«VI СЪЕЗД ПО РАДИАЦИОННЫМ ИССЛЕДОВАНИЯМ (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ ТОМ I (секции I–VII) Москва 25–28 октября 2010 года ББК 20.18 Р 15 ОРГАНИЗАЦИЯ-СПОНСОР Российский фонд ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Отделение биологических наук

Радиобиологическое общество

Научный совет по радиобиологии

МЕЖДУНАРОДНАЯ АССОЦИАЦИЯ АКАДЕМИЙ НАУК

МЕЖДУНАРОДНЫЙ СОЮЗ РАДИОЭКОЛОГИИ

VI СЪЕЗД

ПО РАДИАЦИОННЫМ

ИССЛЕДОВАНИЯМ

(радиобиология, радиоэкология,

радиационная безопасность)

ТЕЗИСЫ ДОКЛАДОВ

ТОМ I (секции I–VII) Москва 25–28 октября 2010 года ББК 20.18 Р 15

ОРГАНИЗАЦИЯ-СПОНСОР

Российский фонд фундаментальных исследований

ОРГАНИЗАТОРЫ СЪЕЗДА:

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Федеральный медико-биофизический центр им. А.Н. Бурназяна ФМБА, Медицинский радиологический научный центр Минздравсоцразвития РФ, Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии Россельхозакдемии Р 15 VI Съезд по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность): Тезисы докладов. Том I (секции I–VII). Москва, 25–28 октября 2010 г. – М.:

РУДН, 2010. – 267 с.

В сборнике представлены тезисы докладов на VI Съезде по радиационным исследованиям, в программу которого включены различные аспекты действия ионизирующей и неионизирующей радиации на живые организмы, проблемы радиоэкологии и радиационной безопасности человека и окружающей среды. Съезд приурочен к 25-летию аварии на Чернобыльской АЭС. В ряде докладов подведены итоги 25-летнего изучения последствий аварии, сформулированы прогнозы и основные направления развития дальнейших исследований.

Тезисы публикуются в авторской редакции.

ISBN 978-5-209-03884-9 ББК 20. © Коллектив авторов, © Российский университет дружбы народов, Издательство,

ПЛЕНАРНЫЕ ДОКЛАДЫ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ РАДИАЦИОННОЙ ЗАЩИТЫ ЧЕЛОВЕКА

А.В.Аклеев ФГУН Уральский научно-практический центр радиационной медицины ФМБА России, Челябинск, Россия Появившиеся после 1990 года эпидемиологические и биологические данные позволили усилить ранее сделанные в Публикации 60 МКРЗ заключения, а в некоторых случаях пересмотреть их. В этой связи в 2007 году Международная Комиссия по Радиологической Защите (МКРЗ) опубликовала новые основные рекомендации (Публикация 103). В основу пересмотра ранее принятых положений МКРЗ по обеспечению радиационной безопасности и населения был положен обзор данных о медико-биологических эффектах, опубликованных после выхода Публикации 60, подготовленный Комитетом 1 МКРЗ. Главной задачей Комитета 1 было обеспечение МКРЗ основными заключениями по биологическим радиационным эффектам для практических целей радиационной защиты. В период между этими публикациями МКРЗ по некоторым принципиальным вопросам Комитетом 1 уже были подготовлены следующие рекомендации: Публикация 83 по риску мультифакториальных заболеваний, Публикация 92 по взвешивающим радиационным факторам и Публикация 99 по риску рака при малых дозах.

Обоснование новых Рекомендаций включало анализ современного состояния следующих проблем: 1) взаимодействие радиации с клетками и тканями, 2) тканевые реакции, 3) риск радиационно-индуцированного рака, 4) нераковые заболевания после облучения, 5) риски наследственных заболеваний.

МАЛЫЕ ДОЗЫ ОБЛУЧЕНИЯ И НАНОСТРУКТУРЫ.

Бурлакова Е.Б.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН. [email protected] В исследованиях, проведенных в ИБХФ РАН и подтвержденных в работах других исследователей, выявлен ряд особенностей биологического действия малых доз ионизирующей радиации, а именно: 1). Малые дозы облучения активно влияют на метаболизм животных и человека. 2).В определенных интервалах доз низкоинтенсивное облучение более эффективно, чем острое. 3) Зависимость эффекта от дозы облучения может носить нелинейный, немонотонный, полимодальный характер. 4).Дозы, при которых наблюдаются экстремумы, зависят от мощности (интенсивности) облучения и уменьшаются при ее уменьшении. 5). Облучение в малых дозах приводит к изменению (в большинстве случаев - увеличению) чувствительности к последующему действию повреждающих факторов.

Аналогичные закономерности были получены нами для ряда биологически активных веществ (БАВ) в сверхмалых дозах (СМД) - вплоть до 10 -20 М Мы обратили внимание на общность закономерностей в действии химических и физических агентов в СМД и поведения наночастиц (НЧ). На многих объектах в физике, химии и биологии показано, что переход от макроразмеров к размерам 1-100 нм приводит к появлению качественных изменений в физико-химических свойствах отдельных соединений и получаемых на их основе систем, особенно в дозовых зависимостях.

Добавление даже одной молекулы в НЧ может привести к потере ее характерных свойств.

НЧ обладают высокой активностью, и с ними в широком интервале температур возможно осуществление реакций, которые не идут с частицами макроскопического размера. В НЧ значительное число атомов находится на поверхности, и их доля растет с уменьшением размера частиц, и соответственно увеличивается вклад поверхностных атомов в энергию системы. Действительно, например, дозовая зависимость физикохимических свойств НЧ имеет полимодальный характер, как и для СМД. В биологических объектах поверхностью для образования зародышей новой структурной фазы и ее последующего роста могут быть биологические мембраны, позволяющие молекулам БАВ в СМД собраться и образовать новые структуры зародышевой фазы в тех случаях, когда их размеры и число атомов в наноструктуре отвечает требованиям нанонауки.

Таким образом, рассмотрение данных об особенностях действия наноструктур или СМД физических и химических факторов позволяет объяснить целый комплекс закономерностей, необъяснимых ранее.

РЕПАРАЦИЯ КРИТИЧЕСКИХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК, ВЫЗЫВАЕМЫХ

МАЛЫМИ ДОЗАМИ РАДИАЦИИ, ЯВЛЯЕТСЯ НИЗКОЭФФЕКТИВНОЙ.

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Ионизирующие излучения (ИИ) вызывают нарушения в структуре ДНК, значительная часть которых имеет кластерный характер деструкции с образованием критических повреждений – двунитевых разрывов (ДНР) и перекрестных межнитевых сшивок (МНС) – (повреждения, забываемые радиобиологами). Начальной стадией в репарации ДНР и МНС в клетках млекопитающих является активизация аварийной иерархической сети сигнализации: индуцируются чекпоинт – системы контроля точек клеточного цикла (G1/S, G2/M и S фазы), структурные изменения хроматина, активация ферментов репарации ДНК. Репарация ДНР ДНК происходить механизмами негомологичного связывания концов (NHEJ) и путем вовлечения микрогомологий, располагаемых на концах разрывов, а также гомологичной рекомбинацией (HR).

Репарация ДНР путем NHEJ является ошибочной и функционирует при фазах G0, G1, G и в начале S фазы клеточного цикла. Механизм HR может реализоваться только при S и G2 фазах и обеспечить более точное восстановление ДНР. Элиминация МНС из ДНК сопровождается ошибками, в этом процессе участвуют несколько систем репарации, включая НР. Репарацию ДНР и МНС можно проследить по снижению количества фокусов, создаваемых фосфорилированными -H2AX и 53BP1 на участках хроматина.

Если большие дозы ИИ активируют чекпойнты, которые блокируют S фазу и переходы G1/S, G2/M, то малые дозы (менее 200 мГр) не могут активировать G2/M чекпоинт-арест.

Это означает, что G2/M чекпоинт-арест не поддерживает репарацию ДНР, когда их количество менее чем 10-20 на клетку. ДНР и МНС в ДНК гетерохроматина сохраняются в течение длительного пострадиационного времени, в связи с необходимостью его "вскрытия" для доступа компонентов репарационных систем к поврежденным участкам ДНК. При малых дозах ИИ гетерохроматин еще меньше релаксируется, и доступ ферментов репарации к повреждениям ДНК более ограничен. Например, жесткая упаковка мужского гаплоидного генома, создаваемая протаминами, не способствует активной репарации ДНК, и сперматозоиды не способны репарировать ДНР ДНК. Однако они, имея повреждения ДНК, способны оплодотворять яйцеклетки. Репарация ДНК сперматозоида, в значительной мере, происходит после его проникновения в яйцеклетку.

Таким образом, можно полагать, что клетки млекопитающих не могут обеспечивать эффективную репарацию критических повреждений ДНК, индуцируемых малыми дозами ИИ. Это обусловлено отсутствием индукции G2/M чекпоинт-ареста и наличием ограничений доступа компонентов систем репарации ДНР и МНС к участкам ДНК в составе хроматина.

МОБИЛЬНАЯ СВЯЗЬ И ЗДОРОВЬЕ НАСЕЛЕНИЯ: ОЦЕНКА ОПАСНОСТИ,

СОЦИАЛЬНЫЕ И ЭТИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ

Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России Население впервые живет в принципиально новой техногенной среде обитания:

А. Постоянное круглосуточное принудительное облучение ЭМП РЧ всех групп населения при работе базовых станций, работающих в широком спектре;

Б. Ежедневные, повторные в течение всей жизни, начиная с детского возраста, облучения головного мозга и рецепторных аппаратов вестибулярного и слухового анализаторов, расположенных непосредственно «под лучом» во внутреннем ухе.

Рассмотрены единичные существующие биоэффекты хронического воздействия ЭМП РЧ низких уровней. Однако научных данных для оценки опасности вновь возникших условий воздействия ЭМП РЧ на население крайне недостаточно, а научно обоснованные данные по длительному влиянию на мозг отсутствуют.

В этой связи возникает социальная проблема. Учитывая это обстоятельство, ВОЗ обратилось к Правительствам всех стран придерживаться «Предупредительного принципа», т.е. решать эту уже социальную проблему на государственном уровне.

Особую важность приобретает проблема нормирования. Разрабатываемые нормативы должны быть абсолютно надежными и гарантировать безопасность для здоровья всех групп населения, включая детей, больных. Следовательно, методология нормирования и существующие нормативы ЭМП РЧ в новой электромагнитной обстановке несут и этическую нагрузку. Права на ошибку не имеется.

К сожалению, международные рекомендации и отечественные нормативы не учитывают изменившиеся условия воздействия ЭМП РЧ на население – головной мозг впервые стал критическим органом, а дети попали в группу риска.

Учитывая сложившуюся ситуацию, должно осуществляться максимально полное информирование населения о возможных последствиях при не выполнении рекомендаций по профилактике и защите от воздействия ЭМП.

РИСК ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ И ДРУГИХ ВРЕДНЫХ

ФАКТОРОВ НА ЗДОРОВЬЕ ЧЕЛОВЕКА: ЭФФЕКТЫ, МЕТОДЫ ОЦЕНКИ,

ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

Рассматривается оценка риска (ОР) воздействия техногенных или природных источников вреда (ионизирующее излучение, вредные химические вещества, наноматериалы и др.) на здоровье человека с практическим применением в области обеспечения безопасности населения. Объектом оценки риска являются процессы воздействия на человека, в которых вероятностный (стохастический) характер носит либо само воздействие или (и) проявление вредных эффектов (включая смерть) в здоровье человека.

Современный уровень развития методологии ОР позволяет разработать общую методику ОР, применимую к любому источнику вреда. Частные методики и их упрощенные варианты разрабатываются на основе общей методики. Кратко описываются основные положения такого подхода к развитию методических основ ОР (показатели риска, их определения и расчетные формулы; конкуренция рисков; модели зависимости доза-эффект; разовая и протяженная экспозиция вредному фактору и др.).

Предложен специальный показатель риска, удобный для разработки норм безопасности (НБ) и для сравнения рисков на единой методической основе в разных областях деятельности человека. Описан подход к нормированию риска (установлению НБ и других уровней принятия решений по безопасности). В этом подходе НБ и другие уровни принятия решений устанавливаются последовательно по схеме: основные универсальные НБ основные отраслевые НБ производные (вторичные) НБ в удобных для практического применения показателях. Такой подход к развитию ОР и нормированию позволяет решить актуальную в современных условиях проблему гармонизации НБ как между разными областями деятельности человека, так и между разными странами.

На примере исторического развития радиационных НБ показана принципиальная роль результатов ОР в развитии и обосновании НБ. Внедрение этих результатов в разработку радиационных НБ привело к их ужесточению в десятки – сотни раз.

СОВРЕМЕННЫЕ ЗАДАЧИ РАДИОБИОЛОГИЧЕСКОГО И

РАДИОЭКОЛОГИЧЕСКОГО ОБРАЗОВАНИЯ

Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, кафедра биофизики, Москва, Россия, [email protected] За прошедшие годы после Чернобыльской катастрофы радиобиология и радиоэкология пополнились принципиально новым важнейшим фактическим материалом.

Изучены медико-биологические последствия радиационной аварии, открыты и исследованы не известные ранее эффекты малых доз радиации на организм, разрабатываются научные основы для защиты от их действия. Радиоэкология, помимо проблем радиационного мониторинга окружающей среды, разрабатывает современные методы ведения хозяйственной деятельности, прежде всего, сельского хозяйства на загрязненных радионуклидами территориях.

Однако, несмотря на эти достижения, заметны явные противоречия в трактовке получаемых данных, приводящие к застою в области радиобиологического образования, к неверным выводам о современной послеаварийной ситуации. Речь идет о массовой радиобиологической и радиоэкологической безграмотности населения, в том числе чиновников, работающих в сфере атомной энергии. То же отмечается и в школьном и вузовском образовании. Не преодолена радиофобия или радиоэйфория населения в оценке радиационной безопасности. Еще более обозначилось расхождение в выводах о хроническом действии ионизирующих излучений в малых дозах и при низкой интенсивности. Например, из последнего совместного коммюнике ВОЗ и МАГАТЭ от 24.04.2009 г. вытекает, что территории, попавшие после аварии под радиоактивные осадки, больше не представляют никакой опасности для населения, а жителей достаточно «успокоить практическими советами» и убедить «вернуться к нормальной жизни». Вместе с этим, в книге А. Яблокова, В. и А. Нестеренко «Чернобыль: последствия катастрофы для людей и окружающей среды», представлены данные более 5000 работ, которые полностью противоречат итогам ВОЗ и МАГАТЭ.

Дезинформация и малограмотность должны быть преодолены кропотливым трудом по радиобиологическому образованию всех слоев общества, начиная с раннего возраста. В докладе приводятся доказательства фундаментальности радиобиологии, и оценивается ее вклад в развитие молекулярной биологии и биофизики. Обсуждаются также организационные меры совершенствования радиобиологического образования.

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОТДАЛЕННЫХ

ПОСЛЕДСТВИЙ ЧЕРНОБЫЛЬСКОЙ АВАРИИ.

Пелевина И.И., Алещенко2 А.В., Антощина3 М.М., Кудряшова1 О.В., Лизунова1 Е.Ю., Осипов1 А.Н., Рябченко3 Н.И, Семенова Л.П.2, Серебряный2 А.М.

Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва. Россия. [email protected] Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва. Россия.

Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск. Россия.

Радиобиологические последствия аварии на ЧАЭС, изученные в короткие сроки после катастрофы, подтверждаются и через длительное время. Нами были исследованы в разные сроки последствия аварии на клетках в культуре ткани, мышах, лимфоцитах крови людей, подвергшихся радиационному (и прочим) воздействиям в зоне аварии. Были обнаружены следующие эффекты (в течение первых 10 лет). В культуре клеток ткани возрастала доля клеток с микроядрами (МЯ), увеличивалась радиочувствительность. У мышей увеличивалась радиочувствительность (по выживаемости животных),наблюдалось уменьшение количества эндотелиоцитов в коре головного мозга. Существенно, что все эти эффекты определялись в течение длительного времени после окончания экспозиции и нахождения в чистых, незагрязненных районах. У детей, проживающих на загрязненных после аварии территориях, увеличивалась частота лимфоцитов с МЯ, уменьшалось количество детей с индукцией адаптивного ответа, возрастала частота проявления радиосенсибилизации лимфоцитов после облучения в малых дозах in vitro.

Через 20 и более лет после аварии в крови ликвидаторов частота лимфоцитах с аберрациями хромосом или МЯ не увеличена, но в спектре аберраций хромосом достоверно выше частота аберраций хромосомного типа. В ДНК лимфоцитов ликвидаторов существенно возрастает количество двунитевых разрывов ДНК и существенно повышена концентрация активных форм кислорода.

Делаются выводы: а. нестабильность генома, возникшая в стволовых клетках во время облучения, проявляется в виде повреждений генетического аппарата через весьма длительные сроки после аварии; б. возникает популяция клеток, животных и, вероятно, людей с особыми свойствами, особым фенотипом. Эта популяция более чувствительна к дополнительным воздействиям и у неё понижена способность к адаптивному ответу. У этой популяции наблюдается высокая индивидуальная вариабельность по спонтанному уровню повреждений, радиочувствительности, адаптивному ответу.

ПОРОГ СТОХАСТИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ:

АРГУМЕНТЫ «PRO» И «CONTRA», ПРИКЛАДНАЯ РЕАЛИЗАЦИЯ

Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И.Бурназяна ФМБА России, Основополагающим наблюдением в пользу порога является принципиальное различие биологических эффектов от малых и больших доз радиации в разных аспектах В начале дозовой кривой риска заболеваемости/смертности для лейкоза/рака (справедливо и для мутаций) имеется плато, лежащее недостоверно выше или ниже контроля. За плато следует восходящая ветвь. Протяженность плато возрастает при облучении с низкой мощностью дозы. Доказательства плато: резкое возрастание кривизны дозовой кривой в диапазоне 0 - 400 мГр острого облучения, возрастание оценки ERR/Gy в отдельных стратах по мере движения от конца плато к его началу. В области малых доз превалируют процессы точной репарации и элиминации клеток с поврежденным геномом, в области больших - кластерные повреждения, оксидативный стресс, нестабильность генома, ведущие к усилению радиационных повреждений, гибели и малигнизации клеток.

Теоретические положения о неизбежности смены знака воздействия с отрицательного на положительный при переходе от больших доз к малым (диалектический закон), о правиле Парацельса (нет ядов и лекарств, таковыми их делает только доза) подводят под концепцию порога прочный фундамент.

Аргументы против порога имеют частный характер. Значения ERR/Gy выше 0 в области малых доз недостоверны и связаны с «выскоками». Значение DDREF порядка является следствием выхода за плато при его определении. Аппроксимация данных всего дозового диапазона в разных регистрах линейной зависимостью слишком груба и не устраняет очевидной нелинейности дозового ответа при строгом анализе.

Необходимо отказаться от оценки данных эпидемиологических исследований единым значением ERR/Gy в пользу раздельной линейной аппроксимации данных для малых и больших доз. При этом можно использовать программу Амфит. Особенно важны устранение «выскоков» в стратах, лежащих в диапазоне малых доз, а также выбор контроля (не подходят данные медстатистики по стране или региону или первой дозовой страты или значение, получаемое в результате аппроксимации данных всего дозового диапазона к 0). Наиболее адекватной оценкой является уровень плато. Практический порог определится на пересечении аппроксимаций плато и восходящей ветви.

Компромиссом с ЛБК может стать принятие DDREF намного больше 2.

СЕКЦИЯ I. РАДИАЦИОННАЯ БИОХИМИЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ

РАДИОБИОЛОГИЯ

ДОЗОВЫЙ ХАРАКТЕР ИЗМЕНЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА МУТАНТНЫХ КОПИЙ

МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК В ТКАНЯХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ ОБЛУЧЕННЫХ

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия.

В последнее время растет значительный интерес к состоянию митохондриальной ДНК (мтДНК), как к более уязвимой мишени для генотоксических агентов и возможности ее использования как чувствительного маркера для прогнозирования и диагностики развития различных патологий. Мы провели скрининг мутантных копий мтДНК в клетках тканей и в плазме (внеклеточная мтДНК) мышей (BALB/c), подвергшихся воздействию ионизирующей радиацией (1-5 Гр Х-лучей). Мутации мтДНК определяли по расщеплению CEL-I нуклеазой гетеродуплексов, получаемых путем гибридизации ПЦРампликонов участков мтДНК (ген ND3 и D-loop регион) облученных и контрольных мышей. Одновременно определяли изменение общего количества копий мтДНК (по гену ND4) относительно яДНК (ген GAPDH) методом ПЦР в реальном времени. Результаты указывает наличие повышенного уровня мтДНК с мутациями в клетках тканей и в плазме крови облученных мышей в течение месячного пострадиационного периода (ПП).

Уровень выявляемых мутантных копий во всех случаях зависит от дозы облучения мышей. Установлено, что в тканях мозга и селезенки наибольший уровень мутантных копий мтДНК наблюдается на 8 день после облучения, с последующим снижением к дню ПП. Снижение количества мутантных копий мтДНК в клетках пролиферирующей ткани селезенки, происходит более активно, чем в постмитотической ткани мозга. Вместе с тем, изменения общего количества копий мтДНК в тканях мышей имеют одинаковый характер и остаются на одинаковом уровне в течение ПП. В плазме же этих животных регистрируется повышенный уровень (в зависимости от дозы облучения) циркулирующих мутантных копий мтДНК. Причем, наибольший уровень повышения наблюдается (в отличие от таковой в тканях) на 14 день после облучения. Таким образом, наблюдается интенсивный выброс мутантных копий мтДНК в кровоток из клеток и митохондрий (возможно в результате отсроченной гибели клеток и митофагии органелл). Внеклеточная мтДНК с мутациями в плазме крови облученных мышей, может служить чувствительным биомаркером радиационного поражения, и действия других генотоксических агентов на организм. (Работа поддержана Программой Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине» и грантом РФФИ № 08-04-00163).

ВОЗДЕЙСТВИЕ ТРИТИЯ НА СВЕТЯЩИЕСЯ БАКТЕРИИ

Сибирский Федеральный Университет, Красноярск, Россия МГУ им. Ломоносова, Москва, Россия, [email protected] За последние десятилетия содержания трития в окружающей среде возросло в тысячу раз. По химическим свойствам тритий аналогичен стабильным изотопам водорода и может присутствовать в организме человека. Потенциальная опасность этого радиоизотопа связана с его возможным усвоением генетическим материалом. Поэтому изучение биологических эффектов бета- излучения трития является одной из актуальных задач современной радиобиологии и имеет важное практическое значение для безопасного развития атомной индустрии.

Удобными тестовыми объектами являются морские люминесцентные бактерии.

Для количественной оценки состояния этих микроорганизмов в различных условиях окружающей среды используется интенсивность их свечения.

Целью работы было определение изучение воздействия тритий- содержащих растворов на рост и свечение люминесцентных бактерий, а также накопление трития в клетках бактерий.

Аминокислоту валин, меченую тритием, использовали в составе питательной среды бактерий Р.Phosphoreum из коллекции Института биофизики СО РАН. Меченые аминокислоты получены на кафедре радиохимии МГУ с помощью метода термической активации.

В процессе выращивания бактерий в растворах различных активностей определяли количество бактериальных клеток и интенсивность их свечения, проводили сравнение с контрольным раствором, не содержащим трития. Получены кривые роста культуры бактерий и кинетические кривые их свечения. При активностях 0,25-10,00 кБк/мл наблюдали увеличение скорости роста и свечения по сравнению с контрольным раствором. При бльших удельных активностях трития (300-1000 кБк/мл) наблюдалось подавление роста и увеличение свечения бактерий. Абсолютное накопление трития в клетках увеличивалось с ростом времени воздействия на бактериальную культуру.

Накопление варьировалось от 0 до 40%.

Воздействие трития обсуждается с точки зрения интенсификации процессов перераспределения электронной плотности в среде в результате -распада.

АКТИВАЦИЯ КАСКАДА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В УСЛОВИЯХ

РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОГО АПОПТОЗА

Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, Украина, индуцированного действием различных агентов, есть цистеиновые протеиназы. Поэтому несомненно актуальным вопросом является изучение активности каспаз и кальпаинов в лимфоцитах тимуса крыс на ранних этапах после воздействия ионизирующего излучения.

Экспериментальными исследованиями установлено увеличение через 30 мин после облучения животных в дозе 1,0 Гр активности каспазы-3 и каспазы-6 в 1,26 и 1,3 раза соответственно, в то время как активность кальпаинов в исследованные сроки увеличивалась незначительно (на 11%). Субстратами обеих классов протеиназ является ряд структурных белков цитоскелета и белки, обеспечивающие поддержание структурной целостности ДНК, поэтому активация каспазо- и кальпаин-опосредованного протеолиза вносит определенный вклад в дискоординацию строго упорядоченных клеточных реакций. Конечным проявлением этого процесса есть развитие ряда морфологических признаков, характерных для апоптотической гибели. В связи с этим мы изучали экстернализацию фосфатидилсерина, появление которого на внешней стороне плазматической мембраны, коррелирующее с активацией цистеиновых протеиназ, рассматривается как раннее событие, обеспечивающее быстрое распознавание апоптотических клеток макрофагами. Нами показано увеличение в 1,2 раза популяции лимфоцитов, способных взаимодействовать с фосфолипидсвязывающим белком аннексином V. Расщепление при участии исследованных протеиназ ферментов, задействованных в репарации ДНК и, как непосредственная, так и опосредованная активация клеточных нуклеаз на фоне радиационно-индуцированной дестабилизации генома, приводит к усилению фрагментации ДНК, что подтверждается увеличением количества одно- и двунитевых разрывов в молекуле ДНК (в 1,9 и 2,3 раза соответственно) и накоплением низкомолекулярных фрагментов полидезоксирибонуклеотидов.

Таким образом, апоптоз лимфоцитов тимуса, индуцированный действием рентгеновского излучения, сопровождается активацией каскада протеолитических ферментов, ключевым компонентом которого являются цистеиновые протеиназы.

ОЦЕНКА СКОРОСТИ РЕПАРАЦИИ НАРУШЕНИЙ СТРУКТУРЫ ДНК

ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ОБЕЗЬЯН

ПРИ ГАММА - ОБЛУЧЕНИИ В ДОЗАХ ДО 1,5 ГР

Бартенева С.С., Абросимова А.Н., Ворожцова С.В., Иванов А.А,.Новицкая Н.Н., Институт медико – биологических проблем РАН, Москва, Россия, [email protected].

обусловленной облучением биообъекта в заданной дозе, необходимо учитывать характер ее накопления (мощность дозы). Это необходимо, поскольку ЧХА будет зависеть от скорости репарации, возникающей в облученных клетках непосредственно после радиационного воздействия на их структуры. В результате ЧХА, накопленная к моменту завершения экспозиции биообъекта в одинаковой дозе (но при разной мощности дозы) должна различаться ввиду разного интервала времени действия репарационных механизмов. Это следует учитывать при установлении взаимосвязи между ЧХА и степенью радиационного поражения биообъекта, в частности, при разработке схем биологической дозиметрии. Основные характеристики динамики хромосомных аберраций для исследуемого класса биологических объектов могут быть определены на основе экспериментальных данных по накоплению ЧХА.

Предлагается математическое описание кинетики частоты хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови обезьян, основанное на результатах эксперимента по их облучению с различной мощностью дозы. В качестве источника облучения использовался Cs137. Диапазон доз в эксперименте составлял от 25 сГр до 250 сГр, при мощности дозы 1,4 сГр/час и 20 сГр/час. По полученным данным проведена оценка скорости репарации нарушений структур ДНК лимфоцитов периферической крови. В соответствии с разработанной вычислительной процедурой получены значения ЧХА на момент окончания радиационного воздействия. Проведено сравнение рассчитанных и экспериментально определенных значений частоты хромосомных аберраций на момент окончания экспозиции.

МЕХАНИЗМЫ ФОРМИРОВАНИЯ ХРОМОСОМНЫХ АБЕРРАЦИЙ,

ИНДУЦИРОВАННЫХ ГАММА-ОБЛУЧЕНИЕМ НА G2 СТАДИИ

КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА

Богомазова А.Н., Цховребова Л.В., Шутова М.В., Лагарькова М.А., Киселев С.Л.

Институт общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН, Москва, Россия [email protected] Репарация повреждений ДНК в клетках эукариот происходит в контексте хроматина, что определяет роль эпигенетического статуса хроматина как одного из основных факторов радиоустойчивости клеток. Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) и полученные из них дифференцированные клетки резко отличаются по пространственной организации ядра, конденсации хромосомных территорий, уровню ацетилирования гистонов и являются интересной моделью для исследования влияния эпигенетического статуса хроматина на процесс репарации ДНК.

Для сравнения ответа плюрипотентных и дифференцированных клеток на повреждение ДНК был использован тест на радиочувствительность хромосом на G стадии клеточного цикла. Во всех трех изученных линиях ЭСК человека (чЭСК) частота хроматидных обменов, выявляемых в метафазных пластинках 2 часа спустя гаммаоблучения в дозе 1 Гр, достоверно превышает (в 3 - 4 раза) значения, регистрируемые в фибробластах и фибробласт-подобных клетках, полученных из чЭСК. У чЭСК наблюдается квадратичная дозовая зависимость частоты хроматидных обменов, что говорит в пользу двуударного механизма их образования и, следовательно, негомологичного воссоединения двунитевых разрывов ДНК (NHEJ) как основного способа их формирования. Химическая дезактивация основного фермента NHEJрепарации, ДНК-зависимой протеинкиназы (DNA-PK), при помощи ингибитора NU приводит к резкому повышению в 4 - 6 раз частоты радиационно-индуцированных хроматидных фрагментов в обоих типах клеток. Частота хроматидных обменов в дифференцированных клетках является нечувствительной к действию ингибитора и остается стабильной при использовании различных концентраций NU7026. В чЭСК ингибирование DNA-PK приводит к существенному снижению частоты радиационноиндуцированных обменов до уровня, сходного с наблюдаемым в соматических клетках.

Таким образом, можно заключить, что в чЭСК активность DNA-PK приводит к частому неправильному соединению двунитевых разрывов ДНК, индуцированных облучением на поздней G2 стадии клеточного цикла. Каким образом происходит подавление ошибок NHEJ-репарации и каковы механизмы образования обменных G2аберраций в дифференцированных клетках, будет обсуждено на конференции.

РЕАЛИЗАЦИЯ ПОСТЛУЧЕВЫХ ЭФФЕКТОВ НА УРОВНЕ

АДЕНИЛАТЦИКЛАЗНОЙ СИСТЕМЫ КАРДИОМИОЦИТОВ

Международный государственный экологический университет имени А.Д.Сахарова, Белорусский государственный медицинский университет, Минск, Беларусь, Исследовались эффекты ионизирующих излучений низкой интенсивности и их малых доз, проявляющиеся на уровне аденилациклазной системы кардиомиоцитов белых крыс. Острое облучение в дозе 1,0 Гр (910-4Гр/с) не оказывало влияния на базальную активность аденилатциклазы и снижало ее чувствительность к -адреностимуляторам. В постлучевой период отмечались волнообразные отклонения фтор- и ГТФ-стимулируемой активностей. Пролонгированное облучение в дозе 1,0 Гр (2,810-7 Гр/с) первоначально вызывало повышение, затем снижение базальной активности аденилатциклазы и волнообразные изменения рецептор- и G-белок-опосредованной ее регуляции.

Постлучевые перестройки аденилатциклазной системы кардиомиоцитов зависели от возраста особей и эндокринного статуса организма. В ближайшие сроки после пролонгированного облучения у молодых животных повышалась чувствительность аденилатциклазы кардиомиоцитов к действию -адреностимуляторов, а у зрелых - к активаторам G-белков, при этом проявлялся бимодальный тип регуляции активности АЦ гуанозинтрифосфатами, характерный для ранних стадий онтогенеза. Подобные изменения в АЦС кардиомиоцитов обнаружены при состояниях, характеризующихся ослаблением регуляторных влияний на сердце центральных механизмов. У гипотиреоидных молодых животных ионизирующая радиация вызывала угнетение функции Gs-белков, у зрелых - ингибирование адренорецепторов. Выявлено, что перестройки регуляции АЦС у облученных гипотиреоидных животных разного возраста вызваны исключительно недостатком тиреоидных гормонов.

Таким образом, в облученном организме выявляется комплекс динамически изменяющихся во времени показателей каждого компонента АЦС кардиомиоцитов. В зависимости от мощности облучения и сроков реабилитации изменения, возникшие в АЦС кардиомиоцитов, по величине и направленности совпадали с нарушениями, обнаруженными при стрессе, при старении, а также при некоторых патологических состояниях, что целесообразно учитывать при планировании реабилитационных мероприятий.

АНАЛИЗ ДИНАМИКИ РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННЫХ ФОКУСОВ

БЕЛКОВ РЕПАРАЦИИ ДНК В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЯХ

С РАЗЛИЧНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТЬЮ

Институт экспериментальной онкологии, Братислава, Словакия;

В последние годы все более актуальной становится проблема поиска биомаркеров индивидуальной радиочувствительности, одними из которых являются радиационноиндуцированные фокусы белков репарации ДНК. Целью настоящей работы явился репарации двунитевых разрывов ДНК (H2AX и 53BP1), способности к образованию колоний и продолжительности клеточного цикла (времени удвоения) 9 опухолевых клеточных линий после воздействия -излучением в дозе 2 Гр. Исследовали клеточные линии (RT112, HT1376, UM-UC-3, T24, J82, SKOV-3, A2730, Saos-2 and Saos-2-His-273) из радиочувствительности. Число фокусов белков H2AX и 53BP1 определялось через 4 и часов после облучения с помощью иммунофлуоресценции с последующей детекцией корреляция времени удвоения с выживаемостью клеточных линий после воздействия 2 Гр (R=–0.82, p=0,007), что может быть связано с контролем клеточного цикла и апоптоза.

Кроме того, наблюдалась корреляция числа спонтанных фокусов 53BP1 в отсутствие облучения со временем удвоения (R=–0.75, p=0,019). Клеточные линии с более коротким клеточным циклом характеризовались более быстрой репарацией двунитевых разрывов ДНК (p=0,014) и, вследствие этого, обладали большей способностью к образованию колоний (p=0,027) по сравнению с клеточными линиями с длинным клеточным циклом.

Не было обнаружено значимой корреляции числа фокусов H2AX со способностью к исследованных клеточных линиях, что соответствует литературным данным. Таким образом, анализ динамики радиационно-индуцированных фокусов белка 53BP1 может являться потенциальным биомаркером клеточной радиочувствительности.

ЭФФЕКТЫ ФРАКЦИОНИРОВАННОГО ОБЛУЧЕНИЯ В СУММАРНОЙ ДОЗЕ

2,0 Гр НА КРОВЬ И РЕПРОДУКТИВНУЮ СИСТЕМУ КРЫС-САМЦОВ,

МЕТАБОЛИЧЕСКИЕ И РЕГУЛЯТОРНЫЕ ПРОЦЕССЫ НА ФОНЕ ВВЕДЕНИЯ

ФЕНОБОЛИНА

Верещако Г.Г., Федосенко О.Л., Гунькова Н.В., Козлов А.Е., Якушев Д.Л.

Институт радиобиологии НАН Беларуси, Гомель, Беларусь, [email protected] Изучали влияние фракционированного облучения на организм при введении препарата анаболического действия феноболин. Опыты ставили на крысах-самцах стадного разведения. Облучение животных проводили на установке ИГУР (137Сs, МД 0, Гр/мин) 4 фракциями с интервалом в 3 недели дозами по 0,5 Гр (суммарная доза 2,0 Гр).

Феноболин (2,5 мг/кг) вводили за неделю перед каждой фракцией облучения.

Эксперименты выполняли на 3, 10 и 30 сут после облучения. В крови определяли количество лейкоцитов, лейкоцитарных элементов, эритроцитов и содержание гемоглобина; в сыворотке крови - содержание общего кальция, фосфора неорганического, кальцитонина, паратгормона, кортикостерона, тестостерона, активность ЩФ и ее изоферментов; в семеннике и эпидидимисе - количество сперматогенных клеток.

В различные сроки после облучения наблюдается лейко- и лимфоцитопения, падение числа зрелых половых клеток в ткани семенника и, в большей степени, в эпидидимисе, повышение активности ЩФ и ее изоферментов на 3 и 10 сут и снижение ее к концу месяца, изменение содержания гормонов, регулирующих кальций-фосфорный обмен, а также уровней тестостерона и кортикостерона. Существенные нарушения в крови и репродуктивной системе крыс отмечаются также под влиянием феноболина.

Облучение на фоне применения феноболина сопровождается более значительным поражением кроветворной и репродуктивной систем. Обнаруженные изменения превышают изолированное действие, как радиационного воздействия, так и феноболина.

Совместное действие феноболина и облучения особенно существенно проявлялось в лейко- и лимфопении, снижении количества сперматогенных клеток в семеннике и, особенно, в эпидидимисе, достигающее на 3, 10 и 30 сут после радиационного воздействия 19,4; 33,8 и 31,8% соответственно по отношению к контролю и нарушению гормональной регуляции.

Таким образом, действие изучаемых факторов (радиация, феноболин) как отдельно, так и совместно вызывает глубокие нарушения в кроветворной и репродуктивной системах крыс-самцов, выраженность которых сохраняется длительное время.

ИНКОРПОРАЦИЯ ОБЕДНЕННОГО УРАНА И РЕАКЦИЯ ОРГАНОВ

ПИЩЕВАРИТЕЛЬНОЙ И ЭНДОКРИННОЙ СИСТЕМ

Воронцова З.А., Проскурякова Е.Е., Степанов Д.С., Зюзина В.В., Афанасьев Р.В.

Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, Биологическая экспериментальная модель представлена белыми беспородными половозрелыми крысами-самцами, которым однократно перорально вводили ОУ в водном растворе 0,1 мг на 100 г массы крысы. После эвтаназии животных извлекали щитовидную железу, надпочечники, участки тощей, толстой кишки и околоушной железы спустя один, три и шесть месяцев после воздействия. На криостатных срезах гистохимически выявляли активность фермента щелочная фосфатаза (ЩФ) – светооптическая плотность которого была критерием оценки проницаемости барьерных образований, обеспечивающих транспорт субстратов метаболизма.

Результаты исследований показали гетерогенность и органоспецифичность биоэффектов ОУ на органы эндокринной и пищеварительной систем. Количественная оценка выявила достоверное повышение проницаемости в системе капилляр-тироцит в прямой зависимости от отдаленности сроков. В пучковой зоне коры надпочечников проницаемость возрастала спустя месяц, к третьему – снижалась, а к шестому не отличалась от контроля, обеспечивая нормализацию взаимодействия «капилляр – кортикоцит». Проницаемость щеточной каемки энтероцитов слизистой оболочки тощей кишки снижалась спустя шесть месяцев от начала эксперимента, с предшествующим возрастанием в 1 и 3 месяца. В толстой кишке проницаемость стенки капилляров межкриптальной стромы снижалась спустя 1 и 3 месяца, и восстанавливалась к завершению эксперимента. Состояние периацинарных капилляров околоушной железы в условиях эксперимента показало повышение светооптической плотности ЩФ с большей выраженностью к 3 месяцу, а далее показатели были приближены к контрольным и нежно подчеркивали изменившийся рельеф ослизненных ацинусов.

Таким образом, гистохимические особенности светооптической плотности, определяющие проницаемость, показали зависимость состояния барьерных образований от отдаленности сроков после перорального применения ОУ и предполагают его кумулятивный радиотоксический эффект.

ПРООКСИДАНТНЫЕ СВОЙСТВА ДОЛГОЖИВУЩИХ РАДИКАЛОВ

L-АМИНОКИСЛОТ

Гармаш С.А.1,2, Карп О.Э.1, Гудков С.В. 1,2, Брусков В.И. 1, Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Известно, что под действием ионизирующей радиации образуются долгоживущие радикалы белков, которые обладают существенными прооксидантными свойствами. В данной работе исследована способность L-аминокислот к образованию долгоживущих радикалов аминокислот (ДЖРА), и их потенциальные прооксидантные свойства. С помощью измерения собственной люминесценции исследована способность аминокислот под действием рентгеновского излучения к образованию ДЖРА. По способности образовывать ДЖРА аминокислоты можно разделить на три группы. Группа 1 – не люминесцирующие аминокислоты (Cys, Gly). Группа 2 – умеренно люминесцирующие аминокислоты (Arg, Met, Pro, Phe). Группа 3 – обладающая наиболее интенсивной люминесценцией (Ser, Thr, Val, Ile, Leu). Время полужизни ДЖРА в водном растворе составляет 2-6 часов. Интенсивность люминесценции ДЖРА линейно зависит от поглощенной аминокислотами дозы рентгеновского излучения. Способность ДЖРА к генерации перекиси водорода (Н2О2) в водных растворах исследовали с помощью метода усиленной хемилюминисценции. По способности генерировать Н2О2 все ДЖРА разделены на 3 группы: 1 – способные к высокой продукции перекиси водорода – Val, Leu; 2 – способные к умеренной продукции перекиси водорода – His, Ser, Ile, Thr; 3 – слабо способные к генерации перекиси водорода – Pro, Arg, Met, Phe. Таким образом, установлено, что ДЖРА индуцированные рентгеновским излучением способны генерировать перекись водорода. Полученные данные позволяют предполагать, что ДЖРА могут оказывать влияние на процесс развития радиационного поражения в организме млекопитающих и способствовать длительному протеканию окислительного стресса.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-00800-а; 10-04-00949-а) и Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых (МК-108.2010.4).

БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ ИНКОРПОРИРОВАННОГО 137Cs

И ФИЗИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ИОНОВ КАЛИЯ В ЖИВОЙ КЛЕТКЕ

Гомельский медицинский университет, Гомель, Белоруссия Белорусский медицинский университет, Минск, Белоруссия В регионах, подвергшихся радиоактивному загрязнению в результате аварии на ЧАЭС поступающий в их организм. Данный изотоп, будучи аналогом/антагонистом ионов К+, хорошо растворим в воде, легко проникает через клеточные мембраны и локализуется исключительно внутри клеток.

В модельных экспериментальных исследованиях, проведенных в наших лабораториях, показано, что инкорпорация Cs, формирующего дозовые нагрузки в микро- и миллигреевом диапазоне (!), вызывает резкие структурно-функциональные нарушения со сократительной активности. Наличие в организме именно этого изотопа объясняет целый ряд патологических состояний со стороны сердечно-сосудистой, иммунной и других систем у жителей зараженных регионов.

Значительное сходство этих ионов по основным физико-химическим параметрам, является, по нашему мнению, ключом к пониманию патофизиологических эффектов 137Cs, причем принципиальное значение для понимания патогенетической роли, является вопрос о его физическом состоянии, внутри клеток.

В настоящей работе обсуждаются два варианта: (i) основная часть K+/Cs+ в клетке внутриклеточного K+/Cs+ связана внутриклеточными, преимущественно белковыми структурами. На основании альтернативных представлений о физическом состоянии 137Cs внутри клеток обсуждаются возможные механизмы его повреждающего действия, а также рассматриваются механизмы, объясняющие основной радиобиологический парадокс несоответствие между малым количеством энергии внутреннего обучения от инкорпорированного 137Cs и его огромным повреждающим эффектом.

ИЗУЧЕНИЕ ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ИЗМЕНЕНИЙ В ПРОЦЕССЕ СТАРЕНИЯ

РАСТЕНИЙ LINUM USITATISSIMUM

Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, Украина На сегодняшний день актуальной проблемой остается изучение эпигенетической составляющей старения. Существует две гипотезы: согласно одной, старение сопровождается уменьшением уровня метилирования ДНК, согласно другой – увеличением уровня метилирования ДНК. Наблюдение за изменениями уровня метилирования ДНК в ходе онтогенеза растений даст возможность отследить момент переключения эпигенома, в который происходит запуск программы старения на клеточном уровне. Целью работы было проведение скрининга ганов, экспрессия которых изменяется в процессе старения.

В работе исследовались семядольные листья Linum usitatissimum. Семядольные листья представляют собой ассимилятивный орган, который накапливает питательные вещества. Старение этого органа является наглядной моделью для изучения эпигенетических изменений во всем растении. Для установления влияния стрессового фактора на эпигеном, было использовано УФ – В облучение в трех дозах: 4,23 кДж/м2, 8,46 кДж/м2, 12,69 кДж/м2. Облучали растение на этапе 15 – дневного проростка (тоесть на той стадии, когда были полностью сформированы ассимилятивные органы). Для исследования каждого этапа онтогенеза, которые условно обозначили как: стадия юности, стадия развития, стадия зрелости, стадия предстарения, стадия полного старения, анализировали уровень метилирования ДНК растений.

Уровень метилирования цитозина определяли с помощью рестриктаз HpaII та MspI.

Фермент рестрикции MspI узнает все последовательности CCGG независимо от того, метилированы они или нет, а, HpaII – только немитилированные CCGG – тетраметры. В ходе работы были зафиксированы изменения. Было показано вариирование спектра метилирования в процессе старения семядольных листьев Linum usitatissimum.

БЕЛОК И НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ НЕЙРОНОВ МОЗЖЕЧКА В РАННИЕ

И ОТДАЛЕННЫЕ СРОКИ ПОСЛЕ МАЛЫХ РАДИАЦИОННЫХ ВОЗДЕЙСТВИЙ

Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко Индикатором радиочувствительности клеток является состояние белка и нуклеиновых кислот. При этом изменения их в самом радиочувствительном отделе нервной системы – мозжечке, остаются неизученными. Эксперимент проведен на беспородных белых крысах-самцах массой 200±10 г, обученных на установке «Хизатрон»

гамма-квантами СО в дозах 0,1 и 1,0 Зв однократно или в течении рабочей недели.

Мозжечок забирали через сутки и 18 мес после воздействия. Криостатные срезы окрашивали по Ши и Бонхегу. Количественную оценку содержания белка (всего нейрона), РНК (цитоплазма и ядрышко) и ДНК (ядра) в нейронах коры и подкорковых ядер проводили с помощью компьютерной программы Image J. Морфологически определяли размеры клеток, их цитоплазмы, ядер и ядрышек. Установлено, что через сутки после облучения в нейронах происходит снижение содержания ядерной ДНК и РНК цитоплазмы на фоне снижения их морфометрических показателей. Снижение РНК в ядрышках связано с увеличением их размеров, а также выходом из них рибонуклеопротеидов. Содержание белка в нейронах (в большей степени ганглионарного слоя коры) повышалось на фоне уменьшения размеров клеток. При этом все изменения показателей имели стохастический характер. Через 1,5 года после воздействия содержание белка в нейронах снижалось как по отношению к контрольной группе, так и по отношению к ранним срокам наблюдения.

Интересно, что это снижение было более выражено при облучении в дозе 0,1 Зв, чем в дозе на порядок выше. Содержание ДНК повышалось по отношению к контролю видимо за счет уменьшения объема ядер. Содержание РНК цитоплазмы нейронов увеличивалось, однако площадь цитоплазмы была уменьшенной. Только в группе с фракционированным облучением в дозе 1,0 Зв отмечалось истинное снижение РНК цитоплазмы. Что касается ядрышковой РНК, то ее содержание было несколько повышенным на фоне постоянного их объема. Учитывая, что содержание белка и нуклеиновых кислот тесно связано с морфометрическими показателями соответствующих структур клеток, для окончательного вывода о их изменениях при радиационном воздействии необходим расчет ядерно-клеточного, ядерно-цитоплазматического и ядрышко-ядерного индексов.

ОЦЕНКА УРОВНЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК И АПОПТОЗА СПЛЕНОЦИТОВ

МЫШЕЙ, ИСПЫТАВШИХ ХРОНИЧЕСКОЕ НИЗКОИНТЕНСИВНОЕ

ВОЗДЕЙСТВИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ

Хроническое низкоинтенсивное облучение вызывает изменения в защитных механизмах клеток, таких как систем антиоксидантной защиты, репарации ДНК, регуляции клеточного цикла и апоптоза, что отражается на реакции целостного организма к действию повреждающего фактора. В связи с этим актуальными представляются исследования, направленные на оценку степени поврежденности генома клеток иммунной защиты.

Проведено хроническое облучение белых беспородных мышей при мощности дозы 150 мкГр/ч. в течение 4, 5, 6 и 7 месяцев (дозы, по расчетным данным, составили соответственно 31.6; 36.9; 44,5 и 52.0 сГр). Каждой облученной группе животных соответствовал свой контроль (10 облученных и 10 контрольных мышей в группе).

Проанализирован уровень двунитевых разрывов (ДР) ДНК в спленоцитах с помощью «нейтральной» версии метода «ДНК-Комет», а также количество клеток селезенки, гибнущих по механизму апоптоза (оценка методом «ДНК-Гало»). Показано, что уровень ДР ДНК в спленоцитах облученных животных выше контрольных значений после четырех месяцев облучения и значительно снижается в группе мышей после семи месяцев облучения. В остальных группах этот показатель существенно не отличается от контроля.

Уровень клеток, гибнущих по механизму апоптоза, значительно превышает контрольные значения во всех группах облученных животных. Полученные результаты свидетельствуют об интенсификации процесса селекции клеток в селезенке после хронического облучения и поддержании популяции клеток, более устойчивых к действию повреждающего фактора.

Работа частично поддержана грантом РФФИ № 09-04-90351.

СООТНОШЕНИЕ МТДНК/ЯДНК В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ОБЛУЧЕННЫХ

МЫШЕЙ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ГЕНОТОКСИЧЕСКОГО ГРУЗА

Институт теоретической и экспериментальной биофизики, Пущино, Россия В современной медицине широко используется генотоксические агенты при проведении радиохимиотерапии онкологических больных. Использование высоких доз облучения и цитостатических антибиотиков, помимо разрушения опухоли, может оказать критическое воздействие на организм в целом. В связи с этим, поиск неинвазивных маркеров для оценки клеточной гибели представляет интерес как для практической медицины, так и для фундаментальной биологии. В течение последних лет активно проводится количественное определение фрагментов нуклеиновых кислот в сыворотке крови. Нам кажется, что более перспективным является определение не столько абсолютных значений ядерных и митохондриальных фрагментов ДНК, сколько соотношение мтДНК/яДНК. На основе метода ПЦР в реальном времени проводилась оценка числа копий четырех различных митохондриальных генов (ND2, ND4, CYTB, ATP6), а также регуляторной области мтДНК – Д-петли, в ядросодержащих клетках крови контрольных и облученных в дозе 1 и 10 Гр мышей. Несмотря на то, что при облучении мышей в дозе 1 Гр не наблюдается массовой гибели ядросодержащих клеток крови по типу апоптоза, содержание мтДНК в клетках крови снижается в два раза, по сравнению с контролем уже через час после облучения. В сыворотке крови облученных в дозе 1 Гр мышей в эти же сроки происходит увеличение количества фрагментов митохондриальных генов по сравнению с содержанием фрагмента ДНК ядерного гена бета-актина. При облучении мышей в летальной дозе 10 Гр в ядросодержащих клетках крови происходит увеличение количества митохондриальной ДНК в три раза по сравнению с контролем. В той же степени, что и число копий мтДНК, в первые часы после облучения изменяется и число транскриптов всех перечисленных митохондриальных генов. В сыворотке крови мышей после облучения в дозе 10 Гр резко увеличивается количество фрагментов ядерного гена бета-актина, однако количество фрагментов мтДНК возрастает в гораздо меньшей степени. В результате, соотношение мтДНК/яДНК в сыворотке крови значительно снижается по сравнению с контролем. Изменение соотношения мтДНК/яДНК в значительной степени отражает уровень повреждения функционирования как митохондриального, так и ядерного генома и, в перспективе, может рассматриваться как показатель гибели клеток при действии генотоксических факторов.

ВНЕКЛЕТОЧНАЯ ДНК ОБЛУЧЕННЫХ КЛЕТОК – ФАКТОР,

ИНДУЦИРУЮЩИЙ ЭФФЕКТ СВИДЕТЕЛЯ ПРИ ДЕЙСТВИИ МАЛЫХ ДОЗ

ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ.

Ермаков А.В., Костюк С.В., Конькова М.С., Смирнова Т.Д., Вейко Н.Н.

Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Россия Эффект свидетеля (ЭС) – сложная клеточная реакция, при которой после повреждающего воздействия происходит передача сигнала от облученных клеток к необлученным (клеткам-свидетелям), в результате чего в тех и других индуцируются одинаковые эффекты. Значимым фактором в развитии ЭС при действии малых доз ионизирующего излучения является внеклеточная ДНК облученных клеток (вкДНКR).

Мы показали, что ЭС с участием вкДНКR реализуется в различных типах клеток – недифференцированных (мезенхимальные стволовые клетки жировой ткани) и дифференцированных (эндотелиальные клетки). Некоторые события, сопровождающие развитие ЭС в различных типах клеток – универсальны. При действии радиации (10сГр) и в клетках – свидетелях в присутствии вкДНКR(10сГр) мы тестировали одинаковые структурные преобразования хроматина – изменение локализации гомологов 1q хромосомы 1 в ядре, изменение конформации ядрышка и увеличение полимеризации актина. ВкДНКR(10сГр) индуцирует в клетках – свидетелях образование одиночных и множественных двунитевых разрывов, тестируемых по взаимодействию с антителами к фосфорилированной форме гистона Н2АХ, и увеличение количества апоптотических клеток. Кроме того, наблюдаются специфичные для данного типа клеток реакции, например, однотипные изменения количества окиси азота в эндотелиальных клетках при действии радиации и вкДНКR. Мы высказали гипотезу: на клетки – свидетели действуют фрагменты вкДНКR, содержащие модифицированные в результате действия ROS основания. Были получены модельные образцы ДНК, содержащие различные количества модифицированных (окисленных) оснований. Модифицированные образцы ДНК радиации. Вывод. Модифицированные ROS фрагменты вкДНКR - значимый фактор в млекопитающих.

ПОКАЗАТЕЛИ ТКАНЕВОГО ДЫХАНИЯ МИОКАРДА КРЫС

ПРИ ОДНОКРАТНОМ ГАММА-ОБЛУЧЕНИИ

Гомельский государственный медицинский университет, Гомель, Беларусь, Традиционные представления о радиорезистентности миокарда не имеют четкого обоснования. Имеющиеся данные указывают на то, что ионизирующее излучение увеличивает вариабельность реакций сердечно-сосудистой системы и механизмов поддержания энергетического гомеостаза миокарда, реализуемых, главным образов, в реакциях митохондриального окисления, исследование которого может быть использовано для оценки степени радиационного воздействия. Целью работы явилось изучение состояния тканевого дыхания кусочков миокарда белых беспородных крыссамцов весом 230–250 г, которых подвергли однократному внешнему гамма-облучению в дозе 0,5 Гр. Животных забивали путем декапитации. Миокард извлекали и отмывали физиологическом раствором, продавливали плунжером с диаметром отверстий 0,5 мм и помещали в раствор Хэнкса. Все операции проводили при температуре 0 ч 2°С. В кусочках ткани миокарда измеряли скорость потребления кислорода на эндогенных субстратах, а также при добавлении сукцината и глутамата (по 5 мМ) с помощью закрытого платинового электрода Кларка в термостатируемой ячейке при t = 37°C.

Исследования показали, что на 3 и 10 сутки после облучения в миокарде достоверно возрастает скорость эндогенного дыхания соответственно на 29,7% и 49,7% по сравнению с контролем составляющим 2,11±0,02 нмоль О2 /мин*мг белка. Достоверно высокая дыхательная активность миокарда сохранялась у облученных животных и при использовании экзогенных субстратов – в присутствии сукцината на 30,2% и 56,5%и при внесении глутамата на 16,7% и на 92,8% соответственно, на 3 и 10сутки. Таким образом, вопреки сложившимся представлениям, миокард отличается довольно высокой чувствительностью к однократному внешнему гамма-облучению, которая проявляется в виде стимуляции его интегрального функционального и метаболического параметра – скорости дыхания на эндогенных субстратах, а также при использовании естественных метаболитов миокарда – сукцината и глутамата.

РЕАКЦИЯ ДЗЕТА ПОТЕНЦИАЛА ЭРИТРОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА В ПОЛЕ

ИОНИЗИРУЮЩЕЙ РАДИАЦИИ МАЛОЙ МОЩНОСТИ НА ФОНЕ

МОДИФИКАЦИИ ТРАНСМЕМБРАННОГО ОБМЕНА Ca2+

Жирнов В.В., Яковенко И.Н., Грубская Л.В., Деденко С.И.

Институт биоорганической химии и нефтехимии Национальной академии наук Украины, Ранее нами были показано, в поле ионизирующей радиации (ИР) малой мощности (Sr90 и С14; 0,5– 15 мкГр/ч) обратимо изменяется дзета потенциал (ДП) эритроцитов человека [Жирнов В.В. и др., 2002]. При этом наблюдалась модификация мембранной сигнальной трансдукции, вызываемых различными модуляторами, по-видимому, реализующаяся через макромолекулярные структурные перестройки плазматической мембраны [Жирнов В.В. и др., 2003; Войцицкий В.М. и др., 2008]. Целью данной работы было изучение действия низкоинтенсивного радиационного излучения на ДП эритроцитов человека в условиях модификации трансмембранных Ca2+-токов ингибитором Ca2+каналов нитрендипином и Ca2+-ионофором кальцимицином (А23187). Дзета потенциал эритроцитов вычислялся по данным измерения их электрофоретической подвижности в растворе, содержащем (в мМ): KCl - 2,5; CaCl2 - 2,0; глюкоза – 289.0; Трис-НСl - 10 (pH Мощности и поглощенные клетками дозы облучения рассчитывались согласно [Loevinger R. et al., 1991]. Показано, что ИР (15 мкГр/ч, поглощенная доза 15 мкГр) достоверно увеличивала ДП на 7%, а кальцимицин в концентрациях 0,1-10 мкМ монотонно и достоверно снижал абсолютную величину ДП на 13-22% соотв. В поле ИР кальцимицин был неэффективен, т.е. -излучение полностью отменяло эффект всех концентраций ионофора. Нитрендипин в концентрации 0,1 - 10 мкМ дозонезависимо повышал ДП в среднем на 10%. В поле ИР с мощностью дозы 15 мкГр/ч нитрендипин увеличивал ДП в среднем на 17%, т.е. фактически наблюдался аддитивный ответ.

Нитрендипин и А23187 были неэффективны в концентрации 10 нМ, но ионофор в этой концентрации снимал действие ИР, тогда как блокатор Са каналов не изменял реакцию ДП на наложенное поле ИР. Все эти эффекты обнаруживаются только в наложенном поле ИР и исчезают после снятия поля. Полученные данные показывают, что поле -излучения малой мощности оказывает существенное влияние на взаимодействие биологически активных веществ с плазматической мембраной, что в свою очередь может сказаться на процессах сигнальной трансдукции в условиях повышенной радиационной нагрузки.

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ФОРМ ГИБЕЛИ ДРОЖЖЕВЫХ КЛЕТОК ПОСЛЕ

ВОЗДЕЙСТВИЯ ВРЕДНЫХ ФАКТОРОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ РАЗЛИЧНОЙ

ПРИРОДЫ

Медицинский радиологический научный центр РАМН, г. Обнинск, Россия, Формы гибели дрожжевых клеток после действия редкоионизирующего излучения были достаточно хорошо изучены (Корогодин В.И., 1966). Однако в литературе отсутствуют систематические данные по формам гибели клеток после воздействия других факторов окружающей среды, таких как плотноионизирующее излучение, УФ свет, гипертермия и химические вещества, а так же сочетанного действия некоторых из них.

Целью данного исследования было сравнить формы гибели, вызываемые такими факторами с формами гибели возникающими в результате действия -излучения (60Со).

Анализ форм гибели после указанных агентов проводили для изоэффективных доз, снижающих выживаемость клеток до одинакового уровня.

Показано, что после воздействия химического агента (йодистый калий), как и после действия различных высоких температур (52,5 – 57 °С), для дрожжевых клеток характерна интерфазная гибель (гибель без деления), свидетельствующая о том, что механизм действия гипертермии и химических агентов обусловлен не разрывами ДНК, а повреждением массовых цитоплазматических структур. Отсутствие восстановления у клеток, подвергшихся воздействию гипертермии или йодистого калия, подтверждает вышеизложенное. После действия УФ излучения (254 нм) наряду с репродуктивной гибелью наблюдается и более тяжелая форма инактивации – гибель клеток без деления, в отличие от действия - и -излучений, когда интерфазная клеточная гибель практически не встречается. Не исключено, что существование двух форм гибели после действия УФ света может быть связано с двумя формами восстановления клеток, характерных для действия УФ света – фотореактивация и темновое восстановление. Результат сочетанного действие после УФ света и гипертермии – преимущество интерфазной формы гибели.

Таким образом, данные сравнительного анализа последствий действия факторов различной природы, свидетельствуют о том, что форма гибели дрожжевых клеток может быть использована в качестве теста степени тяжести повреждений, индуцируемых воздействующими агентами. Для представленного исследования степень тяжести повреждений для изоэффективных доз воздействующих агентов располагается в следующем порядке: химический агент, гипертермия, сочетанное действие УФ света и гипертермии, УФ свет, -частицы и -излучение.

О ФАКТОРАХ, СПОСОБСТВУЮЩИХ ПРОЯВЛЕНИЮ

ИНДИВИДУАЛЬНОЙ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ

ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии, Обнинск, Россия, [email protected] В результате многолетних и разносторонних исследований было установлено, что даже в пределах одного вида наблюдаются существенные различия по радиочувствительности. Однозначного ответа на этот феномен получено не было [Воккен Г.Г., 1964, Василенко И.Я. и др., 2004]. Собственные исследования и анализ литературных данных позволяют высказать обоснованные предположения. Организм животного постоянно подвергается неблагоприятному воздействию этиологических факторов различного происхождения без клинического проявления болезней. Ионизирующее излучение в таких случаях может оказать провоцирующее действие.

При экспериментальном -облучении лошадей, положительно реагировавших по реакции микроагглютинации на лептоспироносительство часть животных погибала через 1-5 суток. Значительно снижалась функциональная активность Т-лимфоцитов (до 7%).

Количество лейкоцитов у латентников снижалось до 5-10% от исходных величин. После -облучения в дозе 4 Гр у клинически здоровых подсвинков количество лейкоцитов через 1 сутки уменьшилось на 80 %. На вскрытии у преждевременно погибших животных были обнаружены аскариды. После облучения возрастала летальность не долеченных телят легочников [Исамов Н.Н., Исамов Н.Н. (мл.), 2009.] Ранее показано, что латентные сальмонеллёз у мышей [Чухловин Б.А., 1959] и пастереллёз у морских свинок [Бонд В. и Сугахара Т., 1974] после облучения отягощали течение лучевой болезни и снижали радиорезистентность. А стерильные от микробов мини-поросята были более радиорезистентными [Mandel L. et al., 1979].

Все это свидетельствует о том, что индивидуальная радиочувствительность внутри вида у клинически здоровых животных в первую очередь определяется наличием скрытых изменений гомеостаза, обусловленных самыми различными этиологическими факторами (инфекционными, инвазионными и др.) и может быть диагностирована через 0,5-1 сутки после -облучения. При этом наиболее информативными показателями являются изменения белой крови. Тщательное и разностороннее обследование, предназначенных для облучения объектов, позволяет прогнозировать с высокой степенью вероятности индивидуумы с пониженной радиорезистентностью

ГЕНОТОКСИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ДОЛГОЖИВУЩИХ РАДИКАЛОВ БЕЛКА

ИНДУЦИРОВАННЫХ РЕНТГЕНОВСКИМ ИЗЛУЧЕНИЕМ.

Карп О.Э.1, Гудков С.В.1,2, Черников А.В.1, Смирнова В.С.1, Брусков В.И.1, Институт теоретической и экспериментальной биофизики, Пущино, Россия Пущинский государственный университет, Пущино, Россия Ранее установлено, что при воздействии ионизирующего излучения в растворах белков и клетках образуются долгоживущие радикалы белка (ДЖРБ) с временем полужизни 20 и более часов. Показано, что ДЖБР in vitro являются источниками продолжительного образования активных форм кислорода и способны повреждать структуру ДНК. В данной работе исследована способность ДЖРБ вызывать окислительные повреждения в ДНК in vivo. С помощью микроядерного теста исследовано влияние облученного крысиного сывороточного альбумина при внутривенном введении его самцам крыс. Установлено, что введение облученного в дозе 100 Гр белка (1 мкг/г) приводит к увеличению количества полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в 2,5 раза по сравнению с контролем. При скармливании в течение суток мышам обезжиренного и обезвоженного творога (80 мг/г), облученного в дозе 100 Гр, в красном костном мозге происходит увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами, эквивалентное количеству, образующемуся при тотальном облучении животных в дозе близкой к 0,2 Гр. Этот факт свидетельствует о способности долгоживущих радикалов сохранять свой окислительный потенциал и при переваривании пищи. При одновременном пероральном введении ДЖБР и приеме с питьевой водой в качестве природных антиоксидантов 5 мМ растворов инозина, L-триптофана и Lметионина наблюдалось снижение величины цитогенетических повреждений. Таким образом, установлено, что облученные белки способны проявлять генотоксические свойства повреждая структуру ДНК in vivo и показана возможность нейтрализации этих повреждений с помощью потребления некоторых природных антиоксидантов.

Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-00800-а; 10-04-00949-а) и Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых (МК-108.2010.4).

СОСТОЯНИЕ АНТИОКСИДАТНОЙ СИСТЕМЫ СПЕРМАТОЗОИДОВ КРЫС

ПРИ ЛОКАЛЬНОМ ОБЛУЧЕНИИ ИХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

Научный центр радиационной медицины АМН Украины, Киев, Украина В литературе имеются данные, указывающие на важную роль свободных радикалов в фертилизационном процессе млекопитающих и человека. В это связи изучение опосредованного влияния ионизирующего излучения на фертилизационный потенциал сперматозоидов представляет значительный интере. Целью наших исследований было изучение активности антиоксидантных ферментов и содержания ТБКактивных продуктов в сперматозоидах крыс-самцов при локальном облучении их головного мозга. Локальное облучение головы животных проводили на установке РУМв диапазоне доз 0,5-10 Гр при мощности дозы 0,17 Гр/мин и 0,34 Гр/мин. Все тело животного, кроме головы, было защищено свинцовым жилетом. Животных декапитировали через 1, 7 и 14 суток. Активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и содержание ТБК-активных продуктов в сперматозоидах животных измеряли спектрофотометрическим методом. Подвижность и гипперактивацию сперматозоидов определяли микроскопически.

Полученные результаты показали, что в первые периоды после облучения в дозах 0,5 и 2,0 Гр активность СОД и каталазы превышали контрольные значения, в то время как при дозе в 10 Гр активность СОД резко уменьшалась. Через 14 суток после локального действия ионизирующей радиации наблюдалось ингибирование СОД с увеличением дозы облучения, при этом активность каталазы достоверно изменялась только при облучении в 10,0 Гр и составляла 78% от контрольного значения. Таким образом, при низких дозах локального облучения головного мозга крыс увеличения активности СОД и каталазы сперматозоидов предупреждало повреждение мембранных структур, про что свидетельствует содержание ТБК-активных продуктов, количество которых оставалось на уровне контроля. Увеличение дозы облучения до 7,0 и 10,0 Гр приводило к накоплению ТБК-активных продуктов в связи с частичным уменьшение активности ферментов антиоксидантной системы. При этом количество гипперактивированных сперматозоидов заметно снижалось.

Установленные изменения активности СОД и каталазы в конечном итоге могут привести к потере фертилизационной способности сперматозоидов.

РОЛЬ СОСТАВА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ ЛИПИДОВ

В ФОРМИРОВАНИИ РАДИАЦИОННО-ХИМИЧЕСКИХ ЭФФЕКТОВ

НА ЛИПОСОМАХ

Климович М.А., Парамонов Д.В.2, Хрустова Н.В.1, Трофимов В.И.2, Шишкина Л.Н.1.

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва, Россия, Водные дисперсии липосом являются удобными модельными системами для выяснения участия липидной компоненты клеточных мембран в формировании радиобиологических эффектов. Целью работы было выявление роли состава и физикохимических характеристик липидов в механизме радиационно-химических эффектов, индуцированных воздействием – излучения на липосомы. Липосомы формировали из лецитин–стандарта (ЛС) и липидов печени и головного мозга самок половозрелых беспородных мышей. Диапазон доз облучения липосом, сформированных из ЛС, 0 - 6, кГр (мощность дозы 27,6 Гр/мин.), из липидов печени и головного мозга 0 - 4,9 кГр (26, Гр/мин. и 29,9 Гр/мин. соответственно). Анализировали следующие показатели: состав липидов и содержание в них диеновых коньюгатов и кетодиенов; концентрацию пероксидов, антипероксидную активность; рН водной суспензии липосом и содержание ТБК-активных продуктов. С ростом дозы облучения суспензии липосом рН среды уменьшается независимо от исходногор уровня. Максимальное снижение рН выявлено при облучении липосом в слабо щелочной среде. Облучение индуцирует окисление липидов, изменение количественного соотношения фракций фосфолипидов (ФЛ) и их доли в составе общих липидов, что обусловливает изменения физико-химических свойств липидов липосом и содержания ТБК-активных продуктов. Наличие холестерина в липосомах, сформированных из липидов органов мышей, оказывает влияние на размер липосом и существенно модифицирует масштаб радиационно-индуцированных эффектов.

Сложный характер зависимости «эффект – доза облучения» на липосомах обнаружен для большинства показателей, независимо от источника липидов, использованных для их формирования. Для ряда показателей выявлены определённые значения доз, при которых наблюдается смена режимов с линейного на автоколебательный.

СОСТОЯНИЕ СИСТЕМЫ Са2+-ОБМЕНА ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ

ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА ОВЕЦ

ГНУ ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск, Россия, Молекулярные механизмы воздействия ионизирующего излучения связывают не только со структурными повреждениями внутриклеточных компонентов, но и с изменением функционирования регуляторных систем клеток. Особый интерес представляет система поддержания внутриклеточной концентрации ионов кальция, который является универсальным регулятором множества клеточных событий, а при различных повреждениях организма выступает в качестве цитотоксического агента.

Известно, что компоненты системы Са2+-обмена интегрированы в плазматическую повреждающего действия ионизирующего излучения. Поэтому возникает вопрос о степени нарушения функционирования этой системы при различных дозах облучения.

Эритроциты млекопитающих, и в частности жвачных животных, в связи с более простым строением системы поддержания внутриклеточного Са2+-гомеостаза (отсутствует ряд Са2+-накапливающих органелл и не обнаружена система Na+/Ca2+-обмена), представляют удобную модель для исследований. В связи с этим в настоящей работе было проведено изучение показателей состояния системы Са2+-обмена эритроцитов при остром воздействии -излучения на овец.

Острое облучение животных в дозах 0,72; 1,2; 2,4 и 3,6 Гр характеризовалось нарушением состояния системы Са2+-обмена в эритроцитах. В первые сутки после воздействия наблюдали, зависящее от дозы облучения, увеличение проницаемости плазматической мембраны для ионов Са2+. Но при дозах 0,72 и 1,2 Гр накопление ионов кальция в цитоплазме было обратимым и предотвращалось активацией Са2+-АТФазы. В то же время степень нарушения проницаемости мембран для ионов Са2+ при облучении овец в дозах 2,4 Гр и 3,6 Гр превосходила транспортные возможности «Са-насоса», что приводило к 4-5-кратному увеличению концентрации ионизированного Са2+ в клетках.

Следствием этого для эритроцитов может являться утрата способности к адекватной радиочувствительных клеток (напр., лимфоцитов) инициация процесса гибели.

АНАЛИЗ ВЗАИМОСВЯЗЕЙ МЕЖДУ СОСТОЯНИЕМ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ

ПРОЦЕССОВ И ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ ОРГАНОВ МЫШЕЙ

ПОСЛЕ СОВМЕСТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПОВРЕЖДАЮЩИХ ФАКТОРОВ

Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва, Россия, Исследование состояния процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) представляется весьма перспективным, поскольку показана высокая чувствительность параметров системы регуляции ПОЛ в тканях диких грызунов и лабораторных животных к воздействию факторов как химической, так и физической природы.

Целью работы явился комплексный автоматизированный анализ взаимосвязей между параметрами физико-химической системы регуляции ПОЛ в печени и морфофизиологическими показателями животных спустя месяц после совместного действия повреждающих факторов различной природы (рентгеновское облучение в сублетальных дозах и химические агенты в малых дозах).

Ранее при этих воздействиях нами были обнаружены изменения масштаба и направленности взаимосвязей между параметрами интенсивности ПОЛ, а также между обобщенными показателями состава фосфолипидов. Для лучшего понимания причин изменения характера корреляций требуется более глубокий комплексный анализ экспериментальных данных, который, являясь весьма трудоемкой задачей, потребовал привлечения средств автоматизированной обработки данных. Поэтому для повышения интенсивности и эффективности обработки результатов эксперимента нами были разработаны несколько программных модулей, позволивших автоматизировать процессы обсчета и анализа полученных данных. Это позволило провести поиск достоверных корреляций и их анализ из более, чем 3000 возможных. При таком подходе к анализу данных были выявлены взаимосвязи, определяющие изменения характера и масштаба корреляций между биофизическими и морфофизиологическими показателями в зависимости от физико-химических свойств липидов печени и их состава как в контрольных, так и в опытных группах животных. Полученные данные позволяют предположить, что состав липидов печени играет важную роль в формировании ответа на совместное действие повреждающих факторов различной природы, направленный на обеспечение выживания животных.

УСЛОВНО-РЕФЛЕКТОРНАЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТЬ ПОТОМСТВА

САМЦОВ КРЫС, ПОДВЕРГШИХСЯ ОСТРОМУ ГАММА ОБЛУЧЕНИЮ

Медицинский радиологический научный центр РАМН (МРНЦ), Обнинск, Россия, В последние годы стала актуальной проблема выяснения физиологической полноценности внешне здоровых детей – потомков облученных отцов. Одним из важных показателей физиологической полноценности или неполноценности потомства могут являться изменения в когнитивных функциях мозга, однако до настоящего времени наблюдается недостаток научной информации в этой области. Целью данной работы являлось изучение влияния острого гамма облучения самцов крыс Вистар в дозах 0,5; 1, или 1,5 Гр на разных стадиях сперматогенеза (мощность дозы 20.0 Гр/ч) на способность к обучению их потомства первого поколения, которая оценивалась с помощью теста выработки условного оборонительного рефлекса избегания в челночной камере. В подопытные группы из числа выживших потомков в возрасте трех месяцев отбирали клинически здоровых животных без выраженных пороков развития. Контрольную группу составляли интактные самцы и самки, которые находились в идентичных с подопытными крысами условиях содержания. Тестирование проводили отдельно для групп самцов и самок.

Обнаружено существенное нарушение когнитивных функций у потомков (как самцов, так и самок) крыс-самцов, облученных в дозе 1,5 Гр. Вероятно, во время облучения при данной дозе нарушения в мужских половых клетках возникают при всех изученных стадиях сперматогенеза и передаются потомкам. Несколько менее снизилась способность к обучению у потомков крыс-самцов, облученных в дозе 1,0 Гр; причем более выраженные нарушения условно-рефлекторной деятельности выявлены у потомков-самцов, родившихся из зигот, оплодотворенных мужскими гаметами, облученными на стадиях сперматозоидов и сперматид, у потомков-самок ухудшение способности к обучению зарегистрировано только у животных, родившихся из зигот, оплодотворенных мужскими гаметами, облученными на стадии сперматогониев. У потомков (как самцов, так и самок) крыс-самцов, облученных в дозе 0,5 Гр, способность к обучению по сравнению с контрольными животными практически не пострадала.

ФРАГМЕНТЫ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ГЕНОМНОЙ ДНК – ФАКТОР СТРЕСССИГНАЛИЗАЦИИ ПРИ РАДИАЦИОННОМ ЭФФЕКТЕ СВИДЕТЕЛЯ,

РАЗВИВАЮЩЕГОСЯ В МОНОСЛОЙНОЙ КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА

Конькова М.С., Ермаков А.В., Костюк С.В., Смирнова Т.Д., Вейко Н.Н.

Медико-генетический научный центр РАМН, Москва, Россия После воздействия рентгеновского излучения (10 сГр) в лимфоцитах человека развиваются реакции транспозиции локусов 1q12 гомологов хромосомы 1 в пространстве клеточного ядра и активация ядрышкообразующих районов (ЯОР) хромосом. Эти же эффекты развиваются в необлученных лимфоцитах-свидетелях после добавления к их инкубационной среде фрагментов ДНК облученных клеток (эффект свидетеля, ЭС). В настоящей работе показано, что аналогичная система стресс-сигнализации характерна не только для суспензионной, но и монослойной культуры клеток человека.

Эндотелиальные клетки подвергали облучению в адаптирующей дозе (10 сГр) и анализировали по ряду параметров. Облучение индуцировало: перемещение вглубь ядра гибридизационных локусов 1q12, их сближение и округление эллипсоидного ядра, активацию ЯОР и усиленную полимеризацию F-актина, повышение уровня регистрируемых -Н2А.Х-фокусов – т.е. увеличение количества клеток с двойными разрывами ДНК и апоптотических эндотелиоцитов. Из ростовой среды облученных клеток методом фенольной экстракции выделяли фрагменты внеклеточной геномной ДНК и вводили их (10 нг/мл) в инкубационную среду интактных эндотелиоцитов-свидетелей.

Через 3 часа в последних развивались все перечисленные реакции.

Как в лимфоцитах, так и в клетках эндотелия человека работает сходная система стресс-сигнализации, факторы которой – фрагменты внеклеточной ДНК - переносятся через инкубационную среду от облученных эндотелиоцитов клеткам-свидетелям.

Источником фрагментов ДНК являются апоптотические клетки (апоптоз активно стимулируется воздействием радиации); элементы взаимодействия на клетках-свидетелях – рецепторы семейства «toll». После блокирования TLR9 хлорокином или олигонуклеотидом по большинству упомянутых параметров клетки-свидетели после добавления внеклеточной ДНК экспонированных эндотелиоцитов не отличаются от контроля. Обнаруженный нами ДНК-сигнальный путь может работать и в других клетках человека.

ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЯ АЛЬФА-ЧАСТИЦ С ЭНЕРГИЕЙ 30 МЭВ

НА МЕМБРАНУ ЛИПОСОМ

Лебедев В.М. 1, Паршина Е.Ю. 2, Спасский А.В. 1, Круглов О.С. 1, Байжуманов А.А. 2, Деев Л.И.2, Труханов К.А. 1,3, Максимов Г.В. На 120-см циклотроне НИИЯФ МГУ изучалось воздействие -частиц на искусственные мембранные системы (липосомы), состоящие из фосфатидилхолина и – каротина. Препараты однослойных липосом облучались в кювете со стенками из лавсановых пленок толщиной 20 мкм, зазор между которыми составлял от 0.8 до 1.0 мм.

Кювета размещалась на расстоянии 5 см от фланца «окна» (50 мкм Al) ионопровода.

Энергия -частиц, попадающих в раствор, составляла 26.7 МэВ. Величина линейной передачи энергии (ЛПЭ) -частиц составляла около 24 кэВ/мкм. Это значение близко к величине ЛПЭ релятивистских ядер группы неона–магния галактических космических лучей, что позволяет моделировать их воздействие на биообъекты.

После облучения в диапазоне доз 5-25 кГр в препаратах липосом определялись ТБК-активные продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ), содержание -каротина, а также регистрировались спектры комбинационного рассеяния -каротина и липидов (длина волны возбуждающего света 473 и 785 нм, соответственно). При помощи анализатора размера частиц оценивались размеры липосом.

Обнаружено увеличение содержания продуктов ПОЛ (около 0.05 нмоль/кГр/мг липидов препарата липосом), незначительное (в зависимости от дозы на 3-15%) снижение содержания -каротина, а также эффекты, свидетельствующие об увеличении вязкости мембран липосом. Признаков распада или агрегации липосом и изменения конформации молекул в оставшемся пуле -каротина отмечено не было. Таким образом, облучение -частицами в исследованном диапазоне доз вызывало интенсификацию ПОЛ, сопровождавшуюся деструкцией –каротина и изменением микровязкости мембран липосом. Обсуждаются причины относительно невысокой интенсификации ПОЛ в исследованных липосомальных мембранах под действием ускоренных -частиц.

Работа выполнена при поддержке Минобрнауки (г/к № 02.740.11.0242).

РОЛЬ ЭФФЕКТА СВИДЕТЕЛЯ В ФОРМИРОВАНИИ ОТДАЛЕННЫХ

ПОСЛЕДСТВИЙ ОБЛУЧЕНИЯ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК ЛИНИИ СНО-К

Осипов А.Н., Лизунова Е.Ю., Воробьева Н.Ю., Анчишкина Н.А.

Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, Россия, Целью настоящей работы было изучение отдаленных последствий радиационного воздействия, в поколениях непосредственно облученных клеток и клеток, не подвергавшихся облучению, но получивших комплекс сигналов от облученных клеток (эффект свидетеля). В работе использовали культуру эпителиальных клеток яичников китайского хомячка (линия CHO-К1). Показано, что на 7-11-е сутки, после облучения в дозе 1 Гр, в потомках облученных клеток регистрировалось статистически достоверное увеличение степени фрагментации ДНК, доли апоптотических клеток и внутриклеточного содержания активных форм кислорода (АФК), что является проявлением радиационноиндуцированной нестабильности генома. В течение всего срока экспериментов (11 суток) не было зарегистрировано достоверно выраженных проявлений нестабильности генома в потомках клеток, получивших комплекс растворимых факторов от облученных клеток (инкубация в среде, полученной от облученных клеток). Было выдвинуто предположение о том, что в индукции нестабильности генома ведущую роль играют прямые радиационные повреждения клеточных структур. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты по со-культивированию смеси клеток содержащей 10 или 30 % клеток, облученных в дозе 1 Гр и необлученных клеток, соответственно. Результаты исследований показали, что в поколениях со-культивированных клеток наблюдаются статистически достоверное увеличение содержания АФК на 7 сутки инкубации и статистически достоверное увеличение всех изученных показателей на 9 и 11 сутки экспериментов. Необходимо отметить, что выраженность эффектов была сопоставима с проявлением нестабильности генома, в потомках тотально облученных клеток. По всей видимости в формировании нестабильности генома задействован так называемый «вторичный» эффект свидетеля. Работа выполнялась при поддержке гранта РФФИ № 07а.

НАРУШЕНИЯ ПАМЯТИ В РАННЕМ ПОСТРАДИАЦИОННОМ ПЕРИОДЕ

ГНИИИ Военной медицины МО РФ, Санкт-Петербург, Россия Исследование влияния ионизирующих излучений (ИИ) на состояние памяти (способность к формированию, фиксации и воспроизведению памятного следа) проведено на беспородных белых крысах-самцах массой 180-220 г, подвергнутых краниокаудальному облучению в широком диапазоне доз. Для выявления ранних пострадиационных изменений функции памяти использовали модель выработки условной реакции активного избегания (УРАИ) ударов электротока в «челночной камере».

Определение влияния ИИ на процессы формирования памятного следа осуществляли по скорости выработки УРАИ в первые 5 - 60 мин после облучения. Эффекты радиационного воздействия на механизмы консолидации памятного следа оценивались по результатам воспроизведения животными условно-рефлекторного навыка, приобретенного ими непосредственно перед облучением. При выявлении действия ИИ на способность к реализации энграммы долговременной памяти анализировали пострадиационные изменения в воспроизведении крысами упроченного навыка. Установлено, что процессы формирования и фиксации памятного следа являются наиболее чувствительными к воздействию ИИ, тогда как выраженное снижение способности животных к воспроизведению упроченного навыка, закрепленного в долговременной памяти, имеет место при дозах, близких к дозам, вызывающим развитие ранних пострадиационных неврологических расстройств. Показано, что дезорганизация процессов консолидации энграммы памяти и развитие «ретроградной амнезии» (на события непосредственно до облучения) возникают при дозовой нагрузке в 1,5 -2 раза более низкой, чем уровни воздействия, приводящие к нарушению воспроизведения энграммы долговременной памяти. Отмечено наличие нелинейной корреляции между степенью изменения поведения крыс в раннем пострадиационном периоде и величиной поглощенной дозы, что отражает пороговый характер нарушения функции памяти при увеличении дозовой нагрузки.

Результаты исследования позволили сделать вывод, что ИИ вызывают дезорганизацию радиочувствительности.

ВОЗДЕЙСТВИЕ AM-241 НА БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

Сибирский Федеральный Университет, Красноярск, Россия, [email protected].

В настоящее время рост в окружающей среде радиоактивных загрязнений техногенного характера ставит перед исследователями задачу поиска новых методов мониторинга и контроля состояния окружающей среды. Для детального исследования радиоактивного воздействия перспективны биолюминесцентные тестовые системы, основные на морских светящихся бактериях. Существует возможность варьирования сложности биолюминесцентной тестовой системы: используются как бактериальные клетки, так и ферментативные реакции. Это дает возможность сравнить действие токсичных веществ на клеточные структуры и ферменты.

биолюминесцентные бактерии и биолюминесцентные ферментативные реакции. Данный радионуклид является продуктом ядерного производства и последнее время все чаще регистрируется в окружающей среде.

Использовались четыре биолюминесцентные тестовые системы: интактные бактерии Ph.Phosporeum, лиофильно высушенные бактерии и биолюминесцентные системы сопряжённых ферментативных реакций (растворимая и иммобилизованная в крахмальный гель). В качестве источника радиоактивности - растворы Am-241 различных концентраций. Токсичность растворов оценивалась относительной интенсивностью биолюминесценции.

Показано, что при хроническом воздействии Am-241 на биолюминесцентные системы эффекты проявляются при содержании радионуклида в растворах более 100 Бк/л.

Эффективность воздействия Am-241 зависит от уровня организации системы (бактериальные клетки или выделенные ферментативные системы), поврежденности клеток, и концентрации радионуклида.

Продемонстрировано накопление америция в клеточной культуре бактерий.

мониторинга детоксикации растворов радионуклидов гуминовыми веществами.

Гуминовые вещества в растворах америция уменьшают отклонения кинетики люминесценции от контроля, накопление америция в клетках и поврежденность клеток.

АНАЛИЗ ПОСТРАДИАЦИОННЫХ ОКСИДАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ В ТКАНЯХ

ОБЛУЧЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Рябченко Н.И., Иванник Б.П., Рябченко В.И., Дзиковская Л.А., Синькова Р.В., Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск, Россия, В результате воздействия облучения и стрессорных факторов интенсифицируются процессы образования активных форм кислорода, которые приводят к окислительной модификации структуры липидов, белков и ДНК. В настоящей работе проведено исследование пострадиационных оксидативных реакций в печени, тимусе и сыворотке крови крыс, облученных в дозе 4 Гр. Полученные результаты показали, что через сутки после облучения в печени и тимусе в 1,9 раз увеличивается содержание МДА, появляются чувствительные к окислению лабильные сайты, увеличивается генерация супероксидного анион-радикала О2•. Через сутки после облучения в сыворотке крови увеличивается концентрация (в единицах Н2О2) окислительных эквивалентов с 23,1 мкМ до 31,1 мкМ, а также повышается концентрация общего железа, в том числе и редокс-активного железа, способного при взаимодействии с перекисями приводить к появлению активного ОН• радикала. В последующие четверо суток выход МДА и О2• в печени и тимусе несколько снижается, однако повышенный уровень показателей оксидативного стресса сохраняется и на 30-е сутки после облучения, что может оказывать существенное влияние на формировании патологических пострадиационных изменений, связанных с проявлением настабильности генома, замедленной репопуляции лимфоцитов, нарушению баланса между анти и прооксидантными системами клеток.

Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Калужской области (проект № 09-04-97551).

ОЦЕНКА РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ КЛЕТОК И ОРГАНИЗМОВ МЕТОДОМ

Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Россия Метод гель-электрофореза нуклеоидов индивидуальных клеток – метод «комета тест» (метод «ДНК-комет», Comet assay) используется уже 25 лет для оценки уровня поврежденности ДНК и ее репарации в индивидуальных клетках разных тканей животных и человека. Щелочная версия этого метода позволяет обнаружить широкий спектр повреждений ДНК: разрывы цепей, сшивки, наличие модифицированных оснований и щелочелабильных сайтов. Помимо обнаружения разрывов в ДНК и сшивок, разработаны подходы, позволяющие выявить долю клеток в состоянии апоптоза; с применением специфических репарационных ферментов оценить вклад, вносимый поврежденными основаниями ДНК; сравнить эффективность различных генотоксических воздействий. Ряд исследователей использовали щелочной и нейтральный варианты метода для обнаружения взаимосвязи между радиочувствительностью клеток, уровнем начальных повреждений и кинетикой восстановления разрывов ДНК на клеточных линиях, отличающихся по радиочувствительности. Клеточные линии, дефектные по репарации (например, xrs-5, SCID и большинство лимфобластоидных линий), как правило, обнаруживали сниженный темп восстановления разрывов и большее количество остаточных повреждений, чем клеточные линии, нормальные по репарации. Однако не проводилось исследований с клетками, полученных из организмов, различающихся по радиочувствительности.

В нашей работе были проведены исследования на клетках периферической крови человека, мыши и лягушки. Образцы крови подвергались воздействию рентгеновского излучения in vitro на установке РУТ-250-15-1, мощность дозы 1Гр/мин. Оценивали уровень повреждений ДНК в индивидуальных клетках сразу после облучения и через разные промежутки после облучения.

ЗАКОНОМЕРНОСТИ ДЕЙСТВИЯ -КВАНТОВ 60CО В ДИАПАЗОНЕ ДОЗ

0,1-6,0 ГР НА ЛИПИДНО-ЛИПОПРОТЕИНОВЫЙ МЕТАБОЛИЗМ И

ОКИСЛИТЕЛЬНО-АНТИОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ ГОМЕОСТАЗ

Талько В.В., Серкиз Я.И., Чоботько Г.М., Янина А.Н., Дмитрук С.Н., ГУ ”Научный центр радиационной медицины АМН Украины”, Киев, Украина, Согласно положениям классической радиобиологии биологическая эффективность одного и того же вида излучения в зависимости от режима его реализации при одинаковой поглощенной дозе составляет ряд: однократное > фракционированное > продолжительное.

Однако накопленные за последнее время данные свидетельствуют о нарушении этой закономерности в сторону большей биологической эффективности продолжительного, по сравнению с однократным, облучением; при этом аргументированные доказательства не приводятся, а специальные исследования для их получения не проводились. Это создает во многих случаях сложность интерпретации радиобиологических эффектов, ошибочные представления относительно природы нарушений, толкование эффектов в сравнительном аспекте и, что является особенно важным, прогнозирование их и оценки величины для проведения защитных мероприятий.