Федеральное государственное бюджетное учреждение

«Уральский научно-исследовательский институт дерматологии и

иммунопатологии»

Министерства Здравоохранения Российской Федерации

На правах рукописи

Пономарева Марина Владиславовна

ИНТРАТЕКАЛЬНЫЙ СИНТЕЗ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ И

ДИСФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ НАРУШЕНИЯ

ГЕМАТОЭНЦЕФАЛИЧЕСКОГО/ГЕМАТОЛИКВОРНОГО БАРЬЕРА ПРИ

СИФИЛИТИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ

14.03.09 – Клиническая иммунология, аллергология (биологические наук

и) диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

Левчик Надежда Константиновна кандидат медицинских наук

Научный консультант:

Зильберберг Наталья Владимировна доктор медицинских наук Екатеринбург -

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Иммунобиологические свойства возбудителя сифилиса

1.2. Поражение центральной нервной системы при сифилисе

1.3. Исследование цереброспинальной жидкости при подозрении на нейросифилис

1.4. Механизмы образования, циркуляции, оттока цереброспинальной жидкости в норме

1.5. Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера

1.6. Интратекальный синтез иммуноглобулинов

1.7. Взаимосвязь локального и системного иммунного ответа при поражении ЦНС

ГЛАВА 2. Общая характеристика пациентов, методов исследования и групп сравнения

2.1. Характеристика обследованных пациентов

2.2. Лабораторное исследование цереброспинальной жидкости и сыворотки крови

2.2.1. Методы выявления и оценки интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера

2.2.2. Диагностические тесты

2.3. Статистические методы анализа

ГЛАВА 3. Характеристика интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера при сифилитической инфекции

3.1. Изучение интратекального синтеза иммуноглобулинов и его особенностей, ассоциированных с наличием в анамнезе противосифилитической терапии 3.2. Дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического / гематоликворного барьера у больных сифилисом

ГЛАВА 4. Исследование влияния дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и интратекального синтеза иммуноглобулинов на иммуноглобулиновый состав цереброспинальной жидкости у серопозитивных по сифилису пациентов

4.1. Сравнительный анализ количественного и качественного состава общих иммуноглобулинов ЦСЖ

4.2. Выявление особенностей интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированных с активностью воспалительного процесса в ЦНС.............. 4.3. Исследование взаимосвязи между выявлением интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункциональных нарушений гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и результатами диагностических тестов, рекомендованными в качестве критериев подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис»

ГЛАВА 5. Изучение взаимосвязи между интратекальным гуморальным иммунным ответом и содержанием общих и сифилис-ассоциированных иммуноглобулинов в системном кровотоке при сифилитической инфекции Заключение

Выводы

Практические рекомендации

Список сокращений и условных обозначений

Список литературы

Одним из наиболее частых и серьезных осложнений сифилиса является вовлечение в инфекционный процесс центральной нервной системы (ЦНС).

Длительное течение нейросифилиса приводит к необратимым последствиям и может являться причиной инвалидизации и летального исхода [15, 40, 41, 48].

Несмотря на значительное снижение заболеваемости сифилисом в Российской Федерации, по данным государственной статистической отчетности за последнее десятилетие (2002-2011 гг) количество зарегистрированных случаев нейросифилиса увеличилось в 2,1 раза (с 471 до 987 случаев) и составило 1,8% от всех зарегистрированных случаев сифилиса в 2011 году. Анализ качества лабораторной диагностики нейросифилиса в Российской Федерации выявил как существенные дефекты, так и отсутствие лабораторного подкрепления при установлении диагноза «нейросифилис», что, несомненно, искажает статистические данные и позволяет предполагать значительное превышение реальной распространенности нейросифилиса над официально зарегистрированной [10,16,45].

Поражение центральной нервной системы (ЦНС) возбудителем сифилиса Treponema pallidum subspecies pallidum, неврологическими, психическими, слуховыми, вестибулярными или офтальмологическими нарушениями. Современная эпидемиологическая ситуация характеризуется снижением доли «классических» клинических проявлений нейросифилиса и увечением количества случаев асимптомного и малосимптомного нейросифилиса [1, 11, 12, 13, 16, 31, 82, 107, 135], при которых диагностика нейросифилиса базируется в основном на анализе цереброспинальной жидкости (ЦСЖ).

На настоящий момент главным инструментом ликвородиагностики при подозрении на нейросифилис являются непрямые методы исследования, а именно, нетрепонемные и трепонемные тесты, выявляющие присутствие в цереброспинальной жидкости (ЦСЖ) сифилис-ассоциированных антител.

Предложен широкий перечень лабораторных методов, использующих различные принципы и подходы для визуализации присутствия антител.

Предлагаемые тесты находятся на разной стадии валидации, но, в целом, мнение относительно наиболее предпочтительных методов исследования ЦСЖ еще не сформировано, лабораторная верификация вовлечения ЦНС при сифилисе остается зоной непрекращающихся дискуссий [16, 36, 39, 50, 61, 82, 87, 88, 116, 134].

Выделяют три основных процесса, влияющих на содержание антител в ЦСЖ: проникновение антител из системного кровотока через барьеры ЦНС, нарушение функционального состояния гематоэнцефалического/ гематоликворного барьера (ГЭБ/ГЛБ), приводящее к увеличению доли плазменной составляющей ЦСЖ, и интратекальный синтез антител, осуществляемый плазматическими клетками периваскулярных воспалительных инфильтратов в ЦНС в ответ на антигенную стимуляцию. Изолированная дисфункция ГЭБ/ГЛБ не характерна для воспалительных заболеваний ЦНС инфекционной природы и может также встречаться при других патологических состояниях (сахарный диабет, гипертиреоз, гипертоническая болезнь, ожирение, нарушения осанки, алкоголизм и т.д.) [86, 95]. Диагностическую значимость имеют только антитела, синтезированные интратекально. Однако теоретически существует вероятность, что высокое содержание в ЦСЖ антител, происходящих из системного кровотока, способно имитировать интратекальный иммунный ответ и влиять на диагностическую эффективность тестов. Исследования, посвященные изучению интратекального иммунного ответа при сифилисе ограничены и противоречивы [74, 77, 121], кроме того не интратекального синтеза иммуноглобулинов на уровень сифилисассоциированных антител в ЦСЖ.

Своевременное установление факта вовлечения центральной нервной системы в инфекционный процесс при сифилисе является очень важной врачебной задачей, так как диктует особую тактику лечения пациента [32, 64].

Стандартная терапия таких пациентов по схемам неневрологического сифилиса, как правило, неэффективна [19, 35].

выполнения, и не исключены осложнения, связанные с ее проведением [76, 114, 115], востребованы критерии, которые предоставляют возможность дополнительного обоснования необходимости выполнения больному пункции в связи с высокой вероятностью нейросифилиса. Опубликованы данные, свидетельствующие о наличии связи между уровнем специфических антител в системном кровотоке и фактом установления диагноза «нейросифилис» [66, 71, 104, 143, 145]. Однако отсутствуют работы, посвященные особенностям иммуноглобулинового состава периферической крови больных сифилисом, ассоциированным с наличием интратекального гуморального иммунного ответа. Исследование взаимосвязи между наличием интратекального иммунного ответа и иммунологическими показателями периферической крови позволит углубить понимание иммунобиологических закономерностей инфекционного процесса при сифилисе и рекомендовать лабораторные предикторы для выявления пациентов с высоким риском поражения ЦНС.

Таким образом, установление закономерностей формирования иммуноглобулинового состава ЦСЖ и крови углубит понимание иммунного совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.

Изучение интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера как факторов влияния на иммуноглобулиновый состав цереброспинальной жидкости и выявление особенностей иммуноглобулинового состава крови, ассоциированных с наличием интратекального иммунного ответа, при сифилитической инфекции.

Охарактеризовать интратекальный синтез иммуноглобулинов и дисфункциональные нарушения гематоэнцефалического/гематоликворного барьера у серопозитивных по сифилису пациентов с подозрением на нейросифилис, и их особенности, ассоциированные с наличием в анамнезе противосифилитической терапии.

/гематоликворного барьера и интратекального синтеза иммуноглобулинов на количественный и качественный состав общих иммуноглобулинов в цереброспинальной жидкости.

Выявить особенности интратекального синтеза иммуноглобулинов, ассоциированные с активностью воспалительного заболевания центральной нервной системы.

Изучить взаимосвязь между выявлением интратекального синтеза иммуноглобулинов и дисфункции гематоэнцефалического/гематоликворного барьера и результатами диагностических тестов, рекомендованными в качестве критериев подтверждения/исключения диагноза «нейросифилис».

системного кровотока и цереброспинальной жидкости, выявить особенности иммуноглобулинового состава крови, ассоциированные с наличием интратекального синтеза иммуноглобулинов.

Дизайн исследования: обсервационное (аналитическое кросс-секционное) исследование. В работе применен комплекс иммунологических и общеклинических методов исследования цереброспинальной жидкости и крови при сифилитической инфекции.

Исследование проведено в соответствии с принципами доказательной медицины и одобрено Локальным этическим комитетом ФГБУ «УрНИИДВиИ»

Минздрава России (протокол № 2 от 03.09.2010 г.) Степень достоверности, апробация результатов, личное участие Достоверность результатов исследования обеспечена обоснованностью исходных теоретических позиций, достаточным количеством пациентов и формированием групп сравнения, использованием адекватных и апробированных лабораторных методов, соблюдением рекомендаций международного консенсуса неврологов и нейрохимиков для лабораторного исследования протеинов ЦСЖ [118], использованием сертифицированных наборов реагентов, и применением современной компьютерной программы для статистической обработки полученных данных. О достоверности полученных результатов также свидетельствует их биологическая правдоподобность и непротиворечивость ранее проведенным исследованиям и наблюдениям, опубликованным в научной литературе.

Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов (Екатеринбург, 2010 г.), региональной междисциплинарной научно-практической конференции «Актуальные вопросы дерматовенерологии» (Челябинск, 2010 г.), IX конференции иммунологов Урала (Челябинск, 2011 г.), межрегиональной дерматовенерологии. Качество и доступность специализированной медицинской помощи» (Екатеринбург, 2011 г.), XII (Москва, 2012 г.) Всероссийском съезде дерматовенерологов и косметологов, региональной междисциплинарной научно-практической конференции «Дерматология:

вопросы повышения качества и доступности специализированной медицинской помощи» (Екатеринбург, 2013 г.).

Автором лично проведен научно-информационный поиск, заполнены оригинальные анкеты на основании анализа историй болезни пациентов, создан банк биологических образцов (ЦСЖ, сыворотка крови) пациентов. Семьдесят семь процентов лабораторных исследований выполнены автором лично.

Статистический анализ и оценка результатов, написание глав диссертации подготовлены в соавторстве.

инфекции характеризуется разнообразием изотипических вариантов с иммуноглобулинов изотипа G4, редкой встречаемости изолированного синтеза иммуноглобулинов А и рестрикции изотипического спектра под влиянием специфической терапии.

При сифилитической инфекции интратекальный иммунный ответ дисфункциональными нарушениями гематоэнцефалического/гематоликворного барьера, которые характеризуются преобладанием форм незначимой, легкой и умеренной степени выраженности.

активным воспалительным процессом в центральной нервной системе, отличается более высокой частотой синтеза иммуноглобулинов М и большей интенсивностью синтеза иммуноглобулинов изотипов G3, G2 и G1.

являются различными инструментами оценки интратекального гуморального «нейросифилис», ассоциированы с наличием признаков интратекального синтеза иммуноглобулинов, а результаты тестов, исключающие нейросифилис - с их отсутствием.

Интратекальный гуморальный иммунный ответ ассоциирован с высоким уровнем реагиновых и трепонемаспецифичных антител в системном кровотоке;

содержание трепонемаспецифичных антител в крови в количестве превышающим титр реакции пассивной гемагглютинации 1:40960, может рассматриваться в качестве дополнительного прогностического критерия наличия поражения центральной нервной системы при сифилисе.

Впервые показана значительная изотипическая вариабельность интратекального гуморального иммунного ответа при сифилисе с более низкой вероятностью синтеза IgG4 и редкой встречаемостью изолированного синтеза IgА. Установлено, что интратекальный синтез иммуноглобулинов у пациентов, получавших терапию по поводу неневрологического сифилиса, отличается более узким спектром интратекально-синтезируемых изотипов.

Показано, что нарушения функционального состояния ГЭБ/ГЛБ при сифилисе носят невыраженный характер, с преобладанием дисфункций незначимой, легкой и умеренной степени выраженности.

содержание иммуноглобулинов в ЦСЖ значительно возрастает в результате их интратекального синтеза (особенно класса М) и умеренно увеличивается при дисфункции ГЭБ/ГЛБ.

Впервые показано, что при активной воспалительной реакции в ЦНС у серопозитивных по сифилису пациентов наблюдается повышенная частота интратекального синтеза IgM и значительное возрастание интенсивности интратекального синтеза IgG3, IgG2 и IgG1.

Впервые доказано, что наличие в ЦСЖ детектируемого количества реагиновых антител и высокой концентрации трепонемаспецифических антител ассоциировано с интратекальным гуморальным иммунным ответом и маловероятно в его отсутствие и при изолированной дисфункции ГЭБ/ГЛБ.

Впервые продемонстрировано, что интратекальный гуморальный иммунный ответ при сифилитической инфекции ассоциирован с более высоким содержанием реагиновых и трепонемаспецифичных антител в системном кровотоке.

Проведенные исследования позволили расширить представление об интратекальном иммунном ответе и нарушении функционального состояния ГЭБ/ГЛБ при сифилисе, установить закономерности изменения качественного интратекального синтеза иммуноглобулинов и нарушенной функции ГЭБ/ГЛБ и выявить связь между интратекальным гуморальным иммунным ответом и содержанием общих и сифилис-ассоциированных антител в системном кровотоке. Полученные данные позволили уточнить иммунобиологическую основу существующих иммунометрических критериев диагностики и прогнозирования нейросифилиса, привести аргументацию в отношении дискутабельных диагностических критериев и предложить новые прогностические критерии.

Внедрение результатов исследования в практику.

Результаты исследования внедрены в практику работы ФГБУ «Уральский научно-исследовательский институт дерматовенерологии и иммунопатологии»

Минздрава России. Результаты работы включены в лекционный курс факультета повышения квалификации и профессиональной переподготовки специалистов по специальности «Дерматовенерология» ГБОУ ВПО «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России, лекционный курс кафедры дерматовенерологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. академика Е.А. Вагнера»

Минздрава России.

1.1. Иммунобиологические свойства возбудителя сифилиса Сифилис - инфекционное заболевание, характеризующееся поражением всех органов и систем организма и волнообразной сменой активных проявлений периодами скрыто протекающей инфекции, длительное течение которого приводит к тяжелым и необратимым последствиям [15, 32, 40, 48].

Особенности заболевания обусловлены иммунобиологическими свойствами возбудителя Treponema pallidum подвид pallidum (синоним бледная трепонема) (порядок Spirochaetales, семейство Spirochaetaeceae).

Бледная трепонема относится к внеклеточным грамотрицательным бактериям, является облигатным анаэробом. Геном T. pallidum представлен кольцевой молекулой ДНК размером в несколько раз меньше многих обычных грамотрицательных и грамположительных бактерий, что обуславливает сильную редукцию катаболических и биосинтетических функций и невозможность жизни вне организма хозяина. Для бледной трепонемы характерны медленное размножение, низкая устойчивость к воздействиям окружающей среды (в том числе кислородным и температурным), хрупкость наружной мембраны. Эти особенности создают трудности для культивирования и молекулярных исследований вирулентных штаммов Т. pallidum [5], что в сочетании со сложностями в создании подходящих животных моделей сифилиса (особенно поздних форм) препятствует изучению сифилитической инфекции.

Бледная трепонема является высокоинвазивным патогеном, легко проникающим через кожу и слизистые оболочки и способным поражать нервную систему, внутренние органы и опорно-двигательный аппарат.

Распространение Т. рallidum происходит гематогенным и лимфогенным путем в ранние сроки заболевания. Т. рallidum обнаруживается в крови в течение нескольких минут после интратестикулярного или внутрикожного заражения кроликов, достигая в течение нескольких часов более глубоких тканей, в том числе ЦНС [34]. Опыты на культурах клеток млекопитающих показали, что T.

pallidum легко и прочно прикрепляется к поверхности практически любых ядерных типов клеток, включая фибробласты, эпителиальные, эндотелиальные клетки, мышечные волокна и нейроны, но не прилипает к эритроцитам [99].

Также была продемонстрирована способность микроорганизма проникать через монослой эндотелиальных клеток без изменения их плотных контактов [138], что, на сегодняшний день, является признанным механизмом преодоления гематоэнцефалического барьера данным микроорганизмом [98]. Кроме того, была продемонстрирована способность вирулентных штаммов Т. pallidum интерстициальной коллагеназы (ММР-1) [139], функция которой состоит в специфическом запуске гидролиза фибриллярных коллагенов, обеспечивая деструкцию тканей и возможность проникать патогену в более глубокие слои.

Т. pallidum обладает невысокой цитотоксичностью. Исследования генома не выявили наличия таких классических факторов, как липополисахарид и цитолитические ферменты (цитотоксины), которые могли бы объяснить проявления сифилитической инфекции [99]. Таким образом, считается, что воспаление и развитие последующего адаптивного иммунного ответа макроорганизма вызывает повреждение тканей, характерное для сифилиса [34].

На сегодняшний день существует достаточное количество независимых исследований, подтверждающих развитие иммунного ответа по типу гиперчувствительности замедленного типа на ранних этапах инфекции.

Гистологические исследования показали, что в месте внедрения микроорганизма первыми регистрируются Т-клетки (на 3 день), достигая пика концентрации с 10 по 13 день, позже появляются макрофаги (на 6 - 10 день, достигая максимального количества также на 13-й день) [69]. Преинкубация эндотелиальных клеток с вирулентными живыми штаммами трепонем повышает экспрессию молекул адгезии [141] ICAM-1, VCAM-1 и E-селектина, хемоаттрактантов Т-клеток и моноцитов MIP-1 и MIP-1, инициирующих дальнейшую лимфоцитарно-макрофагальную инфильтрацию [99]. Кроме того было показано, что липопротеины Т. рallidum стимулируют макрофаги к индукции экспрессии провоспалительных цитокинов TNF-, IL-1, IL-6, IL-8 и IL-12 [99]. B.T. Leader с коллегами в 2007 году опубликовали отчет по изучению субпопуляций Т-лимфоцитов в экспериментальной модели раннего сифилиса при тестикулярном заражении кроликов, в котором получили данные, подтверждающие развитие местного иммунитета по Th1- типу [62]. На другой животной модели раннего сифилиса (обезьяны) в отсутствие клинических признаков поражения ЦНС в ЦСЖ также были обнаружены признаки, позволяющие сделать выводы о развитии иммунного ответа по Th1-типу:

плеоцитоз, представленный преимущественно CD4+клетками, повышенные уровни мРНК интерферона [105]. Таким образом, липопротеины Т. pallidum являются мощными индукторами воспаления в начале инфекции, инициируя развитие иммунных реакций по типу гиперчувствительности замедленного типа.

При прогрессировании заболевания ко вторичной стадии происходит переключениеTh1- типа иммунного ответа на Th2-тип (антитело-зависимое иммунное воспаление) [103, 113]. Важность антительного ответа в развитии инфекции подтверждается экспериментальными данными. Обработка Т.

рallidum иммунной сывороткой в присутствии компонентов комплемента блокирует подвижность микроорганизма и связывание с клетками макроорганизма При искусственной пассивной иммунизации специфические антитела тормозят развитие типичных кожных поражений, но не исключают заражение животных-реципиентов [99]. Кроме того, M. W. Moore с коллегами в опытах in vitro было продемонстрировано, что эффективность фагоцитоза и последующих воспалительных реакций значительно усиливаются при опсонизации трепонемы специфическими антителами [108]. Появление антител в периферической крови IgM и IgG при интратестикулярной модели сифилиса у кроликов регистрировали уже на 6 день [89]. Длительная персистенция специфических IgM регистрировались в сыворотке инфицированных кроликов и людей, даже после регрессии симптомов заболевания и антибактериальной терапии [99, 140]. Антитела класса G к трепонемным антигенам могут сохраняться пожизненно в организме человека, даже после адекватной антибактериальной терапии [3, 28]. Иммунный ответ, вызванный во время инфекции, является специфическим для широкого спектра молекул Т. pallidum, в том числе поверхностных липидов, жгутиковых белков, липопротеинов, а также других белков. Некоторые из этих антигенов являются кросс-реактивными с антигенам патогенных и непатогенных трепонем, млекопитающих [99, 111]. Кроме того, антительный ответ макроорганизма на внедрение трепонемы не является статичным, в ходе развития инфекционного процесса происходит смена репертуара сифилис-ассоциированных антител в их антигенной специфичности [7, 23, 140]. Иммунокомплексная патология (васкулиты, гломерулонефриты), как результат отложения в тканях неэлиминированных комплексов антиген-антитело является также одним из патогенетических механизмов сифилитической инфекции [34].

Длительная персистенция бледной трепонемы связана с ее способностью «ускользать» от иммунной системы. Микроорганизм имеет ограниченный набор антигенных детерминант, доступных для иммунного распознавания в макроорганизме, в частности интегральных белков наружной мембраны [111].

Кроме того, было доказано наличие мутации генов (TprK), которые отвечают за антигенные различия штаммов T. pallidum, что, по мнению авторов, позволяет микроорганизму уходить от иммунного ответа и способствует установлению (внутриклеточный) морфологический вариант спиралевидной бледной трепонемы, наличием которого объясняют особенности сохранения возбудителя в латентных периодах. Возбудитель имеет оболочку, образованную мембраной фагоцитов, причем фагоцит образует дополнительное покрытие у трепонемы. Такие трепонемы иммунологически не узнаваемы. По биологической сущности эта форма близка к инцистированным трепонемам [26]. Способность проникать в так называемые «иммунопривилегированные»

области (ЦНС, глаза и т.д), медленный метаболизм и цикл генерации также позволяют трепонемам персистировать в организме в течение длительного периода.

1.2. Поражение центральной нервной системы при сифилисе Нейросифилис – общее название разнообразных клинических форм поражения нервной системы сифилитической этиологии [48].

Инвазия бледной трепонемы в центральную нервную систему (ЦНС) происходит на ранних стадиях течения сифилитической инфекции в период гематогенной диссеминации возбудителя. Способность микроорганизма проникать через монослой эндотелиальных клеток без изменения их плотных контактов на сегодняшний день является признанным механизмом преодоления гематоэнцефалического барьера данным микроорганизмом [98]. Удельный вес нейроинвазии составляет от 30 до 100% всех случаев сифилиса по данным разных авторов [48]. Тот факт, что присутствие трепонемы в ЦСЖ не всегда сопровождается патологическими изменениями в ЦСЖ и наличием неврологической симптоматики, позволил предположить, что проникновение Т.

pallidum в ЦНС человека не обязательно приводит к развитию серьезных нарушений со стороны нервной системы, т.е. «инвазия» не означает «заболевание». Предполагается возможность самопроизвольной элиминации трепонем из нервной ткани без воспалительной реакции или развитие транзиторного воспаления в мозговых оболочках, которое разрешается спонтанно. По литературным данным [16, 82], только у 13-20% пациентов развивается асимптомный нейросифилис, сопровождающийся патологическими изменениями ликвора, который впоследствии может перейти в манифестные формы. В настоящее время неизвестно, почему только у части пациентов, инфицированных Т. pallidum, развивается нейросифилис, даже после адекватной антибактериальной терапии на ранних этапах инфекции.

Помимо наличия факторов повышенного риска развития нейросифилиса (интоксикации, травмы, возраст, ВИЧ и др.) [15, 22], были высказаны предположения о существовании нейроинвазивных штаммов возбудителя [80, 133].

Поражение специфическим процессом ЦНС может развиваться как результат непосредственного действия бледных трепонем на нервную ткань и ее оболочки, так и как следствие длительно текущей воспалительной реакции, нарушения трофики нервной ткани, циркуляции ЦСЖ и т.д. Не исключается аутоиммунный характер поражения ЦНС при сифилисе [20, 44].

Первоначальная локализация специфического процесса в ЦНС в значительной степени объясняется путями распространения инфекции, соответствующими ходу кровеносных сосудов и периваскулярных лимфатических пространств [15]. Как при ранних, так и при поздних формах сифилиса возможно обнаружение спирохет в ЦСЖ, в оболочках, сосудах и паренхиме головного и спинного мозга. Поражение сосудов мозга при сифилитической инфекции является одним из основных патогенетических механизмов формирования нейросифилиса. Нарушение микроциркуляторного звена цереброваскулярного русла регистрируются уже на ранних стадиях сифилитической инфекции [27]. При раннем нейросифилисе патологические изменения локализуются преимущественно в сосудах и оболочках головного и спинного мозга. Уже в инкубационном периоде заболевания нервной системы обнаруживаются макро- и микроскопические изменения со стороны нервной системы. Наблюдается воспалительная лимфоидно–плазмацитарная инфильтрация кровеносных сосудов и мягких оболочек мозга различной степени выраженности, даже в тех случаях, когда ЦСЖ интактна.

Инфильтрации, как правило, сосредоточены по ходу сосудов оболочек мозга, но могут наблюдаться и в паренхиме мозга. Утолщение мягких оболочек мозга уже на ранних этапах инфекционного процесса может приводить к нарушению черепномозговых нервов (глазодвигательного, слухового, отводящего, зрительного), спинномозговых корешков. Одновременно с поражением ЦНС на ранних стадиях сифилиса патологические изменения выявляются в миелиновых и безмиелиновых волокнах с вовлечением эпи-, пери- и эндоневрия [15, 22].

По мере увеличения продолжительности существования инфекционного процесса наблюдаются также инфильтрация лимфоцитами адвентиции и мышечной оболочки крупных сосудов мозга, с формированием участков стеноза или окклюзии, гиперпластических изменений, некроза сосудов, и как следствие, развитие ишемии, инфарктов, нередки также эпилептические припадки. Воспалительная инфильтрация и образование грануляционной ткани приводят к значительному утолщению мозговых оболочек, особенно твердой оболочки. В дальнейшем в диффузно инфильтрованной мозговой оболочке отмечаются некротические, фиброзные изменения, формирующие грубый склероз. В периферических слоях коры, непосредственно примыкающих к пораженным мягким оболочкам мозга, наблюдается сосудистовоспалительный процесс с выраженной пролиферацией клеток глии, атрофией нейронов. В ряде случаев присутствие микроорганизмов приводит к образованию инфекционных гранулем (гумм) головного или спинного мозга, состоящих из лимфоцитов, плазматических, эндотелиальных и гигантских клеток, с некрозом в центре [15].

При поздних формах нейросифилиса, по данным результатов магнитнорезонансно-томографического обследования головного мозга, обнаруживались наиболее грубые дегенеративно-дистрофические изменения мозговой паренхимы (диффузная атрофия коры головного мозга, перивентрикулярный лейкоареоз, множественные мелкие очаги демиелинизации) [31]. М.В. Родиков и В.И. Прохоренков (2010) [29, 30], характеризуя патоморфологические изменения в ЦНС при позднем паренхиматозном нейросифилисе, выделили следующие признаки: диффузную пролиферацию астроцитарной глии в паренхиме головного и спинного мозга; «ламинарное» выпадение нейронов, вызывающее картину губчатости коры головного мозга; лимфоплазмацитарная инфильтрацию оболочек, стенок сосудов и ткани мозга. Также авторы отметили, что для атрофированных зон головного мозга не характерна воспалительная реакция.

Таким образом, патологические изменения при нейросифилисе затрагивают все типы клеток ЦНС (микроглию, астроциты, нейроны) и различные отделы головного и спинного мозга, ведут к тяжелым, необратимым сифилитической инфекции соответствуют следующим процессам:

экссудативное и продуктивное воспаление на ранних этапах инфекции, и дистрофические, некротические, демиелинизирующие процессы при хроническом длительном течении инфекции. Клинические проявления нейросифилиса зависят от локализации и величины поражения тканей ЦНС.

Клиническая диагностика нейросифилиса нередко представляет сложную задачу, поскольку, с одной стороны, в настоящее время наблюдается увеличение доли малосимптомных и асимптомных форм нейросифилиса [1, 13, 16, 22], с другой стороны, не существует патогномоничных симптомов специфического поражения, что обуславливает необходимость проведения дифференциальной диагностики нейросифилиса с заболеваниями ЦНС иной этиологии [29, 31, 48]. На сегодняшний день выделяют следующие нозологии, имеющие сходные клинические симптомы [48]: менингиты любой этиологии, нейросенсорная тугоухость различного п.роисхождения, гипертонический криз, миелит иной этиологии, опухоль спинного мозга, тромбозы сосудов спинного мозга, спинальная форма рассеянного склероза. Психические нарушения при прогрессивном параличе имеют сходную картину с неврастенией, маниакальнодепрессивным психозом, шизофренией, атеросклерозом, старческим психозом, опухолью мозга (особенно лобных долей); неврологические расстройства при спинной сухотке — с травмой головного и спинного мозга, острыми инфекционными заболеваниями с поражением нервной системы (брюшной тиф, грипп), длительной хронической интоксикацией (мышьяк, алкоголь);

первичную табетическую атрофию зрительных нервов — с атрофиями зрительных нервов другой этиологии, чаще туберкулезной; гуммы — с новообразованиями головного и спинного мозга. Таким образом, обнаружение у больных сифилисом тех или иных неврологических нарушений еще не может служить основанием для диагностики нейросифилиса, поскольку не исключена вероятность, что эти нарушения не являются следствием различных заболеваний и поражений нервной системы несифилитической природы.

Длительный преклинический период, разнообразие клинических и нейровизулизационных проявлений нейросифилиса, включая неспецифические симптомы, существование асимптомных форм определяют важную роль в диагностике нейросифилиса лабораторного исследования ЦСЖ [32, 48, 64, 96].

1.3. Исследование цереброспинальной жидкости при подозрении на Целью исследования ЦСЖ является поиск лабораторных признаков, позволяющих подтвердить или исключить диагноз «нейросифилис».

Показаниями к проведению люмбальной пункции при сифилитической инфекции являются:

офтальмологических, сурдологических симптомов (в том числе изолированные) [32, 64, 96];

- скрытые формы сифилиса [32];

- поздние формы инфекции с проявлениями вторичного сифилиса [32];

отсутствие негативации нетрепонемных тестов в крови в установленные сроки после проведенного полноценного специфического лечения [32, 96];

- наличие ВИЧ-инфекции [63, 96];

- подозрение на врожденный сифилис [32].

Также дополнительно предложены лабораторные критерии, позволяющие выделить пациентов с высоким риском нейросифилиса:

- количество CD4+Т-клеток в крови меньше, чем 350/мкл у ВИЧинфицированных пациентов [66, 96];

- титр выше, чем 1:32 в нетрепонемном тесте RPR в крови [66, 96].

При лабораторной диагностике нейросифилиса в основном используются общеклинические тесты (исследование цитоза с подсчетом количества иммунологические тесты, направленные на выявление антител в ЦСЖ. Так называемые прямые тесты (заражение животных, микроскопия в темном поле, нейросифилиса применяются исключительно в научных целях и имеют свои ограничения. Особенности микроорганизма и патогенеза заболевания делает применение методов прямой детекции возбудителя Т. pallidum (темнопольная микроскопия, ПЦР) весьма ограниченным, только на ранних стадиях в период активной диссеминации возбудителя [22]. Заражение животных считается низкочувствительным, дорогостоящим и трудоемким тестом и не используется в практическом здравоохранении [11].

Исследование содержания клеточных элементов и уровня белка в ликворе воспалительного процесса в мозговых оболочках и органического поражения вещества мозга [4], однако плеоцитоз (>5 лейкоцитов/мкл) и повышение белка (>0,45 г/л) не являются специфичными для нейросифилиса и могут наблюдаться при заболеваниях ЦНС различной этиологии [4, 48].

Плеоцитоз - наиболее ранний и важный показатель активности процесса в ЦНС, в начальном периоде сифилиса небольшой плеоцитоз может быть единственным признаком поражения ЦНС. Для нейросифилиса характерен лимфоцитарный плеоцитоз 6 - 349 клеток/мкл (медиана 29 клеток/мкл) [66].

При симптоматических формах нейросифилиса плеоцитоз достигает 20-50, но редко превышает 100/мкл [38]. Умеренный плеоцитоз характерен для ранних форм [21, 22, 31, 42, 43]. С другой стороны, нормоцитоз ликвора может наблюдаться у 50-73% пациентов с установленным диагнозом «нейросифилис»:

[11, 21, 36], чаще у пациентов с поздними паренхиматозными формами нейросифилиса [31].

При нейросифилисе содержание белка колеблется в зависимости от формы, фазы заболевания и возраста пациента в пределах 0,12-10,0 г/л [31, 135]. Повышение содержания общего белка не всегда характерно для нейросифилиса. Так исследователями M.Timmermans и J. Carr [135] из образцов ЦСЖ пациентов с сифилисом с повышенным содержанием белка в (27%) случаях связали данное повышение с сопутствующими заболеваниями пациентов, исключив у них нейросифилис. В настоящее время в клинической практике при нейросифилисе отмечается преобладание случаев малого цитоза (6-12 клеток/мкл) при нормальных значениях белка [36, 48].

Для выявления сифилис-ассоциированных антител в ЦСЖ предложен широкий перечень лабораторных методов, использующих различные принципы и подходы для визуализации присутствия антител. Традиционно их делят на две группы: нетрепонемные и трепонемные тесты.

В нетрепонемных (син. кардиолипиновые, реагиновые) тестах в качестве антигена используется стандартизованный кардиолипиновый антиген (эмульсия холестерола 0,98%; кардиолипина 0,03%; лецитина 0,27% в абсолютном спирте), позволяющий определять в сыворотке больных сифилисом противолипоидные (син. антикардиолипиновые) антитела – «реагины». Данный антиген также широко представлен в тканях животных и человека (в мембранах митохондрий), поэтому считается, что определяемые антитела направлены не только против липидных антигенов бледной трепонемы, но и аутоантигенов, возникающих вследствие деструкции клеток макроорганизма [3, 37].

В ликвородиагностике используются следующие нетрепонемные тесты:

- реакция связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк);

- реакция микропреципитации (РМП, в зарубежной литературе RMP );

- RPR (в русской транскрипции РПР) – тест быстрых плазменных реагинов (Rapid Plasma Reagins);

- VDRL (Venereal Disease Research Laboratory);

РМП, RPR, VDRL являются флокуляционными тестами с визуальным считыванием результатов. В основе РСК лежит свойство антител приобретать способность связывать определенные компоненты комплемента вследствие своего контакта с антигеном и тем самым создавать их относительную недостаточность, пропорциональную количеству сформировавшихся комплексов антиген-антитело (реакция Борде - Жангу).

К трепонемным тестам относятся:

- реакция иммунофлюоресценции (РИФ, в зарубежной литературе FTA (Fluorescent treponemal antibody), применяется в нескольких модификациях:

РИФц (анализ проводится с нативной ЦСЖ) и РИФабс (включает этап адсорбции перекрестнореагирующих антител путем использования непатогенных трепонем штамма Рейтера);

- реакция пассивной гемагглютинации (РПГА, в зарубежной литературе TPHA – Treponema pallidum haemagglutination assay) и ее аналоги (РМГА микро гемагглютинации);

- реакция связывания комплемента с трепонемным антигеном (РСКт);

- иммуноферментный анализ: планшеточный (ИФА, в зарубежной литературе ELISA – Enzyme lynked immunosorbent assay) и линейный (иммуноблоттинг, в зарубежной литературе называется WesternBlot) варианты;

- реакция иммобилизации бледных трепонем (РИБТ или РИТ, в зарубежной литературе TPI (Treponema pallidum immobilization test).

В качестве антигена используются цельноклеточные живые (в РИБТ) или фиксированные T.pallidum (в РИФ), разрушенные ультразвуком фиксированные T.pallidum штамма Николса (в РМГА-тесте), либо созданные с помощью генной инженерии рекомбинантные белки или синтетические пептиды T.pallidum (в ИФА, РПГА, иммуноблоттинге и хроматографических тестах).

Реакции, используемые в лабораторной диагностике сифилиса, являются полуколичественными, уровень антител, ассоциированных с сифилисом, выражается в титрах разведения биологической жидкости, при котором сохраняется позитивность теста. Большинство тестов, широко применяемых в практике, определяют лишь суммарное количество антител.

Следует отметить, что вышеперечисленные иммунологические тесты находятся на разной степени валидации, в мировом сообществе нет согласованности во мнении относительно наиболее предпочтительных методов исследования ЦСЖ. В частности, используют различные модификации РИФ: в отчественной практике - РИФц, на территории Европы и США – РИФабс [32, РПГА широко используется в зарубежной практике, в 33, 64, 96];

отечественной сифилидологии не накоплен достаточный опыт ее применения [11, 17, 47]. VDRL является основным тестом выявления реагиновых антител ЦСЖ в зарубежной практике [64], в отечественной практике используется крайне редко [11, 24]. Относительно применения теста RPR на сегодняшний день нет единого мнения: получены противоречивые данные относительно его диагностических характеристик [36, 61, 66, 82], тем не менее, этот тест рекомендован European Guidelines on the Management of Syphilis [96] и с года Экспертным советом РОДВК [32] для применения в ликвородиагностике нейросифилиса. РМП, РСКт, РСКк с ЦСЖ используются в отечественной практике [11, 32, 33], в современной зарубежной литературе данных об использовании этих тестов не обнаружено.

Общепризнано, что положительные результаты нетрепонемных тестов считаются высокоспецифичными для нейросифилиса, однако признается их недостаточная чувствительность, поскольку частота отрицательных результов при различных формах нейросифилиса варьирует от 30 до 70% [32, 64, 96].

Предполагается, что выявляемые в данных тестах реагиновые антитела в ЦСЖ имеют, скорее всего, интратекальную природу, так как в системном кровотоке они находятся в небольшом количестве, однако исследований, доказывающих это положение, не было проведено.

Трепонемные тесты обладают высокой чувствительностью (90-100%), но недостаточно специфичны и могут быть положительными с ликвором при формах сифилиса, не сопровождающихся поражением нервной системы [11, 32, Наличие трепонемаспецифических антител в ликворе признано 87].

необходимым, но недостаточным условием для подтверждения диагноза «нейросифилис», так как эти антитела могут быть следствием пассивной диффузии из системного кровотока вследствие их высокого там содержания [32, 64, 96].

трепонемаспецифических антител критической величиной является их количественное содержание. В частности, титр антител в ЦСЖ в реакции гемагглютинации (Treponema pallidum haemagglutination (TPHA) test) выше, чем 1:320 рекомендован в качестве cut-off [96, 102]. Другим вариантом такого подхода является использование индексов, таких как TPHA индекс и ITpAиндекс (intrathecally produced T. pallidum antibody) [102, 116]. Данные индексы не только учитывают титр TPHA в ЦСЖ, но также заявлены их авторами как способ минимизации влияния дисфункции ГЭБ/ГЛБ и уровня антител в системном кровотоке, и расцениваются в качестве индикаторов специфического интратекального синтеза. Эти индексы значительно более чувствительны по отношению к нейросифилису в сравнении с нетрепонемными тестами, однако, они не получили широкого признания и считаются требующими дальнейшего обоснования [96, 102].

Основываясь на высокой чувствительности трепонемных тестов, было предложено их отрицательные результаты использовать в качестве критерия исключения нейросифилиса [32, 33, 37, 63, 64, 96]. Такой подход существовал длительное время, однако после проведенного недавно исследования было сделано заключениие о возможности установления диагноза «нейросифилис»

при отрицательных результатах трепонемных тестов с ЦСЖ [87, 88].

Следует отметить, что существующие критерии ликвородиагностики нейросифилиса были разработаны на основе различий показателей ЦСЖ между контрольной группой и тщательно отобранными пациентами с ярко выраженными типичными клиническими и лабораторными проявлениями нейросифилиса, без учета биологических механизмов, лежащих в основе реализации позитивности диагностических тестов. Изучение влияния физиологических и патологических биологических механизмов на содержание сифилис-ассоциированных антител в ЦСЖ и установление закономерностей позитивации различных диагностических тестов в ЦСЖ при сифилитической инфекции создаст научную основу для систематизации лабораторных исследований, и будет способствовать совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.

1.4. Механизмы образования, циркуляции, оттока Цереброспинальная жидкость (син.: ликвор, спинномозговая жидкость) биологическая жидкость, необходимая для правильного функционирования мозговой ткани и выполняющая защитную функцию [4]. ЦСЖ заполняет полости желудочков мозга, субарахноидальное пространство головного мозга и спинномозговой канал, периваскулярные и перицеллюлярные пространства в ткани мозга, омывая элементы паренхимы мозга и глии. Ликвор находится в состоянии непрерывной циркуляции, его состав формируется в процессе обмена веществ между мозгом, кровью и тканевой жидкостью, что позволяет рассматривать данную биологическую жидкость как среду, отражающую состояние ЦНС и процессов, происходящих на ее территории с тем ограничением, что примерно половина ткани головного мозга, особенно кора, не контактируют с ЦСЖ, поэтому патология этих областей не отражается на составе ЦСЖ [4].

Система ликворообращения мозга включает три основных звена:

ликворопродукцию, ликвороциркуляцию и отток ликвора [121, 125].

Продукция ЦСЖ осуществляется в основном сосудистыми сплетениями желудочков мозга путем ультрафильтрации плазмы крови и секреции некоторых компонентов в сосудистых сплетениях мозга. В образовании ЦСЖ также принимают участие структурные элементы мозга благодаря возможности диффузии межклеточной жидкости через эпендиму в желудочки головного мозга и через межклеточные пространства к поверхности мозга. В нормальных условиях экстраваскулярная продукция цереброспинальной жидкости весьма незначительна. Регуляция проникновения из крови в мозг биологически активных веществ, метаболитов, химических веществ, воздействующих на чувствительные структуры мозга, а также препятствие поступлению в мозг чужеродных веществ, микроорганизмов, токсинов осуществляется гемато-ЦНС барьерами. Барьерные функции осуществляются благодаря уникальным особенностям их анатомических структур: чрезвычайно плотные контакты клеток эндотелия капиллярного русла головного мозга, эпителия сосудистого сплетения, арахноидальных мембран, а также функциональные особенности этих клеток (высокая ферментативная активность, наличие транспортных белков, обеспечавающих избирательную проницаемость веществ), наличие астроцитарной оболочки капилляров мозга, наличие базальной мембраны, залегающей между эндотелиальными клетками капилляров и отростками астроцитов, наличие макрафагальных клеток (перициты, клетки Колмера), отсутствие способности к пиноцитозу эндотелиальных клеток мозга [14, 49, 56, 79, 131]. Выделяют следующие барьеры:

1) гематоэнцефалический (ГЭБ), локализован на уровне церебральноваскулярного эндотелия посткапиллярных венул, разделяет кровь и интерстициальную жидкость ткани мозга;

2) гематоликворный барьер (ГЛБ) – локализован на уровне эпителия сосудистого сплетения, обеспечивающего секрецию ЦСЖ, избирательный транспорт веществ, разделяет кровь и вентрикулярную ЦСЖ;

3) арахноидальный барьер, локализован на уровне арахноидальной оболочки, обеспечивает отток ЦСЖ.

ГЭБ/ГЛБ обладает специфической проницаемостью для разных типов молекул: свободное проникновение (кислород и двуокись азота, вода и алкоголь), активный транспорт посредством транспорных белков (ионов органических кислот, щелочей, которые стабилизируют состав ЦСЖ и экстрацеллюлярной жидкости мозга, глюкозы), также описан механизм транцитоза. Несмотря на наличие FcRn-рецепторов иммуноглобулинов в эндотелии кровеносных сосудов хороидного сплетения не была подтверждена гипотеза трансцитозного механизма переноса антител из периферической крови в ЦСЖ [85]. Позже на моделях животных было показано, что данные рецепторы опосредуют "обратный трансцитоз" из ЦСЖ в кровь [146].Таким образом, на настоящий момент общепризнанным является мнение, что проницаемость иммуноглобулинов через барьерные структуры ЦНС объясняется в основном механизмом пассивной диффузии [49, 123]. При пассивной диффузии для многих молекул проницаемость почти обратно пропорциональна их молекулярной массе и пропорциональна градиенту концентраций в кровеносном русле и ЦСЖ. Различия в молекулярной массе иммуноглобулинов разных классов (IgG ~150 кДа; IgA~170 кДа; IgM~900 кДа) определяет их различную проницаемость. Так, при прохождении через ГЭБ/ГЛБ в норме концентрация иммуноглобулина G уменьшается в 440, IgA в 800, IgM в 3400 раз, альбумин (67кДа) в 205 раз [123].

Циркуляция ЦСЖ определяется градиентом гидростатического давления в ликворных путях, пространствах мозга, обусловленного пульсацией внутричерепных кровеносных сосудов, изменениями венозного давления и положения тела в пространстве [125]. Нарушение ликвороносных путей (закрытие желудочковых отверстий опухолью, спайками, сгустками крови, гуммами; обструкция ячеек, ворсинок и пахионовых грануляций эритроцитами, фиброз оболочек после кровоизлияния или перенесенного менингита; окклюзия синусов) приводит к замедлению циркуляции ЦСЖ [125].

Отток ЦСЖ преимущественно (на 30 - 40%) происходит через арахноидальное пространство в продольный синус (часть венозной системы головного мозга). Движущим фактором такого перемещения ЦСЖ является градиент гидростатического давления ее и венозной крови. Около 10% жидкости оттекает через сосудистое сплетение желудочков мозга, от 5 до 30% — в лимфатическую систему через периневральные пространства черепных и спинномозговых нервов, а также через решетчатую пластинку и адвентиции церебральных артерий. Некоторое количество жидкости резорбируется эпендимой желудочков мозга и сосудистыми сплетениями [46, 125].

Общий объем ликвороносных пространств у взрослого человека в норме составляет 90—200 мл, в среднем 140 мл. В сутки вырабатывается около 500 мл цереброспинальной жидкости, обновление ее происходит примерно 4—8 раз в сутки. Значительные колебания в скорости обновления ЦСЖ зависят от суточного режима питания, водного режима, колебаний активности физиологических процессов в организме, физиологической нагрузки на ЦНС и др. Скорость образования ЦСЖ может значительно возрастать при развитии патологических процессов (воспалительные процессы, черепномозговые травмы, субарахноидальные кровоизлияния, операции по поводу опухоли мозга и т. д.) [46].

При исследовании состава ЦСЖ и последующей интерпретации данных важно учитывать такие факторы: концентрация данного вещества в крови, степень проницаемости ГЭБ/ГЛБ, скорость образования ликвора, источник происхождения ЦСЖ (состав вентрикулярного, цинтернального и люмбального вентрикулярного ликвора – 0,12-0,2 г/л, цистернального – 0,1-0,22 г/л, люмбального – 0,22-0,33 г/л. Происхождение белка ЦСЖ связано с фильтрацией белковых молекул из плазмы крови, а также с синтезом белка в ЦНС. Белок в СМЖ состоит из альбуминов (0,168-0,240 г/л), различных фракций глобулинов (0,024-0,048 г/л, белковый коэффициент 1:5), гормонов и нейроспецифических белков. Белковый состав ликвора имеет важное клиническое значение и определяет физические свойства ликвора. В исследовании иммунной системы ЦСЖ особое значение имеет изучение нейроспецифических белков и иммуноглобулинов ликвора. В норме доля иммуноглобулинов в ЦСЖ составляет 8-14% от общего белка, описано представительство иммуноглобулинов трех классов A (0,2 – 2,1 мг/л), M (0,2мг/л), G (12,0 - 40,0 мг/л) в отсутствии патологических признаков иммуноглобулинов класса G (G1, G2, G3, G4) в ликворе в доступных литературных источниках обнаружено не было.

гематоэнцефалического/гематоликворного барьера различными причинами (повышение проницаемости эндотелиоцитов, нарушение тока или реабсорбции ЦСЖ и т.д.) и наблюдаются при многих воспалительных (инфекционной и неинфекционной природы) и дегенеративных неврологических заболеваниях, а также других патологических состояниях (сахарный диабет, гипертиреоз, гипертоническая болезнь и т.д.) В клинической практике в большинстве случаев определить патогенез нарушений не представляется возможным [131]. При сифилитической инфекции, скорее всего, вовлечение грануляции паутинной оболочки головного и спинного мозга, а также оболочек черепных и спинномозговых нервов, сосудов мозга в воспалительный процесс может быть причиной дисфункции ГЭБ/ГЛБ [15].

Общепринятым лабораторным показателем, позволяющим оценить долю плазменной составляющей ликвора и состояние ГЭБ/ГЛБ, является альбуминовый коэффициент (albumine quotient (Qalb) [4, 86, 95]. Биологической основой данного показателя является тот факт, что альбумин ликвора является исключительно производным от альбумина плазмы крови, так как не синтезируется внутри ЦНС. Qalb представляет собой отношение концентрации альбумина в ликворе к его концентрации в системном кровотоке. Показано, что величина Qalb зависит от многих других факторов, в том числе от возраста, пола, массы и/или индекса тела, осанки, физической активности, употребления алкоголя, курения [86, 95]. Дисфункциональные нарушения ГЭБ/ГЛБ могут патологическими состояниями ЦНС. J. Brettschneider c коллегами [95], проанализировав данные 3873 пациентов, показали, что удельный вес дисфункции ГЭБ/ГЛБ у лиц, не имеющих других клинико-лабораторных признаков заболеваний нервной системы, составил 15%. Эту величину, по нашему мнению, можно рассматривать как популяционную частоту дисфункций, не связанных с заболеваниями нервной системы.

Дисфункциональные нарушения ГБ/ГЛБ ведут к накоплению в ЦСЖ иммуноглобулинов и др.), что, с одной стороны, может опосредовать последующее повреждение клеток мозга [131], с другой стороны, может снижать диагностическую ценность иммунологических тестов в ЦСЖ при диагностике нейроинфекций (в том числе нейросифилиса) [16] в случае неинфекционной природы таких нарушений.

Несмотря на то, что Qalb является часто определяемым показателем, и в ряде исследований приводятся данные по состоянию ГЭБ/ГЛБ у больных сифилисом (в т.ч. нейросифилисом) [21, 22, 68, 78], статей, специально посвященных изучению этого вопроса и обобщающих данные по частоте и выраженности дисфункций ГЛБ у больных сифилисом, среди имеющихся в доступных информационных ресурсах, нами не обнаружено. Конкретное упоминание частоты повышенных значений Qalb при сифилитической инфекции содержится в ограниченном числе литературных источников. Так, в материалах рабочей группы IUSTI/WHO [126] B.L. Schmidt ссылается на данные M. Moskophidis и F. Mller [109] (43% у больных нейросифилисом) и приводит собственные данные (53% у больных нейросифилисом и 20% у исследовательской группы [8] дисфункция ГЭБ встречается у 12 из 32 (38%) обследованных больных сифилисом. В ряде других статей в табличном материале содержатся данные по частоте выявленных дисфункций ГЭБ/ГЛБ у пациентов с установленным и исключенным диагнозом нейросифилиса: R.V.W.

van Eijk и соавт. [78] - 38% и 11%, E. Hische и соавт. [68] 54% и 9%, A.F. Luger и соавт. [102] 53% и 19%, соответственно. Данные A.F. Luger и соавт., вероятно, перекрещиваются с данными B.L. Schmidt, так как были выполнены одной группой исследователей.

Также не были выявлены работы, посвященные исследованию роли дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ в изменении количественного и качественного состава иммуноглобулинов ЦСЖ.

иммуноглобулинов в ЦСЖ дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ при сифилитической инфекции углубит понимание закономерностей формирования иммунного состава ЦСЖ, и будет способствовать совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.

1.6. Интратекальный синтез иммуноглобулинов Иммунные реакции, происходящие в центральной нервной системе (ЦНС) имеют уникальные особенности, обусловленные клеточной и функциональной организацией нервной системы и наличием барьерных структур. Конститутивное отсутствие организованной лимфоидной ткани отражает тот факт, что мозг обычно не подвергается значительной антигенной стимуляции. Хотя ГЭБ/ГЛБ являются серьезным препятствием для гуморальных эффекторных молекул, таких как антитела и компоненты комплемента, однако вполне проницаемы для активированных клеток.

Общепризнано, что ткани ЦНС (как и любой нелимфоидные орган, который может иметь воспаление) в норме патрулируются иммунными, но не наивными, Т- и В-лимфоцитами, фенотип CD45RO+ представлен 65% лимфоцитов ЦСЖ в отсутствии воспаления ЦНС [137]. В экспериментальной модели in vitro миграции лимфоцитов за гематоэнцефалический барьер было продемонстрировано, что В-лимфоциты быстрее, нежели аутологичные Тлимфоциты, проникают через интактный гематоэнцефалический барьер с помощью молекул адгезии и хемокинов [73]. Проникновение на территорию (плазмобласты СD19+CD138+, плазмоциты CD19-CD138+, клетки памяти).

Большинство этих клеток уже праймированы антигеном, и на территории ЦНС возможно существование как коротко живущих, так и долгоживущих В-клеток с различной антигеной специфичностью. При воспалении клетками ЦНС (астроциты, микроглия, нейроны, резидентные макрофаги) синтезируются все необходимые медиаторы (хемокины, цитокины, фактор активации В-клеток – BAFF), необходимые для функциональной стабильности В-клеток, в частности долгоживущих плазматических клеток, пролиферации, а также продуктивного антителообразования [106, 117]. Кроме того, было выявлено повышение экспрессии апоптоз-ингибирующих белков Bcl-2 и FLIP в B- клетках пациентов с рассеяным склерозом [128].

На сегодняшний день существует концепция, что только небольшое число активированных лимфоцитов могут проникать через неповрежденные ГЭБ или ГЛБ в лептоменингеальные пространства для достижения заполненных ЦСЖ пространств, где при встрече с антиген-представляющими клетками (лептоменингеальными макрофагами), они могут вызвать молекулярные события, приводящие к развитию клинических проявлений заболевания. Реактивация Т-клеток антиген-представляющими клетками (периваскулярными макрофагами, клетками глии) в пространствах ЦНС, заполненных ЦСЖ, приводит к воспалительным изменениям ГЭБ и, вероятно, также ГЛБ. Это достигается экспрессией дополнительных сигналов клеточной адгезии в этих барьерах, что позволяет рекрутировать многочисленные клетки из системного кровотока в дренированные ЦСЖ периваскулярные и субарахноидальное пространства. Нейроны и клетки глии активно регулируют эффекторные функции макрофагов и лимфоцитов, клетки микроглии являются иммунокомпетентными, но отличаются от других макрофагов/дендритных клеток в их способности направлять нейропротекторный ответ лимфоцитов.

После стимуляции антигеном в ткани, эти клетки вырабатывают лимфокины, которые стимулируют тучные клетки, чтобы открыть плотные капиллярные контакты, для привлечения и распространения Т-, В-лимфоцитов, моноцитов.

Инфильтрация лимфоидными клетками мозговых оболочек имеет различную структуру: от скопления лимфоцитов до организованных лимфоидных фоллликул, имеющих В-клеточную и Т-клеточные зоны [72, 92, 106, 117]. В частности, при нейросифилисе описаны лимфоплазмоцитарные инфильтрации мозговых оболочек и стенок сосудов [15, 29]. При хроническом воспалении отмечается образование упорядоченных лимфоподобных структур, напоминающих лимфатические капилляры, в периваскулярном (ВирховРобина) пространстве (отделяет сосуды мозга от окружающей паренхимы мозга), содержащих в тесном контакте плазматические, ретикулярные клетки, окружающие их Т-клетки и макрофаги. Предполагается, что эти лимфатические узлоподобные структуры являются местом, где происходят процессы сохранения и активации плазматических клеток, непрерывной презентации антигена и интратекального синтеза антител, регулируемые клетками микроглии. Однако, если основной источник антигена находится в паренхиме мозга, эффекторные иммунные клетки мигрируют в ткани головного мозга, вызывая повреждение (энцефалит, миелит, абсцесс мозга, менингоэнцефалит) [72, 92, 106].

То обстоятельство, что один или несколько типов рецепторов для связывания Fc- фрагментов иммуноглобулинов классов А, G, E обнаружены на всех типах клеток ЦНС (микроглия, олигодендроциты, астроциты, нейроны), причем их экспрессия увеличивается при патологических состояниях, доказывает важную роль иммуноглобулинов в развитии иммунного ответа на территории ЦНС. Иммуноглобулины через связывание с Fc-рецепторами клеток мозга (микроглии) индуцируют фагоцитоз, реакции антитело-зависимой клеточной цитотоксичности, оксидазный взрыв, что в свою очередь позволяет рассматривать Fc- рецепторы в качестве посредников повреждения тканей в ЦНС. С другой стороны, иммуноглобулины могут играть протективную роль, способствуя удалению антигенных детерминант посредством фагоцитоза, например, амилоидных пептидов из мозга [112].

антителопродукции [106]. Во-первых, это может быть результатом миграции Вклеток, находящихся в терминальной стадии дифференцировки (плазмоцитов), в места воспаления независимо от их антигенной специфичности и не требующей формирования эктопической лимфоидной ткани.

Во-вторых, это может быть результатом Т-зависимой дифференциации Вклеток памяти в антителопродуцирующие клетки, сопровождающейся соматической гипермутацией Ig-генов. Данные процессы происходят при воспалении в присутствии антигена на территории ЦНС и не требуют наличия организованной лимфоидной ткани. В частности, в экспериментальной модели на крысах интратекальный синтез иммуноглобулинов фиксировали через дней после антигенной стимуляции ЦНС [54].

В-третьих, длительно существующие воспалительные инфильтраты образуют структуры, напоминающие по функции и архитектуре лимфатические узлы, так называемые третичные лимфоидные органы [53]. Присутствие данных структур позволяют предположить возможность антигенной презентации наивным Т- и В-лимфоцитам в непосредственной близости от места предполагаемого внедрения инфекционного агента, предотвращая его диссеминацию. Регистрация в ЦСЖ В-клеточной популяции с фенотипом центробластов (CD19+CD38high+CD77+Ki67+ Bcl-2–) [119], типичным для герминальных центров вторичных лимфоидных органов, подтверждает возможность данного механизма развития гуморального иммунного ответа на территории ЦНС.

антителопродуцирующие клетки в результате антигеннезависимой активации, при участии Т-клеток и Toll-рецепторов на В-клетках. В результате данной активации возможен интратекальный синтез антител различной специфичности одновременно [106].

Таким образом, суммируя вышесказанное, на терририторию ЦНС Влимфоциты попадают из системной циркуляции в основном на стадии дифференцировки плазмобластов или В-лимфоцитов памяти. В-клетки памяти могут дифференцироваться в антителопродуцирующие клетки под действием антигена в присутствии Т-лимфоцитов как на территории эктопической лимфоидной ткани (фолликулоподобные структуры), так и вне ее. Кроме того, возможна стимуляция дифференцировки В-клеток памяти в плазмобласты в отсутствие антигенов, при так называемой неспецифической активации.

Интратекальный синтез иммуноглобулинов имеет место при различных видах инфекционной и неинфекционной воспалительной патологии ЦНС [86].

Несмотря на то, что факт инратекального синтеза иммуноглобулинов не вызывает сомнений, природа и механизм длительной стимуляции плазматических клеток до сих пор неизвестны.. Кроме того, неясна причина и клиническое значение факта длительно сохраняющегося интратекального синтеза (от нескольких месяцев до нескольких лет) после терапии у части пациентов, в том числе после антибиотикотерапии, нейросифилиса [74, 121].

и J.B. Peter предложили следующую интерпретацию наличия H. Reiber признаков интратекального синтеза иммуноглобулинов [121]. Интратекальный гуморальный иммунный ответ не обязательно является индикатором текущей активности заболевания, а, скорее, может отражать три различных процесса:

(1) острые воспалительные заболевания ЦНС и проявляется повышенным количеством клеток в ЦСЖ, и наличием признаков дисфункции гемато-ЦНС барьеров (повышенное значение Qаlb); (2) остаточный интратекальный синтез антител, как результат перенесенной инфекции в прошлом, не имеет отношения к текущим клиническим симптомам (характеризуется отсутствием дисфункции гемато-ЦНС барьеров и низкими титрами IgM в крови); (3) хронический воспалительный процесс аутоиммунной природы.

Существует несколько методологий выявления интратекального синтеза иммуноглобулинов, отличающиеся способом выявления локального характера чувствительностью.

К качественным методам относят электрофорез и изоэлектрическое фокусирование с иммунофиксацией. Качественные методы позволяют лишь классифицировать гуморальную реакцию в ЦСЖ и крови по количеству клонов, продуцирующих антитела (т.е. моноклональная, олигоклональная или поликлональная реакция). У здоровых людей иммуноглобулины поликлональны. Электрофорез является устаревшей, менее чувствительной методикой, как в сравнении с количественными методами, так и методом изоэлектрического фокусирования с иммунофиксацией. Последний признан на сегодняшний момент «золотым стандартом» выявления интратекального синтеза IgG у пациентов c рассеянным склерозом, так как демонстрирует более высокую специфичность в сравнении с количественными методами [86]. В отличие от рассеянного склероза, при котором олигоклональные иммуноглобулины обнаруживаются только в ЦСЖ, при системных инфекциях идентичные олигоклональные группы иммуноглобулинов регистрируются как в ЦСЖ, так и в сыворотке крови, что не позволяет исключить пассивную диффузию данных иммуноглобулинов из системного кровотока, особенно при функциональной несостоятельности гема-ЦНС барьеров. Помимо этого иммуноглобулинов класса М, А, и по данным международного консенсуса [86] интратекальный синтез этих классов иммуноглобулинов, в частности у пациентов с инфекционными заболеваниями, рекомендуется исследовать количественными методами. Кроме того, изоэлектрическое фокусирование с иммунофиксацией технически является более сложным анализом, требующим специального дорогостоящего оборудования и высокой квалификации специалистов [81].

Основой для количественных методов выявления интратекального синтеза иммуноглобулинов являются следующие положения: проницаемость гемато-ЦНС барьеров для иммуноглобулинов коррелирует с таковой для альбумина (белка, имеющего меньшую молекулярную массу и поступающего в ЦСЖ исключительно из системного кровотока); имеется прямая зависимость концентрации аналита в ЦСЖ от таковой в системном кровотоке.

Количественные методы [101, 122, 136] представляют собой различные математические модели зависимости коэффициентов иммуноглобулинов (соотношение концентраций в ЦСЖ к таковой в сыворотки крови) к соответствующему показателю для альбумина (Qalb). Данные соотношения изучались у пациентов с наличием олигоклональных групп иммуглобулинов, определяемых качественными методами (в основном, у пациентов с рассеянным склерозом) в ЦСЖ и с отсутствием таковых у пациентов с исключенными воспалительными заболеваниями ЦНС. Наиболее простым в использовании является метод, предложенный H. Link с соавторами в году, основанный на линейной зависимости [101]. Более сложной является методология, предложенная H. Reiber, в основу которой заложена гиперболическая зависимость проницаемости альбумина и иммуноглобулинов при различных состояниях гемато-ЦНС барьеров [122]. Данная зависимость была выявлена в результате анализа соотношений ЦСЖ/сыворотка крови иммуноглобулинов различных классов и альбумина 4300 пациентов с невоспалительными заболеваниями ЦНС, в том числе и при функциональной несостоятельности гемато-ЦНС барьеров, в отсутствие олигоклональных иммуноглобулинов в ЦСЖ (отрицательный результат при исследовании ЦСЖ методом изоэлектрического фокусирования). На популяционном уровне было определено предельное (максимальное) значение соотношения иммуноглобулинов ЦСЖ/сыворотка крови для каждого класса иммуноглобулинов (А, М, G) при конкретной проницаемости гемато-ЦНС барьеров, оцененной как Qalb. Превышение расчетного предельного соотношения является признаком интратекального синтеза иммуноглобулинов.

Линейные формулы и гиперболическая функция, предложенная H. Reiber имеют примерно одинаковую диагностическую точность, однако метод H.

Reiber демонстрирует несколько большую сопоставимость с «золотым»

стандартом (изоэлектрическое фокусирование) [130], кроме того, данная методика позволяет количественно оценить в мг/л или % минимальную интратекально синтезированную фракцию иммуноглобулинов каждого из основных классов иммуноглобулинов A, M, G. Преимуществом метода, ложноположительные заключения о наличии интратекального синтеза иммуноглобулинов, полученные при расчете с использованием линейных формул, что особенно актуально при повышенных значениях Qalb. В европейском руководстве 2006 года по рутинному исследованию ЦСЖ резюмировано, что в сравнении с линейными формулами, гиперболические обладают преимуществами большей диагностической точности [86].

Сведения по интратекальному синтезу иммуноглобулинов у больных нейросифилисом ограничены отдельными исследованиями. Основные работы датируются 80-90 гг. прошлого века. Исследования F. Vartdal и B. Vandvik [110, 144] продемонстрировали взаимосвязь общего и специфического локальных иммунных ответов, показав, что олигоклональные общие IgG в ЦСЖ больных нейросифилисом ассоциированы с трепонемаспецифическими IgG. Позже E. A. H. Hische с коллегами доказалидиагностическую значимость повышенных значений индексов общих иммуноглобулинов IgM и IgG для подтверждения диагноза «нейросифилис» Также несколькими исследовательскими группами, было продемонстрировано, что повышенные значения линейных индексов общих IgM и IgG могут быть единственным патологическим признаком при асимптомном нейросифилисе [65, 78].

Вышеизложенные факты явились основанием для рекомендации использования расчетных показателей индексов общих иммуноглобулинов класса M и G (линейные формулы) в диагностике нейросифилиса европейским гайдлайном 2001 года [84]. На современном этапе из-за отсутствия достаточного количества исследовательских работ данные показатели исключены из руководств по диагностике нейросифилиса [96], не используются в Российской Федерации [32, 33], тем не менее, экспертами в области сифилидологии признается их диагностическая значимость [9, 16, 17, 116].

На основании статьи H. Reiber и J.B. Peter опубликованной в 2001 г. [121] существовало мнение, что интратекальный синтез IgA при нейросифилисе встречается редко и может расцениваться как дифференциальнодиагностический признак, характерный лишь для туберкулеза ЦНС. В 2005 г.

M. Ebinger с соавторами [77] на основании собственных и литературных данных, показал, что интратекальный синтез IgA не противоречит диагнозу «нейросифилис» и выявляется у значительного числа пациентов с нейросифилисом. Опубликованных исследований, посвященных изучению локальной продукции подклассов IgG, изотипической структуры интратекального синтеза в целом, оценке вклада интратекального синтеза в изменение иммуноглобулинового состава ЦСЖ, а также особенностей ИТС, ассоциированных с признаками воспалительного процесса в ЦНС и наличием в анамнезе противосифилитической терапии, не было выявлено.

В отличие от интратекального синтеза общих иммуноглобулинов мнение экспертов относительно методологии выявления интратекального синтеза патогенспецифических иммуноглобулинов окончательно не сформировано.

Предложенные методы представляют собой математические расчеты, основанные на допущении, что в отсутствие синтеза патогенспецифических антител на территории ЦНС показатель отношения «концентрация антител в ЦСЖ / концентрация антител в крови» приблизительно соответствует таковому для общих иммуноглобулинов (чаще всего используют отношение «концентрация общих иммуноглобулинов G в ЦСЖ/концентрация общих иммуноглобулинов G в крови»). Величина, характеризующая соотношение данных показателей, получила название антительный индекс (АИ) или Antibody Index (AI), при его увеличении делается заключение о наличии интратекального синтеза патогенспецифических антител. Однако, при исследовании аналитических характеристик АИ при инфекционных патологиях (в частности при другом спирохетозе – лайм-боррелиозе) были получены данные, свидетельствующие о недостаточной чувствительности теста и противоречивости результатов [67, 100, 124]. Аналогом антительного индекса при сифилитической инфекции является ITpA индекс (Intrathecally produced T.

pallidum Antibody), где концентрация трепонемаспецифических антител выражается в титрах ТРНА [16, 116]. Однако, при исследовании данного индекса была показана высокая вероятность ложноположительных результатов [102]. Другой предложенный для диагностики нейросифилиса ТРНА-индекс, представляющий собой отношение титра ТРНА в ЦСЖ к показателю Qalb, и также заявленный авторами как показатель интратекального синтеза, констатируется необходимость его исследования в другом научном центре [126]. Таким образом, вопрос о диагностической значимости показателей, характеризующих патогенспецифический интратекальный синтез при сифилитической инфекции, остается открытым, сведения по их использованию взаимоотношений между данными индексами и доказанными случаями интратекального синтеза не проводилось.

Обобщая вышесказанное, можно сделать заключение, что процесс интратекального синтеза иммуноглобулинов является объективным свидетельством вовлечения центральной нервной системы в воспалительный процесс при инфекционной патологии и имеет валидированные методики выявления. Подробное изучение интратекального синтеза имммуноглобулинов при сифилитической инфекции с использованием стандартизованных, высокочувствительных тест-систем, исследование его влияния на результаты диагностических тестов в ЦСЖ, будет способствовать углублению понимания закономерностей иммунного ответа и совершенствованию иммунодиагностики нейросифилиса.

1.7. Взаимосвязь локального и системного иммунного ответа при Наличие взаимосвязи между процессами антителообразования, развивающимися на территории ЦНС и в периферических лимфоидных узлах, определяется особенностями иммунного ответа ЦНС. Считается, что иммунная система мозга способна осуществлять лишь механизмы врожденного иммунитета, тогда как клетки специфического адаптивного иммунного ответа (Т- и В-лимфоциты) рекрутируются из системного кровотока при воспалении.

При отсутствии патологии данный процесс ограничивается патрулированием забарьерных пространств небольшим количеством иммунных лимфоцитов [70, 106].

направленность системного иммунного ответа должны находить отражение при развитии иммунного ответа на территории ЦНС. С другой стороны, экспериментально доказано, что существует отток специфических для ЦНС антигенов в шейные и поясничные лимфатические узлы, обеспечивающий стимуляцию наивных Т и В-лимфоцитов [60]. В экспериментальной модели нейроборрелиоза (интрацеребральное заражение мышей Borrelia burgdorferi) было продемонстрировано, что наличие живых микроорганизмов в паренхиме мозга вызывает иммунный ответ не только на территории ЦНС, но и в периферических лимфоидных органах, способствует формированию дополнительных эктопических очагов лимфоидной ткани в различных органах, индуцируя активацию поликолональных В-клеток, приводя к производству широкого спектра антител, увеличению содержания иммуноглобулинов класса G и антител к Borrelia burgdorferi в системном кровотоке [100]. Исследований по изучению взаимосвязи интратекального и системного иммунного ответа при инфекционных заболеваниях в доступных литературных источниках не обнаружено. Опубликованы исследования, которые могут служить косвенным доказательством того, что инфекционный процесс в ЦНС сопровождается более выраженным иммунным ответом. Так, у пациентов с установленным диагнозом нейросифилиса выше удельный вес высоких титров (1:32) в тесте RPR в крови [66, 145], у пациентов с титрами противотрепонемных антител (ТРНА) больше чем 1:2560 выше вероятность обнаружить патологические изменения в ликворе [71]. И наоборот, у пациентов, в крови которых определяются низкие титры антикардиолипиновых антител (VDRL Qlim).

Оценка интенсивности интратекального синтеза производилась путем расчета значений минимальной интратекально-синтезируемой фракции иммуноглобулинов (ИСФ) в абсолютном (Igloc) и относительном (IgIF) значении:

Igloc (мг/л)= [QIg-Qlim] • Igсыворотка IgIF (%)=[ Igloc /IgЦСЖ] • 100% Состояние ГЭБ/ГЛБ оценивалось с помощью коэффициента альбумина (Qalb), равного отношению концентрации альбумина в ЦСЖ (мг/л) к концентрации альбумина в сыворотке (мг/л). Значения Qalb, превышающие возрастные нормы [Qalb = (4 + возраст/15) 10-3], были расценены как дисфункция ГЭБ/ГЛБ [121] При выявлении дисфункции ГЭБ/ГЛБ, величину Qаlb (•10-3) дополнительно оценивали на основании критериев SchliepandFelgenhauer [91]: Qalb•10 менее 9,0 – несущественные нарушения, 9,0-14,3 – небольшие нарушения, 14,3-33,3 –умеренные нарушения, 33,3-100,0 – тяжелые нарушения; больше 100,0 – «катастрофическое повреждение», также для характеристики дисфункции использовали показатель величины превышения индивидуального значения Qаlb над возрастной нормой (%), равный [(Qфактический-Qнорма)/Qнорма].

Определение содержание альбумина проводили турбидиметрическим методом (DiaSys, Германия), общих иммуноглобулинов различных изотипов (G1, G2, G3, G4, M, A,) - методом ИФА (ЗАО «Вектор-Бест», Россия). Для повышения надежности и точности соотношения концентраций альбумина и иммуноглобулинов образцы ЦСЖ и сыворотки были проанализированы в дублях, в рамках одной аналитической серии, подбирая соответствующее разведение биологических жидкостей.

Наличие трепонемаспецифических антител в ЦСЖ и сыворотке крови определяли в тестах:

- иммуноферментного анализа (ИФА) - качественное определение антител класса G (ЗАО «Вектор-Бест», Россия);

- реакции пассивной гемагглютинации (РПГА) - количественная оценка суммарных антител (результаты РПГА для образцов ЦСЖ считались положительными в разведении 1:4 и больше, для сыворотки крови 1:80 и больше) (BIO-RAD, Франция);

- реакции иммунофлюоресценции в двух модификациях: с цельным ликвором (РИФц) и с абсорбцией антител к культуральным непатогенным трепонемам (штаммы V, VII, VIII, IX, Рейтерa) (РИФабс) (положительными считались образцы, которые давали свечение интенсивностью больше 1+ (трепонемы окрашены чуть интенсивнее фона), (ЗАО «Вектор-Бест», Россия);

сыворотке крови определяли в тестах:

- реакции микропреципитации с кардиолипиновым антигеном (РМП):

качественный и количественный варианты определения суммарных антител (НПО «Диагностическиесистемы», Россия), результаты выражались в титрах, при позитивации реакции только с неразведенным (цельным) образцом титр указывался 1:0;

- реакции связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк) (методика постановки реакции Вассермана с ЦСЖ [25]) – качественное определение суммарных антител;

-VDRL (по названию лаборатории разработчика Venereal Disease Research Laboratory) - качественное определение суммарных антител в ЦСЖ, «ЭКОлаб», Россия);

(ЗАО - RPR (Rapid Plasma Reagin) тест - качественное определение суммарных антител в ЦСЖ, (Human, Германия).

Для проведения всех вышеуказанных исследований использовались зарегистрированные в Российской Федерации диагностикумы и тест-системы.

Также был произведен расчет индексов, предложенных для оценки специфического интратекального синтеза: ТРНА индекс и intrathecally produced T. pallidum аntibody (ITpA) индекс. Расчет ТРНА- и ITpA-индексов производили по формулам:

ITpA индекс = [(РПГА ЦСЖ (титр) / РПГА сыворотки (титр)/ QIgG] За пороговую величину были приняты значения ТРНА индекса выше [96], ITpA-индекса выше 3 [116].

Данные о цитозе и содержании общего белка в ЦСЖ были получены из историй болезни.

Статистический анализ данных проведен согласно общепринятым методам [2, 18] c использованием лицензионной программы Medcalc 12. (MedCalcSoftwarebvba, Бельгия).

Для оценки нормальности распределения количественных признаков применялась визуальная оценка частотного распределения (по гистограмме и графику нормальности) с последующим использованием критерия Д’Агостино.

Поскольку распределение большинства количественных признаков не укладывалось в нормальное распределение, данные приведены в виде медианы и границ межквартильного интервала (25-75 перцентиль), возраст пациентов приведен в виде среднего и стандартного отклонения. Для бинарных признаков приведены абсолютное количество и доля с 95%- доверительным интервалом (95%ДИ) для доли.

Сравнительный анализ количественных признаков выполнен с помощью критерия Краскела-Уоллиса. Последующие (post hoc) межгрупповые сравнения проведены с помощью процедуры Стьюдента-Ньюмена-Кейлса (для параметрических признаков) либо критерием Коновера. Сравнения корректировкой уровня значимости для выявления существенно различных пар при множественном сравнении с помощью процедуры Бонферрони-Холма. Для выявления взаимосвязи между двумя непрерывными переменными использовался метод ранговой корреляции Спирмена (r). Для тестирования внутригрупповых различий между частотами различных критериев применялся Кохран (Cochran) Q тест. Оценка предикторов по изучаемому признаку производилась с расчетом отношения шансов с 95% ДИ.

устанавливалась равной 0,05. Нулевая гипотеза (отсутствие различий) отвергалась, если вероятность (p) не превышала ошибку первого рода.

ГЛАВА 3. Характеристика интратекального синтеза иммуноглобулинов и гематоэнцефалического/гематоликворного барьера при сифилитической Для решения первой задачи был проведен анализ структуры и выраженности интратекального синтеза Ig и дисфункциональных нарушений ГЭБ/ГЛБ в целом по группе пациентов с выявленными отклонениями и в зависимости от наличия специфической терапии в анамнезе.

3.1. Изучение интратекального синтеза иммуноглобулинов и его особенностей, ассоциированных с наличием в анамнезе Признаки интратекальной продукции Ig были обнаружены у 55 из пациентов, из них 16 пациентов не имели специфической терапии в анамнезе, 25 человек ранее лечились по поводу неневрологического сифилиса, пациентов поступили для контроля лечения нейросифилиса. Анализ частоты встречаемости лабораторных признаков интратекального синтеза в зависимости от наличия/отсутствия специфической терапии в анамнезе выявил статистически значимые ассоциации (таблица 3.1.1). Наиболее часто признаки интратекального синтеза Ig присутствовали у пациентов, не получавших специфической терапии по поводу сифилиса (у 16 из 23 пациентов, 70%) и пациентов, поступивших для контроля лечения нейросифилиса (у 14 из человек, 98%), что статистически значимо отличалось от пациентов с наличием специфической терапии неневрологического сифилиса в анамнезе (у 25 из