«© П.Ф. Забродский, 2012 © А. Н. Чуев, 2012 ISBN 978–5 –91272-254-66 УДК 612.014.46:616–012 ББК 52.84+52.54+52.8 Я 2 з–114 САРАТОВ-2012 2 ОГЛАВЛЕНИЕ стр. Перечень сокращений Введение Глава 1. Нарушения физиологической ...»

П.Ф. Забродский, А.Н. Чуев

Иммунопатология сочетанного действия

диметилдихлорвинилфосфата и механической

травмы

МОНОГРАФИЯ

© П.Ф. Забродский, 2012

© А. Н. Чуев, 2012

ISBN 978–5 –91272-254-66

УДК 612.014.46:616–012 ББК 52.84+52.54+52.8 Я 2 з–114 САРАТОВ-2012 2

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Перечень сокращений Введение Глава 1. Нарушения физиологической регуляции антиинфекционной неспецифической резистентности организма и иммуногенеза при действии фосфорорганических соединений и механической травмы 1.1. Общая характеристика фосфорорганических веществ 1.2. Токсикологические свойства диметилдихлорвинилфосфата 1.3. Нарушения физиологической регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении фосфорорганическими соединениями 1.4. Изменение неспецифической резистентности организма, иммуногенеза, функции Т- и В-звена иммунитета при травматическом повреждении 1.5. Предполагаемые нарушения физиологических механизмов регуляции иммунного гомеостаза при сочетанном действии острого отравления диметилдихлорвинилфосфата и механической травмы Глава 2. Материал и методы исследований 2.1. Объект исследования и применяемые препараты 2.2. Исследование интегрального состояния антиинфекционной неспецифической резистентности организма при сочетанном действии ДДВФ и механической травмы 2.3. Определение параметров неспецифической резистентости организма 2.3.1. Сывороточная активность лизоцима 2.3.2. Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови (-лизин) 2.3.3. Определения фагоцитарной активности нейтрофилов 2.4. Определение колониеобразующих единиц в селезенке 2.5. Исследование функционального состояния лимфоидных органов 2.5.1. Оценка лимфоидного индекса тимуса и селезенки 2.5.2. Определение содержания Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоцитов в селезенке, лимфатических узлах, костном мозге и циркулирующей крови 2.6. Оценка кооперации Т- и В- лимфоцитов in vitro 2.7. Исследование гуморального звена иммунного ответа 2.8. Исследование клеточного звена иммунного ответа 2.8.1. Оценка функции Т-лимфоцитов 2.8.2. Исследование реакции гиперчувствительности замедленного типа 2.8.3. Исследование антителозависимой клеточной цитотоксичности 2.8.4. Исследование естественной цитотоксичности (активности естественных клеток-киллеров - ЕКК) 2.9. Оценка активности эстераз Т-лимфоцитов 2.10. Исследование концентрации кортикостероидов в плазме крови 2.11. Методы статистической обработки результатов исследований Глава 3. Действие острого отравления ДДВФ в сочетании с механической травмой на интегральное состояние неспецифической и иммунологической резистентности организма и факторы неспецифической защиты 3.1. Изменение антиинфекционной неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном перитоните 3.2. Изменение неспецифической и иммунологической резистентности организма при экспериментальном пневмонии 3.3. Влияние острого отравления ДДВФ в сочетании с травматическим повреждением на обсемененность селезенки и циркулирующей крови 3.4. Сывороточная активность лизоцима при остром отравлении ДДВФ в сочетании с травмой 3.5. Сывороточная активность тромбоцитарного катионного белка при остром действии ДДВФ в сочетании с травмой 3.6. Фагоцитарно-метаболическая активность нейтрофилов при острой интоксикации ДДВФ в сочетании с травмой Резюме Глава 4. Сочетанное действие острого отравления ДДВФ и механической травмы на основные клеточные иммунные реакции 4.1. Оценка функции Т-лимфоцитов 4.2. Исследование реакции гиперчувствительности замедленного типа 4.3. Изучение антителозависимой клеточной цитотоксичности 4.4. Определение функции естественных клеток-киллеров Резюме Глава 5. Сочетанное действие острого отравления ДДВФ и механической травмы на гуморальный иммунный ответ 5.1. Влияние на тимусзависимые гуморальные иммунные реакции 5.1.1. Действие на динамику антителообразования к тимусзависимому антигену 5.1.2. Исследование действия на число антителообразующих клеток 5.1.3. Оценка числа РОК в селезенке 5.1.4. Нарушение кооперации Т- и В-клеток при формировании антителообразования in vitro 5.2. Исследование тимуснезависимого гуморального иммунного ответа 5.2.1. Оценка антителопродукции к тимуснезависимому антигену в динамике по титру антител в крови 5.2.2. Исследование содержания антителообразующих клеток в селезенке к тимуснезависимому антигену Глава 6. Сочетанное действие острого отравления ДДВФ и механической травмы на функциональное состояние тимуса, селезенки, перераспределение лимфоцитов в органах системы иммунитета 6.1. Изменение лимфоидных индексов тимуса и селезенки 6.3. Содержание лимфоцитов в органах системы иммунитета 6.3.1. Оценка содержания лимфоцитов в тимусе и селезенке 6.3.2. Содержание лимфоцитов в костном мозге и лимфоузлах 6.3.3. Исследование содержания лимфоцитов в циркулирующей крови Резюме Глава 7. Оценка функции коры надпочечников и активности эстераз в иммуноцитах при остром отравлении ДДВФ в сочетании с механической травмой 7.1. Исследование содержания кортикостерона 7.2. Определение активности эстераз иммуноцитов Резюме ГЛАВА 8. Коррекция нарушений физиологической регуляции иммунного гомеостаза при сочетанном действии острого отравления ДДВФ и механической травмы на основные показатели системы иммунитета 8.1. Обоснование эффективной иммунокоррекции нарушений физиологической регуляции иммунного гомеостаза после травмы, острого отравления ДДВФ и их сочетанного эффекта 8.2. Влияние дипироксима, Т-активина и миелопида на НРО и основные показатели гуморального иммунного ответа 8.3. Влияние дипироксима, Т-активина и миелопида на основные показатели клеточного иммунного ответа Резюме Заключение Выводы Практические рекомендации Литература

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

АЗКЦ - антителозависимая клеточная цитотоксичность АОК - антителообразующие клетки БОВ – боевые отравляющие вещества ГГНС - гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковая система ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота ЕКК - естественные клетки-киллеры ЕЦ - естественная цитотоксичность ИКК – иммунокомпетентные клетки ИЛ-1 (2 и т.д.) - интерлейкин-1 (2 и т.д.) К-клетки – клетки-киллеры (лимфоциты, определяющие АЗКЦ) КА - катехоламины КМ - костный мозг КОЕ - колониеобразующая единица КОЕс - колониеобразующая единица селезенки КонА - конканавалин А КС - кортикостероиды ЛИ – лимфоидный индекс НИРО - неспецифическая и иммунологическая резистентность организма НРО - неспецифическая резистентность организма ОДЛТА – отрицательный двоичный логарифм титра антител П-СКК – примитивная стволовая кроветворная клетка ПЯЛ – полиморфноядерные лейкоциты РНК – рибонуклеиновая кислота РТМЛ – реакция торможения миграции лейкоцитов СВО - системный воспалительный ответ СКК - стволовая кроветворная клетка ТКБ – тромбоцитарный катионный белок ТХВ - токсичные химические вещества Тh1 – Т-лимфоциты- хелперы типа Тh2 – Т-лимфоциты- хелперы типа ФГА – фитогемагглютинин ФОВ – фосфорорганические вещества ФОС - фосфорорганические соединения СКК - стволовые клетки крови ЦНС - центральная нервная система ЭБ - эритроциты барана ЭК - эритроциты кур Ig - иммуноглобулин LD50 - средняя смертельная доза, вызывающая смертельный исход у 50% Vi-антиген (Vi-Ag) - тимуснезависимый Vi - антиген брюшнотифозной

ВВЕДЕНИЕ

Изучение влияния химических ксенобиотиков на иммунный гомеостаз представляет интерес для физиологов, токсикологов и иммунологов в связи со следующими обстоятельствами: во-первых, в настоящее время происходит колоссальное загрязнение окружающей среды различными соединениями, извращающими иммунные реакции и вызывающими связанные с нарушением иммунного статуса различные заболевания; во-вторых, врачи различных специальностей осознают необходимость коррекции нарушений иммунного гомеостаза как в случае хронических интоксикаций, так и при острых отравлениях, связанных с авариями на химических предприятиях, несчастных случаях на производстве, в быту, при транспортировке, хранении и уничтожении запасов отравляющих веществ [Забродский П. Ф., 1998; Descotes G., 1986]. Наиболее важно изучение влияния ФОС на нарушение регуляции иммунного гомеостаза в связи с возможностью аварий на химических объектах, занимающихся уничтожением огромных запасов боевых отравляющих веществ (БОВ). Особую актуальность эта проблема приобрела в связи с тем, что в последнее время любая химическая авария сопровождается не только отравлением, но и патологическими нарушениями, обусловленными механическими травмами и ожогами [Леков Д.С. и соавт., 1990; Сергеев Г.В., Нечаев Э.А., 1990; Янковская А.Е. и соавт., 1992]. Загрязнение окружающей среды ФОС снижает гуморальный и клеточный иммунный ответ, обусловливает различные инфекционные, онкологические и аллергические заболевания [Шубик 1976; Каган Ю.С., 1977; Хаитов Р. М. и соавт., 1995; Забродский П. Ф., 1998; Loose L.D., 1985; Miller K.,1985; Descotes J., 1986; Luster M. I. et al., 1987].

диметилдихлорвинилфосфат) наиболее опасны [Саватеев Н.В., Куценко С.А., 1983]. Поражения данными ядами характеризуются высокой смертностью отравленных. Из числа больных, поступивших в лечебные учреждения, погибает 20-25% [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000]. Несомненно, что в танатогенезе при отравлениях ФОС (особенно в сочетании с механической травмой) существенную роль играет нарушение регуляции иммуногенеза, снижение функции Т- и В-системы иммунитета [Забродский П.Ф., 1993;

Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001]. В связи с этим, одной из актуальных проблем патологической физиологии в настоящее время является оценка нарушения состояния неспецифической резистентности организма (НРО) и системы иммунитета после острых отравлений фосфорорганическими соединениями [Забродский П.Ф., 1993; 1998; Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001; Descotes G., 1986; Luster M. J. et al., 1987; Sullivan J. B., 1989] при их сочетании с тяжелой механической травмой.

Проблема изучения сочетанного действия острого отравления ФОС в сочетании с механической травмой на иммунный гомеостаз актуальна также в связи с тем, что в настоящее время при возможных террористических актах применение ФОС наиболее вероятно и, как правило, поражения данными соединениями будут сочетаться с механическими повреждениями, обусловливающими травматическую болезнь с выраженным иммунодефицитом [Кожевников В.С и соавт., 1991]. Описано отравление зарином 600 человек в Мацумото (Япония) 27 июня 1994 года в результате террористического акта [Morita H. et al., 1995]. Общеизвестна газовая атака зарином, проведенная сектой «Аум Сенрике» в Токийском метро в марте 1995 году, в результате которой пострадало 5000 человек [Masuda N. Et al., 1995]. У части лиц, пострадавших при данных террористических актах, острое отравление сочеталось с различными механическими травмами. В настоящее время формирование иммунодефицитного состояния при сочетанном действии ФОС и механической травмы практически не исследованно.

сочетанном остром отравлении ФОС и механической травме имеет важное значение для целенаправленного применения иммуномодуляторов из большого арсенала известных сейчас веществ данного класса для профилактики инфекционных осложнений и заболеваний. Следует подчеркнуть, что вопрос о фармакологической коррекции нарушений иммунного гомеостаза под влиянием механической травмы в сочетании с острым отравлением ФОС в постинтоксикационном периоде до сих пор практически не исследован и нуждается в изучении. Существенное улучшение способов профилактики и лечения постинтоксикационного иммунодефицитного состояния при действии ФОС в сочетании с травмой позволит значительно снизить инфекционные осложнения и заболевания.

Таким образом, учитывая достаточно широкое распространение и использование ФОС, в частности, диметилдихлорвинилфосфата в сельском хозяйстве и быту, возможность аварий при уничтожении БОВ, относящихся к фосфорорганическим антихолинэстеразным соединениям, высокую смертность при отравлении ими, недостаточно изученные особенности их действия на систему иммунитета, возможное сочетание острых отравлений с механической травмой при авариях, катастрофах и террористических актах следует заключить, что проблема изучения нарушения иммунного статуса в постинтоксикационный период (посттравматический период) с целью разработки способов их коррекции для профилактики инфекционных осложнений и заболеваний актуальна и важна как в теоретическом, так и в практическом отношении.

Цель исследования: изучение нарушения регуляции иммунного гомеостаза при сочетанном действии острого отравления ФОС диметилдихлорвинилфосфата в сочетании с тяжелой механической травмой в условиях эксперимента на животных и обосновать способы коррекции выявленных сдвигов различных параметров системы иммунитета.

НАРУШЕНИЯ ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ

АНТИИНФЕКЦИОННОЙ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ

ОРГАНИЗМА И ИММУНОГЕНЕЗА ПРИ ДЕЙСТВИИ

ФОСФОРОРГАНИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ И МЕХАНИЧЕСКОЙ

ТРАВМЫ

1.1. Общая характеристика фосфорорганических веществ ФОС представляют собой большую группу токсичных химических веществ (ТХВ), обладающих антихолинэстеразным эффектом, с реализацией которого связана характерная картина острой интоксикации [Саватеев Н.В., 1978; Мошкин Е.А. и соавт., 1980; Лужников Е.А., 1982; Лудевиг Р., Лос К.,1983; Могуш Г., 1984; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000;

Бадюгин И.С. и соавт., 1992; Маркова И.В. и соавт., 1998].

Основной механизм действия ФОС на системы и органы организма – ингибирование ацетилхолинэстеразы. Это вызывает накопление ацетилхолина в центральной нервной системе (ЦНС), мозговом веществе надпочечников, ганглиях вегетантивной нервной системы, а также в синаптической щели нервных окончаний парасимпатического отдела нервной системы, подходящим к м-холинорецепторам внутренних органов. Кроме того, ацетилхолин выделяется из пресинаптической мембраны нервных окончаний симпатической нервной системы, иннервирующей потовые железы, и соматической нервной системы (синапсы скелетных мышц). В результате действия ацетилхолина реализуется мускариноподобное, никотиноподобное и центральное действие ФОВ [Лудевиг Р., Лос К.,1983; Могуш Г., 1984;

Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000]. Неантихолинэстеразным механизмами действия ФОС [Прозоровский В.Б., Саватеев Н.В., 1976] является их способность фосфорилировать некоторые белки, действовать на м- и нхолинорецепторы (курареподобный эффект), взаимодействовать с протеолитическими ферментами, оказывать воздействие на адренергические структуры, способствующее увеличению секреции ацетилхолина из нервных окончаний) [Прозоровский В.Б., Саватеев Н.В., 1976; Саватеев Н.В., 1978;

Виноградов В.М. и соавт. 1985; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000].

При острых отравлениях ФОС возникают поражения многочисленных органов и систем, что проявляется психоневрологическими симптомами, нарушением функции дыхания, сердечно-сосудистой системы, желудочнокишечного тракта, печени, почек и других органов и систем [Голиков С.Н, 1968; Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 1989, 2000]. Наиболее частыми осложнениями тяжелых отравлений ФОС являются пневмонии, поздние интоксикационные психозы и полиневриты [Лужников Е.А., Костомарова Л.Г., 2000].

постинтоксикационной пневмонии является нарушение механизмов физиологической регуляции системы иммунитета [Забродский П.Ф., 1998].

Возможны и другие инфекционные осложнения и заболевания после острого отравления ФОС, а также патологические нарушения, тесно связанные с изменением регуляции иммунного гомеостаза: мутагенное, канцерогенное, демиелизирующий эффект и аллергические реакции [Каган Ю.С., 1977].

1.2. Токсикологические свойства диметилдихлорвинилфосфата ДДВФ (вапона, винилфосфат, дихлофос, перкола, нуван, геркол) является эфиром эфиры алкилфосфорной кислоты (O,O-диметил-О,2,2дихлорвинилфосфат). ДДВФ явялется бесцветной, прозрачной жидкостью с неприятным запахом. Молекулярный вес составляет 220,99 Да; точка кипения – 120С при давлении 3 мм рт. ст. и 74С при - 3 мм рт. ст. Летучесть равна мг/кг при 20 и 350 мг/кг – при 30С. В воде растворимость ДДВФ составляет 10 г/л [Каган Ю.С., 1977]. Дихлофос быстро разрушается во внешней среде.

При 20С в воде гидролизуется 50% ДДВФ в течение 61,5 сут, а при температуре 70С – за 25 мин.

Используется для уничтожения малярийных комаров, эффективен против растительноядных клещей, щитовок, мух, минирующей моли, практически всех видов насекомых, дезинсекции транспортных самолетов и складов.В сельском хозяйстве используется в виде 50% эмульсии [Голиков С.Н., 1968; Каган Ю.С., 1977; Лудевиг Р., Лос К.,1983].

Являясь высокотоксичным соединением, ДДВФ в экспериментальных исследованиях может использоваться для моделирования иммунотропных эффектов боевых ФОВ [Забродский П.Ф., 1993; 1995; 1998; Забродский П.Ф, Киричук В.Ф. и соавт., 2001].

Острое отравление ДДВФ характеризуется типичной клинической картиной проявления интоксикации ФОС. В опытах на крысах показано, что ЛД50 для данного вида животных составляет при внутрижелудочном введении 25- мг/кг. При нанесении на кожу ЛД50 ДДВФ равно 107 мг/кг для самцов и 75 мг/кг для самок крыс [Голиков С.Н., 1968]. По данным С.Д. Ковтуна (1980) ЛД ДДВФ для белых крыс составляет 32-40 мг/кг при внутрибрюшином введении.

[С.Д. и соавт., 1980], а при поступлении внутрь - [Западнюк И.П. и соавт.,1983].

Для морской свинки, белых крыс и кролика при внутрижелудочном поступлении ЛД50 дихлофоса составляет соответственно 80,0+11,8 и 56,0+5 и 15 мг/кг [Западнюк И.П. и соавт.,1983].

Среднелетальная лоза ДДВФ для белых крыс при подкожном введении яда составляет 65,0+ 2,5 мг/кг [Беликов В.Г., 2000] По данным Забродского П.Ф. и внутрибрюшинном и пероральном введении составляет 40,0+0,8 и 126,0+5, мг/кг соответственно. В организме хлорофос метаболизируется, образуя ДДВФ, поэтому признаки отравления этих ФОС очень похожи. В концентрации 8,210- М ДДВФ ингибирует активность холинэстеразы эритроцитов крупного рогатого скота на 50% [Голиков С.Н, 1968].

Таким образом, ЛД50 ДДВФ для неинбредных белых мышей и крыс составляет при различных путях введения от 25 до 126 мг/кг. Самцы крыс более устойчивы к действию дихлофоса. Наиболее чувствительны к ДДВФ кролики. Учитывая вполне закономерную вариабельность при оценке токсикометрических параметров, данные литературы не позволяют однозначно утверждать о существенном отличии ЛД50 мышей и крыс при различных путях введения яда.

1.3. Нарушения физиологической регуляции иммунного гомеостаза при остром отравлении фосфорорганическими соединениями Неспецифические факторы защиты (или резистентности) организма (НРО) тесно связаны с иммунной системой. Иммунный гомеостаз обеспечивается не только специфическими реакциями, включающими функцию Т- и В-систем иммунитета, но и комплексом неспецифических факторов: фагоцитарной активностью, системами комплемента и пропердина, системами интерферонов, лизоцима, тромбоцитарного катионного белка (лизина), белков острой фазы, эндогенных пептидов антибиотиков и др.

[Descotes J., 1986; и соавт., 2000]. Данные факторы одни авторы определяют, как пассивный иммунитет [Ройт А., 1991], другие считают их доиммунными биологическими механизмами резистентности к инфекциям [Хаитов Р.М. и соавт., 2000].

Описано непосредственное действие ФОС (диизопропилфторфосфата и других соединений) на мембрану лейкоцитов, в результате чего изменяется концентрация калия, натрия и кальция в клетках [Woodin A.M., Wieneke A.A., 1969; Taurog J.D.,et al., 1979]. Это приводит к снижению хемотаксиса лейкоцитов [Woodin A.M., Wieneke A.A., 1969; Woodin A.M., Harris A.,1973], уменьшению секреции гистамина, серотонина, -глюкоронидазы и лизоцима из лейкоцитов, причем определенную роль в данном процессе играет снижение активности неспецифических эстераз данных клеток [Becker E.L., et al., 1967].

Существуют основания считать, что ацетилхолин при острой интоксикации ФОС легкой и средней степени тяжести способен оказывать противоположный эффект [Dulis B.H. et al., 1979].

При хронической интоксикации фосфорорганическими пестицидами происходит снижение фагоцитарной активности нейтрофилов [Золотникова Г.П., 1980; Перелыгин В.М. и соав., 1971; Hermanowicz A., Kossman S., 1984]. С уменьшением этого показателя под влиянием ФОС связывают повы-шенную частоту заболеваний верхних дыхательных путей у лиц, контактирующих с фосфорорганическими инсектицидами [Золотникова Г.П., 1980; Hermanowicz A., Kossman S., 1984]. В начальном периоде хронической интоксикации (2- месяца) фагоцитарная активность нейтрофилов повышается, затем наступает ее существенное снижение [Перелыгин В.М. и соав., 1971]. Острая интоксикация карбофосом приводит к снижению функции лейкоцитов [Пирцхалава А.В., 1989] и перитонеальных макрофагов [Жамсаранова С.Д. и соавт., 1988].

Использование модели экспериментальной сальмонеллезной инфекции у мышей позволило выявить снижение неспецифической резистентности организма под действием фосфамида и альбуша при дозе, в 10 раз меньшей по сравнению с общепринятыми показателями. Фосфамид и альбуш воздействовали на сопротивляемость организма к инфекции в одинаковой степени. Установлена также количественная зависимость между заболеваемостью населения кишечными инфекциями и интенсивностью применения агрохимикатов [Чугунихина Н.В., Хасанова М.И., 1994].

Существуют основания считать, что снижение неспецифических факторов резистентности организма при увеличении ФОС (армина) в диапазоне доз от 0,75 до 1,0 ЛД50 по сравнению с активирующим эффектом меньших доз [Забродский П.Ф., 1987], видимо, связано с инактивацией эстераз нейтрофилов [Хейхоу Ф.Г.Дж, Кваглино Д., 1983] и лимфоцитов [Ferluga J. et al, 1972]. При этом повышающий антиинфекционную неспецифическую резистентность организма. Эффект ацетилхолина (и обусловленное его действием увеличение концентрации в крови кортикостероидов [Денисенко П.П., 1980]) при интоксикации ФОС в относительно малых длзах, видимо, превышает супрессирующее действие, связанное с ингибированием эстераз клеток крови [Забродский П.Ф., 1987; 1995].

Повышение под влиянием холинергической стимуляции (ацетилхолина) функции естественных клеток-киллеров [Wietrowt R.W. et al., 1978;

Grabczewska E. et al., 1990], возможно, являющихся одним из основных факторов, определяющих антиинфекционную неспецифическую резистентность организма под влиянием острого действия ФОС [Забродский П.Ф., 1986, 1987, 1993].

Данные литературы позволяют считать, что нарушение неспецифической резистентности организма (НРО) под влиянием ФОС могут быть обусловлены нарушением функции нейрогуморальных механизмов [Корнева Е.А., 1990], увеличением в плазме крови гормонов гипофиза, глюкокортикоидов и биогенных аминов [Кузьминская У.А. и соавт., 1980; Забродский П.Ф., 1993;

Szot R.J., Murphy S.D., 1970], действием ацетилхолина на холинорецепторы нейтрофилов [Dulis B.H. et al., 1979], изменением в клетках крови содержания циклических нуклеотидов [Henson P.M., Oades Z.G., 1976], ингибированием эстераз нейтрофилов и моноцитов [Забродский П.Ф., 1993; Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001; Хейхоу Ф.Г.Дж, Кваглино Д., 1983; Ferluga J. et al, 1972] и системы комплемента [Becker E.Z. et al., 1956, 1964, 1966, 1967, 1971, 1976].

Изучение действия ФОС на гуморальный иммунный ответ началось в начале 60-х годов прошлого столетия. В этом период исследования были сосредоточены в основном на эффектах, обусловленных хроническим воздействием фосфорорганнических инсектицидов (ФОИ) [Феерман И.С. и соавт., 1964; Штенберг А.И., Джунусова Р.М.,1968; Фризман Г.И., 1970]. Было установлено, что фосфорорганичесские вещества вызывают снижение антителообразования. При последующем изучении функции гуморального иммунного ответа после хронического воздействия метилмеркаптофоса, хлорофоса, циклофоса и других ФОС эти результаты были в целом подтверждены с помощью различных методов исследования гуморальной иммунной реакции [Николаев А.И. и др., 1972; Диноева С.К., 1974; Забродский П. Ф., 1986; Жминько П.Г., 1986; Присяжнюк Т.Н. и соавт., 1986; Desi I., Varga L., 1983]. Было установлено, что при ежесуточном поступлении хлорофоса в диапазоне доз от 5 до 100 мг/кг в организм крыс с водой через месяц увеличивалось количество лимфоцитов в периферической крови, затем содержание этих клеток в тимусе и селезенке уменьшалось пропорционально суточной дозе яда [Иванов В.В., 1986]. У лиц, работающих с ФОС, изменялись корреляционные связи внутри пула лимфоцитов и нейтрофилов, зависимость между содержанием В-лимфоцитов и общим количеством лимфоцитов [Федоров С.М. и соавт., 1988]. Несущественное уменьшение антитителоподукции под влиянием метилпаратиона сопровождалось существенной редукцией лимфоидного индекса селезенки. При хронической пероральной интоксикации роннелом (фенхлорфосом) отмечали снижение лимфоидного индекса тимуса в зависимости от дозы и экспозиции в 1,4 - раза. [Rodica G., Srefania M.,1973].

Нарушение иммунного гомеостаза людей при острых интоксикациях ФОИ до сих пор практически не изучено, что обусловлено определенными методическими трудностями и отсутствием у клиницистов единого подхода к получению и анализу лабораторных данных. Ряд публикаций свидетельствуют о том, что у больных через 1 сутки после отравления ФОС снижается содержание иммуноглобулинов в крови, а через 7-10 сут отмечается увеличение IgG и IgА. При этом содержание IgМ не изменяется [Ананченко В.Г. и соавт. 1987; Решетова Н.В. и соавт., 1987].

встречаются лимфопролиферативные заболевания. ФОС тормозят активность эстераз в моноцитах, цитотоксических Т-лимфоцитах, интактных и активированных лимфокинами естественных киллерах. Эти эффекты ФОС ослабляют иммунологический контроль и эффекторные функции, опосредуемые данными видами клеток. Развитие лимфомы часто связано с присутствием вируса Эпштейна-Барра и человеческого герпесвируса-6, иммунитет к которым опосредуется моноцитами, Т-лимфоцитами и естественными киллерами. Выдвигается гипотеза, что торможение активности эстераз иммунокомпетентных клеток, вызываемое ФОС, ослабляет процесс эстеразозависимой детоксикации, в результате чего способствует развитию процесса лимфомогенеза. Кроме того, снижение активности эстераз подавляет иммунитет к таким патогенам, способствующим развитию лимфом, как герпесвирусы [Newcombe D.S.,1991].

Формирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при пероральном поступлении в течение двух месяцев у крыс Вистар снижал форматион в дозе 0,01 ЛД50. Авторы связывали это только (не совсем, на наш взгляд, обоснованно) с увеличением содержания в крови кортикостерона (КС) [Хусинов А.А. и соавт., 1991]. Зависимость антителопродукции от концентрации в циркулирующей крови КС после интоксикации ДДВФ [Забродский П.Ф., 1993] и от ряда других более значимых факторов в последующем была подтверждена [Забродский П.Ф., Германчук В.Г. 2000;

Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001].

зарегистрировано существенное уменьшение реакции ГЗТ на туберкулин у кроликов после получения ими пестицидов в различных дозах в течение 10 и 24 суток. Снижение формирования ГЗТ прямо зависело от дозы и времени интоксикации. Так, метилпаратион в дозах от 0,04 до 1,50 мг/кг, получаемых ежедневно, через 24 дня уменьшал реакцию на повторные введения туберкулина от 1,2 до 2,8 раз. На 10-е сутки после ежедневного получения пестицидов дозозависимый эффект для метилпаратиона и большинства исследованных пестицидов отсутствовал [Street J.C., Sharma R.P., 1975].

Курение и потребление алкоголя потенцировали, вызываемые метилпаратионом повреждения лимфоцитов [Sunil К. K.B, 1993], что, вероятно, обусловлено более выраженным повреждением структуры ДНК лимфоцитов [Москалева Е.Ю. и соавт., 1993].

В опытах на крысах и мышах показано [Забродский П.Ф., Мышкина А.К., 1989], что при применении ФОС (армина) за 1 ч до введения разрешающей дозы антигена существенно уменьшалось формирование ГЗТ. Снижение иммуногенности спленоцитов в опытах по изучению формирования ГЗТ при различных моделях может быть связано с ингибированием ФОС эстераз иммунокомпетентных клеток [Ferluga J. et al., 1972]. Показано, что под влиянием холинергической стимуляции равновероятны два процесса:

относительное увеличение в селезенке количества либо Т-эффекторов и Тхелперов, либо клеток-супрессоров. На эти процессы существенное влияние оказывает стимуляция м-холинорецепторов ацетилхолином [Richman D.P., Arnason B.G.W., 1979], концентрация которого после действия ФОС в синапсах и циркулирующей крови повышается. Результаты проведенных опытов позволили авторам заключить, что ФОС (армин) в дозе 0,7 ЛД50 изменял формирование реакции ГЗТ, характер проявления которой на разных моделях в основном связан с особенностями миграции Т-лимфоцитов из селезенки. При рассмотрении иммунотропных эффектов ФОС следует учитывать, что дифференцировка и созревание Т-лимфоцитов регулируется имеющимися на эпителиальных клетках тимуса никотиновыми ацетилхолиновыми рецепторы [Tominaca K. et al., 1989], а также (как уже указывалось) наличием м- и нхолинорецепторов на лимфоцитах [Richman D.P., Arnason B.G.W., 1979; Masini et al., 1985; Rossi A. et al., 1989].

При хроническом воздействии фосфорорганических инсектицидов на рабочих отмечалось ингибирование Т-клеточного эффекта на митогенную стимуляцию фитогемагглютинином и уменьшение содержания Е-РОК в крови [Золотникова Г.П., 1978; Кащенович Л.А., и соавт.1981].

Хлорофос существенно снижал реакцию трансплантат против хозяина и фагоцитарное число [Жамсаранова С.Д. и соавт., 1990]. J.C. Street и Sharma R.P. (1975) установили, что угнетение клеточного иммунитета при интоксикации ФОС сопровождается изменением иммунной структуры лимфатических фолликулов селезенки, в частности, уменьшением тимусзависимых зон в этом органе с атрофией коры тимуса.

Сопоставление иммунотоксичности антихолинэстеразных препаратов, относящихся к ФОС, и производных карбаминовой кислоты, обладающих дитиокарбаматов на ряд иммунологических параметров in vitro и на выживаемость in vitro лимфоцитов самок мышей. Эффект зависел от дозы, отмечалось различное влияние на массу тимуса и селезенки, активность естественных клеток-киллеров (ЕКК). Диэтилдитиокарбамат и этилен-бисдитиокарбамат в отличие от метилдитиокарбамата при введении в желудок в дозах 200, 225 и 300 мг/кг в сутки в течение 7 дней не влияли на киллерную активность клеток селезенки [Padget E.L. et al., 1992]. Обработка карбаматов постмитохондриальным супернатантом не оказывала влияния на их цитотоксичность [Rodgers K.E. et al., 1986в]. Полученные данные свидетельствуют о том, что антихолинэстеразный эффект в реализации иммунотоксичности ФОС не является решающим.

В опытах на мышах установлено, что малатион in vitro при концентрациях 75 мкг/мл и выше существенно снижает образование зрелых форм цитотоксических Т-лимфоцитов под влиянием клеток аллогенной опухоли Р815 Аналогичный эффект при меньших дозах вызывали этилпаратион, метилпаратион, фенитротион и фентиол, которые подавляли генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов в дозе 5 -10 мкг/мл. [Rodgers K.E. et al., 1985а]. Преинкубация ФОС с постмитохондриальным супернатантом печени крыс, приводящая к их биотрансформации, значительно ослабляет этот эффект. Карбофуран существенно не влияет на активность цитотоксических Тклеток, а карбанил подавляет ее в дозе 50-100 мкг/мл. Длительное введение малатиона (0,1 ЛД50) в течение двух недель вызывало у мышей уменьшение количества Т-клеток в тимусе. Острая интоксикация данным пестицидом (0, ЛД50) вызывала увеличение пролиферации Т-лимфоцитов при их стимуляции конканавалином А [Devens B.H. et al., 1985]. Отмечается супрессия выработки Т-ростковых факторов у мышей под влиянием ФОС [Арипова Т. У. и соавт., 1991].

Установлено, что многие иммуносупрессивные эффекты малатиона связаны с действием О,О,S-триметилтиофосфата, обладающего крайне слабой антихолинэстеразной активностью и появляющегося при хранении этого ФОС в условиях повышенной температуры [Devens B.H. et al., 1985; Rodgers K.E. et al., 1985а, 1985б, 1985в, 1986а, 1986б, 1986в; Thomas I.K., Imamura T.,1986;

Rodgers K.E. et al., 1987]. Острая интоксикация малатионом в дозе 0,5 ЛД через 5 суток приводила к увеличению антителообразующих клеток в селезенке после иммунизации эритроцитами барана (ЭБ) [Rodgers K.E. et al., 1985а]. Отмечалось увеличение пролиферации лимфоцитов в ответ на их стимуляцию липополисахаридом и конканавалином А. При этом количество лимфоцитов в тимусе и селезенке не изменялось. Отсутствие супрессии обстоятельством, что при применении малатиона в дозе 0,5 ЛД50 не отмечалось признаков интоксикации и изменения холинэстеразной активности плазмы.

Повышение активности В-системы иммунитета может быть связано с повышением продукции иммуностимулирующих интерлейкинов. Патогенез данного эффекта пока не выяснен. В то же время, установлено снижение функции лейкоцитов и макрофагов прод влиянием острой интоксикации карбофосом [Жамсаранова С.Д. и соавт., 1988; Пирцхалава А.В., 1989].

Неочищенный малатион в опытах in vitro тормозил иммунный ответ на тимусзависимый и тимуснезависимый антигены, подавлял способность макрофагов представлять антиген [Тhomas I.K., Imamura T., 1986а,1986б, 1986в].

Предполагают, что в реализации механизма ФОС, ингибирующего цитотоксичность Т-лимфоцитов, существенное значение имеет связанная с эстеразной активностью проницаемость мембраны клетки-эффектора для ионов кальция и магния. В свою очередь электролитный обмен этой клетки сопряжен с внутриклеточным содержанием циклических нуклеотидов. Показано, что диизопропилфторфосфат уменьшает АЗКЦ при концентрациях от 0,5 до 4 мМ на 5-80% вследствие нарушения электролитного обмена клетки и изменения сотношения цАМФ/цГМФ [Trinchievi G., M. de Marchi, 1976].

Дихлофос при хроническом воздействии в ежесуточных дозах от 0,025 до 0,100 ЛД50 снижал функцию В-звена иммунита у кроликов на брюшнотифозную вакцину [Desi I. et al., 1970]. Аналогичный эффект пероральном поступлении в течение 8 суток уменьшал содержание антителообразующих клеток в селезенке у мышей на 35% [Wietrowt R.W. et al., 1978]. Отмечали угнетение гуморальной иммунной реакции при пятикратном введении мышам карбофоса в дозах от 0,05 до 0,01 DL50 [Жамсаранова С.Д. и соавт., 1990].

В ряде случаев установлено, что ФОС могут не вызывать снижения антителообразования. Например, при действии лептофоса при концентрациях в пище от 10 до 500 ррm, отмечалось уменьшение активности холинэстеразы сыворотки крови в 1,5-8,8 раз через 12 недель, но при не было отмечено существенного влияния этого ФОС на количество антителообразующих клеток селезенки при первичном и вторичном гуморальном иммунном ответе [Koller L.D. et al., 1976]. Не отмечено изменения концентрации иммуноглобулинов в крови рабочих, связанных с использованием ФОС [Desi I. еt al., 1986].

Установлено казалось бы пародоксальное явление: хлорофос при хроническом отравлении течение 100 дней (0,05 ЛД50) приводил к увеличению антителопрдукции к брюшнотифозному О- и Vi-антигену [Шафеев М.Ш.,1976].

Аналогичный феномен был установлен при действии ФОС в отношении иммуноглобулинов М и G. При этом в сыворотке крови снижалось только содержание иммуноглобулинов А [Kossman S. et al., 1985]. Доза метомидофоса, составляющая 0,05 ЛД50, оказывала активирующее влияние на гуморальную иммунную реакцию [Tiefenbach B., Wichner S., 1985].

Противоречивость данных в отношении влияния ФОС на В-систему иммунитета у людей и животных может быть обусловлена особенностями токсикодинамики и токсикокинетики, определяющих иммунотоксичность этих соединений [Lee T.P. et al., 1979; Audre F. et al. 1983], проведением экспериментов в различное время суток, характеризующееся различной концентраций в плазме крови кортикостероидов [Иванова С.С., 1998; Dhabhar F. S. et al., 1996] и другими причинами, в частности, характером изменения внутриклеточного содержания цГМФ под влиянием ацетилхолина [Денисенко П.П., 1980; Абрамов В.В. и соавт., 1986; Калинкович А.Г.,и соавт., 1988;

Garoroy M.R. et al., 1975; MacManus J.P. et al, 1975]).

Острая интоксикация мышей паратионом в дозе 1,0 ЛД50 в продуктивной фазе иммунного ответа (интоксикация через 2 суток после иммунизации эритроцитами барана -ЭБ) приводила к редукции антителообразующих клеток (АОК) в селезенке мышей более, чем в 3 раза. На индуктивную фазу иммунного ответа (при введении паратиона одновременно с иммунизацией ЭБ) данное ФОС существенного влияния не оказывало [Wietrowt R.W. et al., 1978].

В целом такие же результаты получены при остром отравлении и другими фосфорорганическими инсектицидами - малатионом, дихлофосом, метамидофосом [Rodgers K.E. et al., 1986а; Thomas I.K., Imamura T. 1986].

Паратион в дозе 16 мг/кг, вызывающей выраженную холинергическую стимуляцию и гибель 20% мышей, более чем в 2 раза снижал число плазмоцитов в селезенке, продуцирующих Ig М. Использование его через 2 сут после иммунизации (оценка иммунного ответа проводилась на 4-е сутки после иммунизации) доза 4 мг/кг, не вызывающая симптомов интоксикации, не влияла на формирование иммунной реакции [Casale G.P. et al., 1984].

Установлено существенное снижение синтеза антител фозалоном [Алимова М.

Т. и соавт., 1991]. Редукция гуморальной иммунной реакции под влиянием ФОИ сопровождалась снижением лимфоидных индексов тимуса и селезенки, уменьшением активности холинэстеразы в плазме крови и мозге, увеличением концентрации кортизола и глюкозы в крови, активности трансаминазы в печени [Tiefenbach B., Lange P., 1980; Casale G.P. et al., 1983; Tiefenbach B., Wichner S., 1985]. При этом установлена обратная корреляция между антителообразования [Tiefenbach B. et al., 1983]. Предполагают, что супрессия иммунного ответа связана с увеличением содержания в крови под влиянием ФОС кортикостероидов, так как применение преднизолона в дозе 100 мг/кг вызывает аналогичный эффект, а адреналэктомия иммунотоксическое действие антихолинэстеразных ядов устраняет [Tiefenbach B. et al., 1983; Tiefenbach B., Wichner S., 1985]. В опытах на крысах Вистар было показано, что введение внутрь форматиона в дозе 0,01 ЛД50 в течение 2 мес вызывает повышение кортикостерона в крови, коррелирующее со снижением гуморального иммунитета [Хусинов А.А. и соавт., 1991]. Следует отметить, что выводы авторов не вполне корректны и не учитывают других механизмов, обусловливающих иммунотоксичность ФОС [Забродский П.Ф., 1993;

Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001]. В экспериментах in vitro показано, что индуцированная антииммуноглобулинами подвижность Влимфоцитов, существенно подавляется под влиянием диизопропилфторфосфата [Becker E.L., Unanue E.R., 1976]. Это не дает оснований признать роль глюкокортикоидов в супрессии функции В-клеток под влиянием ФОС основной.

Восстановление содержания лимфоцитов в тимусе и селезенке при интоксикации диметоатом происходило через 72 часа. Атропин в дозе 75 мг/кг не оказывал защитного действия на синтез антител [Tiefenbach B., Lange P., 1980]. В последующем было доказано, что он даже усиливал проявление иммуносупрессии [Забродский П.Ф., 1995].

Редукция антителообразования была выявлена не только при дозах, вызывающих выраженную холинергическую стимуляцию [Casale G.P. et al., 1983; 1984], но и при воздействии относительно малой дозы метомидофоса (0, ЛД50).

Данные литературы позволяют считать, что в реализации действия ФОС существенное значение имеют неспецифические и специфические механизмы [Алимова М. Т. и соавт,. 1991; Гущин Н.В. и соавт. 1991, Хусинов А.А. и соавт., 1991, Забродский П.Ф., 1993]. Показано [Забродский П.Ф., 1993], что под влиянием ДДВФ в прямой зависимости от дозы происходит усиление миграции стволовых кроветворных клеток (СКК) из костного мозга (КМ) в селезенку. Аналогичное действие характерно и для ацетилхолина, а стрессорное воздействие и гидрокортизон вызывают обратный эффект.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что увеличение выхода СКК из КМ связано с действием ацетилхолина, причем этот специфический эффект при необратимом ингибировании ацетилхолинэстеразы ДДВФ преобладает над торможением миграции СКК, вызываемым повышением концентрации в крови кортикостерона (неспецифический механизм). Торможение миграции СКК из КМ при стимуляции коры надпочечников известно [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1981]. По-видимому, патогенез индукции ацетилхолином миграции СКК аналогичен описанному при изучении подвижности В-лимфоцитов данным медиатором [Адо А.Д. и соавт., 1983]. При увеличении вводимой дозы ДДВФ происходило прямо связанное с ней уменьшение Т-клеток в тимусе. Таким же образом действовали стрессорный фактор, гидрокортизон и ацетилхолин.

Видимо, инволюция тимуса при действии ФОС связана преимущественно с (неспецифический механизм) и активацией м-холинорецепторов тимоцитов ацетилхолином - специфический эффект [Мaslinski W. et al., 1983], и в меньшей степени - с цитотоксическим действием гормонов коры надпочечников [Heideman M., Bentgson A., 1985]. Данные литературы позволяют ожидать усиления неспецифических эффектов острого отравления ДДВФ и травмы вследствие активации гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы (ГГНС).

Сочетанный эффект механической травмы и острой интоксикация ФОС, вероятно, способны реализовать аддитивное или потенцирующее иммуносупрессивное действие кортикостероидов, синтез которых при отравлении и травме может существенно увеличититься.

В экспериментах на крысах Вистар установлено, что при остром противоположных эффекта: ингибирование ацетилхолинэстеразы Тлимфоцитов, приводящее к супрессии тимусзависимого антителообразования (данный эффект преобладает), и действие ацетилхолина (действие данного медиатора моделировалось введением его в дозе 5 мг/кг двукратно ежедневно в течение 3 сут через 1 сут после иммунизации), вызывающее стимуляцию антителопродукции. В интактных Т-клетках ацетилхолин увеличивает активность ацетилхолинэстеразы. Следует отметить, эффект ацетилхолина зависит от его концентрации в крови, лимфоидных органах и в области холинорецепторов иммунокомпетентных клеток (ИКК), а также от изучаемого параметра системы иммунитета [Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001]. Результатов проведенных экспериментов дают основание полагать, что, возможно, существует не известная до сих пор функция ацетилхолинэстеразы Т-лимфоцитов, регулирующая их активность не только путем гидролиза избытка ацетилхолина.

Данные литературы по иммунотоксическому действию ДДВФ позволяют полагать, что патогенез его иммунотоксического эффекта в сублетальных дозах определяется эффектом гормонов надпочечников [Забродский П.Ф., 1993;

Забродский П.Ф., Германчук В.Г., 2000], ингибированием эстераз Т-хелперов, моноцитов, нейтрофилов, системы комплемента [Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001; Becker E.Z. et al., 1957, 1964, 1966, 1967, 1971], действием высоких концентраций ацетилхолина на м-холинорецепторы иммуноцитов [Richman D.P., Arnason B.G.W., 1979]. Реализация описанных механизмов может приводить к редукции Т- и В- звена иммунитета.

иммунотоксических эффектов ФОС, существует целый ряд неисследованных вопросов в отношении нарушения физиологических механизмов регуляции при острой интоксикации ДДВФ. О сочетанном действии ДДВФ и механической травмы можно говорить только гипотетически.

Фармакологическая коррекции нарушений иммунного гомеостаза под влиянием ДДВФ в постинтоксикационном периоде нуждается в дальнейшем изучении [Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 2001].

иммунотоксичности ДДВФ, его изучение сочетанного эффекта дихлофоса и травмы, влиянии на характер постинтоксикационной и посттравматической иммуносупрессии антидота ФОС дипироксима позволит обосновать адекватную характеру нарушений иммунного гомеостаза возможность применения наиболее перспективных и преемлемых иммуностимулирующих средств для профилактики постинтоксикационных инфекционных осложнений и заболеваний.

1.4. Изменение неспецифической резистентности организма, иммуногенеза, функции Т- и В-звена иммунитета при травматическом повреждении Многочисленные публикации в последнее десятилетие свидетельствуют, что иммунологические проблемы травмы чрезвычайно актуальны и включает в себя три основных аспекта, свзанных с причиной, сущностью и терапией посттравматической иммуносупрессии. Вклад различных факторов травмы в развитие вторичного иммунодефицитоного состояния. до настоящего времени иммуносупрессии острых интоксикаций различными токсикантами практически не исследовано. Актуальность изучения данного аспекта травмы и токсикологии несомненно актуальна, так как при террористических актах, авариях на химических предприятиях, в частности, занимающихся хранением и уничтожением боевых фосфорорганических соединений (ФОС), изолированное действие химического и физического факторов будет отмечаться в крайне малом проценте случаев (за исключением действия на население токсичного химического облака). В основном врачи при оказании медицинской помощи будут иметь дело с сочетанным действием острого отравления ФОС и механической травмы.

Рост промышленного, транспортного, бытового травматизма, а также травматических повреждений, полученных в боевых условиях в последние годы не уменьшается [Гуманенко Е.К. и соавт., 1999]. По данным ВОЗ, только на дорогах мира ежегодно гибнет 250 тысяч человек и более 10 милионов получают ранения [Гвоздев М. П. и соавт, 1978]. Эти показатели в настоящее время существенных изменений не претерпели, более того, они увеличились [Чеснокова И.Г., 2000]. По частоте механическая травма среди всех травм занимают третье место, а в некоторых развитых странах - второе, уступая лишь ожоговой травме. Травма служит одной из наиболее частых причин временной утраты трудоспособности, а лечение больных, получивших механические повреждения, является наиболее трудоемким и дорогостоящим [Григорьев М.

Г., 1977; Долгушин И. И. и соавт., 1989 Чеснокова И.Г., 2000].

Токсемия и септикопиемии, обусловленные постинтоксикационным иммунодефицитным состоянием, приводят к тому, что до 80% больных с механическими травмами умирает [Колкер И.И. и соавт., 1974; Гуманенко Е.К.

и соавт., 1999]. В генезе ранней токсемии существенную роль играет эндотоксин кишечной палочки, который обнаруживается в крови уже в первые сутки после нанесения повреждения [Лемус В. Б., Давыдов В.В., 1974; Кабан С. Т. и соавт., 1976; Берток Л.Б. и соавт., 1978; Зурочка А. В.,1984]. Кроме того, развитие посттравматической токсемии обусловливают высокопатогенные микроорганизмы и условно-патогенные представители нормальной микрофлоры [Колкер И. И., 1977; Стручков В. И., 1978; Гуманенко Е.К. и соавт., 1999].

преимущественно состоянием иммунной реактивности организма. В настоящее время наряду с совершенствованием антисептических методов борьбы с посттравматической инфекцией ведется разработка эффективных способов профилактики и лечения постравматических иммунодефицитных состояний [Абрамовская Л. В., 1985; Бабаева А. Г., 1985; Кожевников В.С. и соавт., 1991;

Блинков Ю.А., 1997; Dawson S. W.,1982; Gelfand J. A., 1984; Ayala A., Chaudry I., 1995].

гетерогенность иммунодефицитов) зависит от характера факторов, вызывающих травму [Кожевников В.С. и соавт., 1991]: термического [Колкер И. И. И соавт., 1974] или механического [Кузин М. И., 1981]. Без сомнения характер иммунодефицита при травме будет существенно зависеть от ее сочетания с действием токсичных химических веществ (ТХВ).

Травматический шок, рассматривающийся рядом авторов как вариант развития травматической болезни [Гвоздев М. П., 1978; Кулагин В. К.,1978], при действии ТХВ может существенно изменить характер формирования посттравматического иммунодефицитного состояния [Гуманенко Е.К. и соавт., 1999].

Острые нарушения гемодинамического, биохимического, структурного и других компонентов гомеостаза при травматически шоке могут являться одной из причин инициации каскада многочисленных биохимических реакций, приводящих к иммунодефицитному состоянию. Ряд авторов рассматривают эти сдвиги преимущественно, как постстрессорные [Масютин В.А., 1994; Идова Г.В., Чейдо М.А., 1996; Mikhova et.el., 1991; Hassig A. et al., 1996]. При этом роль кортикостероидов (особенно при сочетании травмы и острой интоксикации) в формировании нарушений Т- и В-звена системы иммунитета, снижения активности естественных клеток-киллеров (ЕКК) в полной мере не выяснена.

целостности элементов соединительной ткани и капилляров, вызывающих индукцию цепи гистологических изменений. Происходит последовательное накопление в ране тромбоцитов, затем нейтрофилов, макрофагов и лимфоцитов и, наконец, фибробластов и эндотелиальных клеток – основных участников процессов соответственно гемостаза, воспаления и репарации [Кузин М.И., Шимкевич Л.А., 1981; Кожевников В.С. и соавт., 1991].

Нарушения синтеза различных гормонов, в частности, активация секреции кортикостероидов (как и при остром действии ДДВФ [Забродский П.Ф., 1993, 1998]), разнообразных метаболических и функциональных расстройств, возникающих на фоне воздействия травмы ведут к различным нарушениям неспецифической резистентности организма (НРО), функции ЕКК, Т- и В-звена иммунитета. Совокупность указанных сдвигов получила название травматической болезни [Чеснокова И.Г., 2000;. Лебедев В.Ф., Рожков А.С., 2001].

Среди активированных в процессе свертывания крови цитокинов трансформирующий ростовой фактор (ТРФ) обладает выраженным иммуносупрессивным действием, ингибирующим процессы активации, пролиферации и дифференцировки Т- и В-клеток, а также активность ЕКК, которое проявляется локально в месте повреждения. Следует отметить, что для взаимодействия ТРФ с клетками-мишенями необходимо его дополнительное расщепление, которое обеспечивается в катаболической фазе травматической болезни протеазами, индуцируемыми многими факторами травмы, в том числе ИЛ-1 и -фактром некроза опухоли (ФНО) [Кожевников В.С. и соавт., 1991].

тромбоцитами, который модулирует выделение ИЛ-2 Т-клетками, изменяется синтез ИЛ-1 макрофагами, ИЛ-6 Т-лимфоцитами, моноцитами и фибробластами, продукция - и -факторов некроза опухоли макрофагами, Т- и В-лимфоцитами, ЕКК и нейтрофилами, простагландина Е2 и других цитокинов [Кожевников В.С.

и соавт., 1991; Хаитов Р.М. и соавт, 2000; Ройт А. и соавт, 2000]. Данные цитокины, а также простагландин и гистамин существенно изменяют физиологическую регуляцию иммунного гомеостаза и, как правило, индуцируют формирование вторичного иммунодефицитного состояния. Необходимо заметить, что простагландин ограничивает агрегацию тромбоцитов, возникающую при стресс-реакции [Чеснокова И.Г., 2000; Munster A. M., 1986].

Нарушение физиологической регуляции иммунного гомеостаза после травмы может инициировать возникновение аутоиммунных реакций - эффект токсинов тканевого и микробного происхождения, микроорганизмов, продуктов тканевого распада, обладающих антигенными свойствами [Кулагин В. К., 1978;

Ашмарин И. П., 1982; Вагнер Е. А., 1984; Пашутин С. Б., 1984; Кожевников В.С.

и соавт., 1991; Блинков Ю.А., 1997; Kurz R., 1980; ; Bjorson A., 1981; Mikhova et.el., 1991; Hassig A. et al., 1996]. Биологическая роль аутосенсибилизации при травме может быть двоякой. С одной стороны, эти процессы направлены на привлечение в очаг тканевой деструкции фагоцитирующих клеток и сенсибилизирующих лимфоцитов, на изоляцию и отторжение разрушенной ткани и, как следствие, на заживление раны. С другой стороны, сенсибилизация организма к антигенам нормальных тканей может привести к развитию аутоагрессии [Гвоздев М. П., 1978; Кожевников В.С. и соавт., 1991].

Травма является классическим примером стрессорного воздействия на организм (как и острое отравление ФОС, в частности ДДВФ [Забродский П.Ф., 1993, 1998, Забродский П.Ф., Германчук В.Г., 2000]), сопровождающегося не только развитием травматической болезни в различных ее проявлениях, но и формированием стресс-лимитирующих систем - эндогенных антистрессорных центральных и периферических механизмов [Долгушин И.И. и соавт., 1989].

Роль выраженного стресса заключается не столько в редукции иммунных клеточных эффекторных функций, сколько в индукции дополнительной супрессии гуморального иммунного ответа [Кожевников В.С. и соавт., 1991].

Проявления постравматической стресс-реакции тесно сопряжены с центральными и периферическими антистрессорными механизмами (в частности, антиоксидантной системой), которые ограничивают действие катехоламинов и предупреждают постстрессорные повреждения [Munster A. M., 1976; Гуманенко Е.К. и соавт., 1999]. Антистрессорные центральные и периферических механизмы тесно связаны с системой иммунитета [Забродский П.Ф., 1998; Хаитов Р.М. и соавт, 2000; Ройт А. и соавт, 2000; Mikhova et.el., 1991; Hassig A. et al., 1996], обеспечивая сохранение гомеостаза, реализация иммуносупрессии [Богдашин И.В. и соавт., 1991; Забродский П.Ф., 1998].

Иммунодефицит после травматического повреждения оказывает существенное влияние на изменение функции систем и органов организма в периoд ранних, переходных и поздних осложнений [Кузин М. И., 1981; Лебедев генерализованные инфекционные процессы, а также токсемия микробного и тканевого происхождения [Колкер И. И. и cоавт., 1974; Кузин М. И., Заец Т.Л., 1981; Стручков В. И. и соавт., 1978; Гуманенко Е.К. и соавт., 1999; O'Mahony J.

B. et el., 1985]. После периода инфекционных осложнений проявление иммуносупрессии может существенно усиливаться [Кочетыгов В. Н.,1973;

Долгушин И. И. и соавт., 1989].

На формирование посттравматического иммунодефицитного состояния значительное влияние оказывают токсичные среднемолекулярные пептиды, выделенные из ишемизированной конечности [Ашмарин И. П. и соавт., 1982].

Они вызывают нарушение микроциркуляции, обмена веществ, угнетают функции клеточного звена иммунитета [Галактионов С.Г. и соавт., 1984].

Основательным доводом в пользу развития иммунодефицита у перенесших травму людей является подверженность их инфекциям [Ягмуров О.Д., Огурцов Р.П., 1996; Лебедев В.Ф., Рожков А.С., 2001; Renk C. M., 1982; Ayala A., Chaudry I., 1995]. Значение различных иммунокомпетентных клеток (ИКК) в реализации патологии иммунной системы в литературе освещена недостаточно. Не вполне понятно, какие факторы определяют преимущественное нарушение Т- или Взвена системы иммунитета при травматической болезни. Данные различных авторов в отношении типа иммунодефицитного состояния при травме противоречивы [Кожевников В.С. и соавт., 1991]. Доказано снижение факторов НРО (комплемента и пропердина) у больных с повреждением опорнодвигательного аппарата [Голубев Г.Ш., Поляк А.И., 1985]. Выраженность редукции активности пяти компонентов и общей комплементарной активности зависела от степени тяжести травматического повреждения [Голосова Т.В. и соавт., 1985].

Установлено, что число поврежденных областей тела и характер травматических повреждений достоверно коррелируют с особенностями инфекционных осложнений [Гуманенко Е.К., 1992; Гуманенко Е.К. и соавт., 1999]. Благодаря выявлению закономерностей изменений показателей системы иммунитета, метаболизма и адаптационных процессов при различных вариантах течения травматической болезни показано, что фазовые изменения гомеостаза (показателей иммуниета, системы протеолиза, обменных процессов), сопровождающие развитие инфекционных осложнений у пострадавших с тяжелыми механическими поврнждениями, отличаются от динамики этих показателей при инфекционных хирургических заболеваниях. Установленная зависимость иммуногенеза от состояния обменных процессов позволяет отнести катаболической реакции организма на травму, формирующую раннюю иммунную несостоятельность [Дерябин И.И., Рожков А.С., 1984; Дерябин И.И., Насонкин О.С. 1987; Ерюхин И.А., Шашков Б.В., 1995; Лебедев В.Ф. Рожков А.С., 2001; Cerra F., 1987; Fry D.E., 1988].

Современная клиническая иммунология внесла в патогенез травматической воспалительного ответа. Суть этого патофизиологического процесса заключается в универсальности механизмов развития в ответ на любое экстремальное воздействие. Основой данного процесса является цитокиновая концепция регуляции иммунореактивности, которую В.Bone и W. Ertel в ввели клиническую практику в начале 90-х годов прошлого столетия [Гуманенко Е.К.

и соавт., 1999].

Ключевую роль в регуляции иммунного гомеостаза после травмы играет последовательная продукция цитокинов, которой сопровождается системный воспалительный ответ (СВО). На первой стадии ответа на раздражитель макрофаги продуцируют -фактор некроза опухоли, ИЛ-1 и ИЛ-6, вторая стадия гранулоцитов, лимфоцитов и тромбоцитов и формированием регионального адаптивного иммунитета за счет мобилизации зрелых клеточных элементов и эффекторных молекул региональных лимфоидных образований, инициацией острофазовой реакции, контролируемой балансом провоспалительных и противовоспалительных цитокинов. Вторая стадия подолжается до завершения местного инфекционного процесса и восстановления гомеостаза. При обширном разрушении тканей СВО переходит в третью стадию, характеризующуюся активацией провоспалительных цитокинов и формированием, так называемого, цитокинового «взрыва». Эта фаза проявляется как сепсис или септческий шок (стадия генерадизации воспалительной реакции) [Лебедев В.Ф., Рожков А.С., 2001].

Первая стадия СВО является так называемым доиммунным воспалением, а Доиммунное воспаление, которое реализуется в результате действия факторов неспецифической защиты организма (НРО), соответствует фазе срочной долговременной адаптации предполагает включение механизмов преиммунного ответа с последовательным формированием адаптивного иммунитета при адекватном сопряжении названных фаз. Невозможность такого перехода развивающейся в первые часы после травмы [Дерябин И.И., Рожков А.С., 1984:

Самохвалов И.М., 1984].

Характер проявления посттравматического иммунодефицита обусловлен тяжестью повреждения, глубиной органной и клеточной гипоксии, активностью Дисрегуляция и последующая дезорганизация иммунной системы в этой ситуации оказывается ведущим звеном в развитии сепсиса и других инфекционных осложнений [Лебедев В.Ф., Рожков А.С., 2001].

Показано, что травма костей оказывает ингибирующее влияние на развитие ГЗТ с пиком эффекта через 0,5 ч после перелома вследствие повышения активности клеток-супрессоров [Аскалонов А.А. и соавт., 1985], снижает эффекторную и регуляторную активность мононуклеарных фагоцитов и естественных киллерных клеток [Гордиенко С.М. и соавт., 1987].

Установлено [Александров В. Н., 1983], что на тяжелую травму реагируют практически все звенья иммунной системы. Активность одних из них угнетается, других усиливается. Интегральным выражением реакции иммунной системы на травму является развитие вторичного посттравматического иммунодефицита, развивающегося стадийно. В первые 7 суток формируется стадия явного иммунодефицита - происходит угнетение гуморального иммунного ответа, вследствии ингибирования кооперации Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, активации супрессорных лимфоцитов. Спустя 7 суток после травмы развивается стадия скрытого иммунодефицита, типичными проявлениями которой является стимуляция иммунного ответа на фоне функциональной неполноценности кооперации Т- и В-лимфоцитов, Т-хелперов, предшественников В-клеток. Переход стадии явного иммунодефицита в скрытый опосредуется через включение приспособительных реакций:

повышение способности макрофагов к индукции гуморального иммунного ответа, усиление способности мигрировавших в костный мозг Т-лимфоцитов изменять дифференцировку стволовых кроветворных клеток в миелоидном направлении, усиление миграции стволовых клеток из костного мозга в лимфоидные органы. Тяжелая механическая травма приводит к ингибированию накопления АОК в первые 4 сут и стимуляцию на 8 сут. Морфологическим эквивалентом отмеченных различий в реакции гуморального компонента иммунного ответа на травму разной тяжести являются своеобразны для каждой травмы изменения массы и клеточности лимфоидных органов. После легкой травмы масса тимуса и селезенки уменьшается в 1-4 сут и восстанавливается к восьмым. При легкой травме снижается содержание клеток преимущественно в тимусе (проявление стресс-реакции [Забродский П.Ф., 1998]) в отличие от тяжелой, для которой характерно преимущественное уменьшение клеточности селезенки [Александров В. Н., 1982,1983].

Анализ источников литературы за последние 5 лет позволяет выделить две основные группы факторов, влияющих на развитие посттравматического имунодефицитного состояния: причинные факторы, исключение которых ведет к отмене иммуносупрессии (гистамин, простагландин Е2, иммуноцитысупрессоры, большинство нейропептидов, повышенное содержание в крови кортикостероидов), и моделирующие факторы, исключение которых не отменяет развитие иммунодефицита, но моделирует степень его выраженности, что зависит от вида, тяжести травмы и индивидуальных особенностей организма [Кожевников В.С., 1991; Гуманенко Е.К. и соавт., 1999].

Экспериментальные исследования в области иммунопатологии травматической болезни позволяют считать, что травма сопровождается двумя типами иммунодефицита – клеточным, который характеризуется угнетением клеточных эффекторных функций и имеет санатогенное значение в плане стимуляции репаративных процессов защиты от бактериальной инфекции за счет сохранения (или стимуляции) гуморальных иммунных реакций, и сочетанным, который характеризуется угнетением Т- и В-звена иммунитета и имеет патогенетическое значение в развитии инфекционных осложнений.

Существует и третий тип иммунодефицита – гуморальный, который характеризуется преимущесвенным угнетением гуморального иммунитета и стимуляцией клеточных эффекторных функций и имеет патогенетическое значение не только в развитии инфекции, но и в различных посттравматических осложнениях реакций [Кожевников В.С., 1991; Чеснокова И.Г., 2000]. По всей видимости, сочетанное иммунодефицитное состояние (супрессия гуморального и клеточного звена иммунитета) может проявляться в зависимости от вида травмы и других факторов снижением преимущественно Т- или В-зависимых иммунных реакций. При этом редукция гуморального иммунного ответа, вероятно, обусловлена высоким постстрессорным синтезом кортикостероидов и действием их на синтез IgM, IgG и IgА.

Увеличить риск возникновения генерализованной инфекции при травматической болезни могут острые и хронические интоксикации, сопровождающиеся иммунодефицитными состояниями [Долишний В.Н., 1999].

Анализ приведенных данных позволяет постулировать, что профилактика и лечение посттравматических и постинтоксикационных инфекций не может быть обеспечена без учета состояния иммунного гомеостаза и использования иммуномодуляторов [Муразян Р. И., 1984; Долгушин И. И. и соавт., 1989;

Кожевников В.С., 1991; Козлов В.К. и соавт., 1992; Чеснокова И.Г., 2000].

Таким образом, данные литературы свидетельствуют, что исследование состояния иммунной системы после травматического воздействия, и в частности, при сочетанном действии механической травмы и ФОС, в частности, высокотоксичного представителя этих соединений ДДВФ, крайне необходимы и актуальны, так как позволят обеспечить профилактику и лечения инфекционных осложнений и заболеваний, связанных с формированием посттравматического и постинтоксикационного иммунодефицитного состояния.

Роль ГГНС в формировании иммунодефицита при действии ФОС и механической травмы, а также особенности формирования нарушений иммунного гомеостаза после травматического повреждения на фоне активации холинергической системы организма не ясна.

1.5. Предполагаемые нарушения физиологических механизмов регуляции иммунного гомеостаза при сочетанном действии острого отравления диметилдихлорвинилфосфата и механической травмы Данные литературы, содержащие результаты исследований различных авторов изолированного действия ФОС и механической травмы на иммунный гомеостаз позволяет предположить ряд гипотез о сочетанном эффекте ДДВФ и механической травмы на Т- и В-звено иммунитета, ЕКК и НРО. Теоретически возможны следующие типы сочетанных эффектов при действии механической травмы и острого отравления ДДВФ [Nelson B.K., 1994].

независимымым иммуносупресивным эффектам этих факторов.

2. Сочетание ДДВФ и механического повреждения может оказывать аддитивное действие на иммунный гомеостаз.

3. Сочетанный эффект ДДВФ и травматической болезни способен обеспечить эффекты синергизма, потенцирования или антагонизма в отношении иммунной системы.

Существуют основания для утверждения, что снижение Т-клеток в тимусе при действии ФОС (ДДВФ) и травмы может зависеть как от активации их миграции ацетилхолином, действующим на м-холинорецепторы тимоцитов, так и от эффекта глюкокортикоидов, концентрация которых в крови при действии ФОС и механического повреждения (стресс-реакции) увеличивается [Забродский П.Ф., 1993; Maslinski W., 1983; Maslinski W. et al.. 1987; 1989].

Принимая во внимание способность ФОС активировать ГГНС [Забродский П.Ф., 1993; 1998; Szot R.J., Murphy S.D., 1970] можно предположить, что при сочетание ДДВФ и механической травмы иммуносупрессивный эффект будет определяться суммацией действия химического и механического факторов в основном вследствие практически одновременной реализации неспецифических механизмов, обусловленных стресс-реакцией и связанных с действием гормонов коры надпочечников.

Таким образом, современные теоретические положения, изложенные в многочисленных научных трудах, позволяют предположить, что иммуносупрессивное действие ФОС (ДДВФ) и тяжелой механической травмы будет обусловлен суммацией их неспецифических эффектов. Для подтверждения изложенной гипотезы необходимы исследования, которые определены целью и задачами данной работы

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объект исследования и применяемые препараты Исследования проводились на 935 крысах-самцах Wistar и на беспородных белых мышах-самцах. Масса крыс и мышей составляла соответственно 180-240 и 18-22 г.

ДДВФ вводили подкожно в дозе 0,8 LD50 (LD50 для крыс и для мышей составляла 70,0+4,5 и 58,5+6,3 мг/кг соответственно). Опыты на мышах в связи с особенностями экспериментальной модели проводили при исследовании миграции колониеобразующих клеток из костного мозга в селезенку и оценке нарушения кооперации Т- и В-клеток под влиянием ДДВФ, травмы и их сочетанного эффекта.

Дипироксим в дозе 10 мг/кг применяли 3 раза в течение суток непосредственно после введения ДДВФ и через 2 и 24 часа. При моделировании сочетанного действия травматического повреждения и острой интоксикации ДДВФ через 5 мин с момента травматического воздействия. Эксперименты проводили в светлое время суток (с 9.00. до 15.00 ч), характеризующееся минимальным содержанием кортикостерона (КС) в плазме крови крыс [Dhabhar F. S. et al, 1985].

В качестве иммуностимуляторов использовали Т-активин и миелопид.

Дозы Т-активина и миелопида для животных обоснованы данными литературы [Янковский О.Г., Захарова Л.А., 1990; Кириллова и соавт., 1991] и рассчетными методами по Ю.Р.Рыболовлев (1982). Т-активин и миелопид ввводили внутримышечно в дозах 5 мкг/кг и 2 мг/кг соответственно ежедневно в течение 4 сут. Первую инъекцию иммуностимулятора животные получали через 30 мин после изолированного или сочетанного воздействия ФОС и физического фактора.

Кровь для исследования титра антител получали из подъязычной вены животных. Лимфоидные органы извлекали у животных после цервикальной дислокации в различные сроки после интоксикации.

Эксперименты на животных проводили в соответствии с требованиями Женевской конвенции "International Guiding Principles for Biomedical Research Inroling Animals" (Geneva, 1990).

2.2. Исследование интегрального состояния антиинфекционной неспецифической резистентности организма при сочетанном действии Интегральное состояние неспецифической резистентности организма определяли по показателям течения экспериментальной инфекции, вызванной внутрибрюшинным введением крысам суспензии суточной культуры Е. Соli в дозах 1,5; 2,0; 2,5 млрд микробных тел. Данная культура использовалась в связи с тем, что значение условнопатогенной флоры в возникновении различных инфекционных осложнений не уменьшается [Бельцкий С. М., Снастина Г. И., 1985; Гуманенко Е.К. и соавт., 1999; Рожков А.С., 2001].

Антиинфекционную НРО определяли по летальности крыс в течении 36 ч от экспериментальной инфекции по среднелетальной дозе Е. Соli (LD50) и среднеэффективному времени жизни животных (Et50) в опытной и контрольной группах, расчитанных методом пробит-анализа [Беленький М.Л., 1961].

Введение условно-патогенных микроорганизмов производили через 24 ч после введения нитрилов, моделирования травмы и их сочетанного действия.

Аналогичные инфекционные защитные тесты предлагаются в качестве первичной скрининговой модели для оценки иммунотоксичности химических веществ [Забродский П. Ф., 1987, 1994; Mc Grath J., Wong S., 1987].

НРО определяется несколькими факторами защиты организма, к основным из которых относятся бактерицидная активность сыворотки крови (БАСК), системы комплемента и пропердина, сывороточная активность тромбоцитарного катионного белка - ТКБ (-лизина), лизоцима, интерфероны и фагоцитоз. К факторам НРО относятся также биологические барьеры (кожные и слизистые оболочки), бактерицидные субстанции тканей, гидролитические ферменты, лактопероксидаза, лактоферин [Горизонтов П.Д., 1981а, 1981б; Петров Р.В., 1987; Кузник Б.И., Васильев Н. В., Цыбиков Н. Н., 1989; Ледванов М. Ю., Киричук В.Ф., 1996].

Обсемененность крови и селезенки бактериями является одним из иммунологической резистентности организма после воздействия химических ксенобиотиков [Забродский П. Ф., 1998; Германчук В.Г., 2000].

Влияние ДДВФ и его сочетания с травматическим повреждением на обсемененность селезенки и циркулирующей крови Е.Coli проводили общепринятыми методами [Ремезов А. И., Башмаков Г. А., 1976]. Суточную культуру E.Сoli в дозе 1,5·109 микробных тел вводили через 30 мин после химического воздействия и его сочетания с нанесением травмы.

2.3. Определение параметров неспецифической резистентости Лизоцим (мурамидаза) - один из важных факторов неспецифической защиты организма. Он был открыт в 1909 г. П.К.Лащенковым и изучен в г. А.Флемингом. Источником лизоцима являются нейтрофильные гранулоциты и моноциты. [О.В.Бухарин и Васильев Н.В., 1974; Гембицкий Е.В. и соавт., 1987]. Использование показателя лизоцимной активности для оценки свидетельствуют о высокой чувствительности данного теста [Измеров Н.Ф., и соавт., 1977; Бухарин О. В. и соавт., 1985; Генес В. С. и соавт.,1981;

Забродский П. Ф., 1998; Германчук В.Г., 2000]. Как правило, химические соединения вызывают снижение лизоцимной активности сыворотки крови [Забродский П.Ф., 1999; 2000]. Однако свидетельством отрицательного воздействия ксенобиотиков на организм может являться также и повышение содержания лизоцима в крови. Некоторые иммунологические реакции связаны с активностью лизоцима. Так, комплекс "IgA-антиген" проявляет антибактериальную и нейтрализующую aктивность после активации комплементом только в присутствии мурамидазы [Nouragargh S., Holt J.R.S., 1986 ].

О. В. Бухарина (1971) [Ремезов П.И., Башмаков Г.А., 1976], основанным на способности лизоцима растворять индикаторный микрококк (Micrococcus lysodeicticus), измеряя при этом оптическую плотность опытной и контрольной суспензии микроорганизмов. Взвесь суточной агаровой культуры микрококка на 1/15 М фосфатном буфере (рН 6,2) стандартизировали по левому барабану ФЭК до оптической плотности О,66. В опытную пробирку вносили 0,4 мл фосфатного буфера, 0,1 мл исследуемой сыворотки и 2 мл стандартной взвеси микрококка, Смесь выдерживали при 370 С 30 мин, после чего измеряли ее оптическую плотность на ФЭК по правому барабану в кювете №2 с зеленым светофильтром.

Для количественной характеристики лизоцима в исследуемой сыворотке с использованием кристаллического лизоцима строили калибровочную кривую, исходя из активности фермента 2, 4, 6, 8, 10, 20, 40, 50 мкг в пробе. Во все пробирки с различным содержанием лизоцима вносили с интервалом 30 с по мл стандартизованной суспензии микрококка. Смесь инкубировали при 370 С мин и в каждой пробирке, начиная с первой, измеряли оптическую плотность.

Каждое последующее измерение выполняли через 30 с после предыдущего. С помощью калибровочной кривой находили количества лизоцима в иследуемой сыворотке, выраженное в абсолютных единицах. Для удобства расчетов зависимость между оптической плотностью микробной взвеси в опыте и использовали таблицу [Ремезов П. И., Башмаков Г. А., 1976].

2.3.2. Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови (-лизин) резистентности организма является тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови, ранее известный как -лизин [Бухарин О. В и соавт.,1977;

1985; 1998]. -лизин - бактерицидное вещество сыворотки крови, избирательно спорообразующих бацилл. Открыт в 1886 г. G. Nuttal и изучен в 1926 г. A.

Pettersson, назван -лизином в отличие от -лизина (комплемента). -лизин обнаружен в сыворотке крови, слюне, секрете слезных желез и других Существует гипотеза, согласно которой активность -лизина регулируется гипоталамо-гипофизарной системой [Бухарин О.В., Васильев Н.В., 1977].

Механизм действия -лизина обусловлен изменением проницаемости мембран микроорганизмов и блокадой их окислительного метаболизма. Как правило, отмечается угнетение активности данного фактора НРО при острой и хронической интоксикациях.

Метод определения активности -лизина основан на избирательной чувствительности к его бактерицидному действию индикаторной культуры - B.

subticis. Тромбоцитарный катионный белок сыворотки крови (-лизин) определяли фотонефелометрическим ускоренным методом по О.В. Бухарину, Б.А. Фролову и А.П. Луда (1972) [Ремезов П.И., Башмаков Г. А., 1976], учитывая изменение оптической плотности раствора сахарозы при росте в ней индикаторной культуры. Учет результатов проводили по формуле:

Д1 - оптическая плотность опытных проб до инкубации;

Д2 - оптическая плотность опытных проб после инкубации.

фотоэлектроколориметре (ККФ - 2 - УФЛ 4,2).

2.3.3. Определения фагоцитарной активности нейтрофилов Фагоцитоз относится к клеточному фактору НРО. Процесс фагоцитоза осуществляется микрофагами (гранулоцитами) и макрофагами (моноцитами крови, клетками пульпы селезенки, эндотелия кровеносных сосудов, полибластами, гистиоцитами и др.) [Solberg C. O., 1984]. В настоящее время фагоцитоз рассматривается как сложный многоступенчатый процесс, начинающийся с захвата фагоцитом чужеродной субстанции и кончающийся ее перевариванием (хемотаксис; адгезия; пиноцитоз; формирование фагосомы;

слияние фагосомы с гранулами цитоплазмы, приводящее к активированию гидролаз, пироксидаз, протеиназ; гибель и переваривание объекта фагоцитоза, выброс продуктов деградации) [Хаитов Р.Я., Пинегин Б.В., 1995; Ледванов М.

Ю., Киричук В. Ф., 1996; Киричук В. Ф., 1999; Hong R., 1984]. Помимо действия ферментов уничтожение чужеродной клетки может осуществляться путем "дыхательного" (кислородного) взрыва [Nogueira N., 1984]. В настоящее время получены данные, свидетельствующие о том, что в фагоцитарной реакии активное участие принимает радикал окислда азота (NO), макрофаги продуцируют ИЛ-1, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-12 и ТNF- (-фактор некроза опухоли), простагландины, лейкотриен В4 (LTB4), фактор, активирующий тромбоциты.

Нейтрофилы синтезируют и выделяют в кровь ТNF- и ИЛ-12, а также хемокин ИЛ-8 [Хаитов Р. М. и соавт.,2000].

растворимого красителя нитросинего тетразолия (НСТ) в нерасворимый диформазан под влиянием супероксиданиона, образующегося в НАДФ-Нокидазной реакции. НСТ-тест, как уже указывалось, интегрально характеризует кислородзависимые антиинфекционные системы фагоцита [Маянский Д. Н., 1986; Segal A. W., 1974; Elsbach P., Weise J., 1985]. В исследованиях применялся цитохимический вариант этого метода [Измайлова Ф.А., 1985;

Park B.H., 1971]. Учет результатов проводился путем подсчета в каждом мазке 100 нейтрофилов, среди которых определялся процент клеток, содержащих отложения диформазана (НСТ - позитивные нейтрофилы). Далее рассчитывался индекс активности нейтрофилов (ИАН) по формуле:

ИАН = ----------------------------------------------, где А - количество клеток, не содержащих диформазоновых отложений или содержащий их в виде пылевидных немногочисленных включений;

В - количество клеток, в которых площадь отложений диформазана не превышает 1/3 площади ядра;

С - количество клеток, в которых названные отложения занимают от 1/3 до всей величины площади ядра;

D - количество клеток с диформазановыми отложениями, по площади превосходящими площадь ядра.

2.4. Определение колониеобразующих единиц в селезенке Длительное время в качестве стволовых кроветворных клеток (СКК) рассматривали клетки, дающие колонии в селезенке облученных мышей – КОЕс. Однако в последние годы такое предположение было экспериментально опровергнуто. Примитивные СКК (П-СКК) в культуре созревают до стадии КОЕс за 4-6 нед. Несмотря на то, что ни КОЕс и ни одна из категорий клеток, способных к колониеобразованию в культуре, не относятся к классу П-СКК [Чертков И.Л. и соавт.,1990], тем не менее, согласно теории клональной саксессии (последовательная смена кроветворных клонов в результате последовательного созревания одной за другой СКК) число КОЕс, мигрировавших из КМ в селезенку, отражает функциональное состояние клона кроветворных клеток и, следовательно, функцию СКК, продуцирующей этот клон. Кроме того, по числу КОЕс можно судить и о функции лимфоидных стволовых клеток, обеспечивающих иммунопоэз [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1981].

До последнего времени в литературе [Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1972;

Петров Р.В. и соавт.,1981; Корнева Е.А., 1990; Забродский П.Ф., 1993; 1998;

2000; Забродский П.Ф., Киричук В.Ф. и соавт., 1997] описывают содержание КОЕ в селезенке после летального облучения мышей с экранированием голени, как отражение функции стволовых кроветворных клеток.

Действие ДДВФ, травмы и их сочетанного эффекта на функцию СКК оценивали путем определения миграции КОЕс из КМ в селезенку оценивали методом эндогенного колониеобразования после летального облучения мышей в дозе 8 Гр при экранировании костного мозга задней конечности до уровня 1/ голени. Через 30 мин после облучения животных их подвергали изолированному или сочетанному действию химического и физического фактора. Через 8 сут извлекали селезенку, фиксировали ее в растворе Боуэна и подсчитывали число колониеобразующих единиц [Till J. E., Mc Culloch E. A., 1961; Петров Р.В., Хаитов Р.М., 1972].

2.5. Исследование функционального состояния лимфоидных органов 2.5.1. Оценка лимфоидного индекса тимуса и селезенки Массу тимуса и селезенки определяли гравиметрическим методом.

Лимфоидный индекс (ЛИ) вычислялся общепринятым способом [Гольдберг Е.

Д. и соавт., 1972; Тихонов В. Н., 1981, Германчук В.Г., 2000; Беликов В.Г., 2001] путем деления массы органа в мг на массу тела в г. Данные показатели являются косвенными критериями оценки состояния иммунной системы и могут отражать ее функциональное состояние в целом [Александров В. Н., 1983].

ЛИ тимуса и селезенки определяли после острого отравления ДДВФ (0, ЛД50) травматического повреждения конечности крысы и их сочетания через 1, 3, 6 и 8 cут. В период до 3 сут при острых воздействиях токсикантов на животных и других экстремальных воздействиях, как правило, происходит снижение ЛИ данных органов системы иммунитета [Александров В. Н., 1982;

1983; Забродский П.Ф., 1998; Германчук В.Г., 2000; Descotes J.,1986].

2.5.2. Определение содержания Т-лимфоцитов в тимусе и лимфоцитов в селезенке, лимфатических узлах, костном мозге и циркулирующей крови Содержание лимфоцитов в лимфоидных органах после различных воздействий отражает, во-первых, процесс их перераспределения между органами системы иммунитета в основном вследствие изменения функционального состояния симпатического, парасимпатического отделов вегетативной нервной системы и ГГНС [Горизонтов П.Д.,1981а,1981б; Ройт А., 1991], во-вторых, их апоптоз (запрограммированную гибель), на который оказывают влияние кортикостероиды и различные химические ксенобтотикии [Хаитов Р.М. и соавт.,1995; 2000; Clаman H. N., 1972].

Содержание Т-клеток в тимусе крыс определяли общепринятым методом подсчета ядросодержащих клеток в органе, учитывая то обстоятельство, что лимфоциты в вилочковой железе представлены в основном их Т- популяцией (до 90%) [Гольдберг Д. И., Гольдберг Е. Д., 1980; Петров Р. В., 1987; Ройт А., 1991; Хаитов Р. М. и соавт., 2000]. Лимфоциты в селезенке, лимфатических узлах (для изучения брали паховые лимфоузлы) и костном мозге (исследовали клетки костного мозга бедренной кости) подсчитывали, исходя из их относительного содержания в мазках данного органа, окрашенных по Романовскому-Гимзе. Для определения содержания в лимфоидных органах лимфоцитов клеточные суспензии из тимуса, селезенки, костного мозга и паховых лимфоузлов крыс готовили после интоксикации ДДВФ, действия травмы и их сочетания через 2 и 6 cут. Содержание лимфоцитов в крови крыс определяли через 2 и 8 сут после воздействия факторови и их сочетания общепринятыми методами [Гембицкий Е.В. и совт., 1987].

Кооперацию Т- и В-лимфоцитов исследовали после их выделения через 1 сут у животных подвегшихся действию ДДВФ, механической травмы и их сочетания. Контролем являлись клетки, полученные от интактных животных.

Для получения Т-клеток использовали метод фильтрования селезеночной суспензии через нейлоновую вату (“Нитрон”) [Ширшев С.В., 1998]. Для выделения В-лимфоцитов применяли реакцию комплементзависимого массцитолиза. В качестве цитотоксической сыворотки использовали моноклональные антитела против Thy 1.2 антигенов Т-лимфоцитов мыши (Cedarlane Laboratories Limited; London, Canada) [Marshak-Rothstein A. et al., 1979]. Из суспензии спленоцитов макрофаги удаляли методом негативной селекции, используя их способность прилипать к стеклянной поверхности [Ширшев С.В., 1998]. Жизнеспособность клеток оценивали в тесте с трипановым синим (она составляла 95-98%). Инкубируемая по методу J. K.

Thomas, T. Imamura (1986), культура содержала 106 и 5·105 В- и Т-клеток соответственно, 107 эритроцитов барана в 0,15 мл среды Хенкса. Т- и Влимфоциты с целью обеспечения сингенности клеток для каждого опыта получали из суспензии спленоцитов одной мыши. Антителообразующие клетки (АОК) подсчитывали в инкубационных камерах через 4 сут [Thomas J. K., Imamura T., 1986]. Данный тест отражает синтез IgM В-клетками селезенки при участии Т-хелперов типа 1 (Тh1-лимфоцитов).

2.7. Исследование гуморального звена иммунного ответа Для оценки гуморальных иммунных реакций в качестве антигенов применяли эритроциты барана (ЭБ) и брюшнотифозный Vi-антиген (Vi-Ag).

Использование данных антигенов позволяет рассмотреть влияние химического, физического фактора и их сочетанного эффекта на тимусзависимый или тимуснезависимый иммунный ответ, а также оценить роль Т-хелперов в реализации гуморального звена иммунного ответа [Утешев Б. С., 1984; Descotes J.,1986]. Данный подход широко используется для оценки действия различных факторов соединений на систему иммунитета [Плецитый К. Д., 1985; Ройт А, 1991; Забродский П.Ф., Киричук В.Ф., 2000].

Исследование показателей тимусзависимого гуморального иммунного ответа проводили через 5, 8 и 13 сутoк после острой интоксикации.

Иммунизацию эритроцитами барана проводили путем их внутрибрюшинного введения в дозе 2·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия.

Титры антител к ЭБ определяли в реакции гемолиза эритроцитов в присутствии комплемента. Все реакции проводились на стерильных пластиковых микропланшетах. Гуморальный иммунный ответ оценивали по отрицательному двоичному логарифму титра антител (ОДЛТА). Данный тест отражает способность органов системы иммунитета синтезировать Ig M через 5 сут и Ig G через 8 и 13 сут [Ройт А., 1991; Casale G.P. et al., 1983].

тимуснезависимому антигенам оценивали также через 5 суток по числу АОК в селезенке [Белокрылов Г. А. и соавт., 1980; Jerne N. K., Nordin A. A., 1963] после воздействия ДДВФ, травмы и их сочетания, с одновременной внутрибрюшинной иммунизацией крыс ЭБ в дозе 2·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия и Vi-Ag в дозе 8 мкг/кг (использованный тест отражал синтез Ig иммуноглобулинов G, определяли в селезенке методом непрямого локального гемолиза в геле [Jerne N. K., Nordin A. A., 1963; Whisler R. L.. Stobo J.D., 1976].

Для определения АОК к Vi-антигену последний нагружали на ЭБ при температуре 370 С в течении 1,5 часов. Конечная концентрация антигена в растворе составляла 20 мкг/мл. С целью освобождения от несвязавшегося с эритроцитами Vi-антигена эритроциты отмывали изотоническим раствором хлорида натрия на менее 8 раз. Кроме того, при оценке тимусзависимого антителообразования по числу АОК в селезенке животных подвергали воздействию исследованных факторов и их сочетания через 1 и 3 сут после иммунизации. При этом практически одновременное введение ДДВФ (воздействие травмы, ее сочетанного эффекта с ядом) с ЭБ и через 1 сут после иммунизации позволяло оценить их влияние на индуктивную фазу гуморального иммунного ответа, а через 3 сут – продуктивную [Корнева Е. А., 1978; 1986;

Ройт А. и соавт., 2000; Deskotes J., 1986].

2.8. Исследование клеточного звена иммунного ответа Исследование функции Т-лимфоцитов проводили по реакции торморжения сенсибилизированнных Т-лимфоцитов в реакциях с антигеном или митогенами (ФГА, КонА) in vitro выделять биологически активные субстанции – лимфокины, в том числе фактор, ингибирующий миграцию лейкоцитов (один из лимфокинов воспаления) [Фримель Х. и Брок Й, 1986].

Для исследования РТМЛ кровь у крыс получали из подъязычной вены через 2 и 5 сут после интоксикации. В капилляры для определения С реактивного белка набирали с часового стекла смесь, состоящую из гепаринизированной крови (0,2 мл) исследуемых крыс (опыт и контроль) и раствора КонА (0,5 мл). Концентрация митогена (КонА) в растворе составляла центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, затем в вертикальном положении их проводили путем измерения длины зоны миграции основной массы лейкоцитов от границы эритроцитарного осадка в контроле и опыте [Гембицкий Е.В. и соавт., 1987]. Результат реакции оценивали в виде индекса миграции (ИМ), выраженного в процентах:

ИМ = ------------------------------------------- х Величина ИМ обратно пропорциональна функции Т-клеток.

2.8.2. Исследование реакции гиперчувствительности замедленного типа Оценка формирования гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) после острого действия травмы, НАК их сочетания в модели, не связанной с переносом клеток, позволяет установить их действие на клеточный иммунитет, в частности на функцию Th1 и продукцию ими ИЛ-1, ИЛ-3, -интерферона, фактора некроза опухоли и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) лимфоцитов [Georgiev V.St., гиперчувствительности IV типа Т-клеток памяти и макрофагов [Ройт А., 1991].

В адоптивных реакциях (связанных с переносом клеток) существует возможность оценить действие спиртов на вторичный клеточный иммунный ответ и формирование Th1-лимфоцитов и T-супрессоров в селезенке.

Для оценки влияния ДДВФ, травмы и их сочетанного действия на формирование гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) использовали модель данной реакции, в которой не используется перенос сингенных иммуноцитов, и адоптивные модели [adopt (англ.) – принимать, усваивать], связанные с введением ИКК животным-реципиентам. ГЗТ оценивали у крыс Вистар после иммунизации внутривенным введением 2·108 эритроцитов барана (ЭБ) в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия одновременно с действием ДДВФ, физического фактора или их сочетания. Разрешающую (вызывающую реакцию) дозу ЭБ (5·108 в 0,05 мл изотонического раствора хлорида натрия) вводили под апоневроз задней лапы через 4 сут после иммунизации. Оценку реакции осуществляли через 24 часа по приросту массы стопы задней лапы крыс по сравнению с контрольной [Брюхин Г.В. и соавт.,1990]. Данный тест отражал функцию Th1 лимфоцитов и способность их лимфотоксина и гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора (ГМ-КСФ) [Georgiev V.St., Albright J.E., 1993; Kimber I., 1996].

Локальную адоптивную ГЗТ оценивали у крыс-реципиентов после введения им под апоневроз стопы смеси ЭБ (5·108) и спленоцитов (4·108) от сингенных интактных крыс (отрицательный контроль), животных, иммунизированных 108 ЭБ (положительный контроль) и крыс, получавших исследованных факторов и их сочетаннго действия (опытнае серии). Селезенку для получения клеток извлекали у доноров через 4 сут после иммунизации.

Суспензию спленоцитов готовили на среде Хенкса.

При исследовании формирования ГЗТ у крыс-реципиентов после переноса им спленоцитов (5·108), иммунизированных 108 ЭБ сингенных доноров, реципиентов через 1 ч сенсибилизировали внутривенным введением 108 ЭБ.

Через 4 сут под апоневроз стопы реципиентов вводили разрешающую дозу ЭБ (5·108) с последующей оценкой реакции через 24 ч. Спленоциты получали через 5 сут после иммунизации доноров. В данном эксперименте формирование ГЗТ отражало влияние ДДВФ, травмы и их сочетанного эффекта на вторичный иммунный ответ в модели адоптивной реакции, связанной с переносом иммунных спленоцитов крысам-реципиентам. Доноры подвергались воздействию ДДВФ, травмы и их сочетания через 30 мин после иммунизации Исследование формирования ГЗТ у крыс при переносе супрессорных клеток проводили аналогично описанному опыту. Влияние токсикантов на формирование спленоцитов-супрессоров исследовали путем практически одновременного одновременного введения ДДВФ, моделирования травмы (и ее сочетания с токсикантом) и ЭБ в толерогенной дозе (вызывающей значительное снижение или полное отсутствие иммунной реакции на антиген) крысамдонорам [Фролов и соавт., 1985; Забродский П.Ф., Мышкина А.К., 1990;

Германчук В.Г, 2000].

2.8.3. Исследование антителозависимой клеточной цитотоксичности Антителозависимую клеточную цитотоксичность (АЗКЦ), характеризующую функцию К-клеток (клеток-киллеров, относящихся к так называемым «нулевым» лимфоцитам [Фримель Х. и Брок Й., 1986] определяли по методу Ю. И. Зимина, В. Ф. Ляхова (1985), через 5 сут после иммунизации, осуществляемой через 30 мин после введения ФОС, моделирования травмы и ее сочетания с ядом (оценка действия факторов и их сочетанного эффекта в индуктивной фазе иммуногенеза). Кроме того, химический и физические факторы, а также их сочетание, применяли через 3 сут после иммунизации ЭБ (оценка действия ФОС, травмы и их сочетания в индуктивной фазе иммуногенеза). Кроме того, карбофос вводили через 3 сут после иммунизации ЭБ (оценка действия яда в продуктивной фазе иммуногенеза).

В настоящее время доказано, что К-клетки - это ЕКК, использующие для усиления реакции антитела [Ройт А., 1991; Хаитов Р. М. и соавт., 2000]. При этом антитела (IgG) привлекают своим Fc-хвостом ЕКК, имеющие для этого соответствующий FcRIII. Возникает комплекс клетка-мишень – антитело – ЕКК, в котором ЕКК реализует свою киллерную функцию в отношении клеткимало мишени. Субпопуляция CD56 / CD16+ в АЗКЦ является эффекторной [Хаитов Р. М. и соавт., 2000].

Крыс иммунизировали ЭБ (5·108 клеток в 0,5 мл изотонического раствора хлорида натрия), ДДВФ, травматическое воздействие и их сочетание применяли через 2 сут после иммунизации. Через 5 сут извлекали селезенку и тимус, готовили клеточные суспензии в растворе Хенкса, который затем фильтровали через капроновую сетку. Суспензии клеток дважды отмывали изотоническим раствором хлорида натрия по 10 мин при 400 g. Жизнеспособность клеток определяли методом суправитальной окраски 0,1 % раствором трипанового синего. В качестве клеток-мишеней использовали трижды отмытые по 10 мин при 400 g ЭБ, которые в 2,5 % суспензии смешивали с равным объемом гипериммунной антисыворотки кролика в субагглютинирующем разведении (1:5000). Смесь инкубировали 30 минут при 37°С, а затем отмывали 3 раза раствором Хенкса и доводили до необходимой(1:5000). Смесь инкубировали минут при 37°С, а затем отмывали 3 раза раствором Хенкса и доводили до необходимой концентрации. Используемую антисыворотку предварительно инактивировали в течении 30 минут при 56°С. Спленоциты (тимоциты) смешивали с ЭБ в соотношении 20 : 1 (абсолютные значения составляли соответственно 20·106 и 1·106) в 2 мл раствора Хенкса без фенолового красного и инкубировали 4 ч при 37°С. После инкубации смесь клеток центрифугировали 20 минут при 200 g, собирали супернатант. Цитопатогенность киллеров оценивали спектрофотометрическим методом по выходу гемоглобина из лизированных эритроцитов. Контролем служили пробы, содержащие эффекторы и интактные ЭБ. Измерения оптической плотности проводили при длине волны 412 нм на спектрофотометре СФ-46. Уровень АЗКЦ оценивали по индексу цитотоксичности (ИЦ) по формуле:

Е0 - оптическая плотность проб, содержащих эффекторные клетки и сенсибилизированные клетки мишени;

эффекторные клетки и интактные эритроциты;

дистиллированной водой).

Действие факторов оценивали при их воздействии в индуктивной и продуктивной фазах иммуногенеза (одновременно с иммунизацией и через 2 сут после нее), а эффекты иммуностимуляторов и антидотов ФОС после интоксикации ДДВФ, а также, травмы и ее с ФОС сочетания - в продуктивной фазе иммуногенеза.

2.8.4. Исследование естественной цитотоксичности (активности естественных клеток-киллеров - ЕКК) К ЕКК, открытым в 1976 году, относятся клетки, не имеющие антигенных маркеров Т- и В-лимфоцитов (так называемые, О-клетки).