их молекулы могут по-разному проявлять свою биологическую активность в зависимости от клеток - мишеней: 1) не только высокоспецифично разрушать клетки чувствительных беспозвоночных, связываясь с рецепторами на их мембранах и оказывая мембранотропное действие, 2) но и с меньшей специфичностью подавлять рост микроорганизмов посредством не изученного пока механизма, конечный эффект которого мембранотропный. Кристаллы ряда подвидов B. thuringiensis кроме Cry содержат и Cyt белки, которые также полифункциональны, так как проявляют, помимо неспецифичной инсектицидной активности, и антимикробную (Юдина и др., 1988; 1996; 2003; 2004, 2006, 2007).

Полифункциональность Cry и Cyt белков проявляется также в том, что они разрушают клеточную стенку микроорганизмов. Такой механизм отличается от мембранотропного и требует исследований. Имеются сообщения о влиянии белков кристаллов и на клетки млекопитающих.

Актуальность изучения антимикробной активности Cry-белков намного возросла в связи с введением cry-генов в растения для защиты последних от вредных насекомых. При этом большое количество таких белков, синтезируемых всеми частями генетически модифицированных растений, может накапливаться как в самих растениях, так и в почвах, и влиять на биоценозы.

Особенно важны экологические последствия изменения почвенных микробиоценозов.

При попадании токсинов (например, белков параспоральных кристаллов Bacillus thuringiensis) в насекомое у последнего возникает иммунный ответ, приводящий к синтезу лизоцимов, лизоцим-подобных и многих других белков. В этот период вышеуказанные токсины и лизоцимы могут взаимодействовать. Такие процессы представляют несомненный интерес для понимания экологической роли этих белков, их влияния на факторы врождённого иммунитета и на развитие инфекции. Принципиальные этапы этих процессов можно смоделировать in vitro, первым шагом при этом является изучение антимикробных эффектов Cyt, Cry белков, а также лизоцимов.

Поэтому сравнительное изучение особенностей антимикробного действия полифункциональных белков из параспоральных кристаллов B. thuringiensis и Д-Л из медицинской пиявки актуально, имеет большую теоретическую и практическую значимость.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение антимикробной активности и определение её экологической роли у различных полифункциональных белков: а) образующих параспоральные кристаллы энтомопатогенной бактерии B. thuringiensis и б) двух форм рекомбинантного белка Дестабилазы-Лизоцима. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Выделить белки параспоральных кристаллов B. thuringiensis, изучить антимикробный эффект прежде всего Сry1A белка на представителей царств грибов и бактерий, а также 2) Получить форму рД-Л, лишённую мурамидазной активности (рД-Л)t, провести сравнительное исследование антимикробного эффекта этих белков на представителей царств грибов и бактерий.

3) Провести электронно-микроскопическое изучение морфологии лизирующихся микроорганизмов, чувствительных к антимикробной активности исследуемых белков, установить основные закономерности такого лизиса.

Исследовать с помощью ТЭМ морфологию фибрилл кристаллов B. thuringiensis и определить роль амилоидогенности белков кристаллов.

5) Подобрать различные инкубационные условия, которые бы дали возможность моделировать in vitro некоторые изменения антимикробной активности белков.

Основные положения, выносимые на защиту.

1) Белок рД-Лt, лишённый мурамидазной активности, оказывает больший антибиотический эффект на грибы, чем нативный рД-Л.

2) На поверхности кристаллов B. thuringiensis обнаружены амилоидные фибриллы, их больше всего на поверхности кристаллов B. thuringiensis ssp. amagiensis, состоящих из уникальных белков.

3) Прединкубация белков кристаллов с препаратом клеточных стенок и GalNAc активирует образование амилоидных фибрилл этими белками, антибактериальная активность которых выше, чем у олигомеров.

4) Биогенные амины серотонин ослабляет антибиотическую активность белков кристаллов, а дофамин не оказывает на неё влияния.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Сравнительное исследование антимикробной активности разных полифункциональных белков дало возможность проанализировать её экологическое и практическое значение.

Впервые обнаружены амилоидные фибриллы на поверхности кристаллов B. thuringiensis и определено как их экологическое значение, так и их роль в проявлении антимикробной активности белков кристаллов. Впервые показано in vivo, что антимикробная активность Cry3A B. thuringiensis ssp. tenebrionis, приводит к гибели значительного количества клостридий-симбионтов в средней кишке мучного хрущака Tenebrio molitor. Эти клостридии чувствительны также к антибиотическому влиянию рД-Л и Cyt1A. Смоделирован in vitro анализ некоторых реакций иммунного ответа на цитотоксические полифункциональные АМБП. Изученное антимикробное действие полифункциональных белков имеет большое практическое значение для анализа последствий распространения генетически модифицированных растений, синтезирующих белки параспоральных кристаллов B.

thuringiensis, а также для разработки нового лекарственного препарата на основе рД-Л, которая проходит в настоящее время.

Апробация работы и публикации. По результатам диссертационной работы опубликовано 3 научные статьи в рецензируемых изданиях, рекомендованных Министерством Образования и ВАК РФ, а также 3 научные статьи в сборниках.

Опубликовано 11 тезисов докладов на российских и международных конференциях.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов» (Москва, 2009), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биологически активные вещества микроорганизмов» (Москва, 2010), Asian Congress on Biotechnology (Shanghai, 2011), VII Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2011), Chinese Fourteenth National Conference on Environmental Microbiology (Xiamen, 2011), Съезде микробиологов Узбекистана (Ташкент, 2012), XIX и XX Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2012» и «Ломоносов-2013» (Москва, 2012, 2013), Международной конференции Ассоциации гирудологов (Харьков, 2012), II Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия» (Санкт-Петербург, 2012), The 15th Guangzhou Convention of Oversea Chinese Scholars in Science and Technology (Guangzhou, 2012).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов и их обсуждения, заключения, выводов. Работа изложена на 131 страницах, содержит 12 таблиц и рисунков, приложения. Список литературы содержит 205 отечественных и зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

В работе использовали типовые штаммы различных подвидов Bt, полученные из Института Пастера, хранящиеся на кафедре микробиологии МГУ. Использовали также штаммы, полученные и хранящиеся в ФГУП ВНИИГенетика.

Параспоральные кристаллы получали после выращивания энтомопатогенных бактерий на жидких или агаризованных питательных средах, для получения белков отделяли кристаллы от спор по известной методике с помощью п-ксилола (Chestukhina et al., 1980). Смесь белков кристаллов Bt получали путём растворения отмытых кристаллов в 0,02н NaOH в течение 1 часа при перемешивании. Разделение белков кристаллов проводили с помощью жидкостной хроматографии посредством системы FPLC на колонке MonoQ (“Pharmacia“, Швеция) разработанными методами (Chestukhina et al., 1980, 1986, 1994; Zalunin et al., 1982, 1998, 2004). Молекулярную массу белков и их фрагментов определяли электрофоретически в 10% ПААГ в присутствии 0,1% SDS. Полученные растворы, диализованные против 0,05М трис-HCl буфера рН 8,2 - 8,5, или 0,02 – 0,05М фосфатного буфера, рН 7,8 использовали для определения их антимикробной активности методом диффузии в агаре (Егоров и др., 1987, 1988; Юдина, Егоров, 1996).

В качестве тест-культур использовали микроорганизмы Музея кафедры микробиологии МГУ, а также полученные из коллекции DZMZ (Брауншвейг, ФРГ).

Тест-микроорганизмы выращивали на агаризованной среде №1(б), г/л: K2HPO4 – 7,0;

KH2PO4 – 2,0; цитрат натрия - 0,4; MgSO4 - 0,05; (NH4)2SO4 – 1,0; 0,5% триптозного агара (“Reanal”, Венгрия), H2Oдист.; pH 7,4.; а также на среде Чапека с 2% глюкозы, на картофельной, и на некоторых других средах (Нетрусов, 2005). Во всех случаях для приготовления агаризованных сред добавляли в них 13 г/л высокоочищенного агара производства фирм Difco (США) или Ferak (Германия).

Антибиотическую активность белков параспоральных кристаллов, а также рекомбинантного белка Дестабилазы–Лизоцима и некоторых его мутантов определяли, учитывая размер зоны подавления роста тест-культуры от конца лунки. Выражали удельную активность в единицах l/a (ед.), где l – ширина (не диаметр) четкой зоны подавления роста от края лунки (мм); a – количество белка, внесенного в лунку (мкг) (Yudina et al., 2003; Revina et al., 2005). Антибиотическую активность выражали и в ед/мг, используя при расчётах концентрацию раствора белка, внесённого в лунку, в мкг/мл (Юдина с соавт., 1992, 1996). Минимальные ингибирующие (или подавляющие) концентрации (МИК) растворов белков определяли известным способом путем учета антибиотических активностей ряда разведений. МИК выражали в мкг/мл раствора белка, внесенного в лунку. Статистическую обработку полученных результатов проводили