На правах рукописи

РЕЗНИКОВА ЛЮДМИЛА БОРИСОВНА

Эндотелиопротекторная активность производных

ГАМК при экспериментальном гестозе.

14.03.06. фармакология, клиническая фармакология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

ВОЛГОГРАД 2013

Работа выполнена на кафедре фармакологии и биофармации факультета усовершенствования врачей, НИИ Фармакологии ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации член-корреспондент РАМН, доктор

Научный руководитель:

медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич доктор биологических наук, с.н.с.

Научный консультант:

Перфилова Валентина Николаевна Кучерявенко Аида Фатиховна, доктор

Официальные оппоненты:

медицинских наук, доцент кафедры фармакологии ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России Черников Максим Валентинович, доктор медицинских наук, зав. кафедрой биологии и физиологии Пятигорского медикофармацевтического института-филиала ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава России Государственное бюджетное

Ведущая организация:

образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г. Ростов-на-Дону

Защита состоится «_»2013 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 208.008.02 при ГБОУ ВПО Волгоградский государственный медицинский университет» Минздрава России (400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГБОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет»

Минздрава России по адресу: 400131, Россия, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

Автореферат разослан «_»_2013 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор биологических наук Бугаева Л.И.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы Гестоз представляет собой симптомокомплекс, возникающий при патологическом течении беременности, включающий триаду симптомов — стойкое повышение АД, протеинурию, возникновение отков.

В последние годы отмечается рост частоты развития гестозов, что по данным ВОЗ составляет около 30 % среди всех осложнений беременности.

Гестоз является основной причиной материнской и детской смертности, рождению недоношенных детей, отставанию роста и развития плода.

(Чиркова И.В. 2007; Василенко Л.В. 2002; 2008; Торчинов А.М., Кузнецов В.П., Цахилова С.Г.и др. 2010; Гребенник Т.К., Павлович С.В., 2011; Jansson T., Myatt L., Powell TL., 2009; Padmini E., Uthra V., 2011).

По мнению многих авторов ведущую роль в возникновении и развитии гестоза играет эндотелиальная дисфункция, отмечается снижение ее вазодилатирующей и антитромботической функции, возрастание уровня фибриногена, вязкости, свертываемости и ухудшение реологии крови, что приводит к нарушению микроциркуляции, ишемии и гипоксии плода.

Эндотелиальная дисфункция обусловлена, в первую очередь, активацией перекисного окисления липидов (оксидативный стресс), гипергомоцистеинемий, стрессорными факторами и др. (Антошина Н.Л., Михалевич С.И., 2005).

В настоящее время существует широкий спектр лекарственных средств, используемых в акушерской практике для лечения данного осложнения, однако их эффективность не удовлетворяет клиницистов. Поэтому, поиск новых эффективных средств лечения гестоза остается одной из важнейшей задач современной фармакологии и акушерской практики.

Ряд производных ГАМК (цитрат фенибута, салицилат фенибута) оказывают выраженное эндотелиопротективное действие и дополнительно обладают антигипоксическими, антиоксидантными, антистрессорными свойствами свойствами, нормализующе влияют на реологические свойства крови (Тюренков И.Н., Воронков А.В., Робертус А.И., 2009; Перфилова В.Н., 2009; Робертус А.И., 2010; Тюренков И.Н., 2012).

Целью исследования являлось изучить эндотелиопротекторное действие и другие аспекты их терапевтического (гравидопротекторного) действия названных производных ГАМК в условиях экспериментального гестоза Задачи исследования.

Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

родоразрешение и проявления экспериментального гестоза (ЭГ):

выраженность отеков, изменение АД, протеинурию и концентрацию гомоцистеина у беременных самок.

2) Исследовать действие соединений на вазодилатирующую функцию эндотелия у крыс с ЭГ.

3) Изучить влияние производных ГАМК на антитромботическую функцию эндотелия, показатели плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза, фактора Виллебранда у самок с ЭГ.

4) Оценить действие производных ГАМК на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) и активность антиоксидантных ферментов в матке, плаценте, мозге и печени крыс с осложннной беременностью.

5) Изучить влияние соединений на постнатальное развитие потомства крыс с Новизна исследования.

Впервые получены сведения о действии производных ГАМКсоединений РГПУ-147 и РГПУ-189 на развитие экспериментального гестоза у беременных крыс. Показан характер и эффективность их влияния на выраженность отеков, уровень АД, протеинурию, гипергомоцистеинемию, родоразрешение у самок с экспериментальным гестозом. Впервые изучено действие производных ГАМК на функцию эндотелия, реологические свойства крови, процессы ПОЛ/АОС (антиоксидантная система) у крыс с осложненной беременностью. Оценено влияние исследуемых соединений на постнатальное развитие потомства от крыс с экспериментальным гестозом.

Научно-практическая ценность работы.

На основе полученных данных об эндотелиопротекторной активности производных ГАМК в условиях экспериментального гестоза даны рекомендации по направленному синтезу и дальнейшему поиску высокоактивных и малотоксичных веществ с гравидопротекторным действием в ряду производных ГАМК.

Положения, выносимые на защиту:

2.Производные ГАМК - соединение РГПУ-147, РГПУ-189 у самок с ЭГ выраженно улучшают вазодилатирующую и антитрмботическую, что проявляется в повышении стимулируемой (на введение ацетилхолина) и базальной (при введении нитро-L-аргинина) продукции оксида азота, нормализуют показатели плазменного и тромбоцитарного звеньев гемостаза.

3. Соединения РГПУ-147 и РГПУ-189 оказывают антиоксидантное действие, уменьшают содержание продуктов ПОЛ, повышают активность ферментов АОС в плаценте, матке, мозге и печени, снижают уровень гомоцистеина, улучшают постнатальное развитие потомства, что, возможно, лежит в основе их эндотелиопротекторного и гравидопротекторного действия.

4.Исследуемые соединения позитивно влияют на формирование вестибулярной функции, повышают мышечную силу и тонус мышц, способствуют увеличению локомоторной и ориентировочноисследовательской активности, снижению уровня тревожности, оказывают положительное мнемотропное действие у потомства от крыс с ЭГ.

5.Соединение РГПУ-189 обладает выраженным эндотелиопротекторным и гравидопротекторным действием, по многим тестам превосходит препарат сравнения сулодексид и может служить основой для дальнейшей разработки в качестве средства для лечения гестозов.

Апробация работы.

Материалы работы докладывались и обсуждались на 69-ой, 70 -ой открытой итоговой конференции студентов и молодых ученых Волгоградского Государственного Медицинского Университета (2011-2012) (диплом степени среди молодых ученых (2011)). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 6 работ в журналах, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, 5 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка используемой литературы, включающего 306 источников, из них 161 отечественных и 145 зарубежных авторов. Диссертация изложена на 165 страницах машинописного текста, содержит таблиц – 6, рисунков – 45.

Материалы и методы исследования.

Исследование было выполнено на 227 белых беспородных крысах-самках массой 200-240г. и их потомстве, в количестве 143 особей. Крысы были доставлены из питомника лабораторных животных «Столбовая» ГУ НЦБМТ РАМН, Московская обл. и ФГПУ ПЛЖ «Рапполово» РАМН (Ленинградская область). Содержание животных производилось в соответствии с «Приказом МЗ РФ № 750», Рекомендациями Комитета при Минздраве России, рекомендациями ВОЗ по экспериментальной работе с использованием животных (Березовская И.В., 1993; Червонская Г. П. и др., 1998; Zutphen L.F.

et al., 1993) на базе НИИ фармакологии и кафедры фармакологии и биофармации ФУВ ВолгГМУ.

Были исследованы производные ГАМК - соединения под лабораторными шифрами РГПУ-147 (соль фенибута и лимонной кислоты) в дозе 50 мг/кг и РГПУ-189 (композиция фенибута с салициловой кислотой) в дозе 15 мг/кг.

Использовались наиболее эффективные дозы, выявленные при изучении нейро-, эндотелио- и кардиопротекторной, антистрессорной, антиишемической активности данных соединений. Вещества синтезированы на кафедре органической химии Российского государственного педагогического университета им. А.Н. Герцена* (Санкт-Петербург, Россия).

В качестве препарата сравнения был использован Весел Дуэ ф (сулодексид) (Аlfa Wassermann, Италия) 30 ЕД/кг.

Животные были поделены на следующие группы:

1 группа: беременные самки без экспериментального гестоза (ЭГ) (позитивный контроль).

2 группа: самки с ЭГ, получавшие 1,8 % физ р-р ежедневно, per os один раз в день (негативный контроль).

* Выражаем искреннюю благодарность зав. кафедрой органической химии РГПУ им.А.И..Герцена, д.х.н., проф. Берестовицкой В.М., к.х.н.,доц. Васильевой О.С. и всем сотрудникам кафедры за предоставленные для исследования вещества 3 группа: самки с ЭГ, получавшие соединение РГПУ-147 дозе 50 мг/кг ежедневно, per os один раз в день.

4 группа: самки с ЭГ, получавшие соединение РГПУ-189 в дозе 15 мг/кг ежедневно, per os один раз в день.

5 группа: самки с ЭГ, получавшие препарат сравнения сулодексид в дозе ЕД/кг ежедневно, per os один раз в день.

Животные помещались в отдельные клетки по 2 самки и 1 самцу на 12 часов.

Наступление беременности определялось по наличию сперматозоидов во влагалищном мазке.

Гестоз моделировался путем замены питьевой воды на 1,8% р-р NaCl у беременных самок с 1-го дня гестации до родов (Beausejour А., Auger К., StLouis J. et al., 2003). Наличие ЭГ устанавливалось по триаде симптомов, характерных для гестоза: повышению артериального давления (АД), протеинурии, выраженности отеков.

Измерение артериального давления (АД) проводилось у бодрствующих беременных крыс в первый и последний дни гестации с использованием компьютерной системы Power Lab/4SP с ML135 Dual Bio и MLA0112 ECG Lead Swich Box. Для этого самка помещалась в домик, на хвост одевался манжет и датчик, после чего производилось измерение.

Для определения наличия отеков у декапитированных животных забирались кусочки жировой, мышечной тканей и мозга, инкубировались в термостате при t-370 в течение 24 часов, по уменьшению в % массы препаратов до и после инкубации судили о степени выраженности отеков.

Определение концентрации белка в суточной моче осуществлялось спектрофотометрически (спектрофотометр ПЭ -5400В, Экрос, Россия) с использованием набора реагентов «Ольвекс диагностикум». Сбор суточной мочи проводился в метаболических камерах ("Nalgene", Италия).

Определение содержания гомоцистеина в плазме крови проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе с флюориметрическим детектором (Shimadzu, Япония) по методике с ортофталевым альдегидом (ОФА) (Черкас Ю.В., Денисенко А.Д., 2001).

Исследование эндотелийзависимой и эндотелийнезависимой вазодилатации осуществлялось в проекции среднемозговой артерии в теменной области мозга крыс внутривенным введением анализаторов:

ацетилхолина (АЦХ) (0,01 мг/кг, Acros organics, США); нитроглицерина (0,007мг/кг, МТХ, Москва) и блокатора синтеза нитрооксида – нитро- L аргинина (10 мг/кг, Acros organics, США) с использованием метода высокочастотной ультразвуковой допплерографии (Минимакс - Допплер- К, Санкт-Петербург). (Тюренков И.Н. и соавт. 2007).

Состояние системы микроциркуляции исследовалось в сосудах брыжейки на 20 день гестации, наркотизированным (хлоралгидрат 400 мг/кг) крысам при помощи ультразвукового допплерографа (Минимакс – ДопплерК, Санкт-Петербург). Для измерения использовался датчик с рабочей частотой 25 МГц. Регистрировались Vas – максимальная систолическая, Vam - средняя линейные скорости кровотока (см/сек) и соответствующие им объемные скорости кровотока (Qas, Qam) ( мл/мин) Параметры плазменно-коагуляционного и сосудистотромбоцитарного звеньев системы гемостаза определялись в крови, взятой из брюшного отдела аорты беременных крыс с ЭГ на 20 день гестации. Кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия в соотношении 9:1. Исследование проводилось на программируемом оптикомеханическом коагулометре - Минилаб 701 с использованием наборов для определения протромбинового времени, тромбин-теста, фибриноген – теста, активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) (производство НПО РЕНАМ, Россия). Антиагрегантная активность изучалась на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов (модель LA) научно-производственной фирмы «Биола» (г.Москва, Россия) по методу G. В. Born модификации З.А. Габбасова. и соавт. (1989). В качестве индуктора агрегации тромбоцитов использовали АДФ («Renal», Венгрия) в конечной концентрации 5 мкМ. Концентрация фактора Виллебранда в крови осуществлялась на двухканальном лазерном анализаторе агрегации тромбоцитов "Биола" с использованием наборов НПО РЕНАМ (Россия).

антитромботическую функцию эндотелия проводилось на 20 день гестации на модели артериального тромбоза у крыс, который моделировался поверхностным наложением 50% р-ра хлорида железа (III) на адвентицию сонной артерии наркотизированным крысам (хлоралгидрат 400 мг/кг) (Kurz K.D., 1990). Кровоток в сосуде регистрировался до полной остановки при помощи ультразвукового датчика аппарата Допплер (Минимакс – ДопплерК, Санкт-Петербург).

Изучение влияния соединений на состояние окислительноантиокислительной системы крыс с ЭГ.

наркотизированных (хлоралгидрат 400 мг/кг) самок. Исследуемые органы печень, матку, мозг и плаценту -гомогенизировали в дистиллированной воде в соотношении 1:5 в стеклянном гомогенизаторе Поттера объемом 20 мл с тефлоновым пестиком. Клеточный дебрис и ядра осаждали путм центрифугирования в течение 15 минут при 2000 x g.

Концентрацию конъюгированных диенов определяли по методу Ушкаловой В.Н. и соавт.(1993). Расчт концентрации диеновых конъюгатов осуществляли в единицах оптической плотности при длинах волн поглощения 233 и 278 нм на 1 г ткани.

Концентрацию МДА определяли по методу Hunter (1963). Расчт содержания МДА также проводился на 1 г ткани.

Глутатион-пероксидазную активность определяли по методу Моина В.М. (1986). Расчт активности глутатион-зависимых ферментов проводили в моль GSH на 1 г ткани за 1 мин.

Активность суммарной супероксиддисмутазы (СОД) оценивали по степени торможения реакции окисления кверцетина по методу Костюка В.А.

(1990). За единицу активности СОД принимали такое количество фермента в 1 мл реакционной смеси, которое вызывало ингибирование реакции окисления кверцетина на 50%.

Активность каталазы определяли по методу Королюка М.А. и соавт.

(1988). За единицу активности каталазы принимали то количество фермента, которое участвовало в превращении 1мккат перекиси водорода за 1 сек при заданных условиях.

Величина кислотного гемолиза эритроцитов оценивалась по методу Терского И.А. и Гительзона И.И. (1961). Кислотную резистентность эритроцитов определяли по времени достижения половины величины максимальной амплитуды эритрограммы (Т1/2 гемолиза).

Определение осмотической резистентности эритроцитов проводили по количеству экстрацеллюлярного гемоглобина (Katoh M., 2001).

Процент гемолиза рассчитывался как отношение экстинкции опытной пробы (0,55% раствора натрия хлорида) к экстинкции водного гемолизата.

В послеродовом периоде проводилось исследование влияния соединений на развитие сенсорно-двигательных рефлексов, мышечной силы и тонуса потомства от крыс с ЭГ (тесты «отрицательный геотаксис», «избегание обрыва», «мышечная сила»), на поведенческие реакции, уровень тревожности, развитие памяти (тест «открытое поле», «УРПИ») потомства от самок с ЭГ (Хабриев Р.У., 2005).

Методы статистической обработки Статистическую обработку результатов исследований проводили в пакете прикладных программ «Statistika 6.0», используя стандартные параметрические и непараметрические методы, с учетом предварительной проверки выборок на нормальность распределения. Согласно характеру полученных данных применяли t-критерий Стьюдента, метод рангового однофакторного анализа Крускала-Уоллиса, критерии Ньюмена-Кейлса и Даннета для множественных сравнений, непараметрический U-критерий Манна-Уитни. Для сравнения полученных результатов с альтернативной формой реакции применялся точный критерий Фишера (Агафонов А.А. и др., 1991; Гланц С., 1999; Реброва О.Ю., 2006).

Результаты и их обсуждение.

Исследование влияния производных - ГАМК-соединений РГПУ-147 и РГПУ-189 на артериальное давление (АД) беременных самок показало, что у животных без ЭГ АД к 20-му дню гестации практически не изменялось, а у самок с ЭГ наблюдалось повышение показателя на 18,2% по сравнению с исходными данными. В опытных группах самок с ЭГ, получавших производные ГАМК – соединения РГПУ-147 и РГПУ-189, а также сулодексид перорально один раз в день ежедневно практически не отличалось от исходного.

В группе животныхс ЭГ на 20-й день гестации отмечалось повышение уровня белка в моче в 4,4 раза по сравнению с самками без ЭГ. У самок с ЭГ, получавших РГПУ-147, РГПУ-189 и сулодексид, концентрация белка в суточной моче к концу беременности была в 1,9; 2 и 1,3 раз ниже, чем у животных с ЭГ (таб.1).

Таблица 1.

Концентрация белка в суточной моче у беременных самок с экспериментальным гестозом.

(50 мг/кг) (15 мг/кг) (30 ЕД/кг) * р0,05 различия статистически значимы по t-критерию Стьюдента относительно беременных самок без ЭГ; ** р0,05 различия статистически значимы по t-критерию Стьюдента относительно беременных самок с ЭГ.

Масса препаратов мозга, мышц и сальника у самок с неосложненной беременностью снижалась после инкубации при 370С в течение 24 часов на 69,7; 73,8 и 17%, а у животных с ЭГ данный показатель уменьшался на 74,6;

76,3; 25,3% соответственно относительно исходных данных. У самок с ЭГ, получавших в период беременности соединение РГПУ-147, РГПУ-189 и сулодексид, выявлена менее выраженная отечность тканей по сравнению с контрольной группой животных.

Таким образом, существенное повышение АД, гиперпротеинурия и отек тканей у самок, получавших во время беременности вместо питьевой воды 1,8% р-р NaCl, указывает на развитие у них ЭГ. Самки с ЭГ, которым в период гестации вводили производные ГАМК – соединения РГПУ- РГПУ-189, а также сулодексид ограничивают выраженность экспериментального гестоза, о чем свидетельствует отсутствие изменений АД, уменьшение количества белка в моче и степени отечности мышечной, жировой тканей и мозга.

гомоцистеина у самок с ЭГ.* По современным представлениям в патогенезе гестоза значительная роль отводится гипергомоцистеинемии. Выявлено, что у самок с ЭГ исследуемый показатель был в 4 раза выше, чем у животных с неосложненной беременностью. В опытных группах самок, получавших производные ГАМК – соединения РГПУ-147 и РГПУ-189, а также сулодексид концентрация гомоцистеина была ниже по сравнению с контрольной группой в 1,7; 1,5 и 2,6 раза соответственно, что свидетельствует об их способности ограничивать выраженность экспериментального гестоза (рис.1).

При исследовании влияния производных ГАМК на вынашивание и родоразрешение крыс с ЭГ выявлено, что из 13 родильниц контрольной группы с ЭГ у 4 (30,8%) выявлены случаи мертворождения, у 1 (7,7%) – только живорождения. У 5 из 13 (38,5%) наблюдались случаи неразвивающейся беременности, 2 самки погибли во время беременности (15,4%) и 1 – после родов (7,7%). В группе позитивного контроля у родильниц (в 100% наблюдений) было зарегистрировано рождение живого потомства.

У самок, получавших во время беременности соединение РГПУ-147 в 36,3% случаев (у 4 самок из 11) наблюдалось мертворождение, 2 самки из (18,1%) погибли во время беременности. В группе животных с ЭГ, получавших в период гестации соединение РГПУ-189 мертворождение отмечено у 3 из 11 самок (27,2 %), в 18 % - неразвивающаяся беременность ( из 11). В опытной группе животных, получавших сулодексид из 11 животных у 2 (18%) зарегистрированы случаи рождения мертвого потомства. Таким образом, наиболее выраженным гравидопротекторным действием при ЭГ обладают соединение РГПУ-189 и сулодексид несущественно уступает им соединение РГПУ-147.

Оценка вазодилатирующей функции эндотелия у самок с осложненной беременностью, получавших соединения РГПУ-147 и РГПУ- Выявлено, что у беременных самок без ЭГ в ответ на введение ацетилхолина (АЦХ) мозговой кровоток возрос на 30,2% от исходного значения. У самок с экспериментальным гестозом МК снизился на 7,9 % (р0,05), что свидетельствует о выраженной дисфункции эндотелия в данной группе. У животных с ЭГ, получавших соединения РГПУ – 147, РГПУ – 189 и сулодексид исследуемый показатель увеличился на 20,8 и 22,9 и 15, 4% соответственно (Рис.2).

* Выражаем искреннюю благодарность зав. лаб. фармакокинетики, д.б.н. Смирновой Л.А., с.н.с., к.б.н.

Рябухе А.Ф., к.м.н. Кузнецову К.А., Сучкову Е.А. за помощь в проведении исследований.

Для оценки эндотелийнезависимой вазодилатации использовался нитроглицерин, на введение которого отмечалось практически равное увеличение мозгового кровотока у всех опытных и контрольных групп (Рис.2).

На введение нитро-L-аргинина – ингибитора NO - синтазы, у беременных самок без ЭГ отмечено падение мозгового кровотока на 29,1%. У самок контрольной группы с ЭГ показатель снижался на 10% (р0,05), что было статистически достоверно меньше, чем у животных с неосложненной беременностью. У самок, получавших соединения РГПУ –147, РГПУ-189 и сулодексид МК снизился на 22,6, 26 и 21,8% соответственно. Таким образом, исследуемые соединения ограничивают нарушение функции эндотелия при ЭГ (Рис. 2).

Влияние соединений РГПУ-147 и РГПУ-189 и препарата сравнения сулодексида на микроциркуляцию в сосудах брыжейки крыс при ЭГ.

Дисфункция эндотелия при гестозе, сопровождается изменением показателей микроциркуляции. Выявлено, что у животных с ЭГ максимальная систолическая (Vas) и средняя (Vam) линейные скорости кровотока были существенно, на 44 и 52, 5% (р0,05) ниже, чем у самок с неосложненной беременностью. У животных с ЭГ опытных групп, получавших в период гестации соединения РГПУ-147, РГПУ-189 и сулодексид исследуемые параметры были статистически достоверно выше на 60,7 и 73,2% (р0,05), 64,2% и 96% (р0,05), 75 и 90% (р0,05)соответственно(Рис.3А).

Максимальная систолическая (Qas) и средняя (Qam) объемные скорости кровотока в сосудах брыжейки самок с ЭГ были статистически достоверно на 43,4 и 45% (р0,05) ниже, чем у животных с неосложненной беременностью. В опытных группах, получавших соединение РГПУ-147, РГПУ-189, и препарат сравнения сулодексид показатели скорости кровотока повышались, по сравнению с группой животных негативного контроля на 49,2 и 49,6% ; 65,5 и 53,1%; 38,1 и 40% (Рис.3Б). Таким образом, исследуемые соединения улучшают микроциркуляцию у самок с ЭГ.

изменение показателя см/сек Рис.3 Максимальная систолическая и средняя линейные (А) и объемные (Б) скорости кровотока в брыжеечных сосудах у беременных самок с ЭГ, получавших соединения РГПУ-147, РГПУ-189 и препарат сравнения сулодексид.

* р0,05 различия статистически значимы по t-критерию Стьюдента, q-критерию Ньюмена-Кейлса относительно беременных самок без ЭГ;

# р0,05 различия статистически значимы по t-критерию Стьюдента, q-критерию Ньюмена-Кейлса относительно самок с ЭГ.

Оценка влияния соединений РГПУ-147 и РГПУ-189 на плазменнокоагуляционное и сосудисто-тромбоцитарное звенья системы гемостаза при ЭГ. На фоне ЭГ у самок негативного контроля происходит активации процессов свертывания крови, что проявляется в укорочении активированного частичного тромбопластинового времени (АЧТВ) на 14,6%. При этом у животных с ЭГ получавших во время гестации соединения РГПУ-189, РГПУ-147 и сулодексид, АЧТВ было выше на 24,1;

20,3; 59,5% (р0,05) соответственно (Рис.4).

Протромбиновое время (ПВ) у самок с осложненной беременностью уменьшилось по сравнению с аналогичным показателем животных группы позитивного контроля на 15,3% (р0,05). Это отражает активацию внешнего пути образования тромбина на фоне моделируемой патологии. У животных с ЭГ, получавших соединения РГПУ-189 отмечалось повышение ПВ на 32,2% по сравнению с самками с ЭГ контрольной группы, РГПУ-147 – на 49,3% (р0,05), сулодексида – на 40,2% (р0,05) (Рис.4).

О преобладании процессов гиперкоагуляции у самок с ЭГ свидетельствует также укорочение тромбинового времени на 40,8% по сравнению с самками с неосложненной беременностью. Введение соединений РГПУ-147, РГПУ-189 и сулодексида беременным самкам с ЭГ, вызывало удлинение ТВ на 30,1; 17,1; 52,4% соответственно по сравнению с группой негативного контроля (Рис.4).

Концентрация фибриногена у животных с ЭГ, получавших в период гестации физ.р-р. была на 19,2% (р0,05) выше, чем у самок с неосложненной беременностью и может свидетельствовать об увеличении свертываемости крови и риске образования тромбов в группе негативного контроля. Со единения РГПУ-147, РГПУ-189 и сулодексид снижали концентрацию фибриногена в плазме крови на 16,1; 18,5; 19,1% (р0,05) соответственно (Рис.4).

скорость АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у беременных самок с экспериментальным гестозом была на 41,4 % (р0,05) выше по сравнению с таковой животных без ЭГ. Все исследуемые вещества снижали скорость агрегации тромбоцитов у самок с ЭГ: РГПУ-147 – на 14, 5 %, РГПУ-189 – на 41,7 % (р0,05), сулодексид – на 42,8 % (р0,05) по сравнению с показателем самок с ЭГ контрольной группы (Рис.5).

ЭГ+сулодексид (n=7) ЭГ+РГПУ-147 (n=8) При изучении влияния производных ГАМК на скорость тромбообразования у крыс с ЭГ при аппликации 50% раствора хлорида железа (III) на адвентицию сосуда было выявлено, что полное прекращение кровотока происходило уже к 15 минуте, а у животных без ЭГ на 19 минуте.

У самок с ЭГ, получавших соединения РГПУ-147, РГПУ-189 и препарат сравнения сулодексид формирование тромба и прекращение кровотока в сонной артерии отмечалось на 20; 17 и 21 мин (р0,05) соответственно (Рис.6).

Маркером нарушения структуры и функции эндотелия является фактора Виллебранда. При определении его концентрации у самок с ЭГ выявлено, что она статистически значимо на 146,7% (р0,05, t-критерий Стьюдента, q-критерий Ньюмена-Кейлса ) превышает таковую животных с неосложненной беременностью. У самок с ЭГ, получавших во время беременности соединения РГПУ-147, РГПУ-189 и препарат сравнения сулодексид уровень фактора Виллебранда был на 43,6; 43,8 и 58,1% (р0,05, t-критерий Стьюдента, q-критерий Ньюмена-Кейлса ) ниже, чем у самок с эндотелиопротекторном действии исследуемых соединений.

Изменение концентрации ТБК-активных продуктов у крыс с ЭГ под влиянием производных ГАМК.

Выявлено, что уровень конъюгированных диенов (первичных продуктов ПОЛ) в гомогенате мозга крыс с ЭГ был в 14,9 раз выше, чем у самок с неосложненной беременностью, в печени – в 8,7 раза, в матке – в 21, 4 раза, в плаценте – в 14,6 раза, что свидетельствует о развитии окислительного стресса у самок с ЭГ. У животных с ЭГ, получавших соединения РГПУ-147 и РГПУ-189 концентрация конъюгированных диенов была ниже в гомогенате мозга в 9,3 и 14,2 раз, чем у самок с ЭГ, получавших физ. р-р., в матке и плаценте – в 14, 9 и15,4;13,6 и 12,7 раз соответственно, а в печени наблюдалось равное снижение – в 9,2 раза. У животных с ЭГ, получавших препарат сравнения сулодексид, концентрация конъюгированных диенов была ниже таковой контрольной группы в мозге, печени и плаценте в 1,72; 1,86; 1,65 раза (Рис.7).

Выявлено, что у беременных крыс с ЭГ значительно повышалась концентрация вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида (МДА), у самок с ЭГ показатель превышал таковой на 53; 156 и 122% (р0,05) соответственно в мозге, печени и матке беременных самок без ЭГ. У животных с ЭГ, получавших соединение РГПУ-147 концентрация МДА в мозге, печени, матке и плаценте была на 37; 63; 46 и 14% ниже, чем у животных контрольной группы с ЭГ. Соединение РГПУ-189 вызывало снижение МДА на 37; 63 и 46% соответственно в мозге, печени и матке по сравнению с группой негативного контроля. У самок с ЭГ, получавших препарат сравнения сулодексид, уровень МДА был ниже в мозге, печени, матке и плаценте на 45; 72; 78,3 и 74% соответственно (Рис. 8).

антиоксидантных ферментов у крыс с осложненной беременностью.

Выявлено, что активность СОД у самок с ЭГ снижалась по сравнению с животными с неосложненной беременностью в мозге на 60,6%, в печени – на 14,6%, в матке - на 37,4%, в плаценте - на 53,2%. У самок с ЭГ, получавших соединение РГПУ-147, РГПУ- 189 и препарат сравнения сулодексид отмечалась достоверно высокая активность СОД по сравнению с контрольной группой животных с ЭГ, получавших физ. р-р (Рис. 9).

Активность каталазы у самок с ЭГ снизилась по сравнению с показателем у самок без ЭГ на 31,9% в печени, 16,6% в матке и 27% - в плаценте. У самок с ЭГ, получавших соединение РГПУ-147 и РГПУ- активность каталазы возрастала преимущественно в печени – на 33%.

Введение сулодексида беременным самкам с ЭГ вызывало повышение активности фермента в печени, матке и плаценте на 19; 15 и 13% соответственно (Рис.10).

У самок с ЭГ активность ГП была снижена по сравнению животными с неосложненной беременностью на 31,7% -в мозге, на 56,4% - в печени, на 50,3% - в матке и на 65,1% - в плаценте. Наибольшая активность фермента у самок с ЭГ, получавших соединение РГПУ-147 отмечалась в печени и плаценте, а у животных получавших соединение РГПУ-189 в печени, матке и плаценте. Препарат сравнения сулодексид слабо влиял на активность ГП, повышая ее только в печени – на 32% (Рис.11).

Мембранопротекторное действие соединений РГПУ-147 и РГПУв условиях ЭГ на моделях кислотного и осмотического гемолиза.

Обнаружено, что у самок с ЭГ кислотная резистентность эритроцитов была снижена на 32,3% по сравнению с показателем группы самок без ЭГ.

Соединения РГПУ-147, РГПУ-198 и препарат сравнения сулодексид повышали резистентность мембран эритроцитов к повреждающему действию ЭГ, о чем свидетельствует снижение степени кислотного гемолиза на 48,