На правах рукописи

Лебедев Никита Викторович

ПОЛУЧЕНИЕ АНАТОКСИНОВ ACTINOBACILLUS

PLEUROPNEUMONIAE И ИЗУЧЕНИЕ ИХ СВОЙСТВ

06.02.02. – “Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,

микология с микотоксикологией и иммунология”

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир – 2013 2

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»).

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор Русалеев Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты: Диев Вячеслав Иванович доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир;

Кушнир Анатолий Тимофеевич доктор ветеринарных наук, профессор, ГНУ «Всероссийский научноисследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук»

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии), ведущий научный сотрудник лаборатории экспериментальной микробиологии, г.Покров.

Государственное научное учреждение

Ведущая организация:

«Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности» Россельхозакадемии (ГНУ ВНИТИБП), г.Щелково.

Защита диссертации состоится «17» декабря 2013 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец. Тел:

(4922)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан «15» ноября 2013 г., размещен на официальном сайте ФГБУ «ВНИИЗЖ» www.arriah.ru и на официальном сайте ВАК Российской Федерации www.vak2.ed.gov.ru.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций ФГБУ «ВНИИЗЖ», кандидат биологических наук Т.В. Жбанова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1.Актуальность темы исследования Актинобациллезная плевропневмония – инфекционное контагиозное заболевание свиней, характеризующееся септикотоксемией, геморрагической и гнойно-некротизирующей пневмонией, а также серозно-фибринозным плевритом, перикардитом и артритами.

Возбудителем болезни являются бактерии семейства Pasteurellaceae, рода Actinobacillus, Actinobacillus pleuropneumoniae.

вида Это мелкие грамотрицательные, неподвижные коккобактерии и палочки. Спор не образуют;

вирулентные штаммы имеют капсулу; обладают выраженным тропизмом к легочной ткани. Штаммы А. pleuropneumoniae разделяют на 15 серовариантов по капсульному антигену. Эти бактерии продуцируют четыре типа экзотоксинов – ApxI, ApxII, ApxIII, ApxIV. Некоторые исследователи склонны полагать, что А.

экзотоксины играют доминирующую роль в патогенности бактерий pleuropneumoniae. Токсины возбудителя губительно действуют на альвеолярные макрофаги, нейтрофилы и лимфоциты свиней, а также вызывают коагуляционный некроз тканей.

Актинобациллезная плевропневмония свиней была впервые зарегистрирована в свиноводческих хозяйствах Великобритании, США, Швейцарии и Аргентины в 1957-1964 гг., а возбудитель болезни был выделен в 1963. В последующие десятилетия это заболевание было установлено в большинстве стран мира с развитым свиноводством.

Экономический ущерб от этой инфекции складывается из затрат от падежа и вынужденного убоя, снижения продуктивности животных, качества получаемой оздоровительных мероприятий. Ежегодно страны Евросоюза тратят один миллиард евро на проведение лечебно-профилактических мероприятий в борьбе с данным заболеванием.

В настоящее время актинобациллезная плевропневмония свиней широко распространена в Канаде, США, Франции, Великобритании, Италии, Дании, Финляндии, Голландии, Японии, Греции, Австралии, а также в странах Южной Африки.

Согласно последним данным, на территории Российской Федерации циркулирует около 8 серовариантов А. pleuropneumoniae, но в связи с все большей глобализацией торгово-экономических отношений, вступлением нашего государства во Всемирную торговую организацию (ВТО), ростом миграции, увеличением импортно-экспортных торговых операций повышается вероятность появления других серовариантов возбудителя этого заболевания (Тимина, 2010). Из этого возникает проблема, решение которой напрямую зависит от наличия у животноводов эффективных средств специфической профилактики. Все известные в мире противоактинобациллезные вакцины подразделяют на корпускулярные и субъединичные (токсоидные). Наиболее распространенными являются корпускулярные вакцины. В состав таких вакцин включают штаммы серотипов, преимущественно доминирующих в конкретном географическом регионе, а создание вакцины, содержащей в своем составе антигены всех 15 серовариантов, достаточно проблематично, и скорее всего такая вакцина будет обладать низкой иммуногенностью.

Исходя из вышеизложенного, наиболее перспективными являются бактеринтоксоидные и субъединичные вакцины. Разработка фирмой Intervet вакцины «PORCILIS APP» свидетельствует о возможности создания высокоэффективного препарата, имеющего в своем составе инактивированные формальдегидом экзотоксины (АрхI, АрхII, АрхIII) и очищенные белки внешней мембраны, который защищает животных против 14 серовариантов А. pleuropneumoniae.

A.pleuropneumoniae и изучению их биологических свойств является актуальной задачей, имеющей важное научное и практическое значение для ветеринарии.

1.2. Степень разработанности Несмотря на то, что актинобациллезная плевропневмония свиней не относится к особо опасным или трансграничным инфекционным заболеваниям животных, а считается лишь факторной инфекцией, ей посвящено большое число актинобациллезной плевропневмонии свиней внесли зарубежные ученые (R.R.Shope, 1964; T. Nakai, 1983; J. Frey, 1990; R. Nielsen, 2000). Их работы содержат фундаментальные основы эпизоотологии данного заболевания. В последние годы данной тематике уделял внимание J.D. Dubreuil, 2000. В Российской Федерации изучением актинобациллезной плевропневмонии, занимались М.А. Сидоров, Д.А. Скородумов, 1986, а также научные сотрудники лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота ФГБУ «ВНИИЗЖ».

1.3. Цели и задачи исследования A.pleuropneumoniae и изучение их основных биологических свойств.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить биологические свойства имеющихся штаммов A.pleuropneumoniae и отобрать гиперпродуценты экзотоксинов;

- разработать метод получения экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- изучить биологические свойства экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- разработать схему получения анатоксина;

- изучить иммунобиологические свойства анатоксина A.pleuropneumoniae на лабораторных и естественно-восприимчивых животных.

1.4. Научная новизна Научная новизна работы состоит в том, что в результате проведенных исследований:

- отработан метод получения и концентрирования экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- изучены биологические свойства экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- разработана схема получения анатоксина;

- изучены иммунобиологические свойства анатоксина A.pleuropneumoniae;

экспериментального образца анатоксина.

1.5. Теоретическая и практическая значимость На основании экспериментальных данных разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» «Методические указания по определению антигенной активности анатоксин-вакцины против актинобациллезной плевропневмонии свиней».

1.6. Методология и методы исследования Методологической и теоретической основой диссертационной работы послужили труды зарубежных и отечественных исследователей в областях эпизоотологии и профилактики актинобациллезной плевропневмонии свиней, токсикологии и вакцинологии.

1.7. Положения, выносимые на защиту - динамика накопления экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- биологические свойства экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

- условия хранения и способ консервации экзотоксинов A.pleuropneumoniae;

A.pleuropneumoniae;

- схема получения актинобациллезного анатоксина;

- иммунобиологические свойства анатоксина A.pleuropneumoniae в опытах на лабораторных животных и свиньях.

1.8. Степень достоверности и апробация результатов Материалы диссертации были доложены на заседаниях ученого совета ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2010-2013 гг., а также доложены и опубликованы в материалах конференции «Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику», посвященной 30-летию создания СМУ ФГУ «ВНИИЗЖ».

1.9. Публикации По результатам исследований, выполненных по теме диссертации, опубликовано 4 научных работы, в том числе 2 работы в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

1.10. Структура диссертации Диссертация изложена на 133 страницах компьютерного текста по общепринятой схеме и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы, включающий 203 источника, в том числе 54 отечественных. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 19 рисунками и дополнена приложением.

1.11. Личный вклад автора в выполнение работы Отдельные этапы работы выполнены совместно с к.в.н. Потехиным А.В., к.в.н.

Фроловцевой А.А. и к.б.н. Бьядовской О.П., за что автор выражает им искреннюю благодарность.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы Штаммы и изоляты микроорганизмов: в экспериментальной работе использовали референтные штаммы бактерий A.pleuropneumoniae и St.aureus A.pleuropneumoniae серовар 1 № 27088, A. pleuropneumoniae серовар 2 № 27089, A.pleuropneumoniae серовар 3 № 27090, A. pleuropneumoniae серовар 5 № 33377, A.

pleuropneumoniae серовар 6 № 33590, St.aureus № 25923; штамм P. multocida № 1231 из коллекции ФГБУ «ВГНКИ»; изоляты бактерий A.pleuropneumoniae «Ильиногорский» (8 серотип), «Троицкое» (9 серотип), M.haemolytica и A.minor, выделенные из патологического материала от свиней и крупного рогатого скота в лаборатории профилактики болезней свиней и рогатого скота ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

технический с содержанием формальдегида не менее 36% производства «Метафракс».

следующие питательные среды: бульон на основе мясного гидролизата по Хоттингеру (с содержанием 250-300 мг % аминного азота) (ХБ), агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру с добавлением 10% дефибринированной крови барана (КА), агар на основе мясного гидролизата по Хоттингеру с добавлением 10% эритроцитов крови лошади (ХКЭ).

При выращивании бактерий A. pleuropneumoniae в питательные среды вносили ростовые факторы: в качестве V-фактора роста использовали НАД х/ч (добавляли 1% приготовленного 0,1%-го раствора) фирмы “AppliChem”, или 10% дрожжевого экстракта (ДЭ); в качестве Х-фактора роста использовали гемин х/ч (Г) (добавляли 1% приготовленного 0,1%-го раствора) фирмы “Serva” или 10% эритроцитов крови лошади (КЭ).

Подопытные животные: в экспериментальной работе использовали белых мышей массой 16-18 г для определения безвредности анатоксина. Кроликов, массой 2,5-3,0 кг для получения антитоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae.

Поросят массой 10-12 кг для изучения безвредности, реактогенности, антигенных и иммуногенных свойств образцов анатоксинов.

Адъюванты: для изготовления экспериментального образца анатоксина использовали адъювант фирмы SEPPIC, Франция: Montanid ISA-70 VG.

2.2.1. Культивирование бактерий При выращивании бактерий в жидких и полужидких питательных средах отмечали интенсивность роста и характер помутнения среды.

2.2.2. Световая микроскопия Световую микроскопию бактерий проводили под микроскопом МБИ- «Биолам» при увеличении 700 раз в мазках культур, фиксированных на предметном стекле над пламенем горелки и окрашенных по Граму. Наличие капсулы у бактерий определяли по методу Бурри-Гинса.

2.2.3. Определение числа живых микроорганизмов Количество клеток в 1 см3 исходной бактериальной суспензии вычисляли по формуле: М = а x 10n/V, где:

М - количество клеток в 1 см3; а - среднее число колоний при высеве разведения; V - объём суспензии, взятой для посева, в см3; 10n - коэффициент разведения.

2.2.4. Биохимические свойства Биохимические свойства A. pleuropneumoniae определяли с использованием культур не старше 18-20 ч, выросших на плотной питательной среде, средах Гиса, и с применением системы индикаторной бумажной (СИБ) для идентификации микроорганизмов.

2.2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле электрофоретической подвижности в 12% полиакриламидном геле. Для визуализации результата электрофореза гель окрашивали красителем Кумаси.

Молекулярную массу белка определяли, сравнивая его расположение в геле с расположением полос стандартного белкового маркера.

2.2.6. КАМП-тест Для постановки КАМП-теста золотистый стафилококк высевали на поверхность плотной питательной среды ровным диаметральным штрихом, а штаммы А. pleuropneumoniae перпендикулярно на расстоянии 5 мм. Инкубировали посевы культур в условии термостата в течение 18-20 часов при температуре 37С.

Результаты реакции учитывали визуально, реакцию считали положительной, если около штриха St. aureus наблюдалось значительное просветление плотной питательной среды, то есть КАМП – эффект.

2.2.7. Получение токсинов A. pleuropneumoniae С целью получения токсинов бактерии выращивали в жидкой питательной среде на основе триптического гидролизата мяса по Хоттингеру с добавлением 10% дрожжевого экстракта и различных концентраций CaCl2 в конических колбах в аппарате УВМТ-12-250 и лабораторных биореакторах АК-210, BioFlo-110 и BioTron LiFlus GX. Для освобождения от бактериальных клеток пробы бульонных культур центрифугировали при 8000 g в течение 20 мин при температуре 4-6оС.

Дополнительно проводили стерилизующую фильтрацию супернатанта через мембранный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Осаждение экзотоксинов из культурального фильтрата (КФ) проводили с помощью сульфата аммония.

2.2.8. Приготовление эритроцитов Кровь у барана брали из яремной вены в стерильный флакон со стеклянными бусами и встряхивали в течение 10-15 мин для предотвращения свертывания.

Дефибринированную кровь фильтровали через двойной слой марли и центрифугировали 10 мин при 2000 об/мин. Полученные в осадке эритроциты раза отмывали барбиталовым буферным раствором с рН 7,2, содержащим желатин (0,032% желатина в растворе 3,9 mМ барбитала натрия, 1,0 mM MgSO4, 0,38 mM CaCl2, 145,6 mM NaCl). Осадок эритроцитов ресуспендировали в стократном объеме буферного раствора. Полученная 1%-я суспензия эритроцитов соответствовала концентрации 7107 клеток/см3.

pleuropneumoniae Гемолитическую активность штаммов А. pleuropneumoniae оценивали по гемолитической активности культуральных фильтратов и концентратов, используя два способа:

на агаровых средах с добавлением 5% дефибринированной крови барана и/или кролика делали лунки, в которые вносили аликвоты КФ и инкубировали при 37оС в течение 18 часов, после чего учитывали диаметр зоны -гемолиза;

в суспензии 1%-й взвеси отмытых эритроцитов. Для определения 100%-ного гемолиза - к 1,0 мл 1%-й взвеси эритроцитов добавляли 3 мл дистиллированной воды. Пробирки инкубировали при температуре 37°С в течение 45 мин, охлаждали в холодильнике при 4°С в течение 10 мин, центрифугировали при 1500 об/мин и колориметрировали на ФЭК в кюветах (10мм) с зеленым светофильтром против воды. Оптическая плотность лизата при длине волны 541 мкм составляла 1,08.

Расчет количества гемолитических единиц (ГЕ) токсинсодержащего супернатанта бактериальной культуры в 1 мл проводили следующим образом.

После титрования исследуемые пробы инкубировали в течение 45 мин при температуре 37°С и далее выдерживали в течение 10 мин в холодильнике при 4°С.

Затем пробы центрифугировали и сравнивали с контрольной пробиркой, соответствующей 100% гемолизу или 1 ГЕ.

2.2.10. Реакция гемолиза и реакция нейтрализации гемолизина Для постановки реакции гемолиза в полистироловых планшетах готовили последовательные двукратные разведения супернатанта, начиная с 1:2 до 1:256 на барбиталовом буферном растворе в объеме 500 мкл. После этого в каждую лунку вносили по 50 мкл суспензии эритроцитов. Инкубировали в течение 1 ч при температуре 37оС и далее в течение ночи при комнатной температуре. Под действием токсина мутная взвесь эритроцитов превращалась в прозрачную яркокрасную жидкость. Степень реакции гемолиза оценивали визуально по четырехбальной системе.

Реакцию нейтрализации гемолизина ставили также в полистироловых планшетах. Для этого готовили последовательные двукратные разведения супернатанта, начиная с 1:2 до 1:256 на барбиталовом буферном растворе в объеме 400 мкл. После этого в каждую лунку вносили по 100 мкл исследуемой сыворотки кроликов, предварительно инактивированной при температуре 56оС в течение мин. Остальные этапы постановки реакции и учет результатов были как для реакции гемолиза. Индекс нейтрализации гемолизина определяли как разницу титров гемолитической активности токсина (log2), полученных в реакции с использованием нормальной и иммунной сывороток крови кроликов.

2.2.11. Получение первичной культуры альвеолярных макрофагов свиньи Для получения первичной культуры АМС использовали клинически здоровых поросят 4-10–недельного возраста из хозяйств, благополучных по инфекционным болезням свиней. Животных обескровливали, не допуская попадания крови в трахею, затем отпрепарировали легкие и помещали их в стерильный сосуд с фосфатно-буферным раствором с рН 7,2 (121 mM NaCl, 10 mM Na2HPO4, 3,2 mM K2HPO4), содержащим гентамицин в количестве 0,8 мг/см3.

Альвеолярные макрофаги получали путем вымывания их из легких средой Игла с добавлением рабочей концентрации антибиотиков (25 мкг/см3 канамицина, 0, мг/см3 амфотерицина-В, нистатина 0,04 мг/см3 ).

2.2.12. Определение титра цитотоксина Разведение фильтратов бульонных культур A. pleuropneumoniae готовили на среде Игла с глютамином (Sigma) без сыворотки и антибиотиков. Каждую дозу токсина испытывали на четырех матрасах с ровным монослоем АМС. Для характеристики зависимости между эффектом и дозой токсина использовали величину ЦТД50 – дозу токсина (мл), вызывающую гибель 50% клеток в монослое через 1, 3 и 6 часов культивирования. Цитотоксический эффект (ЦТЭ) оценивали по проценту погибших клеток в монослое.

2.2.13. Получение нормальной и специфической сывороток крови лабораторных животных Для получения сывороток крови использовали кроликов массой 2,5 – 3,0 кг, не имеющих специфических антител к микроорганизмам pleuropneumoniae.

2.2.14. Определение антигенной и иммуногенной активности экспериментального образца анатоксина против актинобациллезной плевропневмонии свиней Антигенные и иммуногенные свойства анатоксина определяли на свиньях путем оценки уровня антитоксических антител и контрольного заражения животных с оценкой результатов по Ханнану.

Для оценки иммунобиологических свойств анатоксина вводили различные дозы препарата поросятам внутримышечно в области верхней трети шеи однократно, а кроликам - в области бедра, также однократно. До инъекции препарата, а также спустя 7, 14 и 21 сутки после иммунизации у всех животных брали кровь для определения в сыворотке уровня антител к токсинам АрхI и АрхII в непрямом варианте ИФА (тест-система ФГБУ «ВНИИЗЖ») и в ИФА (СIVTEST suis App, Hipra).

На 22 сутки всех свиней заражали интраназально минимальными смертельными дозами возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней.

Наблюдение за животными вели в течение 10 суток.

2.2.15. Статистика Использовались стандартные приемы обработки выборок варьирующих переменных. При этом определяли средние квадратичные отклонения () и стандартные ошибки средних (m). Сущность различий средних оценок определяли, используя вероятные коэффициенты Стьюдента с заданным уровнем значимости (р).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1.1. Определение гемолитической активности различных серотипов A.pleuropneumoniae Одним из условий удачного проведения экспериментальной работы является получение максимально большого количества гемолизина ApxI. Для выполнения данной задачи было принято решение выявить у имеющихся в распоряжении штаммов и изолятов A.pleuropneumoniae гиперпродуцентов токсина ApxI с помощью реакции гемолиза в лунках полистироловых планшетов. Для этого были использованы 20 часовые агаровые культуры A.pleuropneumoniae штаммов АТСС:

27088 (1 серотип), 27089 (2 серотип), 27090 (3 серотип), 33377 (5 серотип), (6 серотип) и изолятов «Ильиногорский» (8 серотип) и «Троицкое» (9 серотип).

наибольшую гемолитическую активность проявляли штаммы A. pleuropneumoniae 1, 5 и 9-го серотипов, являющиеся продуцентами гемолизина ApxI.

культивирования штамма АТСС 27088 A. pleuropneumoniae первого серотипа Основным принципом наработки бактериального экзотоксина является получение возможно большего количества возбудителя за короткий промежуток технологическом плане является периодический способ глубинного культивирования.

Максимальную концентрацию живых микробных клеток наблюдали через часа культивирования, она соответствовала 7,0109 КОЕ/мл (9,84±0,07 lg КОЕ/мл).

Через 8 часов выращивания количество бактерий снизилось до 5,62109 КОЕ/мл (9,75±0,07 lg КОЕ/мл).

Максимальный титр гемолизина 5,0 log2 в суспензии наблюдали через четыре часа культивирования. При выходе культуры в стационарную фазу наблюдали снижение гемолитической активности. Через 8 часов выращивания бактерий титр гемолизина в суспензии составлял 1,5 log2.

Для изучения профиля молекулярной массы белка в полученных образцах экзотоксина проводили электрофорез в полиакриламидном геле, результаты представлены на рисунке 1.

Рис. 1. Электрофореграмма белка из супернатанта бульонной культуры штамма АТСС 27088 A. pleuropneumoniae: a – стандарты молекулярных масс белка, b – белок из супернатанта бульонной культуры Таким образом, результаты лабораторных исследований свидетельствуют о том, что максимальная продукция гемолизина (ApxI) с молекулярной массой кДа происходит во время экспоненциальной фазы роста бактерий. С переходом культуры A. pleuropneumoniae в стационарную фазу гемолитическая активность суспензии резко снижается.

3.1.3. Гемолитическая активность штаммов АТСС 27088 (1 серотип) и 27089 (2 серотип) A.pleuropneumoniae с эритроцитами барана и кролика Определение гемолитической активности культуральных фильтратов (КФ) штаммов A.pleuropneumoniae 1-го и 2-го серотипов проводили на агаровых средах с добавлением 5% дефибринированной крови барана и/или кролика.

Гемолитическую активность штаммов оценивали путем определения зоны гемолиза, с помощью измерения ее диаметра. Для этого в лунки вносили аликвоты КФ и инкубировали при 37оС в течение 18 часов.

Зоны гемолиза вокруг лунок с КФ штамма АТСС 27088 начинали формироваться уже через 1,5-2,0 часа инкубирования, тогда как с фильтратом штамма АТСС 27089 - только через 7,0-8,0 часов. При этом максимальный размер зоны гемолиза у КФ штамма 1-го серотипа достигал 20 мм, независимо от вида животных, эритроциты которых использовали в составе среды. Зоны гемолиза у КФ штамма 2-го серотипа были различны, так, размер зоны гемолиза на среде с эритроцитами барана не превышал 10 мм, а на среде с эритроцитами кролика достигал 15 мм.

Данное различие, по-видимому, связано с особенностями механизмов взаимодействия разных гемолизинов с мембранами эритроцитов барана и кролика.

Так, задержка лизиса эритроцитов барана КФ штамма АТСС 27089 обусловлена действием “слабого” гемолизина ApхII, который почти не образует поры в мембранах эритроцитов барана, тем самым не вызывает их лизиса, и, напротив, более выраженно лизирует эритроциты кролика.

3.1.4. Влияние концентрации хлористого кальция на активность гемолизина A.pleuropneumoniae На данном этапе работы мы изучили влияние хлористого кальция в среде культивирования A. pleuropneumoniae на активность продуцируемых токсинов. В стандартную среду культивирования добавляли различные концентрации хлористого кальция: 12,5; 25,0 и 50,0 ммоль. Культивирование штаммов 1, 2, 3, 5, и 9 серотипов проводили в конических колбах в установке выращивания микроорганизмов УВМТ-12-250 в течение 4 часов при температуре 37оС и перемешивании 200 об/мин. Количество гемолитических единиц в стандартном объеме культуральной среды определяли описанным выше способом.

Результаты опытов показали, что концентрации 25 и 50 ммоль хлористого кальция повышали активность ApxI-токсина у штаммов 5 и 9 серотипов до 8,5, а у штамма 1 серотипа - до 10,5 ГЕ/мл. На основании полученных данных нами было сделано заключение, что гемолизин ApxI является Ca-зависимым.

3.1.5. Влияние физических и химических факторов на сохранение гемолитической активности гемолизинов A.pleuropneumoniae 1 серотипа Для определения оптимальных условий хранения экзотоксинов необходимо было выяснить его подверженность влиянию различных температур и сохранению гемолитических свойств при их воздействии.

Гемолитическую активность определяли в очищенном от бактериальной массы супернатанте бульонной культуры A. pleuropneumoniae 1 серотипа до и после хранения при различных температурах:

-70, -20, 4, 22, 37, 56 и 80 С.

Реакцию на определение гемолитической активности ставили в полистироловых планшетах с добавлением дефибринированной крови барана, с последующими двухкратными разведениями.

Таблица 1.

Сохранение гемолитической активности супернатанта бактериальной культуры Actinobacillus pleuropneumoniae 1 серотипа при различных температурах хранения *определяют как время, в течение которого активность снижается до 50% от исходной активности.

Полученные результаты (табл.1) показали, что гемолизины pleuropneumoniae сохраняют свои гемолитические свойства при низких температурах хранения и в то же время довольно чувствительны к повышенным температурам. Из этого можно сделать вывод, что хранение образцов экзотоксинов возможно осуществлять в обычном бытовом холодильнике в течение короткого периода времени при +4°С и более длительно - в морозильной камере при -20°С и ниже.

Согласно данным зарубежных исследователей, после выхода культуры в стационарную фазу роста токсины Арх начинают разрушаться под действием ферментов, выделяемых бактериальной клеткой (T. Nakai, 1983). Поэтому для сохранения максимального количества экзотоксинов необходимо инактивировать как сам токсин, так и бактериальные клетки. В своих работах иностранные исследователи рекомендуют использовать формалин в качестве инактиванта в конечной концентрации 0,12%, но поскольку в своих работах они использовали рекомбинантные токсины Арх, у них не было необходимости проводить инактивацию бактериальных клеток (P.Satran, 2003).

Поэтому нами была изучена выживаемость актинобацилл при воздействии различных концентраций формалина. Для инактивации использовались бульонные культуры штамма АТСС 27088, взятые в конце экспоненциальной - начале стационарной фазы роста. Формалин вносили из расчета конечной концентрации 0,025%, 0,05%, 0,1% и 0,2%. Инактивацию проводили при 37оС. Концентрацию живых микробных клеток определяли перед внесением инактиванта (Хо), а затем через каждые 60 мин (Хi).

На основании полученных результатов концентрация 0,2% формалина была определена как оптимальная для инактивации бактерий и экзотоксинов Actinobacillus pleuropneumoniae.

биологических свойств бактерий A. pleuropneumoniae. КАМП–феномен впервые был описан как синергичный гемолиз эритроцитов барана, вызываемый коagalactiae) распространения бета-токсина (сфингомиелазы) St. aureus (J. Frey, 1989).

В начале был проведен КАМП–тест с изолятами A. pleuropneumoniae. Для всех изолятов тест оказался положительным. Затем нами был поставлен биохимическим свойствам представителей рода Actinobacillus. Для представителя вида A. pleuropneumoniae тест оказался положительным, а для представителя вида A. minor - отрицательным.

Полученные результаты дали нам основание полагать, что продуцируемый A. pleuropneumoniae ко-гемолизин усиливает гемолитические свойства других токсинов. В то же время данный тест может использоваться для дифференциации A. pleuropneumoniae от другого постоянного обитателя воздухоносных путей свиньи - A. minor.

3.1.7. Выделение экзотоксинов сульфатом аммония Выделение токсинов из фильтратов бульонных культур проводили путем добавления различных концентраций сульфата аммония.

Результаты опытов по определению оптимальной концентрации сульфата аммония, необходимой для выделения экзотоксинов из КФ A. pleuropneumoniae, на примере штамма АТСС 27088, представлены в табл. 2.

Таблица Влияние различных концентрации сульфата аммония на осаждение экзотоксинов из Концентрация сульфата Гемолитическая активность Гемолитическая активность При анализе полученных результатов можно заключить, что оптимальной концентрацией сульфата аммония, необходимой для более полного осаждения экзотоксинов A. pleuropneumoniae, на примере гемолизина (ApхI), является 55%.

3.1.8. Цитотоксическая активность штаммов АТСС 27088 (1 серотип) и 27089 (2 серотип) A.pleuropneumoniae Цитотоксическую активность исследуемых штаммов A. pleuropneumoniae изучали на культуре клеток альвеолярных макрофагов свиньи методом световой микроскопии.

Результаты проведенных опытов, представленные в табл. 3 показывают, что наибольшей цитотоксической/литической активностью в отношении альвеолярных макрофагов свиньи обладал штамм 27088. Известно, что штаммы pleuropneumoniae, относящиеся к первому серотипу, не продуцируют цитотоксин ApxIII, активный в отношении альвеолярных макрофагов свиньи. Несмотря на это, мы наблюдали полный лизис АМС через 6 часов после внесения исходного КФ штамма 27088, по всей вероятности, обусловленный действием “сильного” гемолизина/цитолизина ApxI.

Таблица Цитотоксическая активность штаммов A. pleuropneumoniae Штамм Титр цитотоксина в исходном КФ, Титр цитотоксина в концентрате КФ, ультрафильтрации биореакторах АК-210, BioFlo-110 и BioTron LiFlus GX в жидкой питательной среде. Процесс накопления гемолизина регистрировали путем ежечасного титрования культурального фильтрата с эритроцитами барана. Максимальное значение было получено на 5-м часу культивирования и соответствовало 1:64 или log2.

Затем культуральную жидкость концентрировали методом двухступенчатой ультрафильтрации. В связи с этим были проведены эксперименты на установке микро- и ультрафильтрации «Сартокон-мини» с рабочей поверхностью мембранного модуля 0,1 м2.

Супернатант подвергали ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтр (Sartorius) с НОММ 300 кДа. Затем полученный пермеат подвергали ультрафильтрации через полисульфоновый мембранный фильтр (Sartorius) с НОММ 50 кДа. В результате был получен двадцатикратный концентрат по объему с содержанием общего белка около 1,0 мг/мл. Стерилизацию концентрата экзотоксина проводили методом микрофильтрации с использованием мембран (Sartorius) с размером пор 0,22 мкм.

3.2.1. Схема получения актинобациллезного анатоксина На следующем этапе исследований мы провели измерения общей концентрации белка и гемолитической активности трех образцов токсина, полученных различными способами.

Результаты, приведенные в табл. 4, свидетельствуют о том, что метод традиционного метода получения экзотоксина с помощью сульфата аммония, он оказался очень трудоемким и малопродуктивным.

Таблица Характеристика методов получения гемолизина A. pleuropneumoniae мембранного концентрирования экзотоксина ApхI из культуральной жидкости A.

pleuropneumoniae и его ультрафильтрационного фракционирования позволили предложить примерную технологическую схему изготовления актинобациллезного анатоксина, включающую следующие этапы:

- глубинное культивирование A. pleuropneumoniae 1 и 2 серотипов;

- инактивацию бактериальных клеток и токсина путем добавления к суспензии формалина в конечной концентрации 0,2% при температуре 37оС в течение 24 часов (T. Nakai, 1983);

- проточное центрифугирование бактериальной суспензии при 15000 g;

- очистка супернатанта проточной микрофильтрацией «кросс-флоу» с использованием микрофильтрационных модулей с мембранами 0,22 мкм;

- очистка супернатанта проточной ультрафильтрацией «кросс-флоу» с использованием ультрафильтрационных модулей с мембранами НОММ 300 кДа;

- концентрирование анатоксина проточной ультрафильтрацией «кросс-флоу»

с использованием ультрафильтрационных модулей с мембранами НОММ 50 кДа;

микрофильтрацией «кросс-флоу» с использованием микрофильтрационных модулей с мембранами 0,22 мкм.

иммунизированных кроликов с экстрактами токсинов A. pleuropneumoniae, St.

aureus и E. coli Отработав схему получения анатоксинов, мы приступили к изучению их иммунобиологических свойств. В начале необходимо было определить их специфичность. Поскольку RTX-токсины, к которым относятся Apx-токсины, продуцируются многими микроорганизмами, оставались сомнения в специфичности, а также иммуногенности данных анатоксинов. Для определения специфичности была проведена реакция диффузионной преципитации сыворотки иммунизированного кролика с экстрактами токсинов A.pleuropneumoniae, St.aureus и E.coli. Кролики были иммунизированы полученным образцом анатоксина, а на 7е сутки из ушной вены была отобрана кровь и приготовлена сыворотка. Реакция проводилась в агаровом слое полистироловой чашки. Через 48 часов между лунками с сывороткой крови и экстрактом токсина А.pleuropneumoniae появилась серо-белая полоса преципитации.

Реакция оказалась положительной только для экстракта токсина App. С экстрактами других представителей группы RTX – токсинов, сыворотка кролика иммунизированного образцом анатоксина A. pleuropneumoniae не была активна.

Полученные данные свидетельствуют о специфичности реакции.

3.3.2. Получение экспериментального образца анатоксина Actinobacillus pleuropneumoniae в смеси с адъювантом Анатоксин получали описанным ранее методом. Затем для усиления иммуногенных свойств анатоксин был смешан с масляным адъювантом Montanide ISA 70. Смешивание проводили интенсивным встряхиванием до получения однородной жидкости белого цвета.

Состав одной дозы препарата: 0,35 см3 – масляный адъювант Montanide ISAи 0,15 см3 – смесь анатоксинов штаммов Actinobacillus pleuropneumoniae АТСС 27088 и 27089 – по 50 мкг каждого, итоговое количество антигена в дозе 100 мкг (A. Rossi-Campos, 1992). Затем было приготовлено три последовательных трехкратных разведения препарата в плацебо с конечными концентрациями антигена 33, 11 и 3,5 мкг. Стерильность экспериментального образца анатоксина в смеси с адъювантом контролировали в соответствии с ГФ XII, ч. 1, с. 150.

3.3.3. Определение безвредности и реактогенности полученного экспериментального образца анатоксина на лабораторных животных и свиньях Вначале была проведена проверка опытных образцов на безвредность для лабораторных животных. Безвредность препарата определяли на белых мышах, которым препарат вводили подкожно в области спины в объеме 0,5 см3 с концентрацией анатоксина 100 мкг. Наблюдение за животными вели в течение суток. Все животные, участвовавшие в опыте, оставались живыми и клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения.

Затем безвредность образцов анатоксина оценивали на поросятах 25-30дневного возраста. Исследуемые препараты вводили внутримышечно в области шеи за ухом с правой стороны в объеме, превышающим прививной в 3 раза (1, см3). На протяжении всего срока наблюдения животные оставались живыми и клинически здоровыми. Через 2 мес. после иммунизации свиньи были подвергнуты убою с целью проведения патологоанатомического вскрытия. Никаких изменений на месте введения испытуемых препаратов обнаружено не было.

Реактогенность исследуемых образцов анатоксина изучали на поросятах путем двукратной инъекции прививной дозы препарата с интервалом между введениями 20 сут. Образцы анатоксина вводили внутримышечно в области шеи за ухом с правой стороны по 0,5 см3. Наблюдение за животными в течение 10 суток после введения второй дозы анатоксина не выявило каких-либо отклонений со стороны общего состояния организма животных.

Таким образом, проведенные исследования дали нам основания полагать, что полученный образец анатоксина против актинобациллезной плевропневмонии свиней, эмульгированный в масляном адъюванте Montanide ISA 70, безвреден для лабораторных животных и свиней, а также не реактогенен при введении поросятам прививного объема 0,5 см3.

экспериментального образца анатоксина на лабораторных животных и свиньях Изучение иммунобиологических свойств и антигенной активности анатоксина против актинобациллезной плевропневмонии свиней предполагает определение уровня специфических антител в сыворотках крови свиней и лабораторных животных (в частности, кроликов). Согласно работам зарубежных исследователей, наиболее оптимальным методом, который может быть использован для оценки уровня специфических антител в сыворотках крови, является непрямой вариант иммуноферментного анализа (Н-ИФА) (J. Klausen, 2007).

Поэтому необходимо было разработать простой и чувствительный вариант иммуноферментного анализа для определения антител к токсинам ApxI и ApxII в сыворотках крови свиней и кроликов.

В начале работы был получен диагностический препарат антигена. Для этого в работе были использованы концентрированные и очищенные анатоксины ApxI и ApxII Actinobacillus pleuropneumoniae, штамма АТСС 27088. Затем мы приступили к получению специфических сывороток лабораторных и естественновосприимчивых животных. Свиньи и кролики были иммунизированы образцами анатоксина A.pleuropneumoniae содержащими анатоксины ApxI и ApxII. В качестве положительного контроля нами были использованы сыворотки крови свиньи и кролика, специфичные к анатоксинам ApxI и ApxII. В качестве отрицательного контроля – сыворотка крови свиньи и кролика, не содержащая антител к вышеуказанным анатоксинам.

После оптимизации всех параметров и отработки схемы непрямого варианта ИФА были начаты опыты по изучению антигенных и иммуногенных свойств анатоксина. Для иммунизации использовали поросят 45 суточного возраста. До инъекции анатоксина, а также на каждый 7-й день после иммунизации, в течение недель у всех животных брали кровь для исследования сывороток крови на наличие антитоксических антител в ИФА (СIVTEST suis App, Hipra) и тест-системе Н-ИФА ФГБУ «ВНИИЗЖ».

Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что разработанная в лаборатории тест-система н-ИФА для обнаружения поствакцинальных антитоксических антител высокочувствительна и высоко специфична. Как и в первом опыте, все животные, взятые в опыт, оказались отрицательными к токсинам