На правах рукописи

Марданов Андрей Владимирович

Расшифровка структур геномов как основа изучения

особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия архей

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва-2013

Работа выполнена в Лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук

Научный консультант:

доктор биологических наук Равин Николай Викторович

Официальные оппоненты:

Шестаков Сергей Васильевич, доктор биологических наук, профессор, академик РАН, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», Биологический факультет, главный научный сотрудник.

Дебабов Владимир Георгиевич, доктор биологических наук, профессор, член-корр.

РАН, академик РАСХН, Федеральное государственное унитарное предприятие научно-исследовательский институт генетики и селекции «Государственный промышленных микроорганизмов», научный руководитель.

доктор биологических наук, Федеральное Пименов Николай Викторович, государственное бюджетное учреждение науки Институт микробиологии им. С.Н.

Виноградского Российской академии наук, заместитель директора по научной работе.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук

Защита диссертации состоится «18» апреля 2013 г. в 11 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Россия, Москва, Ленинские горы, МГУ, биологический факультет, ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «31» января 2013г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы С момента описания Карлом Возе в качестве отдельного, наряду с бактериями и эукариотами, домена живых существ (Woese and Fox, 1977), археи стали одними из наиболее интересных объектов микробиологии, молекулярной биологии и биохимии.

Несмотря на большой интерес к археям, успехи в их изучении до середины 1990-х годов были весьма ограничены, что во многом было связано с сложностью культивирования большинства этих микроорганизмов и практически полным отсутствием генетических «инструментов» (генетическая трансформация, векторы для экспрессии, методы нокаута генов и др.), подобных давно разработанным для таких модельных объектов как Escherichia coli.

Успехи в развитии геномики вносят особенно заметный вклад в исследование архей. Благодаря прогрессу в разработке геномных технологий растет число полных геномных последовательностей, расширяются знания о биологии архей, их разнообразии и эволюции. Получены новые данные о ключевых генетических процессах у архей, таких как клеточное деление и репликация ДНК, о роли горизонтального переноса генов в эволюции, выявлены взаимосвязи между археями и эукариотами. Основные пути метаболизма у архей и соответствующие ферменты сходны с бактериальными, в то время как аппарат репликации и экспрессии генетической информации более близок к эукариотическому. Вследствие этого археи являются удобными модельными объектами для изучения молекулярных механизмов многих генетических процессов у эукариот.

Среди архей выделяют два основных филума (Woese et al., 1990), - Crenarchaeota (кренархеи) и Euryarchaeota (эуриархеи). Кренархеи и эуриархеи не только образуют отдельные филогенетические ветви, но и существенно отличаются в организации аппарата репликации и экспрессии генома, клеточного деления и многих других важнейших генетических процессов.

На момент начала данной работы, к 2008г. было определено всего около полных геномов архей, что более чем на порядок меньше, чем число расшифрованных бактериальных геномов. Большинство архей с известными полными геномами представляли всего несколько филогенетических групп, - метаногены, галофилы, термофильные археи порядка Thermococcales (эуриархеи) и кренархеи порядка Sulfolobales. Для большинства остальных групп, в первую очередь термофильных кренархей, геномные данные отсутствовали либо были доступны для одного-двух представителей, что существенно ограничивало знания о биологии этих организмов.

Таким образом, задача определения и анализа структур геномов архей, в первую очередь представляющих «новые» эволюционные ветви, является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований в области молекулярной биологии и микробиологии. Не меньшее значение, в первую очередь для понимания молекулярных механизмов эволюции, имеет и сравнительный анализ геномов близкородственных организмов. Расшифровка геномов архей, обитающих в специфических экологических нишах, важна для выяснения соответствующих путей метаболизма и экологической роли этих микроорганизмов в природных сообществах.

Функциональная геномика архей, обитающих в экстремальных условиях среды, имеет и очевидное практическое значение, обусловленное биотехнологическим потенциалом этих микроорганизмов в качестве источников новых ферментов.

Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является изучение особенностей метаболизма, путей эволюции и биоразнообразия термофильных архей на основе определения и анализа полных нуклеотидных последовательностей их геномов.

Конкретные задачи исследования состояли в следующем:

термофильных архей – объектов исследования.

Изучение особенностей структурной организации и функционирования геномов архей.

Анализ путей и механизмов эволюции архей на основе геномных данных.

Анализ особенностей метаболизма архей.

Идентификация и характеристика новых термостабильных ферментов, перспективных для использования в биотехнологии.

Определение структур микробных сообществ термальных источников с различными физико-химическими характеристиками, анализ экологической роли отдельных групп микроорганизмов.

Объектами исследования являлись новые виды термофильных архей из коллекции микроорганизмов, выделенных в лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С.Н. Виноградского РАН. Две археи Fervidicoccus fontis), другие были выделены из ранее неисследованных экологических ниш и/или имели необычные возможности метаболизма (Desulfurococcus kamchatkensis, Thermococcus sibiricus, Vulcanisaeta moutnovskia, Thermoproteus uzoniensis, Pyrobaculum sp. 1860, Thermofilum carboxydotrophus, Thermogladius cellulolyticus).

Научная новизна работы Впервые определены полные структуры геномов 9 термофильных архей из различных филогенетических групп. Анализ геномов двух архей, Acidolobus saccharovorans Fervidicoccus fontis, представляют два новых порядка кренархей (Acidilobales и Fervidicoccales), наряду с тремя ранее известными порядками (Desulfurococcales, Sulfolobales и Thermoproteales).

В результате анализа геномных данных охарактеризованы основные пути метаболизма исследуемых архей, механизмы их приобретения и потери на молекулярном уровне.

Впервые проведена глубокая количественная характеристика состава сообществ микроорганизмов термальных источников. Обнаружены ранее неизвестные группы архей. Определена зависимость состава и разнообразия микробных сообществ от температуры и рН, что дало новую информацию о распространении в природе и вероятной экологической роли отдельных групп архей.

Анализ геномов архей выявил ряд особенностей генетических процессов на молекулярном уровне. Обнаружено, что репликация хромосомы A. saccharovorans инициируется с двух ori - сайтов. Один из них расположен вблизи гена, кодирующего архейный инициаторный белок WhiP, гомолог эукариотического белка Cdt1. WhiP гены и ассоциированные с ними ori - сайты присутствуют в геномах Sulfolobales и некоторых представителей Desulfurococcales, но отсутствуют у наиболее эволюционно древней ветви кренархей Thermoproteales, а также у Fervidicoccales. Филогенетический анализ WhiP показал, что «второй» ori-сайт и whiP были приобретены на раннем этапе эволюции кренархей (и впоследствии утрачены в некоторых линиях), а не в результате интеграции вирусов и горизонтального переноса, как это предполагалось ранее.

молекулярных механизмов генетических процессов, эволюции архей и структурнофункциональному исследованию белков, представляющих интерес как для биотехнологических задач.

Практическая ценность работы Практическая значимость работы обусловлена биотехнологическим потенциалом термостабильных ферментов и термофильных микроорганизмов. Термостабильные ферменты, продуцируемые гипертермофильными археями, широко используются в различных областях биотехнологии, что обусловлено их устойчивостью не только к высокой температуре, но и к другим экстремальным условиям (рН, высокие концентрации детергентов и растворителей и др.). Биотехнологически значимыми функциональными характеристиками обладают идентифицированные в этой работе термостабильные ферменты: алкогольдегидрогеназа из T. sibiricus, протеаза из D.

kamchatkensis, альдегиддегидрогеназа из Pyrobaculum sp. 1860, супероксиддисмутаза из A. saccharovorans, бета-галактозидаза из T. sibiricus, многофункциональная бетагликозидаза из A. saccharovorans, ДНК-лигазы из A. saccharovorans и T. sibiricus.

Выявленные термостабильные ферменты могут быть использованы для разработки новых биотехнологий для пищевой промышленности, переработки лигноцеллюлозного сырья, производства детергентов, органического синтеза.

В рамках выполнения данной работы были получены патенты на две термостабильные ДНК лигазы (Патенты РФ № 2405823 и № 2413767) и термостабильную алкогольдегидрогеназу из T. sibiricus (Патент РФ № 2413766).

Поданы две заявки на получение патентов на изобретения – термостабильные бетагалактозидаза из T. sibiricus и бета-гликозидаза из A. saccharovorans.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных и российских конференциях: II международная конференция «BioMicroWorld2007» (Севилья, Испания, 2007), симпозиум «Метаболомика и биотехнология» (Майорка, Испания, 2008), международный симпозиум «BAGECO-10»

(Упсала, Швеция, 2010), международный симпозиум «Биоразнообразие, молекулярная биология и биогеохимия термофилов» (Петропавловск-Камчатский, 2010), международная конференция «Extremophiles 2010» (Азорские острова, Португалия, 2010), I и II международные научно-практические конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Москва, 2010;

Новосибирск, 2011), международный симпозиум «BAGECO-11» (Корфу, Греция, 2011), 2-ая международная конференция «BGRS/SB’12» (Новосибирск, 2012), 3 Московская международная конференция «Молекулярная филогенетика MolPhy-3» (Москва, 2012), 14 международный симпозиум ISME14 (Копенгаген, Дания, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 36 работ, в том числе 21 статья в научных журналах, 12 – в сборниках материалов научных конференций (тезисы сообщений и докладов). Получено 3 патента РФ на изобретения.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста и включают 77 рисунков и 36 таблиц. Диссертация состоит из разделов: «Введение», «Цель и задачи исследования», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение» в 6 тематических главах, «Заключение», «Выводы», «Список «Цитированная литература», список которой содержит 5 отечественных и иностранных источников.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объектами исследования были новые виды термофильных архей из коллекции лаборатории гипертермофильных микробных сообществ ИНМИ РАН, для которых ранее не проводилось определение нуклеотидных последовательностей геномов.

Desulfurococcus kamchatkensis и Thermogladius cellulolyticus представляют порядок Desulfurococcales; Vulcanisaeta moutnovskia, Thermoproteus uzoniensis, Pyrobaculum sp.

saccharovorans и Fervidicoccus fontis – два новых порядка филума Crenarchaeota. Еще одна архея, Thermococcus sibiricus, относится к филуму Euryarchaeota. Для определения полных структур геномов был использован метод высокопроизводительного пиросеквенирования.

1. Термоацидофильная архея Acidilobus saccharovorans – представитель новой филогенетической линии кренархей Архея Acidilobus saccharovorans 345-15Т была выделена из кислого горячего источника кальдеры вулкана Узон, Камчатка, Россия (Prokofeva et. al., 2009). Этот микроорганизм является облигатным анаэробом, термоацидофилом, растущим при pH 2,5-5,8 и температурах от 60 до 90оС. A. saccharovorans – органогетеротроф, способный утилизировать разнообразные углеводы и белковые субстраты (Prokofeva et. al., 2009).

Рост микроорганизма стимулируется добавлением S0 и тиосульфата, которые расшифрованным геномом облигатно анаэробной термоацидофильной археи.

Геном A. saccharovorans представляет собой кольцевую хромосому длиной 1.496.453 п.н. и не содержит внехромосомных элементов (Рис. 1). Геном содержит одну копию оперона 16S-23S рРНК, одну удаленно расположенную копию гена 5S рРНК и 45 генов тРНК. С помощью стандартных протоколов поиска генов было найдено потенциальных белок-кодирующих генов со средней длиной 902 нт, покрывающих 90. % генома. Функции 972 белков (65%) могут быть предсказаны с различной степенью достоверности и детализации в результате сравнения с базами данных. Функции остальных генов предсказать по аминокислотной последовательности соответствующих белков не представляется возможным, причем 246 генов являются уникальными для A. saccharovorans.

Из мобильных элементов в геноме была найдена одна копия транспозона семейства IS607, интегрированные архейные вирусы и плазмиды обнаружены не были.

Геном A. saccharovorans содержит пять кластеров коротких тандемных повторов (CRISPR), включающих 24, 10, 26, 42 и 8 повторяющихся спейсеров. Предполагается, что CRSIPR-локус участвует в системе защиты клетки, действующей по механизму, аналогичному РНК-интерференции эукариот, а спейсерные последовательности являются производными внехромосомных элементов, например вирусов. В подтверждение этой гипотезы мы обнаружили, что последовательность одного из спейсеров совпадает с последовательностью плазмиды pHVE14 из Sulfolobus islandicus.

Активностью CRISPR системы может объяснять отсутствие интегрированных вирусов и минимальное число мобильных элементов в геноме A. saccharovorans.

На Рис. 2 представлены данные о количестве белок-кодирующих генов A.

saccharovorans, гомологи которых присутствуют в геномах других архей. Полученные результаты показывают, что ближайшим родственником A. saccharovorans является кренархея Aeropyrum pernix, описанная как представитель порядка Desulfurococcales, около половины (~740) белков у них гомологичны. Значительно меньшее число «общих» белков A. saccharovorans имеет с другими представителями Desulfurococcales (478-586 белков) и Thermoproteales (491-624 белков). Особо стоит отметить то, что A.

saccharovorans имеет большее число «общих» белков с представителями Sulfolobales (661-687 белков). Причина такого сходства между протеомами A. saccharovorans и Sulfolobales, вероятно, связана с адаптацией этих организмов, способных расти на сложных белковых и полисахаридных субстратах, к термоацидофильным условиям и обусловлена событиями горизонтального переноса генов. Эту гипотезу подтверждает совместное обитание этих микроорганизмов в кислых горячих источниках и наличие у них похожих мобильных элементов.

Рисунок 2. Сравнения протеомов A. sacchrarovorans и других архей.

(A) Число белок-кодирующих генов A. sacchrarovorans имеющих гомологов в геномах других архей. Два гена считались гомологичными, если соответствующие белковые последовательности перекрывались на длине > 70%, при этом E 2H+ + 2e-) и восстановление серы (2H+ + 2e- + S0 > H2S) осуществляются мембрансвязанными гидрогеназой и сероредуктазой; их совместное функционирование в короткой электрон-транспортной цепи приводит к переносу протонов из клетки и к образованию трансмембранного градиента протонов, используемого для синтеза АТФ.

Аналогичные кластеры генов, кодирующих сероредуктазу и гидрогеназу, имеются и в геноме V. distributa, однако, в геноме V. moutnovskia делетированы два из трех генов, кодирующих субъединицы сероредуктазы, гидрогеназа также отсутствует (Рис. 9).

Рисунок 9. Локус, кодирующий мембран-связанную сероредуктазу у V. distributa (вверху) и соответствующий участок генома V. moutnovskia (внизу). Гены, кодирующие субъединицы сероредуктазы, указаны серыми стрелками, гены с неизвестными функциями, - незакрашенными стрелками.

В процессах анаэробного дыхания в присутствии акцептора электронов восстановленный ферредоксин, NAD(P)H и водород, могут быть окислены в результате согласованной работы набора мембран-связанных оксидоредуктазных комплексов и цитоплазматических редуктаз, приводящей к образованию трансмембранного протонного градиента. Все три генома кодируют протон-транспортирующие ферредоксин: NAD(P) оксидоредуктазные комплексы, получающие электроны от восстановленного ферредоксина и передающие их на NAD(P)+ и/или на хиноны дыхательной цепи и далее на мембран-связанные редуктазы. В геномах V. moutnovskia и T. uzoniensis кодируется NAD(P)H:S оксидоредуктаза NSR, которая может окислять восстановленный NAD(P)H с образованием сероводорода. В геноме Pyrobaculum sp.

1860 отсутствует гены цитоплозматической NSR и мембран-связанной сероредуктазы, что согласуется с тем, что этот микроорганизм не восстанавливает серу.

У V. moutnovskia, T. uzoniensis и Pyrobaculum sp. 1860 имеются различные терминальные оксидоредуктазы. Так, T. uzoniensis кодирует мембран-связанную сероредуктазу, а также цитохром bd и цитохром с оксидазы. Особенностью V.

moutnovskia является наличие полного набора генов, кодирующих ферменты пути восстановления сульфатов, редко встречающегося у архей и на сегодняшний день описанного только у эуриархеи Archaeglobus fulgidus и кренархеи Caldivirga maquilingensis. Наиболее широкий спектр мембран-связанных оксидоредуктаз, которые могут служить конечными акцепторами электронов при анаэробном дыхании, обнаружен у Pyrobaculum sp. 1860. Это цитохром-оксидазы различных типов, нитрат редуктаза NarG-типа, цитохром с нитрит редуктаза, NO-редуктаза, цитохром с редуктаза закиси азота, редуктаза оксида железа Fe(III) цитохром с типа, и молибдоптериновые оксидоредуктазы семейства, которые могут восстанавливать арсенат, тиосульфат или полисульфид. Нитрит редуктаза кодируется двумя расположенными рядом генами (P186_0727 и P186_0728); анализ их нуклеотидных последовательностей показал, что удаление одного нуклеотида может приводить к восстановлению рамки считывания. Это может указывать на наличие в этом гене потенциального сайта программируемого сдвига рамки считывания. Реальная физиологическая роль терминальных оксидоредуктаз у Pyrobaculum sp. 1860 является предметом изучения, поскольку экспериментально была показана только способность Pyrobaculum sp. 1860 восстанавливать нитрат, оксид железа (III) и арсенат.

Таким образом, у V. moutnovskia, T. uzoniensis и Pyrobaculum sp. функционируют разветвленные дыхательные цепи. По-видимому, в зависимости от условий окружающей среды эти микроорганизмы используют оптимальные акцепторы электронов. Во всех трех микроорганизмах протонный градиент, являющийся результатом действия протонных насосов и пирофосфатазы, может использоваться АТФ-синтазой A1Ao типа для синтеза АТФ, сопряженного с переносом протонов в клетку. Этот фермент может действовать в обоих направлениях. При росте в отсутствие внешних акцепторов электронов активности протонных насосов может оказаться недостаточно для создания протонного градиента, необходимого для поддержания нормального внутриклеточного рН в условиях кислой среды. В этом случае дополнительный протонный градиент может генерироваться обратной активностью АТФазы, действующей как протонный насос за счет гидролиза АТФ, синтезированного в реакциях субстратного фосфорилирования.

4. Thermofilum carboxydotrophus, карбоксидотрофная кренархея порядка Thermoproteales.

Анаэробная кренархея Thermofilum carboxydotrophus 1505 была выделена из горячего источника, расположенного вблизи вулкана Мутновский, Камчатка. Культура растет в анаэробной среде, содержащей 100 мг/л дрожжевого экстракта, в присутствии 45% СО в газовой фазе (Sokolova et al., 2009). В процессе роста СО полностью потреблялся с образованием молекулярного водорода и СО2. T. carboxydotrophus является первым представителем Crenarchaeota, способным к гидрогеногенной карбоксидотрофии (реакция CO + H2O > CO2 + H2). Это свойство широко распространенно среди бактерий типа Firmicutes, но крайне редко встречается у архей.

Геном T. carboxydotrophus является кольцевой хромосомой длиной 1.754.192 нт и не содержит внехромосомных элементов. Содержание G+C составляет 46.4 %. Было идентифицировано 2013 потенциальных генов, покрывающих 89.7% хромосомы, из них 1969 – кодирующих белки. В результате сравнения с базами данных аминокислотных последовательностей с различной степенью детализации и достоверности были предсказаны функции 66% предполагаемых белков. предсказанных белков являются специфичными для T. carboxydotrophus и не имеют сходства с последовательностями, представленными в GeneBank.

Геном содержит одну копию рибосомного оперона, включающего гены 16S и 23S РНК, а также отдельно расположенный ген 5S рРНК. Гены рибосомных РНК не содержат интронов, однако, интроны были найдены в половине идентифицированных генов тРНК. В геноме T. carboxydotrophus найдено 9 CRISPR локусов, 8 из них расположены в одном участке генома размером около 300 т.п.н. У T. carboxydotrophus найдено только 4 гена, кодирующих необходимые для функционирования CRISPRсистемы Cas белки, т.е. минимальный набор cas-генов, найденных в других организмах, по-видимому, отсутствует. Поэтому можно предположить, что CRISPR-система у T.

carboxydotrophus не функционирует.

В результате сравнения наборов белок-кодирующих генов установлено, что ближайшим родственным T. carboxydotrophus микроорганизмом с известной полной геномной последовательностью является T. pendens. Около 65% предсказанных белков T. carboxydotrophus (~1300 белков) имеют сходство с белками T. pendens. Сравнение полных геномных последовательностей T. carboxydotrophus и T. pendens (Рис. 10) выявило сохранение порядка генов на протяжении крупных участков хромосомы.

Однако, распределение такой синтении в геномах не равномерно – на протяжении примерно 3/4 длины геномы в основном колинеарны, а оставшиеся фрагменты сильно различаются (Рис. 10). У T. carboxydotrophus этот «видоспецифический» участок включает 577 белок-кодирующих генов. Среди этих белков только 35 % (~200 белков) имеют гомологию с белками T. pendens, это в два раза ниже, чем в среднем по геному.

Большая часть генов этого района кодирует белки с неизвестными функциями, отсутствующие в геномах других архей. Появление таких генов может быть результатом интеграции крупных фрагментов чужеродной горизонтально перенесенной ДНК и геномных перестроек.

T. carboxydotrophus T. carboxydotrophus растет на пептоне и глюкозе в присутствии дрожжевого экстракта и серы. Анализ генома выявил гликолитические и протеолитические carboxydotrophus ферментов являются внутриклеточными. Например, из 14 гликозил-гидролаз лишь один фермент семейства GH57 имеет сигнальную последовательность, что может предполагать его внеклеточное функционирование. В геноме кодируется большое количество различных транспортеров сахаров и пептидов, в том числе ферменты фосфотрансферазной системы транспорта углеводов, редко встречающейся у архей.

Все это указывает на то, что рост T. carboxydotrophus обеспечивается не за счет гидролиза внеклеточных полисахаридов и сложных белковых субстратов, а, в первую очередь, за счет эффективного транспорта и использования низкомолекулярных соединений, присутствующих в среде.

Основные пути центрального метаболизма у T. carboxydotrophus сходны с таковыми у проанализированных представителей Desulfurococcales (Рис. 12).

Метаболизм глюкозы может осуществляться посредством модифицированного пути Эмбдена-Мейергофа. В отличие от других Thermoproteales, у T. carboxydotrophus отсутствуют путь Энтнера-Дудорова и цикл трикарбоновых кислот.

Анализ генома выявил два мембран-связанных оксидоредуктазных комплекса.

Первый комплекс подобен гидрогеназе, окисляющей восстановленный ферредоксин с образованием водорода и переносом протонов через мембрану. Второй MBX-подобный комплекс формирует протонный градиент за счет окисления ферредоксина и восстановления NADP+. Образуемый NADPH может в дальнейшем окисляться NAD(P)H:S оксидоредуктазой с образованием H2S. Восстановление серы также может осуществляться посредством мембран-связанной сероредуктазы, которая может получать электроны от хинонов дыхательной цепи или мембран-связанной гидрогеназы.

Еще одной особенностью T. carboxydotrophus, указывающей на его способность использовать продукты деятельности других микроорганизмов, является наличие пути ассимиляции глицерина, который может образовываться, в частности, в результате гидролиза присутствующих в среде триглицеридов липолитическими ферментами.

Глицерин может фосфорилироваться, а затем окисляться мембран-связанной глицеролдегидрогеназой, которая может переносить электроны на хиноны 3-фосфат дыхательной цепи. Образованный гидроксиацетон-фосфат может утилизироваться по пути Эмбдена-Мейергофа.

T. carboxydotrophus является единственной известной кренархеей, способной к росту на СО с образованием H2 и CO2. Ранее анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофы были описаны в основном среди бактерий типа Firmicutes. Среди архей это тип метаболизма был обнаружен у некоторых представителей эуриархей рода Thermococcus. В результате анализа генома T. carboxydotrophus был выявлен кластер генов (Ther_0860 – Ther_0871), кодирующих CO-дегидрогеназу (CODH). Этот кластер включает транскрипционный регулятор и гены, кодирующие субъединицы CODH: электрон-транспортную CooF, каталитическую CooS, вспомогательную субъединицу CooC, субъединицы гидрогеназы CooM, CooU, CooH, CooL, CooK и CooX. Организация кластера генов CODH у T. carboxydotrophus сходна с таковой у эуриархей рода Thermococcus (Рис. 11), что указывает на горизонтальный перенос этого кластера между T. carboxydotrophus и Thermococcus. Первоначальным источником этих генов, вероятно, были термофильные карбоксидотрофные бактерии филума Firmicutes.

Каталитическая субъединица CO-дегидрогеназы T. carboxydotrophus, CooS, имеет высокую гомологию с CooS (THERMP_01153) из Thermococcus barophilus MP (74% идентичности), а также функционально охарактеризованным CooS из Carboxydothermus hydrogenoformans (Chy_0085) и Rhodospirilum rubrum. CODH комплекс Rhodospirilum rubrum принимает участие в СО-зависимой цепи переноса протонов. СО-дегидрогеназа окисляет CO до CO2, используя Н2О, и переносит электроны на протоны с образованием водорода, энергия генерируется в виде трансмембранного протонного градиента (Рис. 12).

F S C M U H L K X

Рисунок 11. Организация кластера CODH генов у карбоксидотрофных архей и бактерий филума Firmcutes.

На основании геномных данных можно предположить, что T. carboxydotrophus использует СО не только как источник энергии, но и как источник углерода. Геном содержит ген рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы, ключевого фермента автотрофной фиксации углекислого газа в цикле Кальвина. Также в геноме кодируются ферменты, участвующие в преобразовании рибозофосфатной группы аденозинмонофосфата (АМФ) в рибулозо-1,5-бисфосфат: AMФ фосфорилаза и рибозо-1,5-бисфосфат изомераза. В условиях недостатка гетеротрофных субстратов и ограниченного образования CO2 в процессах катаболизма, CO2, образуемый в результате действия CODH, может быть субстратом для рибулозо-1,5-бисфосфат карбоксилазы (Рис. 12).

Культивирование T. carboxydotrophus требует присутствия в среде дрожжевого экстракта, что указывает на потребность микроорганизма в сложных соединениях.

Более того, другой представитель этого рода, T. pendens, требует для роста клеточных экстрактов археи T. tenax, что указывает на потерю многих биосинтетических процессов. Как и в случае T. pendens (Anderson et al., 2008), анализ генома T.

carboxydotrophus указывает на потерю способности синтезировать многие метаболиты, в том числе пурины, большинство кофакторов и аминокислот. Из 125 COG (Clusters of Ortologous Groups), кодирующих биосинтетические ферменты у архей (Anderson et al., 2008), в геномах T. pendens и T. carboxydotrophus имеются гены лишь 11 ферментов.

Такая потеря биосинтетических путей характерна для некоторых облигатных паразитов разнообразную органику среды термального источника.

FOR ADP

HPS ATP

PHI VOR

FBA KGOR

AMP ATP

ADP ATP

MBX MBH

Рисунок 12. Основные пути метаболизма T. carboxydotrophus.

(А) – утилизация сахаров, (В) – утилизация белков, (C) – гликолиз (Э-М) и глюконеогенез, (D) – метаболизм пирувата, (E) – синтез пентоз-фосфатов, (F) формирование протонного градиента с образованием АТФ.

5. Эуриархея Thermococcus sibiricus, выделенная из пластовых вод нефтяного резервуара Представители рода Thermococcus широко распространены в наземных и морских гидротермах, а также в пластовых водах подземных нефтяных месторождений.

Гипертермофильная анаэробная эуриархея Thermococcus sibiricus MM 739 была выделена из пластовых вод высокотемпературного нефтяного месторождения Самотлор в Западной Сибири (Miroshnichenko et. al., 2001). Температура вод в месте выделения (глубина 2350 метров) составляла около 84C. Вместе с родами Pyrococcus и Palaeococcus, Thermococcus относится к эуриархейному порядку Thermococcales.

Большинство Thermococcales являются органогетеротрофами, растущими на белках и некоторых углеводах, используя серу или протоны в качестве акцепторов электронов.

Ранее были определены геномные последовательности нескольких представителей Thermococcales, выделенных из морских гидротерм. В отличие от них T. sibiricus был выделен из пластовых вод высокотемпературного нефтяного резервуара. Такие места обитания характеризуются низким уровнем растворенного органического углерода и следовыми количествами свободных аминокислот. Тем не менее, первоначально T. sibiricus был описан как анаэроб, сбраживающий белковые субстраты (Miroshnichenko et al. 2001). Этот организм был найден в изолированном нефтесодержащем горизонте Юрского периода, причем в это месторождение вода искусственно не закачивалась. Оптимальные условия роста T. sibiricus (температура, и соленость) соответствуют условиям месторождения. Поэтому можно нефтесодержащего горизонта, что предполагает его выживание с момента образования месторождения и адаптацию его метаболизма к условиям подземного резервуара.

Результаты анализа генома T. sibiricus позволяют объяснить способность этой археи расти в такой экологической нише.

Геном T. sibiricus имеет длину 1.845.800 нт., содержит одну копию оперона 16SS рРНК и две копии гена 5S рРНК, расположенных удалено от 16S-23S оперона.

Было найдено 46 генов тРНК для 20 аминокислот, распределенных по всей длине генома. В геноме идентифицировано 2061 потенциальных белок-кодирующих генов со средней длиной 815 нт, покрывающие 91% генома. Функции 1413 (69%) белков могут быть предсказаны с различной степенью достоверности и детализации в результате сравнения с базами данных. Функции остальных 648 (31%) предсказать по аминокислотной последовательности не представляется возможным, причем 181 ген является уникальным для T. sibiricus.

На рисунке 14 представлены диаграммы, иллюстрирующие количества белоккодирующих генов T. sibiricus, гомологи которых присутствуют в геномах других представителей порядка Thermococcales. Полученные данные показывают, что около 70% (1480) белков имеют гомологов кодируемых в геномах T. kodakaraensis и T.

onnurineus (Рис. 13). Из них 1024 белка имеются у всех трех известных представителей рода Pyrococcus. Можно предположить, что этот общий набор генов имелся у общего предка архей порядка Thermococcales. Около 387 белков T. sibiricus отсутствуют у других представителей порядка Thermococcales, и хотя функции большинства из этих белков неизвестны, среди них есть ферменты, которые могут обеспечивать специфические особенности метаболизма T. sibiricus (см. ниже).

Первоначально, согласно микробиологическим данным, T. sibiricus был описан как анаэроб, сбраживающий белковые субстраты. В результате анализа генома T.

sibiricus было найдены гены для 281 белков с сигнальными последовательностями на N-конце. Большинство из них были аннотированы как транспортные белки, протеазы, гликозил гидролазы, липазы/эстеразы. В результате геномного анализа были выявлены секретируемые ферменты, которые могут обеспечивать рост T. sibiricus на других субстратах, помимо белков. В ИНМИ РАН была экспериментально проверена предсказанная в результате анализа геномных данных способность T. sibiricus расти на других субстратах. В результате была подтверждена возможность роста на мальтозе, декстране, целлюлозе, целлобиозе, агарозе, гексадекане, ацетоне, оливковом масле и глицерине.

Рисунок 13. Сравнение наборов белок-кодирующих генов T. sibiricus и других представителей порядка Thermococcales.

Анализ геномных данных показал, что определенный участок генома T. sibiricus (нт 308742 – 328657, соответствует генам Tsib_0320-Tsib_0334), содержит набор генов, кодирующих ферменты, существенные для использования целлюлозы, ламинарина, агара и других -связанных полисахаридов (Рис. 14). Этот «сахаролитический остров»

кодирует ферменты для внеклеточного гидролиза этих субстратов, транспорта олигосахаридов в клетку и их последующего расщепления до мономеров: две внеклеточные и одну внутриклеточную эндо-1,4-глюканазы, целлобиоз-фосфорилазу, внеклеточную ламинариназу (эндо-1,3-глюканазу), -галактозидазу, внеклеточную -агаразу, -гликозидазу и транспортную систему ABC-типа для -гликозидов.

Ближайшие гомологи этих ферментов (за исключением –агаразы) были найдены у бактерий рода Thermotoga, однако этот регион отсутствует у близких родственников T.

sibiricus - T. kodakaraensis и T. onnurineus (Рис. 14). В T. sibiricus этот «сахаролитический остров» расположен в кластере генов рибосомных белков, который имеется и у T. kodakaraensis и T. onnurineus. Все эти данные свидетельствует о том, что “сахаролитический остров” был горизонтально перенесен в геном T. sibiricus из неизвестной термофильной бактерии, возможно, близкой к Thermotoga. Также нельзя исключить архейного происхождения этого «острова», поскольку предполагается, что значительная фракция генов T. maritima (более 20%) является результатом горизонтального переноса из геномов термофильных архей.

Рисунок 14. «Сахаролитический остров» в геноме T. sibiricus.

Гены, показанные синим цветом, встречаются во всех геномах Thermococcus. Гены не участвующие в деградации полисахаридов или с неизвестной функцией обозначены желтым.

Гены, кодирующие сахаролитические ферменты, представлены светло зеленым; гены транспортной системы ABC-типа отмечены темно зеленым цветом.

Еще одним вероятным результатом горизонтального переноса генов у Thermococcales является имеющий размер около 16 тпн кластер генов деградации мальтозы и трегалозы, найденный в геномах P. furiosus и Thermococcus litoralis.

Аналогичный локус имеется в геноме T. sibiricus (нт 340628 – 356664, соответствует генам Tsib_0356-Tsib_0369), причем порядок генов совпадает с порядком генов в геноме P. furiosus. Этот кластер генов кодирует предполагаемую трегалоз-синтазу, гликоген-расщепляющий фермент и гликозидазу. Он также содержит гены двух высоко аффинных транспортных систем ABC-типа для -гликозидов.

В геноме T. sibiricus обнаружено 15 генов, кодирующих липазы/эстеразы, четыре из которых содержат сигнальные пептиды, что предполагает их внеклеточную активность. Один из этих генов, кодирующий липазу, Tsib_1424, был нами клонирован, экспрессирован в E. coli и полученный рекомбинантный белок был функционально охарактеризован. Было установлено, что Tsib_1424 может гидролизовать производные п-нитрофенила с различной длиной цепи при температурах 50-70°С, т.е. проявляет липолитическую активность. В соответствии с этими данными было обнаружено, что T.

sibiricus растет на оливковом масле, основным компонентом которого является триолеин. Это свойство крайне редко встречается у архей. Гидролиз триглицеридов липазами приводит к образованию глицерина и жирных кислот. T. sibiricus растет на глицерине, но не на длинноцепочечных жирных кислотах, что согласуется с отсутствием пути -окисления жирных кислот. Следовательно, рост на оливковом масле является результатом утилизации глицерина, образующегося в результате гидролиза липидов.

Центральный метаболизм глюкозы в T. sibiricus может осуществляться с помощью ферментов пути Эмбдена-Мейергофа. Образовавшийся пируват может быть в дальнейшем окислен до CO2 в результате совместного действия пируват:формиат пируват:ферредоксин оксидоредуктазой.

фосфорилирования и анаэробного дыхания. Основным механизмом сохранения энергии T. sibiricus является образование протонного градиента тремя мембранными комплексами, сходными с NADH:хинон оксидоредуктазой. Это два мембран-связанных гидрогеназных комплекса MBH1 и MBH2, а также мембран-связанный NADP+ восстанавливающий комплекс MBX, связанный с восстановлением серы. Повторное окисление образованного NADPH может осуществляться NADPH:S0 оксидоредуктазой, которая переносит электроны на серу и образует H2S. Донором электронов для MBH и MBX комплексов, вероятно, является восстановленный ферредоксин, который образуется в ферредоксин-зависимых реакциях в процессе окислении углеводов и белков. Функционирование H2-образующих гидрогеназ MBH типа подтверждается образованием H2 во время роста T. sibiricus в отсутствии S0 как акцептора электронов.

В отсутствии серы T. sibiricus, вероятно, запасает энергию с помощью MBH1 и MBH2, а в присутствии серы - с помощью MBX-комплекса.

Сформированный за счет работы MBH1, MBH2, и MBX трансмембранный протонный градиент может быть использован АТФ синтазой для синтеза АТФ. В геноме T. sibiricus кодируется одна АТФ синтаза, транспортирующая ионы натрия.

Отметим, что для роста T. sibiricus требуется довольно высокая соленость (оптимум при 20 г/л NaCl).

Рисунок 15. Основные пути метаболизма T. sibiricus.

(А) – утилизация сахаров, (В) – утилизация белков, (C) – гидролиз триглицеридов и утилизация глицерина (D) – гликолиз (путь Эмбдена-Мейергофа), (E) – метаболизм пирувата, (F) формирование протонного градиента и синтез АТФ.

Различные пути метаболизма, идентифицированные на основании геномных данных, представлены на Рис. 15. Расшифровка генома создала основу для открытия новых физиологических особенностей данного микроорганизма, который изначально был описан как архея, способная расти только на белковых субстратах. В результате геномного анализа были выявлены ферменты, необходимые для деградации полисахаридов, а также системы транспорта сахаров в клетку. Способность T. sibiricus расти на олигомерных и полимерных углеводах с -связями (мальтоза, декстран) и связями целлюлоза, ламинарин и агароза) была подтверждена экспериментально в ИНМИ РАН. Способность к росту на агарозе ранее не была описана для термофильных эуриархей. Гены ферментов гидролиза полисахаридов и транспорта сахаров в клетку локализованы в геноме в виде «островков», вероятно приобретенных в результате горизонтального переноса генов. Более того, T. sibiricus, по-видимому, использует неизвестный механизм деградации n-алканов, поскольку его рост стимулируется гексадеканом, а известные пути анаэробного метаболизма алканов в геноме отсутствуют. Редким для термофильных архей является способность T.

sibiricus к росту на липидах, что обеспечивается наличием у него липаз, а не только часто встречающихся у архей эстераз, расщепляющих лишь короткоцепочечные триглицериды.

Особенности метаболизма T. sibiricus, установленные в результате анализа его генома, подтверждают предположение об аборигенном происхождении этой археи из пластовых вод нефтяного резервуара Юрского периода и объясняют ее выживание в этой изолированной экологической нише со времени ее образования. Помимо пептидов и аминокислот, присутствующих в нефтяных резервуарах в следовых количествах, T.

sibiricus может расти на полисахаридах и липидах, источником которых могут являться океанические осадки, из которых образовалась нефть Западной Сибири, а также на алканах сырой нефти.

6. Молекулярный анализ микробных сообществ термальных источников Камчатки За последние 30 лет из термальных источников Камчатки было выделено большое число новых видов термофильных бактерий и архей, в том числе представляющих новые филогенетические линии высокого уровня и характеризующихся различными типами метаболизма (Заварзин, 2004; Лебединский и др., 2007). Некоторые из них были объектами исследования в рамках данной работы. По сравнению с такими экологическими нишами, как гейзеры Исландии и Йеллоустонского парка США, биоразнообразие термофильных микроорганизмов Камчатки исследовано хуже.

В кальдере Узон располагается большое количество разнообразных термальных источников, характеризующихся различными значениями температуры и pH, а также химическим составом. До начала нашей работы «глубокий» молекулярный анализ биразнообразия, основанный на пиросеквенировании фрагментов генов 16S рРНК, для термальных источников кальдеры Узон не проводился.

Целью этой части работы являлся анализ микробных сообществ нескольких термальных источников кальдеры вулкана Узон, отличающихся физико-химическими параметрами. В качестве объектов исследования были выбраны пять «кислых» (рН 3.7источников «1805», «1810», «1807», «1818» и «1884», различающихся по температуре, а также два «нейтральных» (рН 6.3) источника «Заварзин» и «Бурлящий», имеющие температуры 55-58oС и 90-94oС, соответственно (Табл. 3). Пробы биоматериала (воды и/или взвеси грунта) были отобраны в ходе экспедиций в кальдеру Узон в 2007, 2008 и 2009 гг.

Важнейшими факторами, влияющими на состав и разнообразие сообществ термофильных микроорганизмов, по крайней мере, для наземных гидротермальных экологических ниш, являются температура и рН. Исследования микробных сообществ нейтральных и умеренно-щелочных источников Йеллоустонского парка США, показали, что бактерии во всех случаях составляют большую часть сообществ, а на долю архей обычно приходится не более нескольких процентов микроорганизмов.

Большую часть гипертермофильных сообществ (обычно более 75%) составляли бактерии Aquificales, также встречались представители Thermotogales, ThermusDeinococcus, и Thermodesulfobacteria. Суммарно, на эти группы приходилось более 90% всех микроорганизмов. В источниках, температура которых была ниже границы, при фототрофные бактерии, - Cyanobacteria и Chloroflexi. С ростом температуры биоразнообразие сообществ уменьшалось (Miller et al., 2009), и в наиболее высокотемпературных источниках ограничивалось всего несколькими группами бактерий. Например, в источнике West Thumb Pool (температура 89оС, рН 7.3) на долю бактерий рода Hydrogenobacter (филум Aquificales) приходилось 92% сообщества, а остальные 8% составляли Thermotogales (Spear et al. 2005).

Эти закономерности подтверждаются результатами сравнительного анализа микробных сообществ воды из двух «нейтральных» источников, - Бурлящего и Заварзина (Табл. 3). В высокотемпературном «Бурлящем» доминируют всего две группы хемолитоавтотрофных микроорганизмов, - Aquificales среди бактерий (69%) и Thermoproteales среди архей (91%), причем последняя группа представлена почти гидротермах. Эти кренархеи обладают разнообразными системами автотрофного и гетеротрофного метаболизма (раздел 3).

разнообразное по составу сообщество, в котором абсолютное большинство составляют термофильные бактерии (Табл. 3). Поскольку температура источника ниже верхней границы, при которой органического вещества может осуществляться как фотосинтетически, так и хемолитоавтотрофно, в результате окисления восстановленных субстратов вулканического происхождения, поставляемых геотермальным потоком.

Таблица 3. Состав микробных сообществ термальных источников.

Температура Соотношение археи/бактерии Показаны доли (%), которые соответствующие группы составляют среди бактерий или архей (доли менее 0.1% не показаны) Фотосинтетическая продукция в источнике Заварзина осуществляется цианобактериальным матом, покрывающим дно, тогда как в воде концентрация фототрофов (цианобактерий и Chloroflexi) была низкой. Хемолитоавторофная продукция может осуществляться в аэробных или микроаэрофильных условиях за счет окисления серы и ее восстановленных соединений (Sulfurihydrogenibium, Thiofaba), а в анаэробной зоне путем окисления водорода с использованием в качестве акцептора электронов серы (при участии Thermosulfidibacter, Caldimicrobium, Thiomonas).

Образуемая фотосинтетиками и хемолитоавтотрофами, а также поступающая с поверхностными водами из окружающих низкотемпературных зон органика может использоваться разнообразными гетеротрофными микроорганизмами, представленными в основном анаэробами. В их число входят как бактерии, сбраживающие органические субстраты (Fervidobacterium, Dictyoglomus и др), так и осуществляющие ее полное окисление за счет использования в качестве акцептора электронов кислорода, серы или нитрата (Thermus, Desulfurella, Calditerrivibrio). В целом, источник Заварзина характеризуется высоким разнообразием обитающих в нем термофильных прокариот, при этом в отличие от Бурлящего не наблюдается абсолютного доминирования какой-либо одной группы микроорганизмов, например, Aquificales. Вероятно, это обусловлено как сравнительно умеренными значениями температуры и рН, так и разнообразием процессов первичной продукции органических веществ. Большое количество филогенетически разнообразных групп говорит о том, что это – хорошо сбалансированное сложное сообщество, где каждая группа занимает свою экологическую нишу.

Объектами большинства ранее опубликованных исследований были термальные источники с высокой температурой и нейтральным рН, в то время как «кислые»

термальные источники встречаются реже и охарактеризованы хуже. Именно термоацидофильные экологические ниши могут быть источником совершенно неизвестных линий бактерий и архей. Мы охарактеризовали микробные сообщества четырех «кислых» источников с близким рН (от 3.5 до 4.1, - «1884», «1805», «1818» и «1810»), но различной температурой, а также микробное сообщество источника «1807», являющегося промежуточным между «кислыми» и «нейтральными» источниками (86oC, pH 5.6). Прежде всего, отметим, что во всех «кислых» источниках археи составляли значительную, а в некоторых – большую часть микробных сообществ (Табл. 3). С учетом того, что большинство бактерий в источниках «1805», «1818», «1807» и «1810», по-видимому, не являются эндогенными (см. ниже), можно сделать вывод о том, что именно археи доминируют в сообществах кислых гидротерм.

Микробное сообщество источника «1884», представлявшего собой искусственно вырытую заполненную грунтовой водой яму в месте выноса на поверхность углеводородов термальными водами, имело необычный состав. В нем доминировали не бактерии, а археи, составлявшие более 70% всех микроорганизмов. Почти 90% архей относились к различным линиям, не имеющих культивируемых представителей. В отсутствии фотосинтеза первичная продукция органических веществ может обеспечиваться за счет использования неорганических субстратов вулканического происхождения, к которым относятся метан, водород и восстановленные соединения серы, присутствующие в источнике «1884». Первичную продукцию органических веществ могут обеспечивать две группы аэробных автотрофных бактерий:

представители рода Acidithiobacillus, окисляющие неорганические соединения серы и/или металлы, а также термоацидофильные метанотрофы филума Verrucomicrobia.

Эти группы бактерий используют в качестве источника углерода, соответственно, СО и метан. Другие микроорганизмы сообщества являются органотрофами (Fervidicoccales, Geobacillus, Actinobacteria), или их функциональная роль не может быть предсказана исходя из таксономической принадлежности (некультивируемые линии бактерий и архей). Поэтому можно предположить, что в сообществе присутствуют неизвестные группы термофильных литоавтотрофов, либо это сообщество зависит от притока органических веществ извне, с дождевыми водами, поступающими из окружающих более холодных районов и/или от поступления углеводородов из глубинных слоев с геотермальным потоком. Отметим, что «1884» - единственный из проанализированных источников, в котором значительную долю сообщества составляли кренархеи порядка Fervidicoccales.

оптимальными для роста этих органотрофных микроорганизмов, сбраживающих белковые субстраты (глава 2).

Особенностью кислых источников естественного происхождения («1805», «1818», «1807» и «1810») является значительная доля архей в сообществе. Более того, в обнаруженном составе бактериального компонента сообществ большинство бактерий относится к мезофильным, а не термофильным линиям. По-видимому, эти бактерии не являются эндогенными компонентами сообществ, а попали в источники извне, с дождевыми водами из окружающих низкотемпературных зон. К термофилам относятся Aquificales, которые составляли 36% бактерий в «1805», 35% - в «1807», 6% - в «1818», но отсутствовали в «1810». Термоацидофилы Acidithiobacillus были обнаружены в источниках «1805» (12% бактерий), «1807» (0.7%) и «1810» (18%). Еще одна группа термофилов, - Thermotogae, составляла около 1% бактерий в источнике «1818». В пользу гипотезы об экзогенном происхождении «нетермофильных» бактерий в этих источниках свидетельствуют результаты сравнительного анализа бактерий из источников «1805» и «1810». Если исключить из рассмотрения Aquificales, относительные доли основных групп бактерий в источниках «1805» и «1810» окажутся практически одинаковыми, несмотря на большие различия в их температурах. Оба источника расположены вблизи друг от друга, что объясняет сходство состава «экзогенных» бактерий. Кроме того, в отличие от источника Заварзина, источники «1805» и «1810» (а также «1818» и «1807») представляют собой замкнутые бассейны, в которых отсутствует постоянный приток воды из подземных гидротермальных выходов, который мог бы постоянно обновлять воду источника, удаляя попавшие извне микроорганизмы. Таким образом, если сделанное нами предположение верно, археи должны составлять абсолютное большинство в «эндогенных» микробных сообществах кислых термальных источников.

В отличие от бактерий, археи микробных сообществ источников «1805», «1818», «1807» и «1810» относятся к известным линиям термофилов. Две группы термоацидофильных кренархей, Sulfolobales и Acidilobales, доминировали в этих сообществах, представляя более половины архей. Sulfolobales, - типичные обитатели кислых горячих источников, например, сульфатар. Именно эти в основном аэробные археи, окисляющие водород и серу, являются первичными продуцентами в термоацидофильных сообществах, но многие из них способны окислять и органические вещества в процессах аэробного и анаэробного дыхания. Напротив, культивируемые представители Acidilobales являются анаэробными гетеротрофами, способными осуществлять полное окисление органических веществ в процессах анаэробного дыхания в присутствие серы. Сосуществование этих двух групп в кислых термальных источниках может объяснять и интенсивный горизонтальный перенос генов между Sulfolobales и Acidilobales, выявленный в результате анализа генома A. saccharovorans.

Некоторые группы архей в значительных количествах были обнаружены только в отдельных источниках. Прежде всего, это представители филума Taumarchaeota, обнаруженные в источниках «1807» и «1818», в которых они составляют 27% и 2% архейного сообщества, соответственно. Это аэробные, окисляющие аммоний археи первоначально были найдены в морях и почвах, но впоследствии были обнаружены и в гидротермальных местообитаниях Йеллоустонского парка США. Оптимальными для них, видимо, являются высокотемпературные умеренно-кислые гидротермы, о чем свидетельствует сравнение долей Taumarchaeota в источниках «1807» (86oC, pH 5.6) и «1818» (80oC, pH 3.5). Еще одной группой архей, доля которых увеличивалась при снижении рН и росте температуры, являются эуриархеи Halobacteriales, на долю которых приходилось 0.6% архейных последовательностей в «1805», 0.3% - в «1807», 5% в «1810» и 7% - в «1818». Вероятно, обнаруженные нами микроорганизмы образуют группу термоацидофильных галоархей.

7. Основные характеристики отдельных групп архей Расшифровка и анализ геномов позволили не только охарактеризовать конкретные организмы, но и выявить ряд закономерностей и общих характеристик отдельных линий архей. Анализ геномов трех представителей (V. moutnovskia, T.

uzoniensis и Pyrobaculum sp. 1860) наиболее древнего порядка гипертермофильных кренархей, Thermoproteales, показал, что они имеют сравнительно крупные геномы (1.8-2. гетеротрофного метаболизма. Эти микроорганизмы способны гидролизовать сложные белковые субстраты и полисахариды, и не только сбраживать органические вещества, но и осуществлять их полное окисление в процессах анаэробного дыхания. В их геномах кодируются ферменты окислительного цикла трикарбоновых кислот и разнообразные цитоплазматические и мембран-связанные оксидоредуктазы, позволяющих этим археям использовать различные акцепторы электронов. Набор этих окидоредуктаз отличается у разных представителей Thermoproteales. По-видимому, в процессе эволюции Thermoproteales происходили потери отдельных оксидоредуктаз и их приобретение в процессах горизонтального переноса и дупликации генов с последующей специализацией ферментов. Широкий спектр путей метаболизма у Thermoproteales обуславливает их распространение в термальных источниках с различными физико-химическими характеристиками. Наиболее многочисленными они являются в нейтральном источнике с наиболее высокой температурой, «Бурлящем».

По-видимому, Thermoproteales являются не только первичными продуцентами органических веществ благодаря своей способности к литоавтотрофному росту, но и осуществляют их полное окисление в процессах анаэробного дыхания.

Другой тип метаболизма характерен для T. carboxydotrophus, - представителя рода Thermofilum, образующего базовую ветвь порядка Thermoproteales. Анализ генома T.

carboxydotrophus использованию низкомолекулярных продуктов жизнедеятельности других микроорганизмов, присутствующих в среде. У T. carboxydotrophus потеряны многие биосинтетические пути, что характерно для облигатных паразитов. Вероятно, более простой набор путей метаболизма у представителей рода Thermofilum по сравнению с другими Thermoproteales обусловлен не эволюционной древностью Thermofilum, а утратой этих путей в результате вторичной адаптации к получению необходимых метаболитов в «готовом» виде из содержащей разнообразную органику среды термального источника.

Гораздо более простыми по сравнению с Thermoproteales путями метаболизма обладают проанализированные нами представители порядка Desulfurococcales, - D.

kamchatkensis и T. cellulolyticus. Они имеют одни из наименьших геномов (1.3-1.4 млн.

нт), среди свободноживущих микроорганизмов и обладают специализированным метаболизмом, осуществляя гидролиз высокополимерных белковых субстратов и полисахаридов. Анализ генома F. fontis, представителя нового порядка Fervidicoccales, показал, что он характеризуется узкоспециализированным метаболизмом, связанным с гидролизом и сбраживанием только белковых субстратов. Видимо, Fervidicoccales представляют собой имеющую общее происхождение с Desulfurococcales линию, которая эволюционировала по пути специализации к росту на сложных белковых субстратах с потерей «ненужных» генов.

В отличие от F. fontis, термоацидофильная кренархея A. saccharovorans не только специфическими особенностями метаболизма. Как и Thermoproteales, А. saccharovorans обладает сразу двумя путями метаболизма глюкозы - Энтнера-Дудорова и ЭмбденаМейергофа. Другой общей чертой А. saccharovorans и Thermoproteales является наличие цикла трикарбоновых кислот, который обеспечивает полное окисление органических веществ в анаэробных условиях в присутствии внешних акцепторов электронов. Редким свойством, не описанным у Desulfurococcales, но также характерным для Thermoproteales, является наличие цикла бета-окисления жирных кислот. Однако, у А. saccharovorans отсутствует характерный для Thermoproteales широкий спектр терминальных оксидаз, а в качестве акцептора электронов могут использоваться только сера или тиосульфат. Представители Acidilobales могут завершать анаэробный цикл углерода, не только расщепляя сложные полимерные субстраты, но и осуществляя минерализацию органических веществ в процессах анаэробного дыхания. В отличие от мезофильных микробных сообществ, в которых процесс анаэробного разложения органических субстратов состоит из нескольких стадий, осуществляемых разными группами микроорганизмов (гидролиз, ферментация, синтрофные реакции и конечное окисление), в высокотемпературных условиях этот процесс может быть осуществлен всего одной группой микроорганизмов, Thermoproteales – в нейтральных горячих источниках и Acidilobales – в кислых.

Особенности метаболизма T. sibiricus, установленные в результате анализа его генома, подтверждают предположение об аборигенном происхождении этой археи из нефтяного резервуара Юрского периода и объясняют ее выживание в этой изолированной экологической нише со времени ее образования. В результате анализа генома были выявлены ферменты, необходимые для деградации полисахаридов и липидов, источником которых могут являться океанические осадки (водоросли как источник агара, ламинарина и целлюлозы), из которых образовалась нефть, а также системы транспорта сахаров в клетку. Эти гены локализованы в виде «островков», вероятно приобретенных в результате горизонтального переноса.

ВЫВОДЫ

Определены полные структуры геномов термофильных архей Acidolobus saccharovorans, Fervidicoccus fontis, Desulfurococcus kamchatkensis, Thermogladius cellulolyticus, Vulcanisaeta moutnovskia, Thermoproteus uzoniensis, Pyrobaculum sp. 1860, Thermofilum carboxydotrophus, и Thermococcus sibiricus.

Анализ геномов кренархей Desulfurococcus kamchatkensis и Thermogladius cellulolyticus, микроорганизмы обладают комплексом ферментов, которые могут обеспечивать гидролиз белковых субстратов и некоторых полисахаридов. В геномах D. kamchatkensis и T. cellulolyticus отсутствуют гены ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, что ограничивает возможности метаболизма этих архей брожением и не позволяет им полностью окислять органические субстраты.

Fervidicoccales, показал, что эта архея обладает специализированным типом метаболизма, осуществляя гидролиз высокополимерных белковых субстратов и их сбраживание с образованием ацетата и водорода.

Анализ генома кренархеи Acidolobus saccharovorans подтвердил правомерность выделения этого микроорганизма в новый порядок Acidilobales филума Crenarchaeota.

В геноме были выявлены пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова метаболизма глюкозы и путь бета-окисления жирных кислот. Наличие окислительного цикла трикарбоновых кислот и ферментативных комплексов, осуществляющих восстановление серы, позволяет Acidolobus saccharovorans помимо сбраживания органических субстратов осуществлять их полное окисление в процессах анаэробного дыхания в присутствии внешних акцепторов электронов. Репликация хромосомы A.

saccharovorans инициируется с двух сайтов инициации репликации и является двунаправленной.

Бета-гликозидаза ASAC1390 из кренархеи Acidolobus saccharovorans является многофункциональным ферментом, обладающим бета-гликозидазной, бетагалактозидазной, бета-ксилозидазной и бета-маннозидазной активностями.

Анализ геномов кренархей Vulcanisaeta moutnovskia, Thermoproteus uzoniensis и Pyrobaculum sp. 1860 порядка Thermoproteales показал, что эти микроорганизмы могут осуществлять окисление органических субстратов в присутствии внешних акцепторов электронов и автотрофно фиксировать CO2. Геномы этих архей кодируют пути Эмбдена-Мейергофа и Энтнера-Дудорова метаболизма глюкозы. Геномные данные указывают на способность Pyrobaculum sp. 1860 использовать широкий спектр акцепторов электронов, в том числе оксид железа и нитрат.

Анализ генома кренархеи Thermofilum carboxydotrophus порядка Thermoproteales показал, что эта архея адаптирована к использованию низкомолекулярных продуктов жизнедеятельности других микроорганизмов. В её геноме отсутствуют гены ферментов путей биосинтеза многих метаболитов. Способность Thermofilum carboxydotrophus к росту на СО с образованием H2 и CO2 обеспечивается мембран-связанной СОдегидрогеназой, кластер генов которой получен путем горизонтального переноса.

В результате анализа генома термофильной эуриархеи Thermococcus sibiricus, выделенной из пластовых вод нефтяного резурвуара в Западной Сибири, были выявлены пути метаболизма, с помощью которых эта архея может использовать различные органические субстраты, включая белки, липиды и полисахариды. Гены ферментов гидролиза полисахаридов и транспорта сахаров в клетку локализованы в геноме в виде кластеров, приобретенных в результате горизонтального переноса.

Особенности метаболизма T. sibiricus подтверждают предположение об аборигенном происхождении этой археи из пластовых вод нефтяного резервуара Юрского периода и объясняют ее выживание в этой изолированной экологической нише со времени ее образования.

Методом пиросеквенирования фрагментов гена 16S рРНК определены составы микробных сообществ семи термальных источников кальдеры вулкана Узон, различающихся температурой и рН воды. Наибольшее разнообразие автотрофных и гетеротрофных микроорганизмов при отсутствии доминирования какой-либо одной группы обнаружено в воде источника Заварзина, имеющего нейтральный рН и умеренно-высокую температуру воды (55-58oС). В высокотемпературном нейтральном хемолитоавтотрофных микроорганизмов, - бактерии Aquificales и археи Pyrobaculum. В источниках с низким рН археи составляют большинство микроорганизмов. В источнике с температурой около 50oС преобладают различные линии архей, не имеющие культивируемых представителей, в кислых источниках с температурой 60oС - ацидофильные кренархеи порядков Sulfolobales и Acidilobales.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Скрябин К.Г., Марданов А.В., Кубланов И.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Определение полной нуклеотидной последовательности генома гипертермофильного микроорганизма. // Доклады Академии наук. 2008 Т. 421. С. 204Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. Выделение и характеристика новой термостабильной ДНК-лигазы из архей рода Themococcus. // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 45. С. 523-528.

3. Ravin N.V., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Kublanov I.V., Kolganova T.V., Lebedinsky A.V., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Complete genome sequence of the anaerobic, protein-degrading hyperthermophilic crenarchaeon Desulfurococcus kamchatkensis. // J. Bacteriol. 2009. V. 191. P. 2371-2379.

4. Kublanov I.V., Bidjieva S.Kh., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A.

Desulfurococcus kamchatkensis sp. nov., a novel hyperthermophilic protein-degrading archaeon isolated from a Kamchatka hot spring. // Int. J. Syst. Evol. Micr.. 2009. V. 59.

P.1743-1747.

5. Mardanov A.V., Ravin N.V., Svetlitchnyi V.A., Beletsky A.V., Miroshnichenko M.L., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Metabolic versatility and indigenous origin of the archaeon Thermococcus sibiricus, isolated from a Siberian oil reservoir, as revealed by genome analysis. // Appl. Environ. Microbiol.. 2009. V. 75. P. 4580-4588.

6. Stekhanova T.N., Mardanov A.V., Bezsudnova E.Y., Gumerov V.M., Ravin N.V., Skryabin K.G., Popov V.O. Characterization of a thermostable short-chain alcohol dehydrogenase from the hyperthermophilic archaeon Thermococcus sibiricus. // Appl.

Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P. 4096–4098.

7. Lyashenko A.V., Bezsudnova E.Y., Gumerov V.M., Lashkov A.A., Mardanov A.V., Mikhailov A.M., Popov V.O., Ravin N.V., Skryabin K.G., Stekhanova T.N, Kovalchuk M.V.

Expression, purification and crystallization of a thermostable short-chain alcohol dehydrogenase from archaeon Thermococcus sibiricus. // Acta Crystallogr. Sect. F Struct.

Biol. Cryst. Commun. 2010. V. 66. P. 655-657.

Марданов А.В., Гумеров В.М., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Характеристика биоразнообразия термофильного микробного сообщества методом параллельного пиросеквенирования. // Доклады Академии наук.

2010. Т. 432. С. 544-548.

9. Mardanov A.V., Svetlitchnyi V.A., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., BonchOsmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. The genome sequence of the crenarchaeon Acidilobus saccharovorans supports a new order, Acidilobales, and suggests an important ecological role in terrestrial acidic hot springs. // Appl. Environ. Microbiol. 2010. V. 76. P.

5652–5657.

10. Perevalova A.A., Bidzhieva S.K., Kublanov I.V., Hinrichs K.U., Liu X.L., Mardanov A.V., Lebedinsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. Fervidicoccus fontis gen. nov., sp. nov., a novel anaerobic thermophilic crenarchaeote from hot springs in Kamchatka, and proposal of Fervidicoccaceae fam. nov. and Fervidicoccales ord. nov. // Int J Syst Evol Microbiol. 2010.

V. 60. P. 2082-2088.

11. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., BonchOsmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of “Vulcanisaeta moutnovskia” strain 768-28, a novel member of the hyperthermophilic crenarchaeal genus Vulcanisaeta. // J. Bacteriol. 2011. V. 193. P. 2355-2356.

Гумеров В.М., Марданов А.В., Белецкий А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин 12.

Н.В. Молекулярный анализ биоразнообразия микроорганизмов в источнике Заварзина, кальдера Узон, Камчатка // Микробиология. 2011. Т. 80. С. 258-265.

13. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Perevalova A.A., Karpov G.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Uncultured archaea dominate in the thermal groundwater of Uzon Caldera, Kamchatka. // Extremophiles. 2011. V. 15(3). P. 365-372.

14. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Beletsky A.V., Prokofeva M.I., BonchOsmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of the thermoacidophilic crenarchaeon Thermoproteus uzoniensis 768-20. // J. Bacteriol. 2011. V.

193. P. 3156-3157.

Голубев С.С., Кононогов С.А., Кудеяров Ю.А., Марданов А.В., Николаева П.Ю., 15.

Равин Н.В., Скрябин К.Г. Метрологическое обеспечение секвенирования молекул ДНК.

// Измерительная техника. 2012. Т. 3. С. 64-68.

Слуцкая Э.С., Безсуднова Е.Ю., Марданов А.В., Гумеров В.М., Ракитина Т.В., 16.

Попов В.О., Липкин В.М. Характеристика новой М42 аминопептидазы из кренархеи Desulfurococcus kamchatkensis. // Доклады Академии наук. 2012. Т. 442. С. 551-554.

Гумеров В.М., Марданов А.В., Колосов П.М., Равин Н.В. Выделение и 17.

характеристика липазы из термоалкалофильной бактерии Thermosyntropha lipolytica. // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48. С. 376-382.

Слуцкая Э.С., Безсуднова Е.Ю., Марданов А.В., Сафенкова И.В., Клейменов 18.

С.Ю., Чеботарева Н.А., Гумеров В.М., Равин Н.В., Скрябин К.Г., Попов В.О. Feзависимая супероксиддисмутаза из новой термоацидофильной кренархеи Aсidilobus saccharovorans: от гена до активного фермента. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 1681-1692.

19. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Slobodkina G.B., Beletsky A.V., BonchOsmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of strain 1860, a crenarchaeon of the genus Pyrobaculum able to grow with various electron acceptors. // J.

Bacteriol. 2012. V. 194. P. 727-728.

20. Mardanov A.V., Kochetkova T.V., Beletsky A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V., Skryabin K.G. Complete genome sequence of the hyperthermophilic cellulolytic crenarchaeon “Thermogladius cellulolyticus” 1633 // J. Bacteriol. 2012. V. 194. P. 4446Марданов А.В., Равин Н.В. Роль геномики в исследовании разнообразия и 21.

эволюции архей. // Биохимия. 2012. Т. 77. С. 965-980.

Смагин В.А., Марданов А.В., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин Н.В. (2010) 22.

Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Thermococcus, способ ее получения и нуклеотидная последовательность ДНК, кодирующая эту ДНК-лигазу. Патент РФ № 2405823 от 10.12.2010г.

Смагин В.А., Марданов А.В., Прокофьева М.И., Бонч-Осмоловская Е.А., Равин 23.

Н.В. (2011) Термостабильная ДНК-лигаза из археи рода Acidilobus. Патент РФ № 2413767 от 10.03.2011г.

Безсуднова Е.Ю., Бонч-Осмоловская Е.А., Гумеров В.М., Марданов А.В., Попов 24.

алкогольдегидрогеназа из археи Thermococcus sibiricus. Патент РФ № 2413766 от 10.03.2011г.

25. Mardanov A.V., Smagin V.A., E.A. Bonch-Osmolovskaya, Ravin N.V. Isolation of new thermostable DNA ligase from the archaeon Thermococcus. Abstracts of the II International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld2007), Seville, Spain. 2007. P. 21.

26. Mardanov, A., Bonch-Osmolovskaya, E., Ravin, N. Molecular analysis of microbial communities from hydrothermal environments of Kamchatka volcanic area in Russia.

Abstracts of the workshop on metabolomics and environmental biotechnology, Palma de Mallorca, Spain. 2008. P13.

27. Gumerov V.M., Mardanov A.V., Chernyh N.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. (2009) Microbial community of high-temperature spring "Burluashy" of Uzon Caldera, Kamchatka peninsula. Abstracts of the 10th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology BAGECO-10, Uppsala, Sweden. 2010. P.210.

28. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. (2010) Molecular analysis of microbial communities of hydrothermal environments of Uzon Caldera.

Abstracts of the International Workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", Petropavlovsk-Kamchatsky, Russia. 2010. P. 18.

29. Ravin N.V., Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Skryabin K.G. Complete genome sequences of ten hyperthermophilic archaea reveal their metabolic capabilities and possible ecological roles. Abstracts of the international conference “Extremophiles 2010”, Azores, Portugal. 2010. P. 185.

30. Mardanov A.V., Gumerov V.M., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. Microbial diversity of thermal springs of Uzon Caldera, Kamchatka, as revealed by 454 pyrosequencing.

Abstracts of the international conference “Extremophiles 2010”, Azores, Portugal. 2010. P.

250.

Марданов А.В., Равин Н.В. Расшифровка геномов термофильных архей:

31.

фундаментальные и прикладные аспекты. Тезисы I международной научнопрактической конференции «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине», Москва, Россия. 2010. C. 86.

32. Mardanov A.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Ravin N.V. (2011) Complete genome sequences of new crenarchaeones isolated from hot springs of Kamchatka revealed their metabolic potentials and possible ecological roles. Abstracts of the 11th International Symposium on Bacterial Genetics and Ecology BAGECO-11, Corfu, Greece. 2011. P. 58.

Марданов А.В., Кадников В.В., Равин Н.В. Геномика и метагеномика 33.

экстремофильных микроорганизмов. Тезисы II международной научно-практической конференции "Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине: геномика, протеомика, биоинформатика", Новосибирск, Россия. 2011. C. 64.

34. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Gumerov V.M., Ravin N.V. Advances in genomic and metagenomic studies of extremophilic microoganisms. Abstracts of the Eight international conference on bioinformatics of genome regulation and structure/systems biology (BGRS/SB’12), Новосибирск, Россия. 2012. P. 198.

35. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Ravin N.V. The impact of genomics on research in diversity and evolution of thermophilic microorganisms. Тезисы 3-й Московской международной конференции «Молекулярная филогенетика MolPhy-3», Москва, Россия. 2012. P. 21.

36. Mardanov A.V., Kadnikov V.V., Ravin N.V. Metagenomic analysis of microbial community inhabiting the deep subsurface thermal waters in Western Siberia. Abstracts of the 14th International Symposium on Microbial Ecology - ISME14, Copenhagen, Denmark.

2012. P. 905.