Направленный мутагенез пенициллинацилазы из E.coli для изменения каталитических свойств и стабильности

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского

на правах рукописи

Панин Николай Владимирович

Направленный мутагенез пенициллинацилазы из E.coli для изменения каталитических свойств и стабильности 02.00.15 кинетика и катализ 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии) диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научные руководители:

д.х.н., профессор Швядас В.К.

к.х.н., в.н.с. Гуранда Д.Т.

Москва Диссертация посвящается светлой памяти моего отца Панина Владимира Григорьевича.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ПА пенициллинацилаза;

пенициллинацилаза из Acinetobacter baumannii;

abПА пенициллинацилаза из Alcaligenes faecalis;

afПА пенициллинацилаза из Acetobacter pasteurianum;

apПА пенициллинацилаза из Achromobacter species;

asПА пенициллинацилаза из Arthrobacter viscosis;

avПА пенициллинацилаза из Achromobacter xylosoxidans;

axПА пенициллинацилаза из Bacillus megaterium;

bmПА пенициллинацилаза из Escherichia coli;

eсПА пенициллинацилаза из Kluyvera citrophila;

kcПА пенициллинацилаза из Kluyvera cryocrescens;

krПА пенициллинацилаза из Providencia rettgeri;

prПА пенициллинацилаза из Streptomyces lavendulae;

slПА пенициллинацилаза из Stenotrophomonas maltophila;

smПА пенициллинацилаза из Thermus thermophilus;

ttПА пенициллинацилаза из Xanthomonas citrii;

xcПА цефалоспоринацилаза из Pseudomonas diminuta;

pdЦА ацил-гомосеринлактон ацилазы;

AГЛА ГА глутарил-7-АЦК ацилазы;

Пен-G пенициллин-G;

м-карбокси-п-нитроанилид ФУК;

NIPAB м-карбокси-п-нитроанилид D-ФГ;

NIPGB ФМСФ фенилметилсульфонил фторид;

ФУК фенилуксусная кислота;

ФАА фенилацетамид;

ФОУК феноксиуксусная кислота;

D-ФГ D-фенилглицин;

п-OH-D-ФГ пара-гидрокси-D-фенилглицин;

D-2,5-дФГ D-2,5-дигидрофенилглицин;

ТЗУ тетразолилуксусная кислота;

МК миндальная кислота;

ААК -аминоадипиновая кислота;

6-аминопенициллановая кислота;

6-АПК 7-аминоцефалоспорановая кислота;

7-АЦК 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота;

7-АДЦК L-пропенил-7-АЦК (для формулы II: R2=L-пропенил);

7-ПАЦК МТ-7-АЦК 3-(5-метил-1,3,4-тиодиазол-2-ил)-7-АЦК;

7-амино-3-хлороцефем-4-карбоновая кислота;

7-AХЦК 7-АПРА (6R,7R)-7-амино-8-окси-3-(1-пропиенил)-5-тио-1-азабицикло[4.2.0]окто-2-ен-2карбоновая кислота;

2-АБ 2-аминобутанол;

ФФА фенилацетилфенилаланинол;

МФА R-манделилфенилаланинол;

ОФА o-фталиевый альдегид;

R-NMC N-(R)-манделил-(S)-цистеин;

РСА рентгеноструктурный анализ;

ПЦР полимеразная цепная реакция;

дезоксирибонуклеозид трифосфаты;

dNTP SDS изопропил-бета-D-1-тиогалактопиранозид;

IPTG э.и.50% рассчитанное значение энантиомерного избытка (э.и.) при 50% конверсии;

п/гр подгруппа;

н.а. нет активности;

бета-лактамный антибиотик - термин объединяющий все антибиотики, представленные формулами I (пенициллины) и II (цефалоспорины):

где X=S, O, C или SO2, R1 - боковой радикал, например, остаток ФУК, ФОУК, D-ФГ, П-OHD-ФГА или D-2,5-дигидро-ФГ и их производные, а также ацетил, адипил или глутарил и их производные, R2 и R3=Cl, алифатический или ароматический радикал, дополнительно может включать атомы O, S или N, R4 = OH, алифатический или ароматический спирт и возможные производные, дополнительно может включать атомы O, S или N.

error-prone PCR (склонный к ошибкам ПЦР);

epPCR site saturation mutagenesis (сайт-насыщающий мутагенез);

SSM combinatorial active-site saturation test (комбинаторный насыщающий тест по CAST акт. сайту). Не путать с вариантом названия методики SELEX (сyclic amplification and selection of targets);

iterative saturation mutagenesis (итеративный насыщающий мутагенез);

ISM protein sequence activity relationships (взамосвязь белок-последовательностьProSAR Сокращения, характеризующие изменение свойств мутанта по отношению к ecПА ДТ:

ОИ относительное изменение того или иного свойства, зафиксированное в той или иной реакции;

ОИконв отношение максимальных степеней превращения (%) -лактамной части;

ОИкат относительное изменение каталитической активности;

ОИS/H относительное изменение соотношения начальных скоростей синтеза и гидролиза;

ОИin относительное изменение константы инактивации первого порядка.

В скобках приводятся уточнения или особые условия при которых зафиксировано ОИ.

Например, «ОИконв=31/30 (ац.донор)», означает что % конверсии рассчитан по расходу ацильного донора. Если не оговорено иное, изменение зафиксировано относительно есПА.

Рассматриваемые реакции, катализируемые ПА:

Реакция пG: Гидролиз пенициллина-G с образованием 6-АПК и ФУК;

Реакция цG: Гидролиз цефалоспорина-G с образованием 7-АДЦК и ФУК;

Реакция цС: Гидролиз цефалоспорина-С с образованием 7-АЦК и ААК;

Реакция пV: Гидролиз пенициллина-V с образованием 6-АПК и ФОУК;

Реакция 0а: Синтез Пен-G путем ацилирования 6-АПК амидом ФУК;

Реакция 1а: Синтез ампициллина путем ацилирования 6-АПК амидом D-ФГ;

Реакция 1э: Синтез ампициллина путем ацилирования 6-АПК эфиром D-ФГ;

Реакция 2а: Синтез амоксициллина путем ацилирования 6-АПК амидом п-OH-D-ФГ;

Реакция 2э: Синтез амоксициллина путем ацилирования 6-АПК эфиром п-OH-D-ФГ;

Реакция 3а: Синтез цефалексина путем ацилирования 7-АДЦК амидом D-ФГ;

Реакция 3э: Синтез цефалексина путем ацилирования 7-АДЦК эфиром D-ФГ;

Реакция 4а: Синтез цефадроксила путем ацилирования 7-АДЦК амидом п-OH-D-ФГ;

Реакция 4э: Синтез цефадроксила путем ацилирования 7-АДЦК эфиром п-OH-D-ФГ;

Реакция 5а: Синтез цефрадина путем ацилирования 7-АДЦК амидом D-2,5-дФГ;

Реакция 5э: Синтез цефрадина путем ацилирования 7-АДЦК эфиром D-2,5-дФГ;

Реакция 6э: Синтез цефпродина путем ацилирования 7-ПАЦК эфиром D-ФГ;

Реакция 7: Синтез цефалотина путем ациллирования 7-АЦК тиенилуксусной кислотой;

Реакция 8: Синтез цефазолина путем ацилирования МТ-7-АЦК эфиром ТЗУ;

Реакция 9э: Синтез цефаклора путем ацилирования 7-АХЦК эфиром D-ФГ;

Реакция 10э: Синтез цефпрозила путем ацилирования 7-АПРА эфиром п-ОН-D-ФГ;

(Эфир метиловый, этиловый, гидроксиэтиловый).

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза из Escherichia coli (ecПА) широко используется в фармацевтической промышленности для получения ядер бета-лактамных антибиотиков путем гидролиза природных пенициллинов и цефалоспоринов [1; 2].

Проводится изучение биокатализатора в реакциях энантиоселективного ацилирования аминосоединений в водной среде при получении полусинтетических антибиотиков, разделении рацематов, пептидном синтезе с участием неприродных аминокислот, защите свободных аминогрупп и др. [3; 4]. Однако ограниченная субстратная специфичность и стереоспецифичность фермента дикого типа, осложнение реакций синтеза протеканием побочных реакций гидролиза, низкая стабильность в щелочной среде, а также в присутствии высоких концентраций субстратов во многом ограничивают его более широкое применение.

Перспективным путем решения проблемы является использование методов белковой инженерии для направленного изменения свойств фермента в зависимости от поставленной задачи.

Цель и задачи исследования. Основной целью исследования являлось обнаружение и характеристика мутаций, приводящих к изменению каталитических свойств и стабильности фермента. В связи с этим основными задачами были:

анализ и систематизация литературных и патентных данных для установления структурно-функциональных взаимосвязей и определения роли ранее проведенных аминокислотных замен для улучшения свойств фермента дикого типа;

определение стратегии и выбор аминокислотных остатков для мутагенеза;

получение, выделение и очистка новых мутантных форм фермента для последующей характеристики;

изучение каталитических свойств и стабильности полученных мутантов ecПА, их способности катализировать получение полусинтетических пенициллинов, а также стереоселективное ацилирование аминоспиртов в водной среде;

установление основных эффектов от введенных мутаций, нахождение закономерностей и корреляций, составление рекомендаций.

Научная новизна работы. При выборе стратегии мутагенеза был использован комплексный подход, основанный на анализе последних представлений о структуре и механизме действия фермента, молекулярном моделировании и биоинформатике, что позволило выбрать ранее неизвестные позиции для изменения свойств фермента дикого типа.

Получены двадцать семь новых активных мутантных форм ecПА. При систематическом изучении их каталитических свойств и стабильности показано, что направленный мутагенез позволяет существенно и целенаправленно изменять свойства фермента. Обнаружено, что введение мутации bF256R позволяет в 4 раза, а в комбинации с aR145G более чем в 20 раз увеличить эффективность ацилирования 6-аминопенициллановой кислоты в реакции синтеза бета-лактамных антибиотиков; введение мутации bF71A приводит к 250-кратному увеличению стереоселективности в реакции ацилирования ароматических аминоспиртов.

Установлено, что солевая триада bR297-bE266-bN262 и карбоксил-карбоксилатная пара bE482-bD484 играют существенную роль в поддержании третичной структуры белка.

Отталкивание однозарядной пары остатков bE482-bD484 определяет низкую стабильность ecПА дикого типа в щелочной среде. Обнаружена мутация bD484N, позволяющая сохранить взаимодействие между остатками в щелочной среде, что приводит к 9-кратному увеличению стабильности в щелочной среде, а также в присутствии высоких концентраций субстратов при пептидном синтезе. Впервые показана возможность замены консервативного для пенициллинацилаз N-концевого нуклеофильного серина bS1 на треонин с сохранением каталитической активности путем введения компенсирующей мутации. Установлены прямые корреляции между активностью мутантных форм в реакциях гидролиза хромогенного субстрата и синтеза N-ацильных производных аминоспиртов, а также эффективностью ацилирования ароматических и алифатических аминоспиртов.

Практическая значимость работы. Оптимизирована и внедрена в лабораторную практику методика получения генов мутантных форм ecПА. Создана коллекция, включающая тридцать три новые плазмиды (в том числе девять получены к.х.н. Ясной А.С.), содержащие гены мутантных форм ecПА. Получены, выделены и очищены двадцать семь новых активных мутанта ecПА. Показано, что мутант bD484N не только более стабилен в щелочной среде, но и существенно более устойчив к инактивации при высоких концентрациях субстратов, что расширяет границы применимости фермента в препаративном пептидном синтезе. Препараты на основе мутации характеризуются более чем 4-кратным улучшением эффективности ацильного переноса, что может найти свое применение в препаративном биокаталитическом получении полусинтетических антибиотиков. Стереоселективность мутанта bF71A к S-фенилацетилфенилаланинолу превышает стереоселективность ecПА дикого типа более чем на 2 порядка, что позволяет провести биокаталитическое разделение рацемата аминоспирта и получить индивидуальные энантиомеры высокой оптической чистоты. Разработано программное обеспечение, позволяющее моделировать протекание биокаталитических реакций при варьировании начальных концентраций реагентов и эффективных кинетических параметров.

Апробация работы. Основные положения и результаты работы были представленны на зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (2014 г., Москва, ИБХ, лауреат I премии), международном конгрессе «FEBS-2013» (2013, Санкт-Петербург), международных конференциях «Protein Stabilization» (2014, Италия), «Enzyme Engineering XXII» (2013, Япония), «BioTrans-2013»

(2013, Англия), «Biocatalysis-2013» (2013, Москва), «BioTrans» (2011, Италия), российском симпозиуме «Белки и пептиды» (2011, Петрозаводск).

Публикации. По материалам диссертации подготовлены и опубликованы 4 статьи в рецензируемых научных журналах, получен 1 патент, поданы 2 заявки на изобретение, представлены 11 тезисов докладов международных конференций.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из следующих разделов: «Введение», «Литературный обзор», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Основные результаты и выводы», «Список литературы», «Приложения». Объем диссертации составляет 200 страниц машинописного текста (в том числе 20 страниц приложений) и включает рисунков, 67 таблиц, 2 диаграммы, 5 схем и 151 библиографическую ссылку.

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Пенициллинацилаза (ПА, КФ 3.5.1.11) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз и, в основном, известна как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда. ПА широко распространены в различных микроорганизмах, включая бактерии, грибы и дрожжи. В настоящее время наиболее изученной является ПА из Escherichia coli (ecПА).

В работах [5–8], посвященных в той или иной степени прояснению физиологической роли ПА, было установлено, что ФУК, способная выступать в качестве единственного источника углерода, индуцирует активность ПА в клетках на транскрипционном уровне.

Наряду с этим ген ПА (PAC) обладает некоторыми регуляторными особенностями, свойственными многим генам, принимающим участие в метаболизме углерода. Учитывая подобные факты, в качестве рабочей гипотезы принимается предположение, что ПА вовлечена в ассимиляцию ароматических соединений - источников углерода у непаразитических организмов [9]. Roa A. c соавторами приписали ПА роль молекулярного «дворника», трансформирующего неметаболизируемые фенилацетилированные субстраты в метаболизируемые [10]. Однако, к сожалению, современные комплексные работы по данной тематике отсутствуют, и вопрос о роли ПА in vivo до сих пор остается открытым.

Впервые гидролитическая активность ПА была обнаружена японскими учеными в 1950 г. [11]. ПА катализирует реакцию гидролиза Пен-G c образованием 6-АПК и ФУК (рис.1)

COOH COOH

Рис 1. Ферментативный гидролиз Пен-G, катализируемый ПА.

Уникальность свойств ПА заключается в том, что фермент избирательно катализирует расщепление амидной связи в боковой цепи Пен-G, не затрагивая более лабильную лактамную связь. Это преимущество фермента нашло широкое применение при получении ядер бета-лактамных антибиотиков (6-АПК, 7-АДЦК) из природных пенициллинов. Следует особо отметить, что катализ ПА происходит в исключительно мягких условиях в водной среде. Температурный оптимум лежит в диапазоне 35-38 °С, pH оптимум приходится на 7,6Синтетическая активность ПА была обнаружена 10 лет спустя в 1960 г. [14; 15].

Авторы продемонстрировали возможность получения Пен-G обратно из 6-АПК и ФУК.

полусинтетических бета-лактамных антибиотиков (см. п. 1.1.2.1, а также реакции на стр.9Принципиальным отличием реакции гидролиза пенициллинов и цефалоспоринов является ее обратимость, что делает возможным препаративный биокаталитический синтез новых так называемых полусинтетических аналогов в водной среде [16].

Субстратная специфичность ecПА (класс IIa, согласно [17]) главным образом определяется строением ацильной части (рис.2). Наиболее специфичными субстратами являются эфиры и амиды ФУК, в том числе Пен-G (kcat = 39-50 с-1, KM = 5-10 мкМ, рис. 2), который до появления работы [18] считался наиболее реакционоспособным субстратом. В одной из ранних работ [19] авторы предложили ферменту название «фенилацетилаза».

Рисунок 2. Субстратная специфичность ecПА.

Субстратная специфичность ПА к ацильной части строго ограничена и допускает возможность присутствия лишь небольших заместителей в С положении фенилацетильной части или в ароматическом кольце. Марголин А.Л., Швядас В.К. и Березин И.В. в работе [20] показали, что, в то время как kcat гидролиза фенилацетильных производных и производных DФГ отличаются в незначительной мере, значения KM в случае производных D-ФГ примерно на 2 порядка выше, чем в случае соответствующих фенилацетильных производных. Фермент не способен связывать ацильный остаток, содержащий протонированную аминогруппу.

Специфичность ПА к амидной части широкая – ферментативный гидролиз N-ацильных производных широкого круга аминосоединений, в том числе аминокислот, олигопептидов, сахаров и нуклеозидов, протекает эффективно. Было также обнаружено, что при переходе от Пен-G к фенилацетильным производным некоторых аминокислот и фенилацетиланилидов kcat также меняется слабо, и в большинстве случаев значительно повышается значение KM [20]. Высокая специфичность к фенилацетильной части позволяет использовать такие «цветные» субстраты как NIPAB для определения активности препаратов фермента разной степени очистки [21; 22]. Тем не менее изменение структуры уходящей группы может сильно сказываться и на значении kcat: при переходе от цефалексина к п-нитроанилиду D-ФГ каталитическая константа уменьшается в 100 раз при том, что значение KM одинаково для двух субстратов.

Первые указания на энантиоизбирательность ПА были получены при проведении гидролиза фенилацетильных производных альфа-аминокислот. Cole M. показал, что Lэнантиомеры фенилацетильных производных аминокислот гидролизуются ecПА быстрее, чем соответствующие D-формы субстрата [19]. Значение стереоспецифичности гидролиза фенилацетильных производных альфа-аминокислот достигает значений от нескольких сотен до нескольких тысяч в зависимости от структуры бокового радикала аминокислоты [18; 23].

Гораздо менее эффективно различает энантиомеры ацильных производных нефункционализированных аминов и соединений, содержащих спиртовую группу.

Галунский Б. с соавторами изучили стереоспецифичность ПА из разных источников по отношению к ряду субстратов, представляющих практический интерес [24]. Было показано, что при наличии хирального центра в ацильной части субстрата наблюдается избирательное превращение R-форм, а в случае наличия хирального центра в амидной части – S-форм (рис.3).

Рис.3 Стереоселективность ПА из различных источников по отношению к субстратам, содержащим хиральный центр в ацильной и амидной частях субстрата.

В настоящее время для получения полусинтетических бета-лактамных антибиотиков широко используют методы тонкого органического синтеза – синтез из хлорида D-ФГ•HCl по Шоттен-Бауману (рис.4 слева) и синтез через образование соли Дана и смешанного ангидрида (рис.4 справа).

Рис.4 Химический синтез ампициллина по Шоттен-Бауману (слева) и по Дану (справа).

Как видно из рис.4, многостадийный химический синтез требует введения защитных групп, использования галогенированного растворителя, пониженных температур и сопровождается большим числом побочных продуктов. Несмотря на это, еще 10 лет назад у химического синтеза не было реальной экономически оправданной альтернативы.

Разработкой одностадийного биокаталитического синтеза при помощи ПА занимались многие научные коллективы, начиная с открытия в 60-х годах прошлого века синтетических способностей фермента [15; 16; 25–29]. Опытное биокаталитическое производство цефалексина было организовано в СССР на Рижском заводе медицинских препаратов в середине 80-ых годов. В 2004 г. компания DSM (Нидерланды) анонсировала открытие масштабного производства «ферментативного» цефалексина, цефадроксила и амоксициллина Использование иммобилизованных препаратов ПА позволяет производить [30].

одностадийный ферментативный синтез в исключительно мягких условиях в водной среде.

Ферментативный синтез бета-лактамных антибиотиков, как, впрочем, любых амидов, можно проводить в термодинамически (обратный гидролиз) и кинетически контролируемых режимах (рис.5).

Рисунок 5. Упрощенные кинетические схемы и кривые накопления антибиотика (P) для катализируемого ПА (E) термодинамически и кинетически контролируемого синтеза. A – свободная аминокислота, AD – активированное производное аминоксислоты, N – беталактамный нуклеофил, EA – ацил-фермент, Q – уходящая группа.

В первом случае при прямой конденсации производных ФУК (A) и бета-лактамного ядра (N) максимальный выход продукта равен равновесному, определяется константой равновесия и не зависит от свойств фермента:

Данный подход может быть с успехом реализован при использовании ФУК или тиенилуксусной кислоты в качестве донора ацильной части для синтеза Пен-G и цефалотина [15; 28; 31], однако, не подходит для синтеза антибиотиков, содержащих аминогруппу в боковой цепи (ампициллина, амоксициллина, цефалексина и др.) из-за цвиттерионной природы ацильного донора (ФГ, п-OH-ФГ) в широком диапазоне pH.

В кинетически контролируемом режиме, когда происходит перенос ацильной группы от активированного донора (сложных эфиров, амидов, N- ацилированных аминокислот), максимально достижимая концентрация продукта обычно превышает равновесную (рис.5), что делает данный подход более привлекательным. Экспериментальные исследования кинетики реакции ацильного переноса показывают, что реакция описывается схемой 1 [32]:

Схема 1. «Минимальная» кинетическая схема ферментативного переноса ацильной группы на нуклеофил. E – свободный фермент, S – активированный донор ацильной части, P – продукт гидролиза донора, P2 – продукт гидролиза ацилферментного комплекса, N – нуклеофил, P – целевой продукт, ES – фермент-субстратный комплекс, EA – ацилфермент, EP – комплекс фермент-продукт, EAN –ацилфермент-нуклеофильный комплекс.

Процесс протекает через последовательное образование ацилферментного (EA) и ацилфермент-нуклеофильного комплекса (EAN), который в свою очередь подвергается трансформации и приводит к образованию продукта (P). В теоретических работах [32–34] по кинетике ацильного переноса, катализируемого ферментами, действующими по данной схеме, показано, что при фиксированных начальных концентрациях ацильного донора (S0) и нуклеофила (N0) максимальный выход целевого продукта зависит только от значений трех ключевых параметров:

фермента по отношению к продукту (P) и исходному ацильному донору (S).

параметра =k4/(k3·KN), характеризующего относительную реакционную способность нуклеофила (N), параметра =k5/k4, характеризующего способность тройного комплекса превращаться по гидролитическому или синтетическому пути.

Конкурирующие реакции непродуктивного гидролиза ацильного донора (k3) и образующегося антибиотика (k-4) – основные недостатки кинетически контролируемого синтеза бета-лактамных антибиотиков. Одним из принципиальных подходов для устранения данных недостатков и увеличения выхода является оптимизация условий проведения синтеза.

Чтобы уменьшить негативное влияние воды, как нуклеофила, конкурирующего за ацилфермент наряду с акцептором ацильной части, Юшко М.И. и Швядас В.К. предложили проводить реакцию в твердофазной системе [35]. Было показано, что эффективность синтеза ампициллина сильно возрастает при уменьшении содержания воды в системе (рис.6А), а также при увеличении количества внесенной иммобилизованной пенициллинацилазы (рис.6Б).

Рисунок 6. А: Накопление ампициллина в твердофазном режиме синтеза, катализируемого ПА. Содержание воды: 1-35%, 2-30%, 3-20%, 4-15%, 5-10%. Б: Зависимость максимального выхода ампициллина от количесва иммобилизованной ПА в системе.

В работе [36] Юшко М.И. с соавторами воплотили идею использования эффектов кинетического пересыщения системы по отношению к исходным субстратам. При этом для гомогенной пересыщенной системы 6-АПК/амид D-ФГ удалось добиться увеличения выхода по сравнению с твердофазной. Улучшения эффективности ацильного переноса можно также достигнуть при использовании техники pH-градиента [37; 38]. Для этого реакцию начинают при pH 7, благодаря чему достигается хорошая растворимость 6-АПК, а по мере протекания реакции и, следовательно, расходования 6-АПК, раствор плавно подкисляют (до pH 6.3), сдвигая термодинамическое равновесие в сторону синтеза, при этом концентрация 6-АПК всегда близка к насыщающей. Еще одним способом, повышающим эффективность синтетического процесса, является техника, в которой активированный донор и нуклеофил добавляются по ходу их расходования, при этом концентрация нуклеофила поддерживается на уровне насыщения [37; 39]. Показано, что при использовании полунепрерывного режима проведения реакции эффективность синтеза может быть увеличена до практически количественного выхода по 6-АПК и 85% по донору.

Существует также ряд методов, основанных на внесении в реакционную среду различных органических соединений. Внесение таких веществ, как диметилсульфоксид, диметилформамид, глицерин, бутандиол, вызывает заметное изменение значений pKa ионизации функциональных групп [40; 41], что наряду с внесением в систему веществ понижающих активность воды, таких как сорбит, глицерин, сахароза [42; 43], позволяет заметно повысить выход целевого продукта. Есть данные, что при оптимальном содержании метанола в системе (50-60%) выход Пен-G удается увеличить в 8 раз, однако полученный эффект представляет скорее научный, а не практический интерес (увеличение выхода с 3,8 до 31%)[44]. Увеличения выхода также можно достичь при проведении реакции в двухфазной среде путем экстракции целевого соединения в органическую фазу. Например, при проведении реакции в двухфазной системе хлороформ-вода (1об.%) выход Пен-G увеличивается с 10 до 60% по сравнению с реакцией в водной среде [45].

Несмотря на ряд преимуществ, реальное применение данных методов весьма ограничено. Использование описанных техник требует существенного усложнения системы, а использование различных органических добавок сказывается на стабильности биокатализатора и требует введения дополнительных стадий выделения и очистки.

Альтернативным решением проблемы может быть использование более эффективного катализатора. В отличие от термодинамически контролируемого синтеза, в кинетически контролируемом свойства фермента влияют на выход целевого продукта. В связи с этим получение катализатора с улучшенными кинетическими характеристиками представляет большой практический интерес (см. раздел 1.2).

1.1.2.2 Разделение энантиомеров аминосоединений промышленно значимых областях является получение энантиомерно чистых аминосоединений.

В работе [46] было впервые проведено высокоэффективное биокаталитическое ацилирование аминосоединений в водной среде. Было показано, что катализируемое afПА стереоселективное ацилирование аминосоединений, содержащих ароматические группы, в отличие, например, от ацилирования в органических средах липазами [47], протекает чрезвычайно быстро с высокой хемоселективностью, а образующийся продукт может быть впоследствии деацилирован тем же ферментом. Обе стереоселективные стадии – ацилирование и деацилирование могут быть объединены в единый интегральный биокаталитический метод разделения энантиомеров аминосоединений, использующий весь каталитический потенциал afПА, где на первой стадии проводится исчерпывающее ацилирование активного L-энантиомера в рацемате аминосоединения и после отделения незатронутого D-антипода на второй стадии проводится гидролиз N-ацильного производного с образованием свободной L-формы:

1. Стереоселективное ацилирование :

2. Стереоселективный гидролиз:

Обе реакции, катализируемые afПА, проходят в водных растворах с высокой эффективностью. По сравнению с разделением энантиомеров, основанном на одном ферментативные реакции, позволяет получить оба энантиомера и обеспечивает двойной контроль энантиоселективности. Природный катализатор ecПА эффективен для получения оптически чистых аминокислот, что основано на высокой стереоспецифичности к этому классу аминосоединений. Однако, для аминоспиртов и аминов, содержащих алифатические группы, стереоспецифичность ecПА и afПА на порядки ниже [48]. В связи с этим получение катализатора с улучшенной стереоспецифичность к данным соединениям представляет большой практический интерес.

1.1.3 Структурно-функциональные особенности ecПА Зрелый фермент ecПА – это периплазматический гетеродимер с молекулярной массой 86 кДа, состоящий из a- и b-цепей (209 и 566 аминокислот, соответственно) [9]. Обе субъединицы фермента образуются из общего предшественника (рис.7) в результате автокаталитического посттрансляционного созревания [49].

Рисунок 7. Предшественник ecПА.

Сигнальная последовательность (s) состоит из 26 аминокислот и предназначена для прямого транспорта предшественника в периплазму, а 54-аминокислотный участок между aи b-цепями (pro) влияет на окончательное сворачивание цепей. Также известно, что ион Ca2+, присутствующий в структуре белка, способствует процессингу [50].

Первый рентгеноструктурный анализ ПА был проведен в 1995 году для ecПА c разрешением в 1,9 (1pnk) [9]. Согласно полученным данным, гетеродимер имеет усредненные размеры 70x50x55 и состоит из двух тесно переплетенных цепей, формирующих типичный мотив укладки и образующих пирамидальную структуру с глубокой чашеобразной выемкой, на дне которой находится активный центр (рис.8).

Рисунок 8. Трехмерная структура ПА (стереоизображение). а-субъединица показана красным цветом, b-субъединица – синим.

В ранних работах по изучению ПА было показано, что ключевую роль в катализе играет остаток серина, ковалентная модификация которого при помощи ФМСФ приводит к полной потере ферментом каталитической активности [51]. Данные РСА по ковалентному комплексу ecПА с ФМСФ (1pnm) [50] уточнили, что этим ключевым остатком является Nконцевой серин b-цепи. Тем не менее, вблизи остатка bS1 нет групп (H, E, D), которые обычно присутствуют в активном центре сериновых протеаз и принимают участие в каталитических актах ацилирования и деацилирования посредством переброса протона по образуемой ими цепочке сопряженных кислот и оснований. Их роль выполняет собственная аминогруппа серина, что дало основание отнести ПА к классу так называемых гидролаз с Nконцевым нуклеофилом или Ntn-классу (N-terminal nucleophile) [52].

Механизм модельной реакции, исследованный Чиловым Г.Г. с соавторами методами квантовой механики, можно описать следующим образом [53]. Атака атома O N–концевого серина по карбонильному атому углерода субстрата может сопровождаться передачей протона с гидроксильной группы на собственную -аминогруппу. Образующийся при этом оксианион может стабилизироваться взаимодействием с амидной группой bN241 и атомом азота полипептидного остова, принадлежащему bA69. Далее протон, акцептированный аминогруппой серина, может передаваться по той же самой цепочке на уходящую группу.

QM/MM моделирование полного каталитического цикла гидролиза ПенG под действием есПА показало [54], что -аминогруппа N-концевого каталитического S1 действительно участвует в прямой передаче протона на основных каталитических стадиях и совместно с остатками оксианионного центра A69 и N241, а также остатками R263 и Q23 образует систему взаимодействий, приводящих к стабилизации тетраэдрических интермедиатов, переходных состояний, ориентации субстрата и аминокислотных остатков активного центра фермента. Остатки R263 и Q23 обеспечивают целостность каталитического механизма:

R263 участвует в ориентации субстрата, а также -аминогруппы S1 и координирует остаток оксианионного центра N241 в ходе всего каталитического цикла, в то время как основная цепь Q23 отвечает за ориентацию как S1, так и субстрата. Таким образом была аминокислотного остатка в Ntn-гидролазах, и есПА в частности, напрямую активировать нуклеофильную группу без участия дополнительной молекулы воды. Предполагаемый механизм катализа представлен на схеме 2. Интересно отметить, что в представлении РСА предполагалось участие молекулы воды в цепи переноса протона [9].

Схема 2. Каталитический механизм с участием N-концевого серина [54]. На рисунке представлены 1- свободный фермент, 2 - тетраэдрический интермедиат, 3 - ацилфермент.

Показаны также два возможных пути превращения ацилфермента: деацилирование, с участием воды, и ацилирование, с участием нуклеофила (Nu:).

1.1.3.4 Конформационные переходы в активном центре.

В работах [55; 56] был проведен РСА комплексов ecПА с различными лигандами.

Сравнение карт электронной плотности фермент-лигандных комплексов и исходного белка свидетельствовало о том, что пространственное расположение аминокислотных остатков ПА в свободной форме и в комплексе с рассмотренными ингибиторами мало отличается (в пределах 0.2), за исключением области активного центра, находящейся в сфере с радиусом 15. Таким образом, при связывании некоторых лигандов происходят конформационные изменения в активном центре ПА, и, в зависимости от структуры лиганда, два аминокислотных остатка - aF146 и aR145 - могут находиться в двух энергетически выгодных пространственных положениях – в «закрытой» конформации, где гуанидиновая группа остатка aR145 связана с карбонильным кислородом остатка bF24 и гидроксильным кислородом bY31, и в «открытой» конформации, где боковой радикал аргинина повернут в раствор (рис.9).

Рисунок 9. Конформации боковых радикалов остатков aR145 и aF146 в открытом (показано красным цветом) и закрытом (показано зеленым цветом) положениях.

Представлено наложение спирального региона a140-a148. Точками изображены позиции Cатомов в доступных рентгеновских структурах ПА и ее комплексов с различными лигандами.

В теоретической работе [57] было показано, что смещение боковых цепей остатков aR145 и aF146 является лишь частью сложных структурных перестроек в активном центре фермента (рис.10).

Рисунок 10. Закрытая (А) и открытая (Б) конформации ecПА.

Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на связывание субстратов обусловлено тем, что остаток aF146 образует одну из стенок «гидрофобного кармана». В закрытой конформации фермента горлышко гидрофобного кармана слишком узко, чтобы позволить связаться ацильной части субстрата, однако при переходе фермента в открытую конформацию и смещении бокового радикала остатка aF146 главный диаметр увеличивается до 9, что достаточно для проникновения субстрата в гидрофобный карман.

Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на каталитические свойства фермента связано с системой конформационных переходов остатков aN148, aS149, bF71 и bN241. Конформационный переход освобождает дополнительное место для бокового радикала bF71, который смещается как целое, плотно прижимаясь к спирали, что приводит к увеличению сольватно-доступной площади остатка bN241, и, как следствие, дестабилизации оксианионного центра [57].

Таким образом, в открытой конформации облегчено проникновение субстрата в активный центр, а в закрытой облегчен катализ как за счет лучшего связывания, так и за счет благоприятной геометрии.

Аминокислотные остатки активного центра, отвечающие за связывание ацильной части субстрата и, следовательно, определяющие субстратную специфичность фермента, были установлены из РСА комплекса пенициллинацилазы с ФУК (1pnl, рис.11) [9].

PAA PAA

Рисунок 11. Строение гидрофобного кармана пенициллинацилазы по данным РСА (стереоизображение). Гидрофобные остатки, участвующие в связывании субстрата, показаны желтым цветом. Остатки, непосредственно участвующие в катализе (bS1, bA69, bN241) обозначены зеленым цветом. Положительно заряженные остатки (bR263 и aR145) выделены красным.

Было показано, что определяющую роль в связывании играют гидрофобные остатки, принадлежащие как a-, так и b-цепи. Стерически ограниченная гидрофобная полость в свободном состоянии имеет термодинамически невыгодный контакт с окружающей средой, и в результате гидрофобного взаимодействия субстрата с ферментом имеет место двойной выигрыш в энергии, складывающийся из энергии переноса гидрофобного субстрата из воды в гидрофобную полость фермента и выигрыша энергии за счет вытеснения воды из активного центра [21].

Так, гидрофобные взаимодействия существуют между бензольными кольцами ФУК и bF24, которые располагаются параллельно друг другу. aF146 находится на противоположной стороне гидрофобного кармана. Он также взаимодействует с ФУК, и при этом экранирует активный центр от растворителя. Еще один фенилаланин, bF57, локализован на дне полости.

Наименьшее расстояние между ним и ингибитором составляет 4.7, что слишком много для прямого взаимодействия. Однако этот остаток может быть важен для поддержания структуры сайта связывания, поскольку отстоит на 3.5 от bP22 и на 3.9 от bF24, которые непосредственно участвуют в связывании субстрата. Также в гидрофобном кармане присутствуют такие неполярные аминокислотные остатки, как bI177 и aM142.

При анализе рентгеноструктурных данных по комплексу пенициллина с неактивным мутантом bN241A (1fxv) [58], становится ясно, что Пен-G на первом этапе связывается в открытой конформации, что позволяет объемной амидной части субстрата уместиться в активном центре фермента. В открытой конформации фенильное кольцо остатка bF оказывается в плоскости параллельной бета-лактамному кольцу. Более того, появляются Вандер-Ваальсовы взаимодействия между метильной группой Пен-G и С1 атомом aF146, что также усиливает связывание.

Комплекс нативного фермента с «медленным» субстратом сульфоксидом Пен-G представляет собой фермент-субстратный комплекс непосредственно перед каталитическим актом (1gm9) [56]. Позиции остатков aR145 и aF146 в данном случае соответствуют закрытой конформации, а амидная группа bN241 образует водородную связь с карбонильным кислородом субстрата. При этом бета-лактамное кольцо сдвигается на 3.5 по направлению к остатку bR263, который, наряду с bN388, взаимодействует с карбоксильной группой субстрата (рис.12).

Рисунок 12. Наложение структур комплексов Пен-G в открытой конформации (1fxv, зеленый) и сульфоксида Пен-G в закрытой конформации (1gm9, красный) в районе активного центра.

В ходе исследования структуры фермент-субстратных комплексов с Пен-G методами молекулярной динамики [57] было показано, что в связывании амидной части субстрата заметную роль играет также остаток bS386, который образует водородную связь с карбонильным кислородом четырехчленного цикла, а также положительно заряженный остаток aR145, взаимодействующий с карбоксильной группой субстрата опосредованно через мостиковые молекулы воды.

Мутационный анализ остатков aR145 и bR263 показал, что оба остатка существенны для катализа, а bR263 необходим также для автокаталитического созревания [59]. Изучение pH профилей активности мутантов по этим остаткам говорит о существенной роли положительного заряда гуанидиновой группы. Также полученные структурные и кинетические данные показывают, что bR263, положительный заряд которого увеличивает полярность оксианионного центра, принимает участие во всем каталитическом цикле (см.

раздел 1.1.3.3). Следует отметить, что как bR263, так и aR145 консервативны и присутствуют в ПА из почти всех известных источников.

Помимо описанного продуктивного связывания субстратов в активном центре ПА в работе [60] с помощью методов молекулярного докинга и молекулярной динамики удалось обнаружить два дополнительных режима связывания – предпродуктивный и непродуктивный, которые характеризуются сравнимыми с продуктивным состоянием энергиями связывания. Уникальным свойством предпродуктивных и непродуктивных комплексов является то, что ацильная группа субстрата не попадает в гидрофобный карман, а адсорбируется на участке активного центра между остатками bR263 и aR145.

1.1.3.7 Локализация участка связывания бета-лактамных нуклеофилов.

Определение продуктивного сайта связывания нуклеофила в ацилферментнуклеофильном комплексе является нетривиальной задачей из-за низкой прочности таких комплексов (оценка константы связывания нуклеофила составляет 1-10 мМ, что соответствует энергии связывания -4ккал/моль). В то же время в работе [57] с помощью определенных подходов удалось получить комплексы, стабильные в течение 10 нс. В полученных ацилфермент-нуклеофильных комплексах аминогруппа нуклеофила (6-АПК) занимает строго определенное положение, образуя водородные связи с терминальным азотом b-цепи фермента и кислородом основной цепи остатка bQ23. Эти водородные связи фиксируют аминогруппу нуклеофила в положении, благоприятном для нуклеофильной атаки:

электронная пара аминогруппы нуклеофила обращается к атакуемому карбонильному атому углерода ацилфермента, и становится возможным перенос протона с аминогруппы нуклеофила на концевую аминогруппу b-цепи ацилфермента (рис.13).

Рисунок 13. Продуктивное связывание 6-АПК в D-ФГ-ecПА.

С другой стороны, такое расположение аминогруппы нуклеофила оказывается благоприятным и для связывания бета-лактамного ядра. Поскольку взаимная ориентация аминогруппы и остальной части субстрата жестко связаны, фиксация аминогруппы в активном центре фермента ведет к тому, что карбонильный кислород 4-х членного кольца и карбоксильная группа субстрата связываются в строго определенном месте, а именно, образуют водородные связи с остатками bR263, bS386.

Сравнение сайтов связывания бета-лактамного ядра в продуктивных комплексах ПенG и 6-АПК показывает ряд существенных различий. Если в продуктивном комплексе Пен-G карбоксильная группа бета-лактамного ядра связывается с остатком bN388 и находится в непосредственной близости от аргинина bR263, то 6-АПК в комплексе с ацилферментом более подвижна, и ее карбоксильная группа в большей степени экспонирована в раствор, располагаясь практически на равном расстоянии от обоих положительно заряженных остатков активного центра – aR145 и bR263, при этом с остатком bR263 молекула нуклеофила образует водородную связь своим карбонильным кислородом, а остаток aR контактирует исключительно с гидрофобной частью 6-АПК (рис.13).

Несмотря на огромное число уже описанных ферментов, текущий запрос на новые биокатализаторы с измененными свойствами продолжает расти. Такие свойства ферментов, как субстратная специфичность, хемио-, регио- или энантиоселективность, термостабильность, pH профиль, операционная стабильность и др., формируют постоянный интерес со стороны биотехнологии. Для удовлетворения этого интереса и получения подходящего биокатализатора для того или иного процесса, можно выделить три основополагающие стратегии:

экспериментального скрининга различных коллекций штаммов [62], а также метагеномных библиотек [63–65]. В отношении ПА реализация данной стратегии представлена в разделе 1.2.1.

которое включает определение переходного состояния для рассматриваемой реакции, предложение активного сайта, способного стабилизировать данное состояние (QM/MM моделирование) и, наконец, встраивание активного сайта в существующий белковый каркас (например, обратный ROSETTA алгоритм [66]). Теоретически сюда же можно отнести получение биокаталитических моноклональных антител - абзимов, где на первом этапе аналогом переходного состояния выступает фосфорорганическое соединениe [67; 68] В-третьих, это улучшения каталитических свойств существующих ферментов методами белковой инженерии. Белковая инженерия представляет мощный инструмент для улучшения каталитических свойств фермента в реакциях, в той мере в какой они не являются природной функцией фермента. Для этого используют подходы, которые условно можно разделить на методы случайного и направленного мутагенеза (рис.14).

Рис.14 Методы белковой инженерии. Приведены ссылки на наиболее характерные работы.

При отсутствии или недостатке информации о структуре белка чаще прибегают к подходам случайного мутагенеза. Существенным ограничением случайного мутагенеза является необходимость наличия высокопроизводительного скрининга при изучении больших библиотек мутантов. При наличии структурной информации, но отсутствии комбинированные методы случайного и направленного мутагенеза, что может существенно улучшить качество и уменьшить объем изучаемой библиотеки. Непосредственно к направленному мутагенезу прибегают при высоком уровне понимания структурнофункциональных особенностей, а также при использовании методов молекулярного моделирования. В отношении ПА стратегия белковой инженерии представлена в разделе 1.2.2.

В настоящее время известны ПА из более чем 40 бактерий. Филогенетическое дерево для некоторых из них представлено на рисунке 15.

Рисунок 15. Филогенетическое дерево ПА, найденных при помощи BLAST. Серое поле содержит ПА, последовательности которых идентичны не менее чем на 40%.

Посредством функционального скрининга библиотеки генов почвенной культуры авторами работы [65] была обнаружена пенициллинацилаза PAS2 на 51% идентичная ecПА.

По сравнению с ecПА для PAS2 характерно 5-кратное улучшение связывания ФУК (табл.1), что является негативным фактором при использовании фермента в промышленно значимой реакции пG. В реакции гидролиза NIPAB PAS2 характеризуется 4-кратным уменьшением константы Михаэлиса и 5-кратным улучшением константы специфичности по сравнению с ecПА. В реакции гидролиза ампициллина PAS2 показывает 5-кратное улучшение константы Михаэлиса.

катализируемых PAS2 и ecПА [65].

В отношении реакций синтеза пенициллинов PAS2 характеризуется значительным увеличением параметра (табл.2). Однако параллельно происходит увеличение параметра, что негативно сказывается на выходе целевого антибиотика. Исключение составляет реакция синтеза Пен-G (0a), для которой наблюдается одновременное улучшение всех кинетических параметров, что приводит к более чем 2-кратному увеличению выхода целевого продукта.

Таблица 2. Комплексные кинетические параметры в реакции синтеза различных антибиотиков, катализируемых PAS2 и ecПА (pH 7, 30°C).

Также следует отметить 3-кратное увеличение параметра 1/ (максимально достижимый S/H) в реакции синтеза амоксициллина, что хорошо иллюстрирует график зависимости S/H от концентрации нуклеофила на рисунке 16.

Рисунок 16. Синтез ампициллина при помощи PAS2() и ecPA() и амоксициллина при помощи PAS2() и ecPA().

Возможности белковой инженерии представляют большой интерес для дальнейшей оптимизации PAS2, что и было сделано теми же авторами в работе [69] (см. описание в разделе 1.2.2) В работе [70] описана asПА (52% идентичности ecПА), для которой каталитическая активность в реакции пG в 1,5 раза выше, чем для ecПА. Данный фермент способен также катализировать гидролиз пенициллинов, содержащих -аминогруппу в ацильной части, в раза лучше, чем Пен-G (табл.3) и, похоже, это единственная из описанных ПА, которая способна гидролизовать ампициллин быстрее, чем Пен-G. В данном отношении особый интерес представляет гидролаза эфиров -аминоксилот (АЭГ, [71]), однако, ее рассмотрение выходит за рамки данного обзора.

Таблица 3. Субстратная специфичность ПА и АЭГ из различных организмов.

Относительная активность,% Ферм. Пен-G Пен-V Ампициллин Амоксициллин Цефалексин NIPAB slПА (12% идентичности ecПА) с повышенной специфичностью к ФОУК (Пен-V) и еще более к длинным алифатическим остаткам (Пен-K) описана в работе [72] (табл.4). При этом slПА практически неспецифична к ФУК (Пен-G), в связи с чем данный фермент принято относить к классу пенициллин-V-ацилаз.

Таблица 4. Каталитические характеристики slПА.

Субстрат ацильная часть kcat, c-1 KM, мМ kcat/KM,мМ-1 с- kcПА (85% идентичности ecПА) [73] характеризуется сдвинутым, по сравнению с ecПА, в область более высоких значений температур профилем активности и раcширенным в обе стороны профилем pH-стабильности (рис.17) Рисунок 17. Температурный (слева) и pH (справа) профили активности kcПА.

bmПА (29% идентичности ecПА) описана в работе [74] и также характеризуется сдвинутым в щелочную область pH профилем активности (рис.18).

Рисунок 18. pH профиль активности для bmПА.

Для krПА известно, что параметр в реакции 2а на 20% больше, чем в случае ecПА, однако параметр увеличен на 63%, что, в конечном итоге, негативно сказывается на выходе целевого продукта [75]. Также в работе [76] было показано, что среди четырех ПА (krПА, ecПА, prПА и afПА), krПА обладает наилучшим показателем S/H в реакции 3а (рис.19).

Рисунок 19. S/H в реакции 3a для ПА из 4-х различных источников.

Термостабильная afПА (39% идентичности ecПА) представлена голландскими учеными в работе [77]. Активность afПА не изменяется при инкубировании при 50°С в течение 20 мин, в то время как ecПА при тех же условиях необратимо теряет половину исходной активности. Улучшение термостабильности afПА авторы приписывают наличию в структуре дисульфидного мостика от двух цистеинов, которых нет у ecПА (см.3.2.4.6). В отношении реакции гидролиза NIPAB afПА обладает в 6 раз более высокой константой специфичности (kcat/KM), а в отношении реакции пG в 3 раза более высокой, чем ecПА (табл.5) Таблица 5. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и Пен-G.

Эти данные несколько расходятся с данными работы [78] (табл.5 в скобках), которые свидетельствуют в сторону еще большего (42 раза) увеличения константы специфичности в реакции гидролиза NIPAB. Таким образом, авторы заявляют, что afПА является самой активной в реакциях гидролиза NIPAB и Пен-G среди описанных на текущий момент ( г.) пенициллинацилаз. Также следует особо отметить сильно сдвинутый в щелочную область pH профиль активности (рис.20), что выгодно отличает afПА от многих других известных ПА, расширяет область ее применения и возможности для выделения и очистки.

Рисунок 20. Профиль каталитической активности afПА.

В работе [79] китайскими учеными представлена axПА (51% идентичности ecПА). По мнению авторов, это самая термостабильная ПА из всех ранее описанных в литературе на момент публикации. t1/2 при 55°С (рис.21) в 4 раза больше, чем для afПА, а оптимум активности приходится на температуру выше 60°С (рис.22 слева). pH оптимум смещен в сторону более высоких значений и составляет pH 8,5 (рис. 22 справа).

Рисунок 21. Термоинактивация axПА и ecПА. - axПА при 55°С, - axПА при 60°С, - ecПА при 55°С, х - ecПА при 60°С.

Рисунок 22. Температурный (слева) и pH (справа) профили активности axПА.

По результатам гомологичного структурного моделирования и выравнивания первичных последовательностей было показано, что axПА обладает повышенным числом внутренних ион-парных сеток, пониженным содержанием N и Q, большим количеством R, а также значительным числом P, что вносит существенный вклад в стабильность фермента (табл.6). Интересно также, что GC состав (69%) нуклеотидной последовательности максимальный из всех описанных ранее для ПА.

Таблица 6. Предполагаемые факторы, ответственные за повышенную стабильность axПА.

axПА обладает также несколько улучшенными кинетическими характеристиками. В реакции гидролиза NIPAB наблюдается 2-3-кратное улучшение константы специфичности по сравнению с ecПА.

Недавно испанские ученые открыли термостабильную ttПА (21% идентичности ecПА) из термофильного источника, для которой оптимум экспрессии и активности одновременно приходится на 75°C (t1/2 составляет 9 часов), что на 15°C больше, чем для axПА. Фермент также характеризуется повышенной операционной стабильностью по отношению к органическим растворителям, детергентам и экстремальным pH. При этом pH оптимум активности приходится на pH 4. Для фермента характерна субстратная специфичность по отношению к алифатическому пенициллину-K, однако величина kcat/KM довольно низкая (0,016 мкМ/с), а по отношению к Пен-G константа специфичности падает на 5 порядков [80].

Подводя итог, стоит отметить, что под некоторые практические задачи можно подобрать пригодный природный вариант ПА. Однако, к сожалению, возможности белковой инженерии новых объектов весьма ограничены. Практически ни для одного из природных ПА не описана РСА структура (исключения - ecПА и afПА), большинство ферментов не охарактеризовано в биотехнологически важных реакциях, а также отсутствуют данные по мутационному анализу. Все это значительно сокращает возможности для изучения структурно-функциональных особенностей и рационального изменения свойств. Также следует отметить, что для каждого нового объекта необходимо оптимизировать методы экспрессии, выделения и очистки. Таким образом, наиболее изученная ecПА является во многих отношениях более привлекательной. При этом стоит отметить, что закономерности, найденные для ecПА, можно переносить и на другие объекты, как это сделано, например, в работах [69; 81; 82].

Первые шаги в целенаправленном улучшении каталитических свойств ПА с помощью случайного мутагенеза были реализованы методом «направленной эволюции», основанной на селекции жизнеспособных штаммов при использовании ауксотрофов. В 1989 г. американские ученые использовали лейциновый ауксотроф для улучшения сродства ecПА к фенилацильной части, содержащей -аминогруппу [83]. Эксперимент проводили при пониженных значениях pH, в условиях почти полного протонирования -аминогруппы субстрата. Исходным субстратом и единственным источником лейцина при этом служил D-ФГ-лейцин. В результате эксперимента был получен мутант, для которого при pH 6,5 kcat/KM увеличена в раз, при том что kcat увеличилась в 40 раз. Интересно, что улучшение тем более характерно, чем ниже pH. Таким образом, авторы показали возможность изменять специфичность ecПА и получать мутанты, которые при низких pH гидролизуют амиды с -аминофенилацетильным мотивом более быстро. В работe [84] для kcПА аналогичным образом были улучшены кинетические параметры для С-замещенных производных ФУК, в том числе ФГ, МК, СCH3-ФУК, адипил, аминоадипил, фталил боковых радикалов. Также наблюдали увеличение активности в гидролизе ряда антибиотиков, в том числе в реакции пG. Авторы обнаружили, что за приобретенные свойства отвечает мутация F360V, которая соответствует остатку bF в ecПА (см.приложение 1.1). В работе [85] при использовании пролиновых и лейциновых ауксотрофов удалось достичь улучшения в гидролизе ряда антибиотиков, в том числе на 30% ускорить реакцию пG для мутанта G359D, что соответствует bG70 в ecПА. При этом эффект, предположительно, достигается не за счет улучшения специфической активности (она, как показано в той же работе, уменьшается в 3 раза), а за счет значительного ухудшения ингибирования продуктом гидролиза ФУК. Для другого мутанта («B10») удалось улучшить термостабильность при 45°С почти в 4 раза по сравнению с ecПА. Однако уже при 50°С эффект исчезает.

Метод, который стал популярен в последние годы и который успешно используется для оптимизации ферментов, вовлеченных в технологические процессы, является ДНКшаффлинг. Эта методика включает в себя стадию рекомбинации гомологичных молекул ДНК из различных организмов, в результате чего получается набор белков с самыми разнообразными мутациями. Одним из вариантов этого метода является конструирование гибридных геномов в одном семействе, когда рекомбинируются гены гомологов с высоким уровнем идентичности ДНК.

В работе [86] объединяли гены ecПА, kсПА (85% идентичности по ДНК ecПА) и prПА (52% идентичности по ДНК ecПА), при этом наблюдали незначительное улучшение S/H лишь относительно prПА. В более поздней работе [75], с той же целью, брали ecПА, krПА (77% идентичности по ДНК ecПА) и prПА (52% идентичности по ДНК ecПА). Из 700 клонов 81 трансформант синтезировал ампициллин не более чем в 2 раза хуже, чем ecПА, трансформантов обнаруживали улучшение параметра S/H. Среди полученных гибридов обнаружили заметные улучшения параметров в реакциях 1, 2а, 3 (табл.7) по сравнению с krПА. Также наблюдали увеличение скоростей превращения.

Таблица 7. Синтетические свойства родительских и гибридных ПА в реакции 1а.

Интересно отметить, что для гибрида 6B11 избирательно улучшаются все параметры, при этом уменьшение, что было показано в независимом эксперименте, вызвано 2-кратным увеличением KP для продукта синтеза – ампициллина, а для гибрида 73С4 увеличение вызвано 2-кратным увеличением KS для D-ФГА. Секвенирование показало, что эти гибридные мутанты берут начало от ecПА и содержат часть гена от krПА. Также были найдены случайные мутации, не относящиеся ни к одному из родительских генов, большинство из которых находилось далеко от активного центра. Для изучения вклада от мутации bG375S, найденной в гибриде 6G8, авторы сделали соответствующую одиночную замену в ecПА. Было показано увеличение максимального выхода продукта на 22%, а соотношения S/H на 80% при сохранении уровня активности, по сравнению с ecПА. При этом не наблюдали увеличения параметра. Весьма интригующим является тот факт, что остаток bG375 находится на значительном расстоянии от активного центра (17A до каталитического bS1 и 10A до ближайшей карбоксильной группы бета-лактамного кольца субстрата). Еще одна мутация aD148G, обнаруженная в двух гибридах и также расположенная вдалеке от активного центра, для вновь созданного одиночного мутанта дает увеличение выхода в синтезе ампициллина на 20% при увеличении S/H на 80%. В данном случае остаток формирует множественные водородные связи с консервативными атомами, которые, по мнению авторов, при снятии заряда перестают удерживать каталитическую петлю, содержащую остатки aR145 и aF146, что приводит к ее более полному вовлечению в связывание по механизму индуцированного соответствия. В результате, аD148, также как и bG375, становятся потенциальными мишенями для направленного мутагенеза. Стоит подчеркнуть, что эти мишени практически нельзя идентифицировать на основании одних лишь рациональных подходов. Однако, к сожалению, авторы не дают никаких других характеристик мутантов. Так, например, не понятно, что при этом происходит со стабильностью фермента. Также, на наш взгляд, весьма опрометчиво со стороны авторов приводить математически рассчитанные на основании трех экспериментальных параметров комплексные значения Pmax и не учитывать существенную погрешность подобной оценки.

Получение одноцепочечной ПА, путем объединения а и b субъединиц при помощи короткого пептида позволяет получить фермент, созревание которого больше не зависит от автопротеолитических стадий процессинга. С целью получить два антипараллельных -тяжа на двух близкорасположенных (5A) концах субъединиц ecПА, Osuna J. с соавторами удалили первые 4 аминокислоты с N-конца а-цепи и последние 2 аминокислоты b-цепи [87]. Для соединения двух концов в общую антипараллельную -структуру посредством включения потенциального -поворота был предложен случайный тетрапептидный линкер. Для подбора оптимального состава линкера была генерирована библиотека мутантов объемом примерно 106 вариантов, 40% которых отсеялись сразу на этапе роста. На этапе проверки специфической активности было отобрано 15 линкеров. Оказалось, что все пермутированные варианты обладают пониженной активностью в реакции пG (табл.8). Варианты с линкерами NEGM и DPAG были оттитрованы при помощи PMSF. Однако, никакой детальной характеристики препаратов авторы, к сожалению, не приводят.

Таблица 8. Последовательности линкеров функциональных одноцепочечных ecПА.

Активность Еще до того, как была расшифрована структура ПА, производились попытки по направленному мутагенезу отдельных остатков. В работе [88] на основании выравнивания первичных последовательностей ecПА с другими пенициллин-связывающими белками авторы получили информацию о некоторых консервативных регионах, в том числе было сделано предположение об участии одного из них (M168-K191, номерация предшественника) в связывании Пен-G. В работе [89] авторы установили, что замена остатка M168, соответствующего aM142 в ecПА, может влиять на специфичность ПА, а в работе [90] было зафиксировано примерно 2-кратное улучшение термостабильности для M168A по сравнению с kcПА ДТ. Данный остаток авторы работы [81] заменяли на A и V в kcПА и получили точечные мутанты с заметно ухудшенной специфичностью к Пен-G и Пен-V по сравнению с kcПА ДТ. Также для данных мутантов авторы наблюдали нелинейный характер зависимости остаточной активности от концентрации ФМСФ, что, однако, может быть связано с чистотой проводимого эксперимента. Аналогично, на основании выравнивания, приведенного в работе [88], те же авторы предложили мутанты kcПА K375N и H481Y, соответствующие bK86 и bH182 в ecПА, для которых в случае фенилацетил-4-аминобензойной кислоты было зафиксировано изменение в KM при отсутствии изменения в kcat. Это дало основание авторам предположить участие данных остатков в связывании амидной части субстрата. Однако, после появления PCA структуры ecПА стало понятно, что эти остатки находятся слишком далеко от активного центра и вряд ли могут принимать участие в узнавании субстрата.

После того как был проведен первый рентгеноструктурный анализ ecПА [9], стало возможным определение роли тех или иных остатков в активном центре, что сформировало предпосылки для рационального подхода к дизайну фермента. В наиболее значимых работах [58; 91–93] основные усилия были направлены на изменение участков связывания ацильного донора и -лактамного нуклеофила. Различные мутации по остаткам aR145, aF146, bF привели к заметному улучшению параметров S/H,,, и, как следствие, выхода в реакциях 1-6. Однако, во многих случаях наблюдали существенную потерю активности и стабильности. Конкретные примеры мутаций рассмотрены ниже.

С целью получить структурную информацию об участке связывания амидной части субстрата, авторы работы [58] провели РСА неактивного мутанта bN241A в комплексе с Пен-G (1fxv). Было установлено, что бета-лактам связывающий сайт формируется боковыми частями остатков aF146 и bF71, которые имеют Ван-дер-Ваальсовы контакты с тиазалидиновым кольцом Пен-G, а также остатком aR145, взаимодействующим с карбоксильной группой субстрата посредством двух мостиковых молекул воды (чего, однако, не наблюдается, например, в структуре 1gm9). Роль остатка aF146 затем изучили при помощи направленного мутагенеза. Было показано, что удаление ароматического остатка в мутантах aF146L и aF146A приводит к значительному ухудшению реакционной способности фенилацетилированных субстратов (табл.9), однако, в тоже время наблюдается заметное улучшение S/H в реакции синтеза Пен-G при заметном ухудшении связывания 6АПК.

Таблица 9. Кинетические характеристики ecПА ДТ и мутантов по остатку aF146.

Замена же на родственный Y приводит к ухудшению синтетических способностей фермента при неизменности константы связывания (ингибирования) 6-АПК. Данный пример иллюстрирует, что не только связывание 6-АПК может играть ключевую роль в различии синтетических способностей фермента. При изучении роли соседнего остатка aR145 теми же авторами в работе [59] было обнаружено, что замены его на С, K и L приводят к 3-6-кратному увеличению параметра S/H в реакции синтеза ампициллина. Однако, активность в реакции пG падает более чем на порядок.

В работе [92] авторы решили изучить роль гидрофобных остатков в реакциях гидролиза и синтеза бета-лактамных антибиотиков. C этой целью был проведен мутационный анализ 3-х фенилаланинов - aF146, bF24 и bF57- в активом центре ecПА (рис 23). По данным Рисунок 23.

Гидрофобный карман ecПА в структуре 1pnl.

активности, за исключением мутанта bF146Y. Следует отметить, что это единственный мутант, для которого было характерно улучшение KM (3 раза) в реакции гидролиза NIPAB, а также уменьшение константы ингибирования ФУК. Однако в реакции 1а данный мутант оказался наихудшим в отношении S/H (40 раз). Мутации по остатку bF57 не привели к существенным изменениям в S/H в реакции 1a, а наибольший эффект наблюдали для мутаций bF24A (2 раза) и aF146L(3 раза). Однако, скорость ацилирования для обоих мутантов была в 10 и 20 раз ниже, соответственно. Поскольку скорость ацильного переноса с эфиров обычно выше, чем с амидов, оба мутанта протестировали в реакции 1э, при этом для мутанта bF24A наблюдали сравнимую с ДТ активность и почти 3-кратное увеличение выхода ампициллина.

Мутант же aF146L оказался в 20 раз менее активным. Таким образом, мутант bF24A потерял амидазную активность, но сохранил эстеразную, а мутант aF146L потерял и ту и другую активности. В связи с этим, оставшуюся часть работы авторы посвятили изучению свойств мутации bF24A. При изучении стационарной кинетики с широким спектром ацильных эстеразной/амидазной активности, приводит к улучшению связывания C-замещенных синтетических ацильных доноров по сравнению с ФУК, а также к уменьшению ингибирования самой ФУК. Для изучения синтетических способностей мутанта были определены параметры альфа и S/H для реакций 1a-4a и 1э-4э (табл.10).

Таблица 10. Кинетические параметры синтеза полусинтетических бета-лактамных антибиотиков для ecПА ДТ и bF24A.

Исходя из представленных данных, можно сделать вывод, что в реакциях 1э-4э для мутанта bF24A характерно одновременное улучшение обоих параметров. При изучении зависимости S/H от концентрации нуклеофила в реакции 1а также было показано улучшение параметра, что делает данный мутант выгодным в более широком диапазоне начальных концентраций. Также авторами была изучена интегральная кинетика реакций 1а, 1э, 3а и 3э, которая подтвердила существенное превосходство мутанта bF24A в отношении выхода для реакций с эфирами (рис.24). Однако, к сожалению, эфиры в технологическом отношении не столь удобны, как амиды, что в первую очередь связано с их повышенной лабильностью.

Риcунок 24. Кинетически контролируемый синтез ампициллина и цефалексина при использовании ecПА ДТ (пунктир) и bF24A (сплошная). A–реакция 3э, B–реакция 3а, С– реакция 1э, D–реакция 1а. ( - антибиотик, - ФГ).

Для эффективного синтеза полусинтетических бета-лактамных антибиотиков (ампициллин, амоксициллин, цефадроксил и др.) благоприятна низкая специфичность к ФУК и высокая к C-замещенным производным ФУК. В работе [93] голландские ученые получили 3 мутанта – aF146Y, bF24A и aF146Y+bF24A, удовлетворяющие данным требованиям.

Удаление ароматического кольца в мутанте bF24A приводит к структурным перестройкам в активном центре, в результате чего ФУК связывается в существенно менее активной открытой конформации, в то время как в ДТ ФУК связывается в закрытой конформации. При этом исчезают водородные связи между карбонильным кислородом ФУК и остатками A69 и N241, образующими оксианионный центр, что объясняет 20-кратное ухудшение связывания (табл.11). В отличие от ФУК, C-X-ФУК (X=CH3, OH, NH2) связывается в закрытой конформации, при этом C-X занимает место удаленной фенильной группы, что приводит к существенному улучшению связывания.

Таблица 11. Константы ингибирования ecПА и ее мутантов С-замещенными производными ФУК.

Интересно также заметить, что мутация по остатку F24 оказывает сильное влияние на стереоспецифичность фермента по отношению к (R)-изомерам C-замещенных ФУК и может рассматриваться как потенциальная мишень для изменения энантиоизбирательности фермента с целью получения оптически чистых С-замещенных производных ФУК (идея реализована в работе [94], см. далее). Замена F146Y не сопровождается конформационными перестройками в активном центре. При этом наблюдается аналогичное есПА ДТ связывание ФУК. Однако, при связывании C-замещенных ФУК образующиеся Ван-дер-Ваальсовы контакты между C-заместителем и Y146:OH делают связывание более продуктивным. Как уже было отмечено выше, данные мутации имеют ряд недостатков. Так для мутации bF24A характерно значительное падение амидазной активности [92], а для мутации bF146Y наблюдается существенное ухудшение эффективности синтеза [58].

В работах [95; 96] авторы получили и детально изучили мутанты bF71L и bF71C, обнаруженные ранее методом «направленной эволюции» в работе [83]. Данные мутации приводят к более чем 100-кратному улучшению константы специфичности в реакции гидролиза глутарил-лейцина при pH 6,0 по сравнению с ecПА ДТ. При изучении кинетики реакции гидролиза NIPAB также были отмечены значительные улучшения константы специфичности, в основном за счет улучшения связывания (табл.12).

Таблица 12. Кинтетические параметры гидролиза NIPAB для ecПА ДТ и мутантов по остатку bF71.

При изучении денатурации в 4,5 М растворе мочевины наблюдали существенное улучшение стабильности для мутанта bF71C. При pH 8,0 и температуре 54°С фиксировали 2кратное увеличение времени полуинактивации (t1/2) для обоих мутантов. Данные мутанты оказались также более стабильными при повышенных pH. При изучении остаточной активности при pH 10,8 в присутствии NIPAB были получены следующие данные для констант инактивации первого порядка (ki): ecПА ДТ 2,3·10-3, bF71C 3,8·10-5, bF71L 1,3·10-4 cОднако, методика изучения pH-стабильности не соответствует общепринятой, так как наличие субстрата, может сильно повлиять на интерпретацию результатов. Не понятно, что в данном случае является решающим: то ли сохранение стабильности, то ли просто повышенная каталитическая активность мутантов.

Шаповаловой И.В. [96; 97] было проведено исследование энантиоселективности ферментных препаратов ecПА, содержащих мутации по остатку bF71 в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных фенилглицина и аспарагиновой кислоты (табл. 13).

Таблица 13. Стереоселективность (E) в реакции гидролиза N-фенилацетильных производных ФГ и аспарагиновой кислоты для ecПА ДТ и мутантов по остатку bF71.

Было показано, что введение мутаций bF71K и bF71E способствует увеличению стереоселективности фермента в 3-6 раз в случае ФГ в амидной части субстрата. В случае аспарагиновой кислоты, когда хиральная дискриминация субстратов представляет более сложную задачу, некоторое увеличение стереоселективности наблюдали только для мутации bF71L.

Ямсковой О.В. было проведено детальное исследование кинетических параметров мутантных форм ecПА, содержащих мутации по остаткам aR145, aS149, bF71, bT384 и bG385 в реакциях ацилирования аминосоединений и гидролиза амидов и установлено, что мутации aR145L и bF71L приводят к значительному улучшению стереоселективности в реакциях ацилирования аминоспиртов (табл. 14) и гидролиза их N-фенилацетильных производных (табл. 15) [48]. Также наблюдалось существенное улучшение эффективности и скорости синтеза по сравнению с ecПА ДТ. Однако, несмотря на довольно существенные улучшения стереоселективности, величина параметра все еще на порядок ниже, чем для аминокислот, и недостаточна для получения препарата в энантиомерно чистой форме.

Таблица 14. Кинетические параметры ферментативного стереоселективного ацилирования рацемата 2-АБ амидом R-МК (pH 9,5, 25oC).

Таблица 15. Стереоселективность в реакции гидролиза N-(R)-манделил-производных аминосоединений для ecПА ДТ и мутантных форм bF71L и aR145L (pH 7,5, 25oC).

Авторы работы [98] изучали аминокислотные остатки, расположенные на поверхности белковой глобулы, и продемонстрировали, что изменение поверхностного заряда может повлиять на стабильность фермента при определенных pH. С помощью вычислений электростатических потенциалов в программе DELPHI авторы предложили мутацию bW431R, локализованную на расстоянии 32 от активного центра, которая привела к 2кратному увеличению t1/2 при pH 8,5. Данный эффект обусловлен, предположительно, взаимодействием аргинина и bQ318 на соседней альфа спирали. Хотя сам по себе низкий по величине эффект вряд ли имеет практическую ценность, однако, может найти свое место в многоточечных конструкциях.

В работе [99] китайскими учеными были получены мутанты bmПА, которые оказались более термостабильными, а также устойчивыми в присутствии органических растворителей.

При этом авторы опирались на то положение, что фермент более стабилен при pH близком к pI. Для понижения pI были произведены замены поверхностных положительно заряженных неконсервативных остатков K на нейтральные маленькие А – bK427A, bK430A, bK427A+bK430A, что привело к гидрофобизации поверхности белка и, как следствие, стабилизации по отношению к органическим растворителям (диметилформамид). Для двойного мутанта также было зафиксировано 2-кратное увеличение t1/2 при 55°С, что делает его сравнимым с afПА. К сожалению, в методической части авторы не приводят никаких пояснений к кинетическим экспериментам. Также по части термостабильности отсутствует иллюстративный материал, что вызывает некоторое недоверие к полученным результатам.

Юрьеву Р. с соавторами удалось получить мутант afПА, в котором а-цепь остается связанной с природным линкером за счет двух мутаций T206G+S213G, которые приводили к заметному замедлению процессинга [100]. Для данного мутанта характерно 2-кратное увеличение kcat и 3-кратное уменьшение KM в реакции гидролиза пG по сравнению с afПА ДТ. Также данный мутант обладает повышенной операционной стабильностью при сохранении термо- и pH-стабильности.

специфичность на цефалоспориновую, открывая тем самым возможность использования ПА в реакции цС. Для этого было проведено структурное выравнивание для ecПА и pdЦА (23% идентичности ecПА), с целью установления соответствия остатков, ответственных за связывание ароматической гидрофобной ацильной части пенициллина в ecПА и линейной гидрофильной ацильной части цефалоспорина в pdЦА (табл.16).

Таблица 16. Соответствие остатков ecПА и pdЦА.

Далее, 7 остатков гидрофобного кармана ecПА заменили на соответствующие остатков из pdЦА. Полученный таким образом многоточечный мутант характеризовался 8кратным улучшением специфичности по отношению к цефалоспорину. Но, к сожалению, эти результаты представляют собой не более чем научную ценность, так как специфичная активность природного цефалоспоринового фермента осталась недостижима.

Методика сайт-насыщающего мутагенеза была реализована в работе [91].

Совместными усилиями российских и голландских ученых удалось добиться значительного увеличения параметра за счет мутаций по остатку aR145, который по данным РСА и, в соответствии с представлениями работы [102], может опосредованно взаимодействовать с карбоксильной группой Пен-G. Предварительные исследования реакции ферментативного синтеза ампициллина в разбавленных растворах показали, что у всех 19-и мутантов возрастает способность к переносу ацильной группы на 6-АПК. Затем были отобраны наиболее перспективных мутанта - aR145L, aR145G, aR145S и проведено детальное изучение кинетических параметров (рис.25, табл.17).

Рисунок 25. Нуклеофильная реакционная способность 6-АПК в реакции 1а для ecПА и мутантов по остатку aR145.

Таблица 17. Эффективные кинетические параметры в реакции 1а для ecПА ДТ и ее мутантов по остатку aR145.

Полученные данные свидетельствуют о том, что удаление положительного заряда в позиции а145 приводит к значительному увеличению нуклеофильной способности 6-АПК.

Почти синхронное увеличение параметра может свидетельствовать о том, что улучшение связывания нуклеофила (Kn), выраженное в увеличении параметра, неизбежно ведет к улучшению связывания продукта синтеза (Kp), и невозможно улучшить оба параметра одновременно, в той степени, в которой невозможно различить связывание нуклеофила и продукта (рассмотрение данного вопроса см.3.7). Однако негативное влияние можно в какой-то степени снизить, если выводить ампициллин из сферы реакции или использовать различие в амидазной/эстеразной активности фермента в случае, если донором ацильной части является эфир.

Стереоселективность ПА в отношении фенилацетильных производных с C-X группой не высока, поэтому в реакциях синтеза полусинтетических бета-лактамных антибиотиков используются энантиомерно чистые ацильные доноры. В работе [94] авторы применили метод SSM для улучшения стереоселективности ecПА в отношении D-ФГ, что делает возможным использовать более дешевый рацемат донора. Исходно, при использовании рацемата метилового эфира ФГ удается получить R-ампициллин с энантиомерным избытком (э.и.) 37% при достижении максимального выхода. Для дизайна стереоселективности были отобраны 5 остатков на расстоянии Thr. В одном случае это была замена в незначимой области межсубъединичного спейсера, в другом – в значимой части далеко от активного центра. Следует отметить, что на рынке полимераз появилась полимераза Q5 (New England Biolabs), которая обеспечивает точность на порядок большую по сравнению с Pfu, что делает QuikChange ПЦР мутагенез еще более привлекательным.

В случаях, когда необходима высокая точность, и под рукой нет высокоточных полимераз, предпочтительнее использовать классический метод ПЦР-мутагенеза с перекрыванием. Для одновременного получения многоточечных мутантов этот метод в модификации [112] также представляется более эффективным.

В качестве экспрессионной плазмиды использовали вектор на основе плазмиды pBR322 (4562 п.н.), содержащий ген ecПА (PAC, 2541 п.н.), а также ген устойчивости к хлорамфениколу (CmR, рис.32).

Рисунок 32. Рестрикционная карта вектора на основе pBR322.

Расстояние от последовательности Шайна-Дальгарно до AUG кодона в PAC меньше среднего, что приводит к затруднениям в системе трансляции-транспорта, заключающимся в несоответствии скоростей обоих процессов, и, как следствие, к накоплению неполноценного белка при повышенных температурах. В связи с этим экспрессию ПА следует проводить при пониженных температурах [114]. В настоящей работе экспрессию генов мутантных форм ПА осуществляли при 15°С в клетках E.Сoli штамма TG-1 в течение 48-56 часов. Принимая во внимание рекомендации работы [111], в культуральную среду дополнительно вносили CaCl в концентрации 2мМ и глицерин в концентрации 5 г/л. В качестве индуктора биосинтеза ПА использовали IPTG. В ходе культивирования констатировали прирост плотности клеточной биомассы и увеличение специфической активности по NIPAB в клеточном лизате (рис.33, здесь и далее на примере мутанта bF256R+bF71L). Культивирование прекращали при достижении высокого уровня пенициллинацилазной активности.

Рисунок 33. Прирост оптической плотности при 600 нм для клеток с bF256R+bF71L (прерывистая линия) и активность клеточного лизата в реакции ферментативного гидролиза NIPAB (сплошная линия).

Известно, что большинство изученных ПА транспортируется в периплазматическое пространство [115]. В связи с этим клетки, содержащие ecПА, полученные на предыдущей стадии, осаждали и выделяли периплазматический экстракт методом осмотического шока в градиенте сахарозы. Выход рассматриваемого белка на этой стадии составил 24 мг/л среды.

обессоливания и концентрирования был получен препарат с выходом 20 мг/л среды. Фактор очистки, характеризуемый отношением специфических активностей по NIPAB в пересчете на общий белок для очищенного препарата и периплазматического экстракта, составил значение 7. Очищенные препараты полученных мутантов анализировали с помощью электрофореза в ПААГ (рис.34).

Рисунок 34. 12% SDS-ПААГ электрофорез препаратов ecПА ДТ (1 дорожка коммерческий препарат) и очищенных мутантных форм (2 – bS149R, 3 – bF256R+bF71L, 4 – bA255R+bF71L, 5 – bN388Q).

Две характерные полосы в области 23 и 63 кДа соответствуют a- и b-субъединицам белка, что свидетельствует о завершенных стадиях автокаталитического созревания.

3.4 Титрование активных центров, каталитическая активность и термостабильность Предварительный эксперимент по титрованию активных центров показал, что инактивация полученных мутантных форм фермента под действием необратимого ингибитора сериновых протеаз - ФМСФ протекает так же эффективно как и инактивация ecПА ДТ [51], и прирост остаточной активности в ходе эксперимента происходит не более, чем на 1%.

Рисунок 35. Структура ФМСФ (слева) и титрование активных центров ПА на примере A255R+bF71L (справа).

Концентрацию активных центров ПА рассчитывали методом линейной регрессии, экстраполируя значение концентрации ингибитора до нулевого значения начальной скорости гидролиза NIPAB (рис. 35).

спектрофотометрически, детектируя накопление продукта гидролиза - м-карбокси-пнитроанилина, интенсивно поглощающего при длине волны 400 нм:

Для определения каталитической константы kcat и константы Михаэлиса KM анализировали зависимость начальной скорости ферментативного гидролиза от концентрации NIPAB в прямых координатах (рис.36).

Рисунок 36. Зависимость начальной скорости (V0) от концентрации NIPAB (S0) на примере bN388Q+bF71L.

Согласно [116] термическая денатурация ПА представляет собой необратимый процесс, который может быть описан следующей схемой:

На первой стадии происходит обратимая потеря структуры a-субъединицы, что активирует вторую стадию – диссоциацию субъединиц и денатурацию b-цепи. Эта стадия необратима и кинетически контролируема. Третья стадия – агрегация и выпадение в осадок представляющей собой детализированное представление модели Ламри-Эйринга [117], необратимая денатурация является реакцией первого порядка и может быть описана функцией: A / A0 e kin t, где kin – константа инактивации первого порядка (рис.37).

Рисунок 37. Термостабильность мутантной формы bN388Q при 50°С и pH 7,5.

Кинетические параметры гидролиза NIPAB для всех мутантов, полученных в работе, а также данные по термо- и pH-стабильности представлены в таблице 27.

Таблица 27. Кинетические параметры гидролиза NIPAB и стабильность для ecПА ДТ и мутантных препаратов.

bR533C+bM485R bF256R+bN388Q+bF71L 39,4±0,8 5,6±0,5 7,1 --- % - максимальный выход антибиотика при эквимолярных (50мМ) условиях, ** - данные [92], ***-см. 3.8.1.

С целью изучения максимального выхода целевого антибиотика в условиях влияния всех трех комплексных кинетических параметров нами были построены интегральные кинетические кривые накопления для ecПА ДТ и мутантов aS149R, bF256R, bF24A, bF256R+bF71L, bF24A+bF71L, bF24A+bF71L+bF256R, показавших хорошие эффекты по отдельным параметрам (рис. 41).

Рисунок 41. Интегральная кинетика реакции 1а для мутанта aS149R. Условия проведения синтеза: 50 мМ 6-АПК, 50 мМ D-ФГ амида, pH 6,3, 25°C. – 6-АПК, – D-ФГ амид, – Ампициллин, – ФГ.

Как было указано в предыдущем разделе, параметр можно экспериментально определять при совместном гидролизе двух субстратов по начальным скоростям накопления отражение сложнейшего процесса, в результате которого нуклеофил как накапливается (EANEA, EANE), так и расходуется (EAEAN). Моделирование процесса при численном решении системы дифференциальных уравнений (см.приложение 3) показало, что кривая накопления нуклеофила проходит как минимум через 3 перегиба (рис.42). При этом 0,95 оказывается очень мал и определяется начальными концентрациями реагентов (табл.29) Рисунок 42. Накопление нуклеофила при совместном гидролизе продукта (0,001 М) и ацильного донора (0,01 М). По оси ординат концентрация нуклеофила (М), по оси абсцисс время (с). Параметры модели = 10, = 1000, = 0,01.

Таблица 29. Максимальная степень конверсии продукта, при которой достоверно (95%) определяется значение параметра эксп, для различных начальных концентраций исходных реагентов при совместном гидролизе.

Параметры модели = 10, = 1000, = 0,01.

Как видно из таблицы 29, чем ниже концентрация реагентов, тем для более высокой степени конверсии можно проводить определение начальных скоростей. При установлении зависимости экспериментально определяемого значения параметра эксп от концентрации (сознавая при этом, что сам параметр от концентрации не зависит) была получена кривая (рис. 43), которая иллюстрирует нелинейное уменьшение параметра эксп при увеличении концентрации. Также нами было показано, что значение параметра эксп сильно зависит от присутствия в системе солей. Так, например, включение в систему 10мМ ФБ более чем в раза сказывается на увеличении параметра эксп.

Рисунок 43. Влияние концентрации продукта (P0, ампициллин) на эксп для ecПА ДТ при совместном гидролизе. Концентрация ацильного донора в каждой точке S0=10P0.

Ориентиром для нахождения истинного значения параметра служит величина, найденная для раздельного гидролиза, при обработке зависимости начальной скорости

Главная >> Диссертации - все темы

[ СКАЧАТЬ ОРИГИНАЛ ДОКУМЕНТА .pdf ]

Похожие работы:

«Юмаев Егор Александрович АНТИКРИЗИСНЫЙ КОМПОНЕНТ РЕГИОНАЛЬНОЙ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством (региональная экономика) Диссертация на соискание ученой степени кандидата экономических наук Научный руководитель : доктор экономических наук, профессор О.П. Кузнецова Омск – СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ РЕГИОНАЛЬНАЯ ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ПОЛИТИКА РОССИИ НА СОВРЕМЕННОМ ЭТАПЕ...»

«ПОЛЯКОВ СЕРГЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ МАТЕМАТИЧЕСКОЕ МОДЕЛИРОВАНИЕ С ПОМОЩЬЮ МНОГОПРОЦЕССОРНЫХ ВЫЧИСЛИТЕЛЬНЫХ СИСТЕМ ПРОЦЕССОВ ЭЛЕКТРОННОГО ТРАНСПОРТА В ВАКУУМНЫХ И ТВЕРДОТЕЛЬНЫХ МИКРО- И НАНОСТРУКТУРАХ (05.13.18 - Математическое моделирование, численные методы и комплексы программ) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора физико-математических наук Москва – СОДЕРЖАНИЕ Наименование Стр. Введение Глава 1....»

«Черемхина Анастасия Петровна ОЦЕНКА ЗАКОНОМЕРНОСТЕЙ ИЗМЕНЕНИЯ ИНЖЕНЕРНОГЕОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ УСТОЙЧИВОСТИ ГИДРООТВАЛОВ ВСКРЫШНЫХ ПОРОД В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ЭТАПА ЭКСПЛУАТАЦИИ Специальность 25.00.16 - Горнопромышленная и нефтегазопромысловая геология, геофизика,...»

«Ершов Сергей Александрович ПОСОБНИЧЕСТВО В ОБЩЕЙ И ОСОБЕННОЙ ЧАСТЯХ УК РФ 12.00.08 – уголовное право и криминология; уголовно-исполнительное право Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : доктор юридических наук, профессор Благов Евгений Владимирович Ярославль -...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Щербакова, Оксана Викторовна Структурносемантическая и этимологическая характеристика словообразовательного поля существительныхнеологизмов в современном английском языке Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Щербакова, Оксана Викторовна Структурносемантическая и этимологическая характеристика словообразовательного поля существительныхнеологизмов в современном английском языке : [Электронный ресурс] : Дис. . канд....»

«РУССОВ АЛЕКСАНДР СЕРГЕЕВИЧ ПОВЫШЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ МАТЕРИАЛЬНЫХ УСЛОВИЙ ИНТЕНСИФИКАЦИИ ПРОСТРАНСТВЕННО-ЭКОНОМИЧЕСКОГО РАЗВИТИЯ РЕГИОНА (ПО МАТЕРИАЛАМ КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ) Специальность 08.00.05 – Экономика и управление народным хозяйством: (региональная экономика) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«Ксенофонтова Татьяна Юрьевна РЕГИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ УПРАВЛЕНИЯ РАЗВИТИЕМ ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО И ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОГО КАПИТАЛА В УСЛОВИЯХ ИЗМЕНЕНИЙ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ Диссертация на соискание ученой степени доктора экономических наук Специальность 08.00.05 - Экономика и управление народным хозяйством (региональная экономика;...»

«ЧИСТЯКОВ ДМИТРИЙ ГЕННАДЬЕВИЧ РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ЧУГУННЫХ ОТЛИВОК СТЕКЛОФОРМ С ПОВЫШЕННЫМ ЭКСПЛУАТАЦИОННЫМ РЕСУРСОМ Специальность 05.16.04 Литейное производство Диссертация на соискание ученой степени кандидата технических наук Научный руководитель доктор технических наук, профессор И.О. Леушин Нижний Новгород ОГЛАВЛЕНИЕ ВВЕДЕНИЕ Глава 1. ИНФОРМАЦИОННО-АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР СОСТОЯНИЯ ВОПРОСА...»

«СКАЧКОВА Елена Борисовна ДОСУГОВЫЕ ОБЪЕДИНЕНИЯ КАК СРЕДА ПРОФИЛАКТИКИ ДЕВИАНТНОГО ПОВЕДЕНИЯ ПОДРОСТКОВ ГРУППЫ РИСКА В УСЛОВИЯХ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО УЧРЕЖДЕНИЯ Специальность: 13.00.05 – теория, методика и организация социально-культурной деятельности Диссертация на соискание ученой степени кандидата педагогических наук Научный руководитель :...»

«ИЗ ФОНДОВ РОССИЙСКОЙ ГОСУДАРСТВЕННОЙ БИБЛИОТЕКИ Скоморощенко, Анна Александровна Оценка эффективности производственного предпринимательства в аграрном секторе экономики Москва Российская государственная библиотека diss.rsl.ru 2006 Скоморощенко, Анна Александровна. Оценка эффективности производственного предпринимательства в аграрном секторе экономики [Электронный ресурс] : На материалах Краснодарского края : Дис. . канд. экон. наук : 08.00.05. Ставрополь: РГБ,...»

«Призова Наталия Сергеевна МЕТОДОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ, РЕЗУЛЬТАТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ СКРИНИНГА РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В КРУПНОМ АДМИНИСТРАТИВНОМ РЕГИОНЕ Специальности: 14.01.12 – онкология; 14.02.03 – общественное здоровье и здравоохранение Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: д.м.н., профессор,...»

«Жидкова Юнна Юрьевна РАЗРАБОТКА СОСТАВА И ФАРМАКОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ КОМПОЗИТНЫХ ГЕЛЕЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ГИПЕРТРОФИЧЕСКИХ И КЕЛОИДНЫХ РУБЦОВ 14.04.01. – технология получения лекарств ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель :...»

«Кубарев Вячеслав Сергеевич ОСОЗНАНИЕ ЖИЗНЕННЫХ СМЫСЛОВ В РАБОТЕ СО СНОВИДЕНИЯМИ (ТОМ 1) 19.00.01 – Общая психология, психология личности, история психологии Диссертация на соискание ученой степени кандидата психологических наук Научный руководитель : доктор психологических наук А.В. Россохин Москва – 2013 ОГЛАВЛЕНИЕ Введение Глава 1. Феномен смысла жизни и его понимание в философии и психологии:...»

«АРШИНОВА ОЛЬГА ЮРЬЕВНА ТЕХНОЛОГИЯ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ ФОТОДИТАЗИНА 14.04.01 – Технология получения лекарств Диссертация на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук Научный руководитель : доктор фармацевтических наук, профессор Н.А. Оборотова Москва – СОДЕРЖАНИЕ Список...»

«МАКСИМОВА Анна Николаевна ФОРМИРОВАНИЕ СИСТЕМЫ ФРАНЧАЙЗИНГА В СФЕРЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Специальность 08.00.05 - Экономика и управление народным хозяйством (экономика, организация и управление предприятиями, отраслями, комплексами: сфера услуг) Диссертация на соискание ученой степени кандидата...»

«ПИЛЮГИН АНДРЕЙ ГЕННАДЬЕВИЧ ГЕОХИМИЯ И ПЛАТИНОНОСНОСТЬ ХРОМИТИТОВ НИЖНЕТАГИЛЬСКОГО И СВЕТЛОБОРСКОГО МАССИВОВ, СРЕДНИЙ УРАЛ Специальность 25.00.09 - Геохимия, геохимические методы поисков полезных ископаемых ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата...»

«ЗЫКОВА ИРИНА ВЛАДИМИРОВНА РОЛЬ КОНЦЕПТОСФЕРЫ КУЛЬТУРЫ В ФОРМИРОВАНИИ ФРАЗЕОЛОГИЗМОВ КАК КУЛЬТУРНО-ЯЗЫКОВЫХ ЗНАКОВ Специальность: 10.02.19 – Теория языка (филологические наук и) ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора филологических наук Научный консультант : доктор филологических наук, профессор Телия Вероника Николаевна доктор филологических наук, профессор Беляевская...»

«Фадеева Елена Ивановна КОЛЛЕГИАЛЬНОСТЬ СОСТАВА СУДА В ХОДЕ СУДЕБНОГО ПРОИЗВОДСТВА ПО УГОЛОВНЫМ ДЕЛАМ Специальность 12.00.09 – уголовный процесс Диссертация на соискание ученой степени кандидата юридических наук Научный руководитель : кандидат юридических наук,...»

«ПОИСК ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМОРФИЗМОВ, АССОЦИИРОВАННЫХ С БИОЛОГИЧЕСКОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ ОРГАНИЗМА К РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ Специальность 03.03.03 - иммунология Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Научные руководители: член-корреспондент РАМН, профессор Алексеев Л.П. к.б.н. Кофиади И.А. Москва 2012 год СОДЕРЖАНИЕ СПИСОК...»

«Лукина Юлия Николаевна ПРОБЛЕМЫ ЗДОРОВЬЯ РЫБ В ВОДНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ ЕВРОПЕЙСКО-СИБИРСКОЙ ОБЛАСТИ ПАЛЕАРКТИКИ Специальности: 03.02.08 – экология 03.02.06 – ихтиология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Петрозаводск 2014 2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ГЛАВА 1. ФИЗИКО-ГЕОГРАФИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ РАЙОНОВ ИССЛЕДОВАНИЯ,...»

наверх

<< ГЛАВНАЯ | КОНТАКТЫ

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА (Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

COOH COOH

PAA PAA

БЕСПЛАТНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА
(Авторефераты, диссертации, методички, учебные программы, монографии)