На правах рукописи

ТОНЬШИН АНТОН АЛЕКСАНДРОВИЧ

ДИНАМИКА И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ МЕХАНИЗМ ИНДУКЦИИ

АПОПТОЗА В ТКАНИ МИОКАРДА ПРИ АНОКСИИ

03.00.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2006

Работа выполнена в НИИ физико-химической биологии им. А.Н.

Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В.

Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Ягужинский Лев Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Звягильская Рената Александровна доктор биологических наук, профессор Зинченко Валерий Петрович

Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино

Защита состоится 30 октября 2006 г. в 15 ч 30 мин на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, корп. 12, биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.В. Медведева

Общая характеристика работы

Актуальность работы Для аэробных форм жизни кислород является одним из важнейших метаболитов. С одной стороны, молекулярный кислород – конечный акцептор электронов при дыхании аэробных организмов, с другой стороны, активные формы кислорода (АФК) – это молекулы, играющие огромную роль во внутриклеточной и межклеточной сигнализации. В процессе онтогенеза, а также при некоторых патологиях в тканях могут возникать области с пониженным содержанием кислорода. Падение парциального давления кислорода в тканях индуцирует включение ряда сигнальных систем. В частности, при гипоксии может происходить активация апоптоза или пролиферации. Самым активным потребителем кислорода в организме млекопитающих является ткань миокарда. Снижение уровня кислорода приводит к нарушению ее функции. Реакция тканей сердца на снижение парциального давления кислорода активно изучается во многих лабораториях. Наибольший интерес представляет изучение изменений, происходящих в митохондриях, так как кислород является одним из основных субстратов для этих органелл и снижение его концентрации, с одной стороны, приводит к нарушениям энергетики клетки, а с другой стороны, резко изменяет скорость генерации АФК в дыхательной цепи.

Кроме этого митохондрия контролирует запуск апоптоза, который часто индуцируется в кардиомиоцитах в условиях гипоксии. В большинстве исследуемых моделей изучается быстрая реакция ткани на гипоксию, опосредованная окислительным стрессом, связанным с повышением скорости генерации АФК. В случае полного отсутствия кислорода (аноксии), когда генерация АФК невозможна, изменения в ткани миокарда развиваются более медленно. Изучение механизмов изменений, происходящих в ткани миокарда, при длительном анаэробиозе осложняется тем, что в таких условиях возникает значительное (более 2 единиц) снижение pH, вызванное активацией гликолиза. Сильное снижение pH приводит к некрозу тканей, как в аэробных, так и в анаэробных условиях. До настоящего времени изменения, происходящие в кардиомиоцитах в условиях длительной аноксии при слабом (около 1 единицы) снижении pH, исследовались лишь на моделях переживающих клеточных культур. Подобные исследования на сердечных тканях не проводились. До сих пор остаются неизвестными изменения структуры и функции митохондрий в составе ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии, а также механизм клеточной смерти, который развивается в этой ткани при полном отсутствии кислорода и без сильных изменений pH.

Цель работы – изучить изменения системы митохондриальной энергетики в ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии при отсутствии значительного снижения pH, и определить особенности механизма клеточной гибели, протекающей в этой ткани при полном отсутствии кислорода.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель, позволяющую исследовать биохимические изменения, происходящие в ткани миокарда в условиях продолжительной аноксии.

2. Исследовать изменения ультраструктуры и функции митохондрий в составе ткани миокарда, происходящие в условиях длительной аноксии:

а) изучить изменения системы окислительного фосфорилирования, б) изучить изменения проницаемости митохондриальных мембран, в) установить изменения ультраструктуры митохондрий.

3. Изучить особенности механизма клеточной гибели кардиомиоцитов, запускаемой в ткани миокарда в анаэробных условиях.

Научная новизна работы В работе найдены условия, при которых в переживающей в бескислородной среде ткани миокарда сохраняется ультраструктура миофибрилл и дыхательная активность митохондрий в течение 1–3 суток. В ткани миокарда впервые зарегистрирована индукция особого типа апоптоза, который характеризуется специфичной межнуклеосомной фрагментацией ДНК и не сопряжен с выходом цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий. С помощью ингибиторного анализа доказано, что данный тип апоптоза включает в себя стадию открывания неспецифической поры в митохондриях. Показано, что открывание неспецифической поры является необходимым условием активации эндонуклеаз. Обнаружено, что в составе ткани миокарда митохондрии могут удерживать цитохром с в межмембранном пространстве в условиях открытой поры. Обнаружено, что в условиях аноксии целостность внешней мембраны митохондрий может нарушаться независимо от процесса открывания циклоспорин А чувствительной поры. Однако такое нарушение не приводит к индукции апоптоза. Изучена динамика изменения функции системы окислительного фосфорилирования митохондрий, а также изменения ультраструктуры митохондриальных мембран, происходящие в ткани миокарда во время длительной инкубации в аноксических условиях.

Практическая значимость работы Разработана новая экспериментальная модель для изучения процессов, происходящих в ткани миокарда в условиях длительной аноксии.

Продемонстрирована возможность использования данной модели для поиска и исследования механизмов действия биологически активных веществ, обладающих кардиопротекторными свойствами.

Апробация работы и публикации Результаты диссертации представлены на 8 научных конференциях. По теме диссертации опубликованы 3 статьи.

Структура и объем работы Диссертационная работа изложена на 126 страницах и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы. В работе содержится 24 рисунка и таблиц.

Материалы и методы исследования Экспериментальная модель Взрослых крыс (150-180 г) декапитировали, ткань желудочков извлекали и быстро измельчали на фрагменты с линейными размерами порядка 1-3 мм в растворе буфера, содержащего 250 мМ сахарозы, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris, рН 7.4 при 0 C. В опытах, где исследовалось влияние ионной силы на изменения, происходящие в ткани миокарда в условиях аноксии, использовалась среда: 125 мМ сахарозы, 60 мМ KCl, 250 мкМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris, рН 7.4. Препарат ткани помещали в пластиковые пробирки и доверху заливали тем же буфером, в котором нарезалась ткань, предварительно продутым азотом в течение 30 мин. При продувке удалялось 70–90 % кислорода (количество оставшегося кислорода контролировалось с помощью электрода Кларка). Образец быстро герметизировали и инкубировали при 20 оС в течение 24–72 часов. При измерении эндогенной скорости дыхания фрагментов ткани в среде предварительно продутой азотом было показано, что время удаления остатков кислорода из среды составляет менее 3-х минут. После окончания инкубации проводилось измерение pH среды с помощью pH электрода.

Выделение и электрофорез ДНК ДНК выделяли по стандартной методике фенольной экстракции. Осаждение ДНК проводили с помощью добавления изопропанола. От РНК избавлялись путем инкубирования смеси нуклеотидов с раствором РНКазы. Электрофорез ДНК проводили в течение 45 минут в 1%-агарозном геле, содержащем бромистый этидий.

Выделение митохондрий и приготовление митопластов Митохондрии для измерения функциональной активности и спектров выделяли с помощью стандартного метода дифференциального центрифурирования. Выделение проводили в среде содержащей 250 мМ сахарозы, 1мМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris; рН 7.4. Ядерную фракцию осаждали при 750g, митохондрии осаждали при 9000g. Митопласты делали путем помещения митохондрий в среду с резко сниженной тоничностью (1мМ ЭДТА, 10 мМ Hepes-Tris, pH 7.4). Концентрацию белка в митохондриях определяли биуретовым методом.

Исследование функциональной активности митохондрий Исследование функциональной активности митохондрий проводили с помощью одновременной регистрации скорости поглощения кислорода электродом Кларка и мембранного потенциала митохондрий ТPPселективным электродом. Среда инкубации содержала: 120 мМ KCl, 1мМ ЭДТА, 10мМ Hepes-Tris, 5 мМ глутамат, 5 мМ малат, 0.5 мкМ тетрафенилфосфоний (TPP), рН 7.4.

Определение содержания цитохрома с в суспензиях митохондрий и супернатантах Исследование содержания цитохрома с в митохондриях и супернатантах проводилось путем регистрации дифференциальных оптических спектров поглощения окисленной формы цитохромов против восстановленной.

Концентрация митохондрий в кювете составляла 1 мг белка на 1 мл среды. В суспензию митохондрий в кювете “образец” добавляли KCN (0.5 мМ) и несколько кристаллов дитионита; в кювете “сравнение” - ротенон (1мкМ) и FCCP (0.5 мкМ). В случае супернатантов в кювету “образец” добавляли несколько кристаллов дитионита, в кювету “сравнение” добавляли феррицианид (5мМ).

Иммуногистохимия Ткань фиксировали в PBS-буфере, а затем нарезали на 10 мкм срезы на криомикротоме. Далее проводилось иммуноокрашивание первичными моноклональными антителами мыши anti-Cytochrome c (BD Biosciences) и вторичными антителами козы anti-mouse IgG Cy-2 (Jackson) по стандартной методике. Клеточные ядра окрашивали с помощью Hoechst 33342 (Sigma).

Электронная микроскопия Для электронно-микроскопического исследования материал фиксировали 2,5% раствором глутарового альдегида в течение 2 ч при температуре 4°, затем дофиксировали 1% раствором четырехокиси осмия в течение 1,5 ч и обезвоживали в серии спиртов с возрастающей концентрацией спирта (70% спирт содержал насыщенный раствор уранил ацетата). Материал заливали в эпоксидную смолу Эпон-812. Срезы делали на ультрамикротоме LKB-III.

Окрашивали срезы свинцом по Рейнольдсу. Полученные препараты просматривали и фотографировали в электронном микроскопе HU-11B («Hitachi», Япония) Результаты и обсуждение 1. Модель срезов ткани миокарда, переживающих в условиях аноксии.

В первом разделе работы были подобраны условия, при которых в ткани миокарда в условиях аноксии не происходит резкого снижения pH при активации гликолиза. Объектом исследования были переживающие срезы ткани миокарда, помещенные в изотонические растворы с относительно высокой концентрацией буфера. В экспериментах было подобрано такое соотношение количества среды инкубации на единицу массы ткани, чтобы, с одной стороны, эндогенная скорость дыхания была достаточной для удаления остатков кислорода из среды за время, не превышающее 3 минуты, а с другой стороны, количества буфера хватало для того, чтобы удерживать скорость снижения pH среды на достаточно низком уровне, не превышающим 0.3-0.4 единицы в сутки. Эксперименты показали, что в этом случае ультраструктура ткани не претерпевает драматических изменений в течение 24 ч инкубации. Основная масса кардиомиоцитов имеет нативную структуру. Признаки некроза мышечной ткани отсутствуют. Видна хорошая сохранность миофибрилл, выражены Z-диски и Н-зоны, митохондрии располагаются рядами вдоль миофибрилл. При увеличении сроков инкубации до 72 ч ультраструктура ткани также не претерпевала драматических изменений. Важно подчеркнуть, что отличительной особенностью представленной модели является использование в качестве объекта исследования небольших фрагментов ткани, что позволяло предотвратить сильное снижение pH равномерно во всем объеме ткани. В Рисунок 1. Ультраструктура срезов ткани миокарда, инкубированных в условиях аноксии 24 ч, при незначительном (0.3-0.4 ед.) снижении pH.

опытах, где соотношение среда/ткань было таким, что количества буфера было не достаточно, и pH среды падал ниже, чем 5.5 единиц, ультраструктура ткани, инкубированной в таких условиях 72 ч, нарушалась.

Наблюдался лизис миофибрилл и разрушение митохондрий (рис. 2). Такая морфология характерна для кардиомиоцитов при некрозе. Следовательно, соотношение количества буфера на единицу массы ткани является ключевым параметром в данной модели. Можно заключить, что некротические изменения ультраструктуры ткани в условиях аноксии предполагают снижение pH среды, а не только снижение концентрации кислорода. В бескислородных условиях при приблизительном постоянстве pH ткань миокарда может сохранять свою ультраструктуру десятки часов.

Разработанная модель была использована для исследования биохимических изменений, происходящих в ткани миокарда в условиях продолжительной аноксии.

2. Ультраструктура и динамика изменений функциональной активности митохондрий ткани миокарда в условиях аноксии Рисунок 2. Ультраструктура срезов ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 72 ч, при значительном (2 ед.) снижении pH (некроз).

Кислород является одним из основных субстратов системы окислительного фосфорилирования митохондрий. Поэтому длительное отсутствие кислорода, прежде всего, должно вызывать повреждение этой системы. В связи с этим исследование изменений структуры и функции митохондрий, происходящих в ткани миокарда при длительном отсутствии кислорода, явилось одной из основных задач данной работы. В настоящем разделе описаны структурные и функциональные изменения митохондриальных мембран, а также динамика изменений системы окислительного фосфорилирования, происходящих в ткани миокарда в условиях аноксии. Обнаружено, что митохондрии в составе ткани способны удерживать цитохром с в межмембранном пространстве при открытой неспецифической поре.

А. Изменения ультраструктуры мембран митохондрий в условиях аноксии При электронно-микроскопическом исследовании ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч, было обнаружено, что на фоне практически неизмененной общей морфологии кардиомиоцитов происходят изменения в ультраструктуре митохондриального аппарата (рис 1).

Возникает гетерогенность популяции митохондрий. Часть популяции составляют набухшие митохондрии с обводненным, просветленным матриксом. Мембраны крист таких митохондрий имеют низкую электронную плотность, кристы утрачивают взаимнопараллельную ориентацию. Наряду с этим в ткани присутствуют электронно-плотные митохондрии с незначительно обводненным межмембранным пространством, электронноплотным матриксом, со взаимопараллельно расположенными кристами.

Количество межмитохондриальных контактов в ткани, инкубированной 24 ч в условиях аноксии, соответствует норме.

Б. Основные стадии изменений системы окислительного фосфорилирования в условиях аноксии Исследовалась функциональная активность митохондрий, выделенных из ткани миокарда на различных этапах инкубации в условиях аноксии. Было показано, что функция дыхательной системы митохондрий полностью сохраняется в течение 24 ч инкубации. Максимальная скорость дыхания на субстратах, как первого, так и второго комплексов дыхательной цепи не снижается относительно контроля (рис 3А, табл. 1). При этом фосфорилирующая функция митохондрий полностью нарушена: добавление АДФ не стимулирует скорости дыхания, мембранный потенциал () после добавления субстратов дыхания незначительно возрастает, но затем быстро спонтанно спадает (рис 3А). При более длительной инкубации ткани миокарда в аноксии (72 ч) полностью подавляется малатоксидазная активность митохондрий, но сукцинатоксидазная активность остается без изменений (рис 3Б, табл. 1). В результате было показано, что система окислительного фосфорилирования митохондрий быстро разобщается в процессе инкубации ткани в условиях аноксии. При этом функция дыхательной цепи сохраняется длительное время: сукцинатоксидазная активность регистрируется через 72 ч инкубации, а малатоксидазная активность через 24 ч инкубации.

Таблица 1. Максимальные скорости дыхания митохондрий аноксии** микарда, инкубированной 72 ч в аноксии** - среднеквадратичное отклонение N- количество экспериментов *- дыхание в состоянии 3 по Чансу **- дыхание не стимулируется разобщителем и АДФ Рисунок 3. Дыхание (верхние кривые) и мембранный потенциал (нижние кривые) митохондрий, выделенных из (А) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч; (Б) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 72 ч; (В) свежей ткани (контроль); (Г) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч в среде, содержащей 100 мкМ циклоспорина А; (Д) ткани миокарда, инкубированной в условиях аноксии 24 ч в среде, содержащей 1 мМ спермина. Инкубацию проводили в средах с низкой ионной силой. Добавки: Mit- митохондрии, 0.5 мг белка, ADP –АДФ, rot – ротенон 1 мкМ, suc – сукцинат 10мМ, FCCP – FCCP 0.2 мкМ, KCN- 1мМ KCN, глутамат и малат содержался в среде инкубации.

В. Пермеабилизация мембран митохондрий в условиях аноксии Исследование механизма разобщения системы окислительного фосфорилирования митохондрий показало, что данное нарушение подавляется циклоспорином А. Добавка циклоспорина А в среду инкубации ткани перед герметизацией пробирок предотвращает нарушение фосфорилирующей активности и падение, наблюдаемое через 24 ч инкубации ткани в условиях аноксии (рис. 3Г). Для того чтобы обеспечить быструю диффузию циклоспорина А в ткани миокарда, он добавлялся в систему в высокой концентрации 100 мкМ. Таким образом было показано, что в основе механизма разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях в составе ткани миокарда в условиях аноксии лежит эффект пермеабилизации внутренней мембраны, в результате открывания циклоспорин А-чувствительной поры.

Г. Связывание цитохрома с с митохондриями в составе ткани и в суспензии, в условиях открытой неспецифической поры Известно, что индукция открывания неспецифической поры часто приводит к выходу цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий. Для того чтобы определить, происходит ли выход цитохрома с из митохондрий в составе ткани миокарда в наших условиях было проведено иммуногистохимическое исследование. Оказалось, что после 24 ч инкубации срезов в аноксических условиях, когда открывается неспецифическая пора, выход цитохрома с из митохондрий не наблюдается (Рис 4А) и распределение плотности этого белка в клетке остается таким же, как в контроле (Рис 4C). Однако поскольку срезы инкубировались в среде с низкой ионной силой, существовала возможность того, что значительная часть ионов калия выходит из цитоплазмы в процессе эксперимента. В таких условиях цитохром с прочно сорбируется на внутренней мембране митохондрий за счет усиления электростатического взаимодействия. Поэтому была проведена серия опытов в среде с высокой ионной силой (60 мМ KCl). Такой ионной силы достаточно для удаления значительной части цитохрома с из митохондрий с искусственно нарушенной внешней мембраной (митопластов) (табл. 2). В этих опытах высвобождения цитохрома с из митохондрий так же не было зарегистрировано (рис 4B). Эти результаты позволяют заключить, Рисунок 4. Иммуногистохимическое окрашивание срезов ткани миокарда антителами на цитохром с (зеленый) и Hoechst 33342 (синий). (A) Ссрезы инкубировали в среде с низкой ионной силой 24 ч в условиях аноксии; (B) срезы инкубировали в среде с высокой ионной силой (60 мМ KCl) 24 ч в условиях аноксии; (C), контроль (срезы свежей ткани миокарда). Из фотографии видно, что цитохром с локализован в митохондриях, распределение его плотности одинаково в опыте и в контроле.

Рисунок 5. Определение содержания цитохрома с в препаратах митохондрий и митопластов, полученных в средах с низкой ионной силой (комментарии в тексте).

Спектры оптического поглощения суспензий митохондрий, митопластов и супернатантов в области 525-580 нм: (А) – суспензия митопластов, полученных из контрольных митохондрий; (Б) – те же митопласты, переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl); (В) – контрольные митохондрии, переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl); (Г) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с низкой ионной силой; (Д) – контрольные митохондрии; (Е) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с высокой ионной силой ( мМ KCl); (Ж) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с низкой ионной силой и переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl); (З) – митохондрии, выделенные из ткани миокарда, инкубированной в аноксии 24 ч в среде с низкой ионной силой в присутствие мкМ циклоспорина А, переосажденные из среды с высокой ионной силой (120 мМ KCl). (а) – суспендированные осадки, (б) – супернатанты.

что в ткани миокарда цитохром с может удерживаться в митохондриях в условиях открывания неспецифической поры. При исследовании свойств внешней мембраны митохондрий, выделенных из ткани миокарда после 24часовой инкубации в аноксии было обнаружено, что она проницаема для цитохрома с. Относительное содержание цитохрома с в суспензии митохондрий измерялось спектрофотометрически по соотношению величин оптического поглощения цитохромов с и b (A550/A560). Для того чтобы предотвратить выход цитохрома с из митохондрий с поврежденной внешней мембраной в процессе выделения, было использовано свойство этого белка прочно связываться с внутренней мембраной в среде с низкой ионной силой.

В контрольных экспериментах было показано, что в таких условиях цитохром с прочно сорбирован на внутренней мембране митохондрий за счет электростатических взаимодействий и не отрывается от митопластов, полученных из митохондрий путем воздействия осмотического шока (рис 5А). При ресуспендировании митопластов в среде с высокой ионной силой цитохром с отрывается от поверхности мембраны и практически полностью уходит в водную фазу (рис 5Б). Было показано также, что в нормальных условиях внешняя мембрана контрольных митохондрий может повреждаться в процессе выделения, однако доля митохондрий с поврежденной внешней мембраной в этом случае не превышает 20 % (рис 5В). Эксперименты на митохондриях, выделенных в безионной среде, из ткани миокарда инкубированной 24 ч в среде как с низкой, так и с высокой ионной силой в условиях аноксии показали, что количество цитохрома с в таких митохондриях такое же, как в контроле (рис 5Г,Д,Е, табл. 2). Таким образом, эти эксперименты еще раз подтвердили вывод о том, что в условиях аноксии в ткани сердца цитохром с удерживается в митохондриях, несмотря на открывание неспецифической поры, и это удержание не связано с сорбцией данного белка на внутренней мембране. Полученные митохондрии были переосаждены в среде с высокой ионной силой. В результате наблюдался почти полный выход цитохрома с в супернатант (рис 5Ж) такой же, который наблюдается при аналогичной обработке митопластов (рис 5Б). Этот результат говорит о том, что в условиях открывания неспецифической поры при аноксии, свойства выделенных митохондрий качественно отличаются от свойств митохондрий в составе ткани. Повышение ионной силы приводит к выходу цитохрома с из выделенных митохондрий. В то же время, в митохондриях в составе ткани в таких условиях цитохром с остается в межмембранном пространстве (рис 4В). Возможно, этот эффект связан с тем, что при выделении митохондрий происходит реоксигенация, при этом становится возможным окисление кардиолипина, что является необходимым условием для выхода цитохрома с из межмембранного пространства митохондрий (Kagan et al, 2005).

Д. Два механизма нарушения интактности внешней мембраны митохондрий миокарда в условиях аноксии Выше было указано, что инкубация ткани в условиях аноксии вызывает открывание неспецифической поры в митохондриях – добавка циклоспорина А предотвращала сброс на внутренней мембране. Обычно при открывании поры в аэробных условиях наблюдается выход цитохрома с из митохондрий, который блокируется циклоспорином А (Knorre, et al 2003).

Важно было определить, способен ли циклоспорин А предотвращать выход цитохрома с из митохондрий, выделенных из ткани сердца инкубированной в условиях аноксии 24 часа. Было показано, что в отличие от аэробных условий при аноксии добавка циклоспорина А в среду инкубации ткани не предотвращала нарушение интактности внешней мембраны выделенных митохондрий (рис 5З). Однако при этом циклоспорин А блокировал сброс. Таким образом, было установлено, что в условиях аноксии индуцируются два пути нарушения интактности внешней мембраны митохондрий. Один из них связан с открыванием неспецифической поры, другой очевидно не связан с этим процессом и наблюдается в явном виде только на выделенных митохондриях.

Таблица 2. Соотношение значений оптической плотности в максимумах спектров поглощения цитохромов с и b (A550/A560) в суспензии митохондрий инкубированной в аноксии 24 часа в среде с низкой ионной силой инкубированной в аноксии 24 часа в среде с высокой ионной силой (60 мМ KCl) Митопласты, переосажденные в среде с ионной силой 60 мМ 0.95 0.06 - среднеквадратичное отклонение N- количество экспериментов 3. Динамика и особенности молекулярного механизма индукции “цитохром с – независимого” апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии Известно, что сильное снижение парциального давления кислорода (гипоксия) приводит к индукции апоптоза в ткани миокарда и в культуре кардиомиоцитов. Представлялось интересным выяснить вопрос о том, может ли возникать апоптоз в ткани миокарда в условиях полного отсутствия кислорода (при аноксии). В данном разделе показано, что в условиях аноксии в ткани миокарда индуцируется тип апоптоза, который не связан с выходом цитохрома с из митохондрий. Наблюдалось, что индукция такого вида апоптоза жестко сопряжена с открыванием неспецифической поры митохондрий. Приведена вероятная последовательность реакций, протекающих при индукции апоптоза в условиях аноксии.

А. Динамика индукции апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии Известно, что одной из специфических стадий апоптоза является межнуклеосомная фрагментация ДНК. Исследование динамики распада ДНК в ткани миокарда в условиях аноксии показало, что межнуклеосомная фрагментация ДНК развивается в течение первых трех суток (рис. 6АБ). Этот процесс протекает относительно равномерно. Через трое суток полностью распадается высокомолекулярная ДНК и в системе остаются только низкомолекулярные фрагменты. Данные наблюдения свидетельствуют об относительно медленном протекании процесса апоптоза в наших условиях по сравнению с апоптозом при реоксигенеции (Gottlieb, et al 2002). Известно, что одним из этапов большинства типов апоптоза является выход цитохрома с из митохондрий, однако как указывалось в предыдущей главе, что этот Рисунок 6. Электрофореграмма препарата ДНК, выделенного из срезов ткани миокарда, инкубированных в условиях аноксии 24-72 ч. (A) Инкубацию проводили в среде с низкой ионной силой 24 ч (1), 48 ч (2), 72 ч (3), молекулярный маркер (M). (Б) Инкубацию проводили в среде с высокой ионной силой 24 ч (1), 48 ч (2), 72 ч (3). (В).

Инкубацию проводили в среде с низкой ионной силой 24 ч, добавлен циклоспорин А мкМ (1), 50 мкМ (2), 100 мкМ (3), без добавок (4). (Г). Инкубацию проводили в среде с низкой ионной силой 24 ч, добавлен спермин 1 мМ (1), 0.5 мМ (2), 0.25 мМ (3), без добавок (4).

Таким образом, в аноксии наблюдается особый тип клеточной гибели – «цитохром с – независимый апоптоз», который равномерно развивается в течение первых трех суток. В этой связи важно подчеркнуть, что в среде с высокой ионной силой (в условиях, когда выход цитохрома с из митохондрий не ограничен его электростатическим взаимодействием с поверхностью внутренней мембраны) скорость фрагментации ДНК приблизительно такая же, как и в безионных средах.

Б. Образование неспецифической поры в митохондриях – необходимая стадия индукции “цитохром с – независимого” апоптоза в аноксии Была показана тесная связь между открыванием неспецифической поры митохондрий и межнуклеосомной фрагментацией ДНК. Удалось показать, что присутствие циклоспорина А в среде инкубации ткани в условиях аноксии приводит к подавлению фрагментации ДНК (рис 6В). Можно поэтому предполагать, что образование неспецифической поры в митохондриальных мембранах предшествует процессу межнуклеосомной ДНК. Этот эффект позволил окончательно ответить на вопрос о том, на какой стадии эксперимента открывается неспецифическая пора: в процессе инкубации в аноксии или в процессе выделения митохондрий и измерения мембранного потенциала и дыхания, когда происходит реоксигенация. При выделении ДНК из ткани миокарда образцы ткани замораживаются в жидком азоте в анаэробных условиях непосредственно в пробирках, в которых велась инкубация, и затем в замороженном состоянии растираются и заливаются раствором лизирующего буфера. Такая обработка не включает стадии реоксигенации. Благодаря этому наблюдаемое ингибирование циклоспорином А фрагментации ДНК свидетельствует о том, что открывание неспецифической поры в митохондриях происходит именно во время инкубации ткани в аноксии, но не при вынужденной реоксигенации. Было показано также, что фрагментация ДНК в наших условиях подавляется ингибитором нуклеаз спермином (рис 6Г). Важно отметить, что этот ингибитор нуклеаз не предотвращает открывания неспецифической поры (рис 3Д). Проведенное исследование позволило определить последовательность процессов при наблюдаемом типе апоптоза: аноксия, открывание неспецифической поры, фрагментация ДНК. При этом обратный сигнал «фрагментация ДНК – открывание поры» не реализуется.

В. Схема процесса индукции апоптоза в ткани миокарда в условиях аноксии Анализ литературы показал, что в культурах кардимиоцитов (Guo, et al 2001;

Kubasiak, et al 2002) в бескислородных условиях индуцируется апоптоз с такими же как у нас характерными особенностями. Он не включает стадию выхода цитохрома с из митохондрий и подавляется ингибиторами неспецифической поры. В работах этих авторов показано, что на первых стадиях индукции апоптоза экспрессируется белок Bnip3. Весьма вероятно, что начальные стадии процесса индукции апоптоза в ткани миокарда такие же, как и в культуре кардиомиоцитов. Поэтому для наших условий можно предполагать существование следующей последовательности реакций протекающих при апоптозе, из которых последние две стадии обнаружены в настоящей работе (рис 7).

Рисунок 7. Вероятная схема ключевых стадий апоптоза, возникающего в миокарде в условиях аноксии.

Выводы 1. Экспериментальная модель, разработанная нами для исследования процессов, происходящих в ткани миокарда в условиях длительной аноксии, была применена для изучения динамики и механизма индукции апоптоза в бескислородных условиях.

2. Показано, что в условиях длительной аноксии (24 ч) в ткани миокарда сохраняется ультраструктура миофибрилл и основные параметры ультраструктуры мембран митохондрий. Установлено при этом, что в таких условиях возникает гетерогенность популяции митохондрий. Наблюдается набухание части митохондрий.

3. Показано, что в процессе инкубации ткани при аноксии в течение 24 ч происходит разобщение системы окислительного фосфорилирования в митохондриях миокарда за счет пермеабилизации внутренней мембраны.

Установлен эффект открывания циклоспорин А-чувствительной поры в условиях аноксии. Показано, что наблюдаемый эффект определяет падение потенциала на внутренней митохондриальной мембране. Прослежена динамика нарушения дыхательной активности митохондрий в ткани миокарда в условиях аноксии. Показано, что малатоксидазная активность сохраняется более 24 ч инкубации при аноксии, а сукцинатоксидазная активность более 72 ч инкубации.

4. Обнаружено, что в ткани миокарда в условиях аноксии цитохром с удерживается в митохондриях с открытой циклоспорин А-чувствительной порой. Показано, что нарушение интактности внешней мембраны митохондрий происходит как минимум двумя способами, один из которых связан с открыванием неспецифической поры, другой не зависит от этого процесса.

5. Показано, что в условиях длительной аноксии в ткани миокарда индуцируется особый тип апоптоза с характерной специфической фрагментацией ДНК и без выхода цитохрома с из митохондрий.

Установлено, что необходимым этапом запуска этого процесса является открывание неспецифической поры митохондрий. На основе полученных результатов и литературных данных предложена блок-схема, описывающая особенности развития данного типа апоптоза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Тоньшин А.А., Сапрунова В.Б. Солодовникова И.М. Бакеева Л.Е.

Ягужинский Л.С. Функциональная активность и ультраструктура митохондрий, выделенных из апоптозной ткани сердца, (2003) Биохимия, 68, 1070-1079.

2. Тоньшин А.А., Лобышева Н.В., Ягужинский Л.С., Взаимосвязь между специфическими изменениями проницаемости мембран митохондрий и межнуклеосомной фрагментацией ядерного генома в ткани сердца в условиях аноксии, (2006) Биологические мембраны, 23, 320-326.

3. Сапрунова В.Б., Казимирчук С.А., Тоньшин А.А., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С. Индукция апоптоза в миокарде крыс в условиях аноксии (2002) Биохимия, 67, 293-302.

4. Сапрунова В.Б., Тоньшин А.А., Бакеева Л.Е., Ягужинский Л.С., “Индукция апоптоза в кардиомицитах ткани сердца в условиях аноксии.” Сборник тезисов докладов III Съезда Биохимического общества. Санкт-Петербург 2002 г..

5. V.B.Saprunova, A.A.Tonshin, L.E.Bakeeva, L.S.Yaguzhinsky “ Mitochondria abnormalities in heart after induction of apoptosis under anoxic conditions" Mitochondrion, 2002, Vol. 1 (6), p 525.

6. A.A.Tonshin, I.M.Solodovnikova, V.B.Saprunova, L.E.Bakeeva, L.S.Yaguzhinsky “Functional activity of mitochondria isolated from myocardium tissue after apoptosis induction by anoxia" Mitochondrion, 2002, Vol. 1 (6), p 529.

7. С.А.Казимирчук, В.Б.Сапрунова, А.А.Тоньшин, Л.Е.Бакеева, А.В.

Бахуташвили Л.С.Ягужинский “Изменения в кардиомиоцитах сердца крысы в условиях аноксии”. Материалы Всероссийского рабочего совещания “Митохондрии в патологии”. Пущино 2001 г.

8. А.А. Тоньшин, С.Б. Казимирчук, В.Б. Сапрунова, “Апоптоз в ткани сердца крысы в условиях полной аноксии”. Сборник тезисов докладов 5ой Пущинской Конференции Молодых Ученых “Биология – наука 21го века” 2001г.

9. Tonshin AA, Lobysheva NV "Anomalous binding of cytochrome c in mitochondria of heart tissue in apoptosis at anoxia condition" сборник тезисов докладов международной конференции "Российская биоэнергетика: от молекул к клетке ", Москва, МГУ, 2005 г. С. 10. Тоньшин А.А., Лобышева Н.В., Подгорный О., Ягужинский Л.С " Разрыв внешней мембраны митохондрий при апоптозе сердечной ткани, индуцированном в условиях аноксии, не приводит к выходу цитохрома с" сборник тезисов докладов международной конференции "Рецепция и внутриклеточная сигнализация" 2005 года, Пущино C. 11. Solodovnikova IM, Saprunova VB, Bakeeva LE, Tonshin AA, Yaguzhinsky LS, “BHT action on the dynamics of ultrastructural changes of mitochondria in myocardium tissue after apoptosis induction by anoxia.” Abstracts of FEBS Congress 2004, Blackwell Publishing, p. 12. Tonshin AA, Lobysheva NV, Podgorny OV, Yaguzhinsky LS “Unusual apoptosis induced in heart tissue in anoxia, mechanisms of cytochrome c retaining.” Abstracts of FEBS Congress 2006 Congress, Blackwell Publishing, p.