«Н.Н. АХМЕТСАДЫКОВ, Г.С. ШАБДАРБАЕВА, Д.М. ХУСАИНОВ ТЕХНОЛОГИЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Допущено МОН РК ВУЗ в качестве учебника Книга 3 ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ...»

КАЗАХСКИЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Н.Н. АХМЕТСАДЫКОВ, Г.С. ШАБДАРБАЕВА,

Д.М. ХУСАИНОВ

ТЕХНОЛОГИЯ ВЕТЕРИНАРНЫХ

БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Допущено МОН РК ВУЗ в качестве учебника

Книга 3

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ,

ПРИМЕНЯЕМЫХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И

ПРОФИЛАКТИКИ БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ

БАКТЕРИЯМИ И ПАРАЗИТАМИ

Алматы, 2013 1 УДК 378 (075.8):576.8 ББК 48 я 7 А17 Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М.

А17 Технология ветеринарных биологических препаратов:

Учебник – Алматы: Изд-во "Агроуниверситет", – с.

ISBN 978-601-241-218- В книге 3 учебника для студентов, изучающих курс технологии производства ветеринарных биологических препаратов, приведены материалы для проведения лекционных, лабораторных и практических занятий по вопросам производства биологических препаратов, применяемых для диагностики лечения и профилактики болезней, вызываемых бактериями и паразитами, применяемых при борьбе с заболеваниями животных, встречающихся на территории Республики Казахстан.

Учебник разработан на основе рабочей учебной программы, с использованием материалов отечественных и зарубежных литературных научных источников, нормативных документов, личного опыта, и отвечает требованиям высшей школы. Предназначается для студентов, бакалавров, магистрантов, аспирантов, ветеринаров, биотехнологов, медиков и практических специалистов, работающих в области производства и применения биологических ветеринарных препаратов.

УДК 378 (075.8):576. ББК 48 я Рецензенты:

Заманбеков Н.А., доктор ветеринарных наук, профессор;

Сейдахметова Р.Д., доктор биологических наук Учебник рекомендован к изданию Ученым Советом Казахского национального аграрного университета (протокол № 7 от 14.12. 2009 г.).

ISBN 978-601-241-218- © Ахметсадыков Н.Н., Шабдарбаева Г.С., Хусаинов Д.М., © Изд-во "Агроуниверситет",

ПРЕДИСЛОВИЕ

Обеспечение ветеринарной службы высокоэффективными конкурентноспособными отечественными лечебно-профилактическими препаратами - одна из главных задач в экономике и экологии страны. Выполнение данной задачи предусматривает проведение работ по технологическому и техническому переоснащению производства биопрепаратов на основе достижений биотехнологии.

Биотехнология - управляемое получение целевых продуктов полезных для народного хозяйства, медицины и ветеринарии с помощью биологических агентов: микроорганизмов, вирусов, клеток животных и растений, ферментов и антител. Она базируется на использовании современных методов исследований и технологий, разработке, новых биотехнологических процессов, способов их контроля и управления и определения путей их дальнейшего развития и оптимизации.

Программой мероприятий по развитию агробиологического комплекса, в частности биопромышленности Казахстана, является совершенствование существующих и разработка нового поколения биопрепаратов - поливалентных, комплексных, ассоциированных, субъединичных, синтетических и генно-инженерных вакцин, сывороток и диагностикумов, препаратов для экстренной защиты животных от особо опасных болезней, массовых форм применения.

Технологический уровень производства биопрепаратов в частности, бактериальных вакцин, в последние годы значительно изменился. Этому способствовало, в частности, широкое внедрение глубинного метода выращивания микробов, с помощью которого выпускается большое количество противобактерийных препаратов, при этом осуществляются контроль ряда основных физикохимических и биофизических параметров (температура, рН, подача глюкозы, концентрация биомассы). При изготовлении вакцин одним из наиболее важных аспектов является подбор имунногенных штаммов.

Для серологической диагностики заболеваний (в реакции агглютинации (РА), реакции связывания комплемента (РСК), реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и др.) используются различные антигены, получение которых основано на наработке биомассы и определенной обработке: инактивации, очистке, дезинтеграции, окраске, выделении полисахаридно-полипептидной фракции и пр.

Кроме того, при диагностике и лечении заболеваний животных используются позитивные, лечебно-профилактические, антитоксические сыворотки и приготовленные из них иммуноглобулины.

Данная книга 3 посвящена изучению технологических аспектов получения диагностических и лечебно-профилактических препаратов при заболеваниях бактериальной и паразитарной этиологии.

ТЕХНОЛОГИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ

ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ, ЛЕЧЕНИЯ И ПРОФИЛАКТИКИ

БОЛЕЗНЕЙ, ВЫЗЫВАЕМЫХ БАКТЕРИЯМИ

Сибирская язва (Anthrax) – инфекционная болезнь, вызываемая Bacillus anthracis (Cohn, 1872). Протекает с явлениями септицемии или образованием карбункулов разной величины. Регистрируют ее во всех странах мира. Восприимчивы к заболеванию животные многих видов и человек.

Возбудитель (Bacillus anthracis) – неподвижная, грамположительная, спорообразующая аэробная палочка длиной 5 - 8 мкм, толщиной 1 - 1,5 мкм.

В мазках бациллы располагаются цепочками, одиночно или попарно.

Свободные концы палочек закруглены, концы, обращенные друг к другу, как бы обрублены. Хорошо окрашиваются всеми анилиновыми красками и по Граму. Существует в вегетативной и споровой формах. Споры образуются при доступе кислорода и температуре 15 - 42°С. Микробы хорошо растут при 35 - 37°С на обычных питательных средах при рН 7,2 - 7,6. На МПА образуются характерные колонии R-формы, а также колонии переходных Оформ и карликовых G-форм. При выращивании на средах, содержащих пенициллин, бациллы приобретают форму шаров. Этот феномен получил название «жемчужное ожерелье» и его учитывают при диагностике болезни.

В организме больного животного или при культивировании на искусственных питательных средах, содержащих в большом количестве нативный белок, возбудитель сибирской язвы образует капсулу.

Возбудителя в крови павших от сибирской язвы животных первыми обнаружили французские ученые К.Давен и П.Райе в 1850 г. Резистентность вегетативных форм и спор различна. Вегетативные формы Вас. anthracis не обладают высокой устойчивостью. Споры сибирской язвы выдерживают кипячение (100°С) в течение 5 - 10 мин., сухой жар при t°C 120 - 140 убивает их только в течение 2 - 3 часов. Возбудители сохраняются в земле в течение десятилетий; в сушеном мясе они живут несколько недель, соление мяса убивает их через 1,5 месяца.

Вакцины против сибирской язвы впервые получил Л. Пастер в 1881 г.

Сибиреязвенные вакцины Пастера, Ценковского и некоторые другие обладали существенными недостатками, их нужно было вводить двукратно, а иногда они вызывали сильные поствакцинальные осложнения. Причинами этого являлись, с одной стороны, состояние организма животного во время прививки, с другой — биологические особенности указанных в вакцине. Эти вакцины готовили из микробов, обладающих капсулогенными свойствами, которые несут в себе значительную остаточную вирулентность для лабораторных животных. Поэтому в целях получения более совершенных вакцин против сибирской язвы ученые пошли по пути выделения и отбора наследственно измененных бескапсульных вариантов возбудителя сибирской язвы.

Н. Н. Гинсбург в 1940 г., используя метод рассева на чашках со свернувшейся нормальной лошадиной сывороткой, получил из вирулентной культуры штамма «Красная Нива» вакцинный бескапсульный мутант СТИ-1, который при проверке на лабораторных и крупных животных оказался безвредным и иммуногенным. Вакцину, изготовленную из этого штамма, применяют в нашей стране с 1942 г. Она зарекомендовала себя как высокоиммуногенный препарат.

Таким образом, вместо вакцин, изготовляемых из ослабленных штаммов, полученных в результате воздействия на них температурных факторов, применяют вакцины, изготовляемые из штаммов, характерной особенностью которых является наследственная утрата свойств образовывать капсулу.

Аспорогенный рекомбинантный штамм Bacillus anthracis 55ТПА-1Spo-(pUB110PA-1)-продуцент протективного Аспорогенный рекомбинантный штамм В. anthracis 55ТПА-1SроpUB110РА-1), продуцирующий протективный антиген сибиреязвенного микроба, получен путем трансформации штамма В. anthracis 55Tspo- ДНК гибридной плазмиды pUB110РА-1.

Известные аттенуированные штаммы-продуценты сибиреязвенных антигенов: в России - штамм В. anthracis СТИ-1, в США - В. anthracis V770NP1-R, в Англии - В. anthracis Sterne 34F2 не содержат плазмиды капсулопродукции (рХO2), обуславливающей вирулентность штамма, но содержат плазмиду токсинообразования (рХO1), кодирующую синтез экзотоксина бинарного действия, состоящего из протективного антигена, отечного и летального факторов. Протективный антиген сибиреязвенного микроба обладает основным иммуногенным потенциалом и используется в производстве химических вакцин. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитическим активированным протективным антигеном, образуют токсичные комплексы, запускающие патогенетические механизмы инфекционного процесса и обуславливающие специфическое повреждение тканей макроорганизма. Все компоненты сибиреязвенного токсина имеют очень близкие значения молекулярных масс (83-89 кДа), что является препятствием для их полного хроматографического разделения.

Примеси отечного и летального факторов в препарате протективного антигена, выделенного из аттенуированных штаммов, отражаются на реактогенности изготовляемой на его основе химической вакцины. При использовании подобных средств для специфической профилактики людей нередко возникают побочные реакции в виде аллергии или даже некротических реакций на месте введения препарата.

С развитием генно-инженерных технологий стало возможным получение рекомбинантных штаммов, продуцирующих только протективный компонент сибиреязвенного токсина.

Известные штаммы Escherichia coli HB101, содержащие клонированный ген синтеза протективного антигена (pag) в составе гибридных плазмид pSE24 и pSE36 и штаммы Е.coli JM103, содержащие клонированный ген pag в составе рРА1, рРА2 и рРА4 сконструированы посредством встраивания по сайтам рестрикции BamH1 участка плазмиды pXO1, содержащего ген pag, в векторы pBR322 или pUC19 (для рРА2 и рРА4). Однако данные рекомбинантные плазмиды отличались нестабильностью при функционировании в клетках Е.coli и обеспечивали крайне низкие уровни синтеза протективного антигена. Количество биологически активного белкового продукта, выделяемого из соответствующих штаммов, не превышало 5-10 нг/мл культуры или 1- мкг/мл - в случае использования рРА2. Для сравнения продукция протективного антигена аттенуированным штаммом В. anthracis Sterne 34F составляет 15-20 мкг/мл.

Известеный штамм Е.coli DH5 с клонированным геном pag, синтезирующий протективный антиген не является оптимальной моделью для клонирования протективного антигена сибиреязвенного микроба, что связано с внутриклеточным механизмом секреции данного белка.

Преимущество представителей рода Bacillus в качестве бактериальных хозяев клонированной ДНК заключается в их способности к секретируемому синтезу белкового антигена. Процедура выделения протективного антигена из среды культивирования микроорганизма значительно менее трудоемка.

Новый штамм создан на основе бесплазмидного производного В.

anthracis 55Т, полученного в результате температурной элиминации плазмиды рХО1 из вакцинного штамма В. anthracis 55, используемого в ветеринарной практике. В популяции штамма В. anthracis КМ92(2) отобран спонтанный аспорогенный мутант. В его геном посредством электростимулируемой трансформации введена гибридная плазмида pUB110РА-1, содержащая ген синтеза протективного антигена. Плазмида pUB110РА-1 является дериватом плазмиды pUB110РА, сконструированной нами посредством встраивания участка рХO1, содержащего ген pag, в мультикопийный вектор pUB110 по сайтам рестрикции BamH1.

Морфологические признаки: неподвижные, грамположительные, необразующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: штамм при высеве на твердых питательные среды образует колонии с шероховатой поверхностью и неровным краем (в R-форме); при высеве в питательный бульон - придоный осадок и помутнение среды.

Резистентность к антибиотикам: рекомбинантный штамм резистентен к канамицину. Селективная концентрация антибиотика 25 мкг/мл.

Антигенные свойства - штамм содержит основной иммуногенный антиген сибиреязвенного микроба - протективный антиген, а также поверхностные антигены.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: для штамма характерна низкая активность протеолитических ферментов. Штамм синтезирует протективный антиген, вызывающий формирование специфических иммунологических реакций в живом организме. Уровень продукции протективного антигена сконструированным штаммом в 4 раза превышает продукцию протективного антигена контрольными вакцинными штаммами В. anthracis СТИ-1 и В. anthracis 55.

Плазмидный состав: в геноме сконструированного штамма отсутствуют собственные плазмиды рХO1 и рХO2. Штамм содержит гибридную плазмиду pUB110РА-1 с включенным в ее состав геном pag, детерминирующим синтез протективного антигена сибиреязвенного микроба. Размер гибридного репликона 6,5 т.п.н. Плазмида pUB110PA- содержит по одному сайту для ферментов Bam HI, Hind III и два - для Eco RI.

В делегированной области оказалось по одному сайту для Bam HI и Hind III.

Гибридный репликон несет также детерминанту устойчивости к канамицину.

Патогенные и иммуногенные свойства: рекомбинантный штамм вследствие отсутствия в его геноме основных детерминантов патогенности:

капсулы, отечного и летального факторов, не может вызывать развитие инфекционного процесса в восприимчивом макроорганизме.

Отличительные свойства штамма В. anthracis 55ТПА-1SроpUB110PA-1):

- аспорогенность - дает преимущество при его использовании в качестве продуцента протективного антигена - основного компонента сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы;

- наличие гибридной плазмиды pUB110PA-1 с включенным в ее состав геном pag, детерминирующим синтез основного иммуногена сибиреязвенного микроба - протективного антигена;

детерминирующей синтез отечного и летального токсинов, и рХO2, детерминирующей синтез капсулы - основных факторов патогенности сибиреязвенного микроба;

- высокий уровень продукции (около 70 мкг/мл) протективного антигена сибиреязвенного микроба, являющегося компонентом химических вакцин;

- низкая активность протеолитических ферментов, разрушающих протективный антиген в процессе выделения и очистки;

- стабильность гибридной плазмиды при хранении штамма, культивировании на питательных средах и после пассажей через организм лабораторных животных.

Возможность использования штамма иллюстрируется примером 1.

1. Выделение и очистка протективного антигена из аспорогенного рекомбинантного штамма.

Суточную агаровую культуру штамма В. anthracis 55ТПА-1SроpUB110PA-1) засевают в 5 л L-бульона с добавлением канамицина - мкг/мл; выращивают при температуре 37°С с аэрацией 18 часов. После инкубации добавляют ингибитор протеаз (до 1 ммоль ЭДТА) и фильтруют через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм.

Охлажденный фильтрат концентрируют в 10 раз на установке "Амикон" (США) с картриджем (Millipore, США) с пределом исключения белков с молекулярной массой 30 кДа и диализуют 18 часов против 10 объемов буфера, содержащего 25 ммоль диэтаноламина, 50 ммоль NaCl, 2 ммоль ЭДТА, 30 ммоль KCl (рН 8,9). После диализа осуществляют ионобменную хроматографию препарата на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США).

Затем вновь концентрируют в 10 раз на установке "Амикон", диализуют при тех же условиях и фильтруют через мембранные фильтры. Полученный препарат доочищают с использованием гель фильтрации на Sephacryl 300HR (Сигма-Алдрич, США). Образцы хранят при температуре минус 70°С. Из 5 л бульонной культуры рекомбинантного аспорогенного штамма получается около 300 мкг очищенного протективного антигена.

Основные свойства рекомбинантного штамма, экспрессия клонированного гена pag и стабильность гибридной плазмиды pUB110PA- иллюстрируются следующими примерами:

2. Определение способности к спорообразованию.

Способность к споруляции определяют сравнением жизнеспособности прогретых и непрогретых культур. Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37°С в течение пяти суток на L-агаре, суспендируют в физиологическом растворе. Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65°С в течение 30 минут. До и после прогрева делают высев по 0,1 мл культуры на L-агар. Через 24 часа инкубации при температуре 37°С по отсутствию роста на посевах прогретой культуры судят о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию спор. Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

3. Определение стабильности свойства аспорогенности.

Рекомбинантный аспорогенный штамм В. anthracis 55ТПА-1SроpUB110РА-1) несколько раз (не менее 10) пассируют на питательной среде (L-агар) при температуре 37°С в течение 18-20 часов. После последнего пассажа делают высев на L-агар и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака аспорогенности.

4. Скрининг плазмидных ДНК.

Культуру рекомбинантного аспорогенного штамма В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110РА-1) выращивают 16 часов в BHI-бульоне с добавлением 0,4% глицерина и канамицина (25 мкг/мл) с аэрацией при температуре 37°С. Клетки осаждают центрифугированием при скорости вращения ротора 10000 об/мин и суспендируют в 100 мкл Е-буфера (0,04 М трис-ОН; 0,002М ЭДТА; 15% сахароза, рН-7,9), хорошо перемешивают и добавляют 200 мкл лизирующего буфера (0,05М трис-ОН; 15% сахароза; SDS - 0,03 г/мл в 5N NaOH). Смесь инкубируют на водяной бане при температуре 60°С в течение 30 минут, после чего помещают в ледяную баню на 10 минут и добавляют 50 мкл охлажденного 2М Трис-ОН, а затем 600 мкл охлажденного фенол-хлороформа (1:1), осторожно переворачивают не менее 40 раз. Переносят все содержимое в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 30 минут при скорости вращения ротора об/мин и температуре 5°С. Отбирают верхнюю жидкую фазу и хранят при температуре 4°С.

Препараты плазмидных ДНК и маркеры молекулярных масс (MBI Fermentas) вносят в лунки 0,7% агарозного геля и проводят электрофорез в 0,089 М трис-боратном буфере при силе тока 80 мА в течение 90 минут. По окончании электрофореза гель окрашивают раствором бромистого этидия в концентрации 0,5 мкг/мл в течение 20 минут. Визуализацию ДНК проводят с использованием источника ультрафиолетового света и регистрируют с помощью системы гель-документирования ViTran (ДНК-технология, Россия).

На электрофореграмме образца ДНК, выделенного из тестируемого аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55THA-1SpopUB110РА-1), отмечают отсутствие собственных плазмид сибиреязвенного микроба рХO1 и рХO2 и присутствие гибридной плазмиды pUB110PA-1 на уровне миграции молекулярного маркера около 6,5 т.п.н.

5. Определение протеолитической активности рекомбинантного штамма.

Культуру рекомбинантного - В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110РА-1), и контрольного - В. anthracis Sterne 34F2, штаммов высевают уколом на поверхность специальной среды, содержащей (г/л): бакто-агар - 15,0;

дрожжевой экстракт - 4,0; казеин - 2,0; трис-HCl - 1,21; К2HPO4 - 0,5;

MnSO4·H2O - 0,03; MgSO4·7H2O - 0,4; CaCl2 - 0,08; ZnSO4·7H2O - 0,005;

CuSO4·5H2O - 0,005; (NH4)2SO4 - 2,0; и выращивают в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Оценивают ширину зоны просветления вокруг колоний.

Вокруг колоний рекомбинантного штамма В. anthracis 55ТПА-1SроpUB110PA-1) зоны протеолитической деградации белковых субстратов не превышают 1 мм. Вокруг колоний контрольного штамма, с высокой активностью протеолитических ферментов, на мутном фоне среды образуются зоны просветления шириной до 10 мм.

6. Определение экспрессии клонированного гена pag на основании реакции преципитации на среде с сибиреязвенным -глобулином или антителами к протективному антигену.

рекомбинантного и контрольного вакцинного штаммов переносят уколом на полусинтетическую среду, содержащую (мг/л): CaCl2·2Н2O - 14,7;

MgSO4·7H2O - 9,8; MnSO4·H2O - 0,85; KH2PO4 - 680,0; К2HPO4 - 871,0; аденин - 2,1; урацил - 1,4; L-триптофан - 52,0; L-цистин - 12,0; глицин -15,0; тиамингидрохлорид - 10,0; казаминовые кислоты - 3,6 (рН 6,9); в которую добавляют (г/л): агарозу - 7,5; глюкозу - 20,0; бикарбонат натрия - 72,0 и канамицин (для рекомбинантного штамма) - 25 мкг/мл. Непосредственно во время розлива чашек Петри вносят (мл): нормальную лошадиную сыворотку - 0,6; сибиреязвенный -глобулин - 1,0 или кроличьи антитела к протективному антигену - 2,0. Инкубируют в атмосфере CO2 в течение часов при температуре 37°С. Результаты регистрируют в проходящем свете, отмечая ширину зон преципитации вокруг посевов уколом.

Ширина зоны преципитации у аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110РА-1) составляет около 5,0 мм, у контрольного вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 - 1,5 мм.

7. Определение экспрессии клонированного гена pag на основании исследования белкового состава культуральных фильтратов.

Суточные агаровые культуры тестируемого В. anthracis 55ТПА-1SроpUB110РА-1) и контрольного штаммов засевают в 5 мл бульона, содержащего (г/л): триптон - 33,0; дрожжевой экстракт - 20,0; L-гистидин NaCl - 7,4; Na2HPO4 - 8,0; KH2PO4 - 4,0 (рН - 7,4). В готовую среду добавляют бикарбонат натрия - 7,2 г/л и канамицин (для рекомбинантного штамма) - 25 мкг/мл. Культуры выращивают на ротационной качалке при 37°С 18 часов, затем центрифугируют при скорости вращения ротора об/мин и температуре 5°С в течение 30 минут. Супернатант фильтруют через мембранные фильтры (Millipore, США) с диаметром пор 0,22 мкм и центрифугирования при скорости вращения ротора 13000 об/мин в течение 10 минут надосадочную жидкость удаляют, а осадок разводят буфером для электрофореза, содержащим 0,125 моль Трис-HCl, 4% SDS, 20% глицерола, 2% 2-меркаптоэтанола, 0,03 мМоль бромфенола синего (рН 6,8). Образцы по 15 мкл вносят в лунки 10% полиакриламидного геля. Для определения электрофоретической подвижности используют коммерческие маркеры молекулярных масс (Sigma, США). Электрофорез осуществляют в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 70 мА в течение часов. Полиакриламидные гели окрашивают по инструкции фирмы Amersham и сканируют.

В концентрированных культуральных фильтратах штаммов В. anthracis 55ТПА-1Spo- (pUB110PA-1) и В. anthracis СТИ-1 (контроль) присутствует белок с электрофоретической подвижностью, установленной для протективного антигена (83 кДа). На основании интенсивности полос, соответствующих протективному антигену, продукция данного белка штаммом В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110PA-1) в несколько раз превосходит продукцию протективного антигена вакцинным штаммом В.

anthracis СТИ-1.

8. Определение экспрессии клонированного гена pag на основании результатов иммуноблота с антителами к протективному антигену.

Приготовление культуральных фильтратов тестируемых аспорогенного и контрольного, штаммов и белковый электрофорез осуществляют как описано выше (см. пример 7). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (Hybond-C, Amersham, США) проводят при силе тока 0,4 А и напряжении 100 В в течение 1 часа. После переноса мембрану отмывают в течение 10 минут в буфере (TBS), содержащем 20 мМ трис-ОН, 500 мМ NaCl (рН 7,5) и инкубируют в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 1% бычий сывороточный альбумин в TBS. Затем мембрану выдерживают дважды по 10 минут в буфере (TTBS), содержащем 0,05% твин-20 в TBS (рН 7,5). Инкубацию мембраны со специфическими антителами к протективному антигену в разведении 1: проводят в течение 1,5 часов, после чего дважды по 10 минут отмывают в TTBS. Взаимодействие с мечеными пероксидазой иммуноглобулинами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1:2000 осуществляют в течение 2 часов. После инкубации мембрану выдерживают дважды по 10 минут в TTBS и один раз в TBS.

Окрашивание проводят раствором диаминобензидина в течение 30 минут.

На уровне, соответствующем электрофоретической подвижности для белка с молекулярной массой 83 кДа, отмечается специфическое взаимодействие с антителами к протективному антигену. Взаимодействие белков культуральных фильтратов со специфическими антителами к протективному антигену происходит интенсивнее у аспорогенного рекомбинантного штамма В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110PA-1).

9. Сравнение уровней продукции протективного антигена рекомбинантным и контрольным штаммами с использованием дот-анализа.

Препараты культуральных фильтратов готовят как описано выше (см.

пример 7) и наносят по 3 мкл в двукратных разведениях на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США), инкубируют в течение 1 часа в блокирующем растворе, содержащем 1% БСА в TBS.

Мембрану отмывают в буфере TTBS и инкубируют в течение 1 часа с кроличьими антителами к протективному антигену в разведении 1:100, затем в течение того же промежутка времени с мечеными пероксидазой антителами диагностическими против кроличьих иммуноглобулинов (Sigma, США) в разведении 1:2000. После 15 минут отмывки в буфере TTBS окрашивают раствором диаминобензидина в течение 30 минут.

По результатам дот-анализа рекомбинантный штамм В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110PA-1) продуцирует протективного антигена в 4 раза больше, чем контрольные вакцинные штаммы В. anthracis СТИ-1 и В.

anthracis 55.

10. Определение стабильности гибридной плазмиды in vitro.

Стабильность гибридной плазмиды оценивают согласно следующим методикам: 1) выращиванием в течение нескольких генераций в бульоне с добавлением селективного антибиотика или без него; 2) чередованием циклов развития в присутствии канамицина (25 мкг/мл) и без него. Во втором случае культуру штамма В. anthracis 55ТПА-1Sро- выращивают в бульоне с добавлением канамицина (25 мкг/мл) до середины логарифмической фазы, затем разводят 1:100 средой без антибиотиков и продолжают выращивать до конца логарифмической фазы. После периода инкубации культуру высевают на твердую питательную среду для образования изолированных колоний. По 100 клонов переносят методом реплик параллельно на среды с добавлением антибиотика и без селективного давления. Подсчитывают процент клонов, выросших на чашках с селективной средой.

В процессе пассажей (10 и более суточных пересевов) на средах с антибиотиком 100% тестированных клонов штамма В. anthracis 55ТПАSро- (pUB110PA-1) сохраняют устойчивость к канамицину. В процессе чередующихся пассажей на средах с антибиотиком и без него частота элиминации гибридного репликона не превышает 5-10%.

Таким образом, получен штамм В. anthracis 55ТПА-1Sро- (pUB110PAявляющийся стабильным экологически безопасным аспорогенным продуцентом протективного антигена. Уровень продукции протективного антигена штамма В. anthracis 55TSpo- pUB110РА-1 превосходит в 4 раза уровень продукции протективного антигена контрольными вакцинными штаммами - В. anthracis 55 и В. anthracis СТИ-1. Заявляемый штамм не содержит собственных плазмид рХO1 и рХO2 и, следовательно, не синтезирует основные факторы вирулентности возбудителя сибирской язвы капсулу, отечный и летальный факторы. Штамм В. anthracis 55ТПА-1Sрообладает низкой активностью собственных протеаз, приводящих к деградации белковых антигенов в процессе выделения и очистки. Указанные свойства полученного штамма свидетельствуют о том, что он может использоваться в качестве не образующего спор эффективного продуцента протективного антигена, являющегося основным компонентом химических сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Штамм Bacillus anthracis KM 92-продуцент сибиреязвенных антигенов Аспорогенный штамм B. anthracis, сохраняющий свойства при хранении и культивировании на питательных средах, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов, является продуцентом различных сибиреязвенных антигенов.

Аспорогенность штамма дает преимущество при его использовании в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Штамм обладает низкой активностью протеолитических ферментов, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз. Штамм является источником различных сибиреязвенных антигенов: антигенов клеточной стенки, протективного антигена, отечного и летального факторов.

Известны штаммы-продуценты сибиреязвенных антигенов, в настоящее время применяемые для производства химических вакцин и диагностических препаратов. Однако перечисленные выше производственные штаммы, как и все представители рода Bacillus, являются спорообразующими. Способность сибиреязвенного микроба к образованию спор при культивировании в лабораторных или промышленных условиях требует соблюдения строгих правил безопасности работы, пренебрежение которыми может привести к обсеменению помещения и оборудования спорами В. anthracis - возбудителя опасного инфекционного заболевания, сибирской язвы. Споры - основная форма сохранения В. anthracis в объектах внешней среды. В воде они сохраняются до 18 лет, в почве - до 300 лет и более. При температуре 120-140oС споры погибают только через 2-3 часа.

Обычные обеззараживающие средства, принятые для работы с необразующими спор видами, на них не действуют. При попадании в благоприятные условия споры прорастают и образуют полноценные вегетативные клетки. Следовательно, использование не способного к образованию спор (аспорогенного) штамма В. anthracis для промышленного или экспериментального выделения сибиреязвенных антигенов более целесообразно.

Заявляемый штамм возбудителя сибирской язвы получен на основе вакцинного штамма В. Anthracis-55 с использованием разработанного нами способа получения аспорогенного штамма В. anthracis.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" (Саратов) под номером КМ92.

Основные свойства штамма В. anthracis KM92:

- аспорогенность штамма дает преимущество при его использовании в качестве продуцентов сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов, так как отсутствует вероятность обсеменения рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы;

- авирулентность подобно вакцинному штамму В. anthracis СТИ является моноплазмидным, т.е. не содержит плазмиды капсулопродукции;

- иммуногенность является источником сибиреязвенных антигенов:

- антигенов клеточной стенки;

- протективного антигена;

- отечного и летального факторов;

- низкая активность протеолитических фермеров, разрушающих белковые препараты на этапах их выделения и очистки, что обеспечивает оптимальный выход белковых сибиреязвенных антигенов и исключает необходимость применения ингибиторов протеаз;

- стабильность сохраняет свойства при хранении, культивировании на питательных средах и после пассажей через организм лабораторных животных.

Морфологические признаки: грамположительные, необразующие спор палочки, капсулы не имеют.

Культуральные признаки: на твердых питательных средах клетки штамма образуют колонии с гладкой поверхностью и ровным краем (в Sформе). При выращивании в жидких питательных средах - равномерное помутнение.

Биохимическая активность штамма и другие свойства: обладает низкой гемолитической и протеолитической активностями, не сорбирует конго красный, не синтезирует и не экскретирует в среду культивирования желтый пигмент. Синтезирует сибиреязвенный токсин. Оптимальная температура роста 37oС, оптимум рН 7,2.

Питательные потребности штамма: является ауксотрофом.

Плазмидный состав: содержит плазмиду токсинообразования (рХО1+ рХO2-).

Определение способности к спорообразованию.

Колонии с посевов, инкубировавшихся при температуре 37oС в течение пяти суток на агаре Хоттингера, суспендируют в физиологическом растворе.

В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis 55.

Пробирки с культурой помещают в водяную баню и прогревают при температуре 65oС в течение 30 мин или при 80oС 10 мин. Наличие роста до прогрева и отсутствие роста после прогрева при высеве по 0,1 мл культуры на агар Хоттингера свидетельствует о неспособности клеток сибиреязвенного микроба к образованию полноценных спор.

Дополнительно способность к образованию спор проверяют при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля. В качестве контроля используют спорообразующий штамм В. anthracis 55. В опытном мазке отмечается отсутствие характерно окрашенных спор.

Определение стабильности свойства аспорогенности.

Штамм несколько раз (не менее 3-х) пассируют на питательной среде (L-агар) при температуре 37oС. После последнего пассажа делают высев на L-агар и проверяют способность к спорообразованию у 20 изолированных клонов. Отсутствие спорообразования у всех тестированных клонов свидетельствует о стабильности признака. После 3-х пассажей на питательной среде проводят 3 пассажа через организм лабораторных животных. Для этого белой мыши вводят подкожно 0,2 мл клеточной суспензии штамма в концентрации 10 млн спор. У павшей особи делают высев из головного мозга и выделяют чистую культуру В. anthracis.

Выделенной чистой культурой возбудителя сибирской язвы в той же концентрации проводят заражение следующей мыши и так повторяют 3 раза.

Затем проверяют признак спорообразования по изложенной выше схеме.

Отсутствие способности к образованию спор свидетельствует о стабильности признака.

Определение протеолитической активности.

Субстратами для определения активности протеолитических ферментов являются казеин и бычий сывороточный альбумин.

Казеиновая среда для определения протеолитической активности содержит (г/л): бакто-агар - 15,0, казеин - 2,0, трис - 1,21, К2НРO4 - 0,5, MnSO4х7H2O - 0,05, MgSO4 - 0,2, CaCl2 - 0,08, ZnSO4х7Н2О - 0,005, CuSO4х5H2O - 0,005, (NH4)2SO4 - 2,0.

Изолированные колонии с помощью петли наносят бляшкой на поверхность казеиновой среды и выращивают в термостате при 37oС в течение 24 часов. На каждую чашку наносят не более 16 колоний. На мутном фоне среды вокруг колоний штамма с высокой активностью протеолитических ферментов образуются зоны просветления шириной до мм. Зоны просветления у штамма с низкой активностью протеолитических ферментов до 1 мм.

Таким образом, получен стабильный аспорогенный штамм В. anthracis KM92, обладающий низкой активностью протеолитических ферментов, который рекомендуется для использования при получении сибиреязвенных антигенов и других биологически активных веществ - компонентов сибиреязвенных вакцин и диагностических препаратов.

Сибиреязвенный нативный протективный антиген Получение антигена сибиреязвенного бактерийного стандартного включает рассев сибиреязвенной культуры, снятие бактерийной массы, ее автоклавирование, высушивание и экстрагирование, фильтрацию и стерилизацию экстракта, с использованием в качестве сибиреязвенных, вакцинных бескапсульных штаммов № 55 и СТИ-1.

А. Техника получения антигена.

Для получения расплодки делают раздельно посев двух штаммов (№ и СТИ-1) во флаконы с МПБ (рН 7,2-7,4), и ставят в термостат на 18- часов при температуре 36-37 С. Одновременно, для контроля, делают посев на МПА, МПБ и МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро.

Бульонную культуру сибирской язвы засевают на чашки Петри или матрасные колбы с 3%-ным агаром, затем тщательно распределяют по поверхности агара. Посевы ставят в термостат при 36-37 С на 24 часа.

Выросшую культуру снимают шпателем, помещают в чашки Петри и убивают в автоклаве при 120 С в течение 30 минут. Затем бактерийную массу высушивают в термостате до постоянного веса. Полученный порошок от двух штаммов (№ 55 и СТИ-1) растирают в ступках, взвешивают с точностью до 1 мг и растворяют физиологическим раствором 1:3000-1:5000.

Экстрагирование осуществляют при 4-6 0 С в течение 24-48 часов, после чего экстракт фильтруют до прозрачности через асбестовый фильтр.

Антиген проверяют на активность, расфасовывают в ампулы или флаконы, и стерилизуют при 120 С в течение 30 минут. На стерильность проверяют высевом на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро. Посевы должны оставаться стерильными при 10-дневном выдерживании в термостате.

Б. Проверка активности антигена.

Стандартный антиген проверяют на активность с шестью сериями активной преципитирующей сибиреязвенной сывороткой, с нормальной сывороткой лошади и с физиологическим раствором. В уленгутовскую пробирку наливают 0,2-0,3 см3 прозрачной преципитирующей сыворотки.

Затем осторожно наслаивают равное количество антигена так, чтобы между компонентами была ясно выражена граница (тонкая прямая линия).

Реакцию считают положительной, если не позднее, чем через 1минуту на границе между компонентами появится тонкое беловатое кольцо. С нормальной сывороткой и физиологическим раствором подобное кольцо не появляется в течение 15 минут.

При исследовании 5 серий сибиреязвенного антигена, полученного по данной методике, образование кольца с положительными сыворотками происходило в пределах 25-47 секунд, что свидетельствовало о высокой активности препарата.

Глубинное анаэробное культивирование штамма В. anthracis на питательной среде, содержащей бикарбонат натрия, осуществляют в ферментере, непрерывно аэрируя культуральную жидкость газом или смесью нескольких газов (аргоном, гелием, азотом и т.п.). При этом нативный протективный антиген можно получать в ферментерах с перемешиванием мешалкой и поверхностной аэрацией культуральной жидкости (КЖ) различными газами или только при барботажном способе перемешивания КЖ. При этом расход газа составляет 0,05-0,40 л/мин на один литр КЖ.

Способ позволяет в 2-4 раза повысить выход сибиреязвенного антигена и сократить сроки его накопления на стадии культивирования до 15-20 ч. табл.

В процессе анаэробного культивирования В. anthracis на ПС, содержащей бикарбонат натрия, культуральную жидкость в ферментере в течение всего процесса культивирования непрерывно аэрируют (продувают, вентилируют) воздухом или любым инертным газом (аргоном, гелием, азотом и т.п.). При атом аэрацию культуральной жидкости осуществляют с удельным расходом газа 0,05-0,040 л/(л х мин).

Указанный способ позволяет в 2-4 раза повысить выход НПА и сократить продолжительность процесса его накоплений до 15-20 ч.

Пример получения сибиреязвенного НПА в ферментерах 0,5 м3 с перемешиванием мешалкой и поверхностной аэрацией КЖ различными газами.

В качестве исходной культуры для получения НПА используют эталонный вакцинный, некапсулирующий, непротеолитический сибиреязвенный штамм СТИ-1. Стерильная питательная среда на основе 3%ного соляно-кислотного гидролизата рыбной муки, кукурузного экстракта с добавлением бикарбоната натрия и других солей вводится в ферментер вместимостью 0,5 м3 (один из вариантов), и в нее добавляется посевной материал в количестве (3-5) х 105 спор на 1 мл. Включается мешалка и на поверхность культуральной жидкости (КЖ) в течение всего процесса культивирования подается через стерилизующий фильтр воздух или азот с удельным расходом 0,2 л/(л х мин). Показатели процесса культивирования и накопления НПА в аппарате 0,5 м3 при поверхностной аэрации КЖ воздухом и азотом приведены в табл. 1.

Пример получения сибиреязвенного НПА в ферментерах 0,5 м3 при барботажном способе перемешивания КЖ воздухом.

Условия проведения культивирования те же, что и в примере 1.

Отличие заключается в том, что в ферментере перемешивание мешалкой и поверхностная аэрация заменены на барботажное перемешивание (аэрацию) КЖ воздухом. Показатели процесса культивирования и накопления НПА в аппарате 0,5 м3 при барботажном способе перемешивания КЖ приведены в табл. 2.

Предложенный способ получения НПА позволяет значительно повысить выход сибиреязвенного антигена (до 1:8) и сократить сроки его накопления на стадии культивирования примерно до l5-20 ч. При этом необходимо отметить, процесс развития культуры СТИ-1 и накопления НПА в ферментере 0,5 м3 при барботажном способе перемешивания КЖ воздухом был несколько продолжительнее и наблюдался более высокий выход биомассы, чем в ферментере с перемешиванием мешалкой и поверхностной аэрацией КЖ. Это было связано с тем, что в примере 2 в ПС для ферментера 0,5 3 вносилось несколько больше глюкозы, чем ПС в примере 1.

Полученный при культивировании вакцинного штамма СТИ-1 в ферментерах вместимостью 0,5 м3 НПА концентрировался, и из него готовилась адсорбированная химическая сибиреязвенная вакцина.

Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка Сыворотку впервые получили Асколи и Валенти в 1910 г.

внутривенной гипериммунизацией лошадей или ослов слабовирулентной культурой сибирской язвы. Ими же была разработана и предложена реакция преципитации.

В 1940 г. Н. М. Никифорова и М. И. Ананьев разработали метод интравенозной гипериммунизации лошадей сибиреязвенной культурой вегетативной формы, убитой формалином. Этот метод позволил устранить неспецифичность получаемой сыворотки. Однако он вызывал повышенную реактивность лошадей на вводимую формолкультуру, а получаемая преципитирующая сыворотка имела меньший срок годности (не два, а один год).

Свойства преципитирующей сибиреязвенной сыворотки и антигена.

Преципитирующая сыворотка содержит специфические антитела — преципитины, связанные с глобулиновой фракцией сывороточных белков.

Антигены, применяемые для реакции преципитации, представляют собой обезвреженные экстракты (в виде коллоидов), полученные из вирулентных микробов возбудителя сибирской язвы или из кож животных, погибших от этой болезни. Антигены весьма Устойчивы. Они не разрушаются при гниении и не изменяют своих свойств в результате воздействия высоких температур вплоть до автоклавирования.

Четкость реакции преципитации зависит от активности и специфичности преципитирующей сибиреязвенной сыворотки. Реакция преципитации протекает по принципу коллоидных реакций. Поэтому важно, чтобы преципитирующая сыворотка и экстракт (антиген) были прозрачны, так как мутные компоненты на границе соприкосновения не позволяют увидеть преципитащюнное кольцо.

Получение сыворотки. Для гипериммунизации берут лошадей в возрасте от 4 до 10 лет массой не менее 350 кг и предварительно исследуют на инфекционные болезни. Здоровых лошадей сначала пятикратно вакцинируют в увеличивающихся дозах вакциной Ценковского, а затем гипериммунизируют.

Приготовление антигена. Штаммы СТИ-1, 55 обладают типичными свойствами, характерными для микробов сибирский язвы. Указанные штаммы хранят в 30%-ном растворе химически чистого глицерина. Для постоянного пользования штаммы выращивают на МПА до спорового состояния, смывают с агара физиологическим раствором и хранят в 30%-ном растворе глицерина во флаконах в холодильнике при температуре 2—4°С.

Штаммы, применяемые для гипериммунизации животных, выращивают как расплодку, так и антиген на гороховом агаре в колбах или в четвертях. Расплодки культивируют в термостате при 36—37°С в течение 18—20 ч.

Антиген, предназначенный для интравенозного введения лошадям, смывают с горохового, агара физиологическим раствором, тщательно шуттелируют, фильтруют через двойной марлевый фильтр и устанавливают концентрацию в 2—3 млрд. микробных клеток в 1 мл по 500 млн.

оптическому бактерийному стандарту. Лошадей гипериммунизируют поочередным введением каждого из сказанных выше четырех штаммов.

Антиген инъецируют интравенозно. Предварительно его подогревают до 36—38°С и вводят интервалами в три дня. При этом обращают внимание на реакцию лошадей на вводимый антиген. Всего делают 16—17 инъекций антигена, постепенно увеличивая дозы с 5 до 70 мл.

Для предупреждения анафилактических явлений антиген, начиная с дозы 10 мл, вводят лошадям дробно, т. е. сначала вводят антианафилактическую дозу, а затем остальное количество антигена.

Для проверки степени нарастания преципитинов, начиная с 8-й инъекции, проводят пробное титрование сыворотки крови каждой лошади.

Сыворотку титруют со стандартным антигеном и параллельно с 2— экстрактами сибиреязвенных кож. В это время в крови продуцентов начинают появляться преципитины. В дальнейшем количество их увеличивается и после 14-й инъекции антигена почти все лошади дают активную сыворотку.

Если положительная реакция преципитации со стандартным антигеном наступает через 20--50 с, а с экстрактами сибиреязвенных кож через 1— мин, то гипериммунизация лошадей считается законченной.

Кровь берут через 9—10 дней после введения антигена или через 9— дней после предыдущего крововзятия, если продуцентам не требуется очередное введение антигена в количестве 800 мл с каждых 50 кг массы лошади после проверки активности преципитирующей сибиреязвенной сыворотки.

Сыворотку получают методом цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринизацией плазмы, которую затем консервируют 0,5%-ным раствором фенола и отстаивают в отстойниках в течение двух месяцев. Отстоявшуюся сыворотку фильтруют сначала через пластинки Ф, а затем через стерилизующие пластинки СФ и расфасовывают в стерильные 50—100-миллилитровые флаконы, закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. На флаконы с сывороткой наклеивают этикетки с указанием названия препарата, биопредприятия, его изготовившего, номера серии, номера контроля, даты изготовления, количества и срока годности.

Сибиреязвенные флуоресцирующие сыворотки Люминесцентно-серологический метод позволяет изучать внутривидовые специфические антигены, характерные для каждой морфологической формы сибиреязвенного микроба, а также дифференцировать Вас. anthracis от ложносибиреязвенных бацилл.

Возбудитель сибирской язвы серологически родствен с многими штаммами аэробных бацилл, поэтому для его идентификации необходимо применять адсорбированную сыворотку.

У молодых бацилл антракса, прорастающих из спор, характеристика антигенов иная, что позволяет их идентифицировать методом иммунофлуоресценции с помощью неадсорбированной сыворотки.

Диагностический набор «ОКВС» состоит из двух сывороток:

адсорбированной и неадсорбированной.

Адсорбированная флуоресцирующая сыворотка ОКВС Приготовление сыворотки. Данную сыворотку готовят из преципитирующей сибиреязвенной сыворотки в несколько этапов:

последовательное адсорбирование сыворотки 12—14-часовыми культурами Вас. pseudoantharacis Вас. anthracoides. Вас. cereus и Вас.

megaterium, контролируемое в непрямой реакции иммунофлуоресценции;

стерилизация фильтрованием, выделение из нее общих глобулинов и их очистка;

метка глобулинов флуоресцеинизотиоцианатом, их очистка и лиофидьная сушка.

Контроль сыворотки. Сыворотка в рабочем разведении должна обеспечивать специфическое свечение бацилл антракса на 2 креста или более, позволяющее при люминесцентной микроскопии четко дифференцировать их от неокрашивающихся посторонних бацилл; не содержать свободного флуорохрома; сохранять люминесцентносерологические свойства не менее трех лет при 2—6 С.

Применение сыворотки. Сыворотку применяют для ускоренного обнаружения некапсулированных бацилл антракса в первичных высевах из различных материалов после 8—10 ч и более выращивания и на последующих этапах исследования.

Сыворотка для идентификации возбудителя сибирской язвы Ранее пригодные для идентификации диагностические препараты получают в большинстве случаев путем многократной адсорбции сибиреязвенных сывороток близкородственными микроорганизмами.

Однако существует возможность получения сыворотки с использованием нативного сибиреязвенного антигена, позволяющей дифференцировать возбудителя сибирской язвы от близкородственных микроорганизмов.

Для этого бесклеточный культуральный фильтрат B. anthracis СТИ концентрируют на ультрафильтрах HLP-10 и РМ-10 в 150 раз, до содержания белка в фильтрате 8-10 мг/мл, затем выделение антигенных компонентов осуществляют гельхроматографией на сверхтонком сефакриле S-300, уравновешенном 0,3 М раствором NaCl с 0,025 М трис-HCL буфером рН 8,4, с регистрацией выхода фракций при = 280 нм, для получения высокоспецифичной сыворотки используют антиген с м.м. более 150 кДа, что соответствует первому пику выхода фракций. Полученная по способу сыворотка к антигену реагирует в реакции иммунодиффузии в геле только с антигенами различных вариантов возбудителя сибирской язвы, что позволяет идентифицировать возбудитель сибирской язвы от близкородственных по антигенным свойствам бацилл.

Для получения сывороток кроликов иммунизируют антигеном с м.м.

более 150 кДа (1 пик), который элюируется в свободном объеме с регистрацией при =280 нм. Животным внутрикожно вдоль позвоночника и внутримышечно в паховые области вводят возрастающие дозы антигена от 250 мкг до 750 мкг с гидроокисью алюминия.

Активность сывороток оценивают в реакции иммунодиффузии в геле с культуральным фильтратом (разведение 1: 4). Животных обескровливают при титре сыворотки 1:8-1:16.

Специфичность сывороток проверяют в реакции иммунодиффузии в геле с выросшими в течение 18 часов на питательном агаре возбудителями сибирской язвы и близкородственными микроорганизмами.

О принадлежности микроорганизма к возбудителю сибирской язвы судят по зоне преципитата, образовавшейся между выросшей культурой и лункой с сывороткой.

1 стадия Получение бесклеточного культурального фильтрата.

B.anthracis СТИ-1 выращивали в 500 мл колбах с 200 мл жидкой питательной среды в течение 21 часа, с шуттелированием 72 об/мин.

Стерилизовали культуральную среду после выращивания в ней B. anthracis фильтрованием через фильтр ДР-045 (фирма "Amicon"). Проверяли на стерильность посевом в жидкие и на плотные питательные среды, затем концентрировали на установке ДС-2 с волоконным фильтратом HLP-10 и РМ-10 в 150 раз. Содержание белка в концентрированном культуральном фильтрате обычно составляло 6-10 мг/мл белка.

2 стадия. Выделение гельхроматографией антигенных компонентов B.

anthracis СТИ.

Фракционирование компонентов культурального фильтрата В.anthraсis СТИ осуществляли в колонке 2х70 см со сверхтонким сефакрилом S-300, который уравновешивали 0,3 М раствором NаСl с 0,025 М трис-НСl буфером рН 8,4, при скорости элюции 25 мл/ч. Выход фракций регистрировали при 280 нм с помощью спектрофотометра "Uvicord SII (ЛКБ, Sweden). Выход фракций регистрировали в виде четырех отдельных пиков. Фракции концентрировали на РМ-10 до исходного объема использованного культурального фильтрата.

3 стадия. Получение сывороток к антигенам отдельных фракций.

Кроликов породы "Шиншилла" весом 2,5-3 кг иммунизировали возрастающими дозами фракций - от 250 до 750 мкг белка на животное, которые вводили с гидроокистью алюминия (Alu Gel фирма "Serwa") через недели, внутрикожно вдоль позвоночника и внутримышечно в обе паховые области.

Активность сывороток проверяли в реакции иммунодиффузии в геле с культуральным фильтратом. Животных обескровливали при титре сывороток 1:8-1:16.

4 стадия. Определение специфичности сывороток, полученных к отдельным антигенам В. anthracis СТИ.

Штаммы В. anthracis и близкородственных микроорганизмов засевали в виде газонов на питательный агар. После 18-часовой инкубации при 37oС против газонов выросших культур в агаре пробивали лунки (диаметром мм), в которые вносили исследуемые сыворотки, чашки оставляли при комнатной температуре. Через 18-24 часа между выросшими культурами и лунками с сывороткой образовывались зоны преципитатов.

После образования преципитатов культуры обеззараживали парами формалина, смывали, чашки фотографировали. При этом сыворотка к антигену фракции 1 культурального сибиреязвенного фильтрата образует зону преципитата только с антигенами В. anthracis как содержащими плазмиды вирулентности (px01, px02), так и с антигенами бесплазмидных сибиреязвенных штаммов.

В отличие от сыворотки к фракции 1 сыворотки к фракции 2 (а также к фракциям 3 и 4 - данные не приведены) и коммерческий сибиреязвенный глобулин образуют зоны преципитатов как с антигенами сибиреязвенных штаммов, так и с антигенами близкородственных микроорганизмов.

Таким образом, сыворотка к высокомолекулярному антигенному комплексу B. anthracis в отличие от сывороток к другим внеклеточным антигенам B. anthracis и коммерческого сибиреязвенного глобулина является высокоспецифичной и может быть использована для идентификации штаммов B. anthracis как содержащих плазмиды вирулентности, так и бесплазмидных штаммов.

В 1951 г. Мак-Клой получила высокоэффективный специфический бактериофаг, выделив его из лизогенного штамма бациллы цереуса. С тех пор различные авторы, используя методику Мак-Клой, получили около десяти отдельных линий фагов как из лизогенных культур бацилл антракса и цереуса, так и из почвы.

Проба с сибиреязвенным бактериофагом основана на его взаимодействии с сибиреязвенной культурой, в результате чего наступает лизис последней. Эта реакция высокоспецифична и применяется для идентификации возбудителя сибирской язвы и дифференциации его от ложносибиреязвенных бацилл.

Биопредприятия выпускают два сибиреязвенных бактериофага К ВИЭВ и Гамма МВА.

Приготовление вакцины. Вакцину СТИ готовят из эталонного штамма, который поддерживают в 30%-ном растворе химически чистого глицерина.

Для получения расплодки эталонного штамма вакцины применяют мясо-пептонный бульон, содержащий 120 мг% общего азота с рН 7,2. После выращивания бульонной расплодки в термостате в течение 20 ч и проверки на чистоту и типичность роста ее засевают на питательный агар в большие бутыли (четверти) в количестве, достаточном для овлажнения всей поверхности агара.

Агар готовят из мясного кислотного гидролизата, содержащего мг% общего азота. После посева бутыли в вертикальном положении помещают в термостат при температуре 34°С для выращивания и спорообразования. Через 3 дня культуру выборочно исследуют в раздавленной капле и в окрашенном мазке на полноценность спорообразования. К этому времени обнаруживается 80—85% полноценных спор от числа бациллярных форм. Для ускорения процесса спорообразования в марлево-ватные пробки четвертей с культурой вводят шприцем 2 мл скипидара, после чего четверти опять ставят в термостат на одни сутки.

Затем культуру выборочно микроскопируют для определения степени спорообразования. Количество спор должно составлять 95—100% в поле зрения микроскопа. Все четверти просматривают макроскопически на чистоту и типичность роста, вакцина должна давать сплошной рост колоний R-формы с сухим сероватым оттенком. После просмотра делают смыв вакцины стерильным физиологическим раствором по 200 мл на каждую четверть. Споровую культуру вакцины отсасывают закрытым способом в стерильные промеренные бутыли с бусами через сифон с марлевым фильтром. Смытую культуру шуттелируют в течение 1,5 - 2 ч, после чего из нее берут пробу для определения концентрации жизнеспособных спор и проверки на чистоту. Полученную бактериальную массу ставят в холодильник при 2—4°С.

После получения результатов контроля споровую бактериальную массу при изготовлении жидкой вакцины помещают в реактор с 30%-ным раствором стерильного глицерина из расчета получения концентрации жизнеспособных спор, равной 25—35 млн. в 1 мл. Приготовленную серию вакцины расфасовывают во флаконы емкостью 50—100 мл, закрывают их стерильными резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками. На каждый флакон наклеивают этикетку, на которой указывают название вакцины, биопредприятия-изготовителя, номер серии и контроля, дату изготовления, срок годности препарата и дозы вакцины для животных разных видов. Флаконы вакцины хранят до окончания ее проверки в отделе биологического контроля при температуре от 2° до 15°С. Срок годности жидкой вакцины СТИ — 2 года.

От каждой серии вакцины СТИ отдел биологического контроля отбирает по десять флаконов, из них пять используют для контроля, а пять для хранения в архиве при температуре 2—15°С в течение трех лет.

Изготовление сухой вакцины СТИ (выращивание в мясо-пептонном бульоне и агаре в четвертях, смыв споровой культуры с агара, шуттелирование) проводят методом, изложенным при изготовлении жидкой вакцины СТИ.

Для изготовления сухой вакцины СТИ после 10-дневного выдерживания споровой бактериальной массы в холодильнике, при 2—4°С и проверки ее на чистоту роста отстоявшуюся в бутылях жидкость декантируют, а осадок спор переносят в 16-литровую бутыль, содержащую стерильное обезжиренное молоко, взятое в качестве защитной среды в равных соотношениях (1:1). После чего вакцину тщательно смешивают и расфасовывают по 2 мл в ампулы. Расфасованную вакцину замораживают в специальных морозильных камерах при 30—40°С в течение 5—7 ч, а затем высушивают из замороженного состояния в условиях глубокого вакуума в специальных мощных вакуумных аппаратах сначала при минусовой температуре (- 20—25°С), а затем при постепенно повышающейся плюсовой температуре (от 0° до 30—35°С). Процесс лиофилизации вакцины продолжается 35 ч. После окончания высушивания ампулы с вакциной запаивают под вакуумом. Степень полноценности высушивания проверяют определением в препарате количества остаточной влажности, которое не должно превышать 2—2,5%. Ампулы с вакциной маркируют с обозначением номера серии, названия биопрепарата, биопредприятия-изготовителя и даты изготовления.

Ампулы с сухой вакциной СТИ после проверки на вакуум при помощи аппарата д'Арсонваля упаковывают в картонные коробки, на которые наклеивают этикетки с указанием наименования биопрепарата, биопредприятия-изготовителя, номера серии и контроля, даты изготовления, срока годности и дозы для животных разных видов. На этикетке указывают количество кипяченой воды для растворения вакцины, содержащейся в каждой ампуле. После растворения в 1 мл вакцины должно содержаться млн. жизнеспособных спор. В архив отдела биологического контроля отбирают 20 ампул из них 10 используют для контроля, а 10 хранят при температуре 2—15°С в течение четырех лет.

Вакцину СТИ применяют для профилактических и вынужденных прививок животным однократно подкожно.

Контроль вакцины. Перед выпуском каждую серию жидкой и сухой (после растворения) вакцины СТИ проверяют на чистоту роста, концентрацию жизнеспособных спор; безвредность и иммуногенную активность.

На чистоту роста вакцину проверяют путем высева на питательные среды: мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, мясо-пептоннопеченочный бульон под вазелиновым маслом, а также на среды Сабуро или Чапека. За посевами наблюдают в течение десяти дней. Все посевы должны быть чистыми и иметь типичный рост вакцинного микроба.

На безвредность вакцину СТИ проверяют подкожным введением трем кроликам массой 2—2,5 кг по 3 мл каждому. Все животные должны остаться живыми. У некоторых животных возможно появление незначительного отека.

На иммуногенную активность жидкую и сухую сибиреязвенную вакцину СТИ проверяют на десяти морских свинках массой 400—450 г. Ее вводят подкожно, первый раз в дозе 0,1 мл, а через 8 дней повторно в дозе 0, мл. Через 12 дней после 2-й инъекции десять привитых вакциной морских свинок и десять контрольных заражают 2-й вакциной Ценковского (матрикс № 71) в дозе 500—800 тыс. спор подкожно. За животными наблюдают в течение десяти дней с момента заражения. Вакцина считается иммуногенной, если из 1 десяти вакцинированных морских свинок останутся живыми минимум восемь, а из десяти контрольных минимум восемь погибнут в течение 3—4 суток. Вакцину Ценковского (матрикс № 71), применяемую для заражения морских I свинок при контроле сибиреязвенных вакцин, выпускаемых биопредприятиями, высылает с соответствующим паспортом ВГНКИ.

Вакцина против сибирской язвы из штамма B. anthracis В предлагаемом способе изготовления вакцины против сибирской язвы, культивирование осуществляют в реакторе с добавлением пеногасителя пропинол Б-400, концентрирование бактериальных спор осуществляют с помощью натриевой соли карбоксилметилцеллюлозы (КМЦ), с целью повышения иммуногенной активности, вакцина дополнительно содержит протективный антиген (ПА) сибиреязвенного микроба. ПА сибиреязвенного микроба может быть сорбирован на носителе или находиться в простой смеси со спорами вакцинного штамма Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ.

Соотношение компонентов следующее: ПА сибиреязвенного микроба (из суспензии 10 млрд спор/см 3 ) – 0,5 мл, геля гидроокиси алюминия более – мг, живых спор Bacillus anthracis штамма 55-ВНИИВВиМ (10 млрд. спор/см ) – 10 мл. При этом одна прививочная доза содержит 40-60 млн живых спор.

Состав жидкой споруляционно-ростовой среды (мас.):

Панкреатический гидролизат казеина 3,0-5, Панкреатический гидролизат мяса говядины 20,0-25, Дрожжевой экстракт сухой 0,2-0, Пептон ферментативнывй сухой 0,2-0, Калий фосфорнокислый двузамещенный 0,04-0, Кальций хлористый 0,004-0, Магний сернокислый 0,03-0, Цинк сернокислый 0,0005-0, Медь сернокислая 0,0005-0, Железо сернокислое 0,00005-0, Аммоний сернокислый 0,15-0, Пропинол Б-400 0,05-0, Вода деминерализованная (рН 7,2 0,2) – остальное.

Кроме того, используют иные условия культивирования. В первые 18 ч барботирования, уровень аэрации составляет 20-40 см воздуха на 1 л среды в 1 ч, скорость вращения мешалки 200-300 об/мин при температуре 37-38 0 С, при этом 95-100 % выросших бактериальных клеток образуют споры. Затем аэрирование прекращают и культуру выдерживают 6 ч до завершения спорообразования и полного лизиса вегетативного материала.

Сокращение времени на концентрирование спорового материала достигается использованием в качестве вспомогательного вещества натриевой соли: карбоксиметилцеллюлозы (Na КМЦ) в оптимальной концентрации 0,2-0,3 %. Кроме того, осаждение спор осуществляют непосредственно в реакторе при температуре 15-20С в течение 23-25 ч.

Пример получения сибиреязвенной вакцины в 250-литровом реакторе.

Выращивание культуры штамма 55-ВНИИВВиМ и получение спор.

В реакторе (250л) приготавливают 160 л споруляционно-ростовой среды по прописи (см. выше). Реактивы растворяют в той же последовательности, в которой они написаны. Устанавливают рН среды 7, 0,2 добавлением 25 %-ного раствора гидроокиси калия или натрия. Среду стерилизуют при 0,7-0,8 атм., 134 С в течение 30 мин и охлаждают до 30- В реактор с питательной средой заливают через пробоотборник посевной материал, споровую суспензию штамма 55-ВНИИВВиМ, в количестве 1,5-3,0 10 12 жизнеспособных спор, что составляет 1-2 спор на см 3 среды. Весь посевной материал должен содержаться в объеме 2л.

Устанавливают температуру инкубирования 37 С, в засеянную питательную среду подают сжатый воздух через барботер, уровень подачи воздуха 20-40 см 3 воздуха на 1 л среды в 1 ч.. Культивируют 18ч.

Следующие 6 ч инкубируют без аэрации.

Культура вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ, выращенная в этих условиях, состоит из зрелых жизнеспособных спор, количество которых в 1см 3 составляет 450-500 млн.

Осаждение спор в культуре вакцинного сибиреязвенного штамма 55ВНИИВВиМ осуществляют непосредственно в реакторе.

В реактор, содержащий 160 л споровой культуры штамма 55ВНИИВВиМ с концентрацией спор 450-500 млн/см 3 заливают через пробоотборник 16л 2%-ного раствора Na КМЦ, простерилизованного при С в течение 1 ч и охлажденного до 15-20 0 С. Содержимое реактора перемешивают и оставляют в состоянии покоя на 23-25 ч. По истечении этого времени надосадок осторожно декантируют, а осадок тщательно перемешивают и сливают в отдельный сосуд, например 20-литровую стеклянную бутыль. Осадок в количестве 10-15 л содержит 9-11 млрд.

жизнеспособных спор/см 3 легко ресуспендируется и его используют для изготовления вакцины против сибирской язвы животных. В этих условиях происходит 10-15 кратное концентрирование спорового материала.

Протективный антиген получали после разрушения 10 млрд. споровой суспензии ультразвуком при 15-35 КГц 30-80 Вт/см 2 в течение 20-30 минут при рН 9,0. Способ дезинтеграции позволяет использовать внутриклеточные антигенные детерминанты, играющие большую роль в формировании антитоксического иммунитета.

К концентрированному споровому материалу добавляют ПА, исходя из соотношения компонентов: ПА сибиреязвенного микроба (из суспензии млрд спор/см 3 ) – 0,5 мл, геля гидроокиси алюминия более – 25 мг, живых спор Bacillus anthracis штамма 55-ВНИИВВиМ (10 млрд. спор/см 3 ) – 10 мл.

комбинированную вакцину из штамма 55-ВНИИВВиМ разводят буферным раствором до концентрации с содержанием 50 доз в объеме 1 мл, разливают в ампулы и отпаивают без вакуума.

Использование предлагаемого способа изготовления вакцины из штамма 55-ВНИИВВиМ по сравнению с существующими способами обеспечивает следующие преимущества: позволяет изготавливать в реакторах большие объемы спор штамма 55-ВНИИВВиМ и концентрировать их, соблюдая условия стерильности; сокращает время на изготовление спорового материала в 2 раза, а на концентрирование спор в 5 раз; позволяет проводить концентрирование спор в широком диапазоне температуры (15- С); дает возможность увеличить выход спор с 1 см 3 питательной среды в раза; увеличивает выход протективного антигена, позволяет получать жидкую концентрированную комбинированную вакцину, вызывающую и антитоксический иммунитет.

Вакцину применяют для профилактических и вынужденных прививок животных однократно, строго подкожно. Молодняк, не достигший 3месячного возраста, прививать вакциной не разрешается.

Овцам и козам вакцину вводят в области внутренней поверхности бедра в бесшерстный участок в дозе 10-12,5 млн в объеме 0,5 см 3. Лошадям, крупному рогатому скоту, оленям, верблюдам и ослам вакцину вводят в области средней тре5ти шеи в дозе 20-25 млн спор в объеме 1,0 см 3, а свиньям в области в области внутренней поверхности бедра или предплечья в дозе 1,0 см 3. Кожу на месте введения вакцины предварительно дезинфицируют 70 %-ным спиртом или 3 %-ным раствором фенола.

Профилактические прививки лошадей, крупного и мелкого рогатого скота в неблагополучных по сибирской язве зонах рекомендуется проводить 2 раза в год – весной и осенью. Другие виды животных, а также всех животных благополучных по сибирской язве зон рекомендуется прививать один раз в год в период наилучшего физиологического состояния организма животных.

Сухая комбинированная сибиреязвенная вакцина Сущность заключается в использовании для приготовления сухой формы комбинированной сибиреязвенной вакцины протективного антигена, получаемого из микробной культуры Bacillus anthracis штамма-продуцента 55/5, выборе эффективной среды высушивания и лиофилизации препарата.

При этом увеличивается срок хранения вакцины (до 4 лет) и расширяется температурный режим хранения (до плюс 25oС в течение месяца) при доставке вакцины потребителю.

Сухая комбинированная сибиреязвенная вакцина состоит из следующих компонентов:

- сорбированного ПА, получаемого из Bacillus anthracis штамма 55;

- спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1;

- геля гидроокиси алюминия.

Одна прививочная доза вакцины (в объеме 0,5 см3) содержит (40...60) млн спор штамма СТИ-1, (30...40) ИД50 ПА, не более 0,2 мг общего азота, не более 2,5 мг окиси алюминия, не более 0,0005% формальдегида и (18...22) мг сахарозы.

Выбор штамма-продуцента протективного антигена.

Аттенуированный высокоиммуногенный бескапсульный штамм Bacillus anthracis 55 был получен из гетерогенной (до 30%) по детерминантам раg, lef, cya исходной культуры Bacillus anthracis штамма 55 ВНИИВВиМ.

Способ получения включал в себя ряд последовательно выполняемых операций:

- термовоздействие на споры (при температуре плюс 83oС в течение мин);

- пассаж микробных клеток через организм морской свинки;

- отбор на содержащей сибиреязвенный глобулин и бикарбонат-ион (индуктор синтеза токсина) плотной питательной среде Тох+ - клонов с наиболее выраженной зоной иммунопреципитации;

- тестирование методом полимеразной цепной реакции ДНК клеток на полноразмерность и целостность детерминант протективного антигена, летального и отечного факторов (раg, lef, cya) и отбор генетически полноценного Тох+ - клона 5;

- приготовление стабилизированной споровой однородной культуры В.

anthracis штамма 55, обладающего высокой и стабильно воспроизводимой продукцией защитного антигена.

Антигенную активность ПА определяли в реакции диффузионной преципитации с сибиреязвенным иммуноглобулином, а иммуногенность на белых мышах путем расчета ИД50.

В сравнении со штаммом Bacillus anthracis СТИ-1, использование штамма Bacillus anthracis 55 позволяет стабильно получать как нативный, так и концентрированный ПА с более высокими иммунологическими показателями, что обеспечивает возможность его использования для приготовления жидкого полуфабриката комбинированной вакцины и последующего лиофильного высушивания.

Выбор оптимальной среды высушивания.

В качестве протектора при приготовлении сухих форм иммунобиологических препаратов используется сахароза, отличающаяся хорошим защитным эффектом. Так как в состав комбинированной вакцины входит чувствительный к колебаниям температуры ПА, необходимо было определить, какое влияние оказывает сахароза при его высушивании.

Концентрат ПА, лиофильно высушенный с добавлением сахарозы в различной концентрации, оценивали по показателю антигенной активности в реакции диффузионной преципитации с иммуноглобулином и содержанию ИД50. Анализ полученых результатов показывает, что при лиофильном высушивании ПА с добавлением сахарозы в конечной концентрации 8...10% по объему антигенная и иммуногенная активность препарата практически сохраняется на исходном (до высушивания) уровне.

Способ приготовления сухой комбинированной сибиреязвенной вакцины.

Споровую суспензию Bacillus anthracis штамма СТИ-1 разводят стерильным физиологическим раствором до концентрации 0,8...1,2 млрд спор/см-3. Полученную суспензию смешивают со стерильным 40%-ным раствором сахарозы в объемных соотношениях 1:1 и тщательно перемешивают в течение 15...20 мин. Концентрат сорбированного ПА разводят стерильным физиологическим раствором до содержания ИД50/см-3. Равные объемы приготовленных компонентов объединяют и тщательно перемешивают. В приготовленном жидком полуфабрикате комбинированной вакцины должно содержаться 200... 300 млн спор/см -3 и 180...220 ИД50/см-3 ПА. Приготовленный полуфабрикат вакцины разливают по 2 см3 (10 прививочных доз) в ампулы вместимостью 6 см3 или флаконы объемом 10 см3. В процессе розлива содержимое емкости с приготовленным полуфабрикатом перемешивают каждые 20...25 мин с целью получения однородного состава препарата.

Лиофильное высушивание вакцины осуществляют в камерных сушильных установках, обеспечивающих нижеуказанный режим:

- температура замораживания суспензии - минус 35...40oС;

- время выдерживания - 3...4 ч;

- разряжение в сублиматоре - 20...25 Па;

- досушивание материала при температуре плюс 30...32oС в течение 10...12 ч.

Влияние температуры хранения на иммуногенные свойства сибиреязвенного ПА.

Влияние температуры хранения на иммуногенные свойства ПА Bacillus anthracis штамма 55/5, сорбированного на геле гидроокиси алюминия, изучали в опытах на лабораторных животных. В опыте использовали лиофильно высушенный в 10% сахарозе сорбированный ПА. Контролем служил исходный жидкий сорбированный препарат. Из полученных данных следует, что процесс лиофильного высушивания с криопротектором (сахароза) не сопровождается снижением иммуногенных свойств препарата.

После хранения при температуре плюс 25oС в течение месяца у исходного жидкого сорбированного ПА происходит снижение в 3 раза величины ИД 50.

Вместе с тем, при тех же условиях хранения лиофильно высушенного сорбированного ПА не происходит изменения защитной эффективности препарата (величина ЛД50 практически не изменяется).

Таким образом, показано, что лиофильное высушивание с сахарозой сорбированного ПА Bacillus anthracis штамма 55/5 позволяет сохранить его иммуногенные свойства при температуре плюс 25oС в течение месяца по сравнению с исходным жидким препаратом.

Влияние продолжительности хранения и температуры на иммуногенные свойства и реактогенность жидкой и сухой комбинированных сибиреязвенных вакцин.

В экспериментах использовали жидкую комбинированную вакцину на основе спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и ПА этого же штамма и сухую комбинированную вакцину из спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и ПА Bacillus anthracis штамма 55/5, которые характеризовали по индексу иммунитета (ИИ) на момент приготовления, после хранения в течение 2-х и 4-х лет при температуре плюс 2...6oС, а также после переменных режимов хранения: 4-х лет хранения в условиях субнулевых температур с последующим переводом на режим транспортирования при температуре плюс 25oС в течение 25 суток. Результаты проведенных исследований показывают, что исследуемые жидкая и сухая комбинированные вакцины обладали практически одинаковым защитным эффектом после приготовления.

Таким образом, в результате исследований установлено, что сухая форма комбинированной вакцины из спор Bacillus anthracis штамма СТИ-1 и ПА Bacillus anthracis штамма 55 при заданных сроках ее хранения и транспортирования обеспечивает сохранение умеренной реактогенности в тех же значениях показателей как и у применяемой жидкой комбинированной в нормативные сроки ее хранения.

Ассоциированная вакцина для профилактики сибирской язвы и Ассоциированная вакцина содержит адсорбированный на гидроокиси алюминия инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,5)х109 спор/см3 в физиологическом растворе, 1 М раствор метабисульфита натрия и масляный адъювант. Компоненты вакцины содержатся в сбалансированном соотношении. Лейкоцидинэкзотоксин представляет собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа. Он получен из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ. Ассоциированную вакцину вводят однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2-0,4 см3.

Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза является высокоэффективным препаратом, способным защитить животных одновременно от сибирской язвы и некробактериоза, и по иммуногенности превосходит составляющие ее моновакцины.

Существующие моновакцины применяют независимо друг от друга и не создают иммунитет у животных одновременно против сибирской язвы и некробактериоза.

Сущность изобретения заключается в следующем: ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза содержит инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин, представляющий собой высокоочищенный белок с молекулярной массой 18-20 кДа, полученный из производственного штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ и адсорбированный на гидроокиси алюминия, суспензию живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,2)х109 спор/см3 в физиологическом растворе, 1 М раствор метабисульфита натрия и масляный адъювант при следующем соотношении компонентов, мас.%: адсорбированный на гидроокиси алюминия инактивированный формалином лейкоцидин - экзотоксин с м. м. 18-20 кДа из штамма Fusobacterium necrophorum "0-1" ВИЭВ с содержанием белка 5,5- мг% - 32,0 - 34,0; суспензия живых спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с исходной концентрацией (5-5,2)х109 в 1 см физиологического раствора - 1,0 - 1,2; 1М раствор метабисульфита натрия масляный адъювант – остальное.

Ассоциированную вакцину вводят однократно крупному рогатому скоту, овцам, козам, свиньям и северным оленям внутрикожно при помощи безыгольного инъектора в объеме 0,2-0,4 см3.

Ассоциированную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза готовят следующим образом.

Для получения некробактериозного антигена - лейкоцидин экзотоксина берут производственный штамм Fusobacterium necrophorum "0ВИЭВ, культивируют, инактивируют формалином в конечной концентрации 0,4%, отделяют бакмассу от культуральной жидкости центрифугированием, из культуральной жидкости выделяют экзотоксин, подвергают его высокой очистке ультрафильтрацией на полых волокнах с размером пор 13-17 кДа и концентрируют до содержания белка (по Лоури) 5,5-6,0 мг%. Далее полученный антиген - лейкоцидин - эндотоксин сорбируют на гидроокиси алюминия. Лейкоцидин - эндотоксин содержит 5,5-6,0 мг% белка (лейкоцидина) с молекулярной массой 18-20 кДа. После сорбции антигена на гидрате окиси алюминия проверяют нейтрализацию остаточного количества формалина.

К 32,0 см3 полученного некробактериозного компонента добавляют 2, см3 1 М раствора метабисульфита натрия. Смесь выдерживают 50 мин при t 20-25oС, периодически перемешивая. Затем добавляют 1,2 см суспензии спор сибиреязвенного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ с концентрацией 5 х 109 спор в 1 см3 физиологического раствора и 64,5 см3 масляного адъюванта, например легкое минеральное масло "Маркопол-52". Вакцину эмульгируют в гомогенизаторе при 5000 об/мин в течение 20 мин.

Полученная вакцина представляет собой однородную эмульсию белого цвета.

Полученную по примеру 1 ассоциированную вакцину против сибирской язвы и некробактериоза применяют для профилактических и вынужденных прививок клинически здоровых животных однократно.

Молодняк, не достигший 3-месячного возраста, прививать ассоциированной вакциной не разрешается. Вакцину вводят внутрикожно с помощью безыгольного инъектора в бесшерстный участок тела крупному рогатому скоту и свиньям по 0,4 см3 (2 раза по 0,2 см3) овцам, козам и северным оленям по 0,2 см3.

Устойчивость к заражению сибирской язвой и некробактериозом определяют по величине антител в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) и реакции агглютинации (РА). У привитых овец титр противонекробактериозных антител 1:1024-1:2048, что свидетельствует о наличии иммунитета против сибирской язвы и некробактериоза.

При этом титр антител при введении ассоциированной вакцины значительно выше, чем при применении моновакцин, что свидетельствует о выработке более напряженного иммунитета. В сыворотках крови непривитых животных антител не обнаружено.

Таким образом, ассоциированная вакцина против сибирской язвы и некробактериоза является высокоэффективным препаратом, способным защитить животных одновременно от сибирской язвы и некробактериоза, и по иммуногенности превосходит составляющие ее моновакцины.

Ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец Вакцина содержит суспензию жизнеспособных спор сибиреязвенного вакцинного штамма "55-ВНИИВВиМ" в исходной концентрации 180- млн. спор/см3, культуральное вируссодержащее сырье клонированного вируса оспы овец штамма "НИСХИ" с исходной активностью не менее 5,0 lg ТЦД50/см3 и лактозопептонный стабилизатор. Вакцина характеризуется высокой иммуногенностью, ареактогенностью, безвредностью и стабильностью при хранении.

В настоящее время известна вакцина против сибирской язвы, представляющая собой суспензию живых спор бескапсульного авирулентного вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ "Вакцина против сибирской язвы животных живая споровая лиофилизированная из штамма 55-ВНИИВВиМ".

Известны культуральные вирусвакцины против оспы овец, изготовленные из вакцинных штаммов НИСХИ и ВНИИЗЖ - "Вирусвакцина против оспы овец сухая культуральная" и "Вирусвакцина против оспы овец из штамма ВНИИЗЖ культуральная сухая".

В результате проведенных экспериментов установлено, что ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец, изготовленная из сибиреязвенного штамма 55-ВНИИВВиМ и клонированного штамма НИСХИ вируса оспы овец, создает иммунитет у однократно привитых овец через 10-12 суток одновременно против сибирской язвы и оспы длительностью не менее 12 месяцев (срок наблюдения), при этом по иммуногенности она не уступает моновакцинам, применяемым при этих болезнях, и стабильна при хранении.

Примеры получения.

К 450 см3 культурального вируссодержащего сырья клонированного вируса оспы овец штамм "НИСХИ" с активностью 5,5 lg ТЦД50/см добавляют 50 см3 суспензии спор штамма "55 ВНИИВВиМ" возбудителя сибирской язвы с концентрацией 7,7х109 в 1 см3 и 500 см3 лактозопептонного стабилизатора (пептон - 20%, лактоза - 4%). Смесь перемешивают и лиофильно высушивают до содержания массовой влаги в пределах 1-4%.

Вакцина представляет собой гомогенную пористую таблетку от желтоватого до светло-коричневого цвета.

В экспериментах на морских свинках и овцах показано, что ассоциированная вакцина не уступает по иммуногенности моновакцинам против сибирской язвы и оспы овец, изготовленным из этих штаммов.

Процент защиты морских свинок, зараженных референс-заражающей культурой возбудителя сибирской язвы штамм М-71 через 10-12 суток после вакцинации, составил для ассоциированного препарата 91,2%, а для сибиреязвенной моновакцины - 86,6%. В эти же сроки вакцина предохраняла от заболевания 100% привитых овец, зараженных вирулентным штаммом "Монгольский" вируса оспы овец. Аналогичные результаты были получены при контрольном заражении животных через 12 месяцев после иммунизации.

В результате проведенных экспериментов установлено, что предлагаемая ассоциированная вакцина против сибирской язвы и оспы овец создает у однократно привитых овец напряженный иммунитет к этим инфекциям продолжительностью не менее 12 месяцев и не уступает выпускаемым в настоящее время моновакцинам против этих болезней.

Изучена сохраняемость сухой ассоциированной вакцины при температуре 4±4oС (рекомендуемая температура хранения) и 18±2oС.

Технология изготовления сыворотки против сибирской язвы В качестве антигена для гипериммунизации лошадей-продуцентов используют вегетативную культуру вакционного бескапсульного сибиреязвенного штамма СТИ 1, 55. Гипериммунизацию проводят в два этапа: производят 5 инъекций антигена параллельно подкожно в возрастающих дозах от 0,4 - 0,6 до 4,0 6,0 млрд. микробных клеток и внутрикожно в постоянных дозах 0,4 0,6 млрд. клеток, на втором этапе производят 8 инъекций антигена подкожно в возрастающих дозах от 8,0 12, до 78,0 126,0 млрд. клеток. Интервал между инъекциями 3-4 дня. Через 7- дней после окончания гипериммунизации производят крововзятие от каждого продуцента. Отделяют сыворотку общепринятым методом.

Сыворотку используют для профилактики и лечения сибирской язвы.

Препарат животным вводят подкожно или внутримышечно. Полученная сыворотка обладает высокой протективной и терапевтичной активностью, широким спектром защитного действия в отношении разных вирулентных сибиреязвенных штаммов. Специфическая активность препарата сохраняется в течение 3,5 лет после изготовления.

1. Приготовление антигена для гипериммунизации.

Споровую культуру штамма СТИ-1, 55 высевают во флаконы с МПБ (рН 7,0±0,2) в количестве 0,2-0,3 см3 и посевы инкубируют в течение 18-20 ч при 37-38оС. По истечении этого срока полученную бульонную культуру проверяют макроскопически и микроскопически на чистоту и типичность роста.

После проверки матричной культуры проводят посевы ее в количестве 5-10см3 в стеклянные бутыли-четверти, заполненные на 2/3 объема МПБ.

Посевы инкубируют в течение 18-22 ч при 37-38оС. Выращенную микробную культуру по оптическому стандарту мутности ГИСК им. Л.А.Тарасевича доводят до концентрации 500-100 млн. микробных клеток/см3, проверяют макроскопически и микроскопически на бактериальную чистоту, типичность, после чего используют для гипериммунизации продуцентов для первых шести инъекций.

Для последующих инъекций используют концентрированную бактериальную суспензию штамма СТИ-1, 55. С этой целью полученную бактериальную суспензию штамма СТИ-1, 55 с концентрацией клеток 500млн./см преципитируют калийными квасцами. Квасцы добавляют в количестве 0,1 мас. в виде 4%-ного раствора. Смесь отстаивают в течение 20мин и при помощи сифона отсасывают часть отстоявшейся жидкости (30Концентрированный остаток микробных клеток (см3) используют для дальнейшей гипериммунизации продуцентов.

2. Гипериммунизация лошадей.

Лошадей 3-6 лет массой не менее 350 кг гипериммунизируют по схеме, представленной в табл.1. При этом суточную бульонную культуру штамма СТИ-1, 55 продуцентам вводят в объемах 1, 2, 4, 5, 10, 20 см3 подкожно (инъекции N 1-6) и 1 см3 внутрикожно (инъекции N 1-5), а концентрированный антиген в объемах 40, 50, 60, 80, 100, 120, 150 см (инъекции N 7-13) подкожно.

В процессе обработки схемы гипериммунизации лошадей установлено, что введение антигена в дозах, превышающих максимальные, вызывает резковыраженную нежелательную ответную реакцию организма продуцентов (сильное угнетение, повышение температуры тела, иногда гибель продуцентов). Введение лошадям антигена в дозах меньших, чем минимальные, приводит к получению противосибиреязвенной сыворотки специфической активности, уступающей сыворотке, полученной при использовании вирулентных сибиреязвенных штаммов.

3. Взятие крови.

Через 7-9 дней после окончания гипериммунизации производят первое "рабочее" крововзятие от каждого продуцента. Второе и последующие крововзятия производят через 7-9 дней после введения "рабочей " дозы антигена (41,6-67,2 млрд. микробных клеток), которые вводят через 3-4 дня после очередного крововзятия.

Порядок взятия и обработки крови. Кровь от продуцентов берут в градуированные стерильные бутылки емкостью 15-20 л. Первое крововзятие производят из расчета 8-10 см3, а последующие из расчета 16-20 см3 на 1 кг массы лошади.

Для отделения сыворотки применяют общепринятый метод цитрирования крови с последующим сепарированием и дефибринацией плазмы.

4. Контроль сыворотки на специфическую активность. Контроль сыворотки на активность проводят на трех кроликах, которых после внутривенного введения сыворотки в дозе 2 см3 на 1 кг живого веса заражают культурой вирулентного сибиреязвенного штамма Ч-7 в дозе 10 ЛД50. При выживании минимум двух кроликов из трех привитых сыворотку считают активной.

Сыворотка не теряет своей активности в течение 3,5 лет хранения.

5. Сыворотку используют для профилактики и лечения сибирской язвы.

6. Превентивную активность сывороток определяют в опытах на кроликах и овцах количественным методом в сравнении с активностью сыворотки, полученной с использованием в качестве антигена культур вирулентных сибиреязвенных штаммов, т. е. полученной по используемой в настоящее время технологии. Сыворотки (каждую в отдельности) кроликам вводят внутривенно в неразведенном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8 в дозах из расчета по 2 см3 на 1 кг массы кролика, овцам подкожно в дозах 20, 10, 5 и 2,5 см3 на 1 голову. Одновременно привитых сывороткой и контрольных (непривитых) животных заражают культурой вирулентного сибиреязвенного штамма Ч-7 подкожно в дозе 20 ЛД50. На каждую дозу сыворотки и в контроль берут не менее четырех животных. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 10 сут, после чего окончательно учитывают результаты.

количественным методом в опытах на кроликах. С этой целью сыворотки кроликам вводят внутривенно в неразведенном виде и в разведениях 1:2, 1:4, 1:8. Через 24 ч привитых сыворотками и контрольных (непривитых) животных заражают культурой штамма Ч-7, как при проверке превентивных свойств. На каждую дозу сыворотки и в контроль берут не менее четырех кроликов. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 10 сут, после чего по методу Кербера в модификации Ашмарина рассчитывают ЕД сывороток.

8. Количественным методом (описание метода дано в примере 2) проверены превентивные свойства сывороток, полученных после двенадцатой инъекции антигена (доза 62,4-100,8 млрд.микробных тел), тринадцатой инъекции антигена (доза 78,0-126,0 млрд. микробных тел) и дополнительной четырнадцатой инъекции антигена (доза 93,6-151,2 млрд.

микробных тел). Всего проведено 3 опыта, в которых использовано кроликов. Установлено, что сыворотка, полученная от продуцентов после двенадцатой инъекции антигена, менее активна, чем сыворотка, полученная после тринадцатой инъекции (ЕД50 соответственно 2,0 и 1,0 см3).

Последующая инъекция антигена не приводит к повышению активности полученных от продуцентов сывороток (ЕД50 остается на прежнем уровне, 1,0 см3 ). Следовательно, оптимальная схема гипериммунизации лощадейпродуцентов предусматривает 13 инъекций антигена.

9. Оценка биологических свойств сыворотки (по определению спектра защитного действия в отношении разных штаммов возбудителя болезни).

Спектр защитного действия сывороток, полученных предлагаемым способом и с использованием вирулентных сибиреязвенных штаммов, против 12 вирулентных штаммов возбудителя антракса изучают в опытах на кроликах. С этой целью кроликам внутривенно вводят испытуемые сыворотки (каждую в отдельности) в дозе 2 см3 на 1 кг массы. Одновременно привитых и контрольных (непривитых) животных заражают культурами вирулентных сибиреязвенных штаммов подкожно в дозе ЛД50. Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 10 сут, после чего учитывают опыт.

Проведенные испытания показали, что предлагаемый способ изготовления сыворотки против сибирской язвы обеспечивает получение более эффективного препарата, чем известные способы, с высокой протективной и терапевтической активностью, широким спектром защитного действия в отношении разных вирулентных сибиреязвенных штаммов, сохраняющего свою специфическую активность в течение 3,5 лет после изготовления.

Применение в качестве антигена культуры одного штамма СТИ-1 или 55 по указанной схеме позволяет повысить специфическую активность противосибиреязвенной сыворотки, значительно упростить и удешевить технологию ее производства, исключить возможность заражения сибирской язвой людей и обсеменения окружающей среды спорами вирулентных штаммов антракса, в более короткие сроки (43-57 дней вместо 59-109 дней) получить сыворотку, значительно более эффективно использовать продуценты (очередные крововзятия через 10-12 дней вместо 31-80).

Бруцеллез (Brucellosis) – хроническая инфекционная болезнь животных, сопровождающаяся частыми обострениями и проявляется абортами, яловостью, нарушением репродуктивных функций животных.

Возбудитель. Род Brucella, включает 6 видов: В.abortus – возбудитель бруцеллеза крупного рогатого скота; B.melitensisовец и коз; B.suis – свиней;

B.canis – собак; B.neotome – кустарниковых крыс; B.ovis – инфекционного эпидидимита баранов.

Бруцеллы обнаружил в 1886 г. Брюс, микроскопируя мазки из селезенки солдата, умершего от мальтийской лихорадки, а в 1887г. он выделил чистую культуру и назвал возбудителя Micrococcus melitensis.

Бруцеллы – мелкие коккобактерии (0,3 - 0,6 мкм) или палочки (0,6 мкм), в окрашенных препаратах располагаются одиночно, парами и небольшими группами. Неподвижны, спор не образуют. Мукоидные и гладкие варианты синтезируют нежную капсулу. Хорошо окрашиваются анилиновыми красителями, грамотрицательны. При окраске по Козловскому бруцеллы красные, а другие микроорганизмы и фон препарата зеленого цвета.

Возбудителей бруцеллеза культивируют на сывороточных средах и Хоттингера, МПА, в МПБ. Лучший рост наблюдают на печеночных средах с добавлением глицерина и глюкозы, на среде Д, в состав которой входит рыбный и дрожжевой гидролизах и др. По характеру роста на плотных питательных средах различают S-типичные гладкие, R-измененные шероховатые и М-слизистые варианты колоний. Установлена L-форма бруцелл.

Болезнь распространена по всему земному шару, особенно часто встречается в странах с развитым животноводством.

Восприимчивы все виды животных. Резервуар возбудителя бруцеллеза – больное животное.

При изучении бруцеллеза были испытаны, пожалуй все известные методы диагностики, предложен для практики ряд диагностических реакций.

Однако, пока не найдено способа выявления в короткие сроки всех зараженных животных. Сложность диагностики обусловлена, прежде всего, особенностями самой инфекции, при которой иммунологическое состояние организма на протяжении переболевания постоянно меняется, а показания диагностических реакций, которыми располагает современная наука, становятся позитивными только через 6 - 45 дней и более после заражения.