«2.7. исследование лекарственной чувствительности микобактерий 2.7.1. основные понятия Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза (ЛУ МБТ) является одной из самых серьезных проблем современной фтизиатрии. ...»

Наиболее распространенным методом штаммовой идентификации МБТ является технология, называемая полиморфизмом длин рестрикционных фрагментов (RFLP), которая основана на фрагментировании (рестрикции) ДНК МБТ и последующей гибридизации полученных фрагментов с определенными специфическими последовательностями на ДНК ее повторяемого элемента IS6110. Штаммы микобактерий туберкулеза различаются по количеству и размерам рестрикционных фрагментов. ПоКультуральные методы диагностики туберкулеза лучаемый после гибридизации на нитроцеллюлозной мембране специфический рисунок полос характеризует ДНК конкретного штамма МБТ. Эта технология является весьма сложной и трудоемкой.

Альтернативой может быть основанный на ПЦР метод (VNTR) вариабельного числа тандемных повторов, обнаруживаемых в значительном числе локусов генома M. tuberculosis. Этот метод позволяет достаточно эффективно дифференцировать микобактерии различных видов и является менее трудоемким.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы обеспечение качества исследований в бактериологической лаборатории противотуберкулезной службы Обеспечение качества клинических лабораторных исследований является одним из основных направлений деятельности любой медицинской лаборатории. Для реализации этой функции лаборатория должна разработать и внедрить систему обеспечения качества проводимых исследований.

Система обеспечения качества включает три основных составляющих (рис. 44):

критерии, которым должно соответствовать качество исследований в лаборатории;

контроль качества исследований (внутрилабораторный и внешняя оценка качества) – определение соответствия качества исследований установленным в лаборатории критериям;

улучшение качества исследований – комплекс мероприятий, предпринимаемых для исправления выявленных при контроле качества недостатков и улучшения качества проводимых исследований.

Понятие качества лабораторных исследований включает в себя не только такие количественные характеристики качества, как точность, правильность, специфичность или чувствительность, воспроизводимость, но и такие характеристики, как безопасность проведения исследований, эффективность работы лаборатории в целом, включая эффективность административных мероприятий. В связи с этим мероприятия по обеспечению качества клинических лабораторных исследований должны охватывать все стороны работы лаборатории.

Последовательно проводимые мероприятия по обеспечению качества проводимых исследований образуют цикл, позволяющий поднять качество исследований на Материально-техническое Рис. 44 Составляющие системы обеспечения качества клинического лабораторного исследования (ВЛК – внутрилабораторный контроль качества, ВОК – внешняя оценка качества) 162 Культуральные методы диагностики туберкулеза новый уровень. Мониторинг качества в процессе ВЛК и ВОК позволяет выявлять возникающие проблемы и их причины. Мероприятия по улучшению качества позволяют ликвидировать выявленные недостатки и приводят к регулярному пересмотру критериев качества.

Критерии качества зависят:

от уровня научно-технического развития лабораторной диагностики в целом;

потребностей клиники;

материально-технического обеспечения и финансирования лаборатории.

По мере развития научного знания о природе заболеваний и совершенствовании приборной базы растут потребности клиники в более детальном описании патологических процессов у конкретного пациента, сведения о которых позволяют получить клинические лабораторные исследования.

Материально-техническое обеспечение лаборатории, определяемое ее финансированием, должно соответствовать запросам обслуживаемой ею клиники или, в случае лабораторий противотуберкулезной службы, функциям лаборатории в противотуберкулезной программе. При этом необходимо учитывать, что каждое исследование требует определенного набора средств обеспечения безопасности его проведения, оборудования, обеспечивающего его адекватное качество, реактивов, расходных материалов и персонала в достаточном количестве и соответствующей квалификации.

НЕДОПУСТИМО снижение себестоимости исследований за счет снижения безопасности их проведения, исключения мероприятий по контролю качества (ВЛК и ВОК), использования не соответствующих установленным стандартам оборудования реактивов и расходных материалов, несоответствия нагрузки фактическому количеству и квалификации персонала.

Критерии качества должны охватывать все этапы проводимых исследований (преаналитический, аналитический и постаналитический), а также все их стороны, включая безопасность персонала и окружающей среды. Критерии качества и инструкции по обеспечению соответствия этим критериям (в том числе описания проведения исследований, стандартных операционных процедур, инструкции по безопасности и т. д.) должны быть включены в Руководство по обеспечению качества.

5.1. Внутрилабораторный контроль качества микробиологических исследований Информация, полученная при микробиологических исследованиях клинических образцов для диагностики туберкулеза, должна быть точной, надежной и воспроизводимой. Целью ВЛК является гарантия получения достоверных результатов клинических исследований, своевременное выявление проблем, отражающихся на их качестве.

ВЛК должен осуществляться на регулярной основе во всех лабораториях. Каждый сотрудник лаборатории ответственен за качество проводимых им работ и должен проводить мониторинг соответствия выполняемых манипуляций установленным в лаборатории критериям или правилам.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Внутрилабораторный контроль качества (ВЛК) представляет собой оператив­ ный контроль качества результатов исследований до их передачи для клинического использования. Иными словами, ни один результат лабораторного исследования не может быть передан в клинику, если его достоверность не подтверждена задокументированными результатами ВЛК соответствующих серий исследований.

Обычно к ВЛК относят контроль с применением стандартных контрольных образцов. Однако ежедневный мониторинг соответствия проводимых исследований принятым в лаборатории инструкциям, методикам, правилам также относится к мероприятиям внутрилабораторного контроля качества, выполнение которых входит в обязанность каждого сотрудника лаборатории в объеме, соответствующем его функциональным обязанностям и компетенции. Внутренний аудит, проводимый руководством лаборатории, также можно отнести к ВЛК.

В процессе регулярно проводимых внутренних аудитов необходимо контролировать:

планирование и оптимизацию расположения функциональных зон лаборатории и оборудования;

выполнение требований Госсанэпиднадзора к организации исследований и соблюдению техники безопасности в соответствии со специализацией лаборатории;

качество доставленного материала;

технику обработки материала;

соблюдение утвержденных стандартизованных методик;

использование качественных реагентов;

сроки годности используемых реактивов и растворов, правильность их хранения и соответствия их внешнего вида стандарту;

правильность и своевременность выдачи результатов;

регистрацию исследований (контроль должен быть направлен как на обеспечение правильного ведения журналов и оформления ответов, так и на выявление отклонений показателей работы от обычного для этой лаборатории уровня).

Планирование и оптимизация расположения функциональных зон лаборатории и оборудования Помещение, в котором должна располагаться микробиологическая лаборатория, осуществляющая исследования с целью диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза, должно соответствовать требованиям, предъявляемым к работе с микроорганизмами III группы патогенности. Помещение должно быть оборудовано автономной приточно-вытяжной вентиляцией, водопроводом и канализацией. Лаборатория должна иметь следующие помещения: офисную часть, средоварку, приемную для анализов, картотеку, бокс или биологический шкаф безопасности, термостатную, микроскопную, автоклавную, моечную, склад (подробное описание см. в разделе 1.3).

Стены помещения и пол должны быть покрыты легко моющимся материалом, устойчивым к действию дезинфектантов. При организации исследований должна быть соблюдена поточность поступления анализов и работы с ними – по направлению от «чистой» части помещения к более «грязной». Микробиологическая лаборатория, работающая с возбудителями 3-й группы патогенности, должна быть оснащена необходимым оборудованием, обеспечивающим безопасную работу, и посудой.

164 Культуральные методы диагностики туберкулеза Правильность использования помещений лаборатории, рабочее состояние вентиляции и других инженерных систем, работа оборудования в соответствии с установленными в паспортах параметрами, достаточность запаса расходных материалов, посуды и реактивов должна регулярно контролироваться не только инженерными службами, но и руководителем лаборатории или уполномоченным им лицом.

Контроль за соблюдением правил техники безопасности Соблюдение правил техники безопасности считается удовлетворительным, если помещение, где проводятся исследования, соответствует требованиям Госсанэпиднадзора и Приказа №109 МЗ РФ. Сотрудники лаборатории должны иметь и правильно использовать защитные принадлежности и одежду, включающие в себя халат, шапочку, передник, перчатки и маски, которые обеспечивают задержку более 95% частиц диаметром более 1 мкм. Сотрудники лаборатории должны соблюдать правила техники безопасности и применять безопасные манипуляции при проведении исследований.

Ежедневный контроль за соблюдением правил техники безопасности является обязанностью как руководителя лаборатории, так и всех ее сотрудников.

Контроль качества доставленного материала Организация приема диагностического материала считается удовлетворительной, если соблюдаются следующие условия.

Анализы выполняются только при наличии сопровождающей заполненной формы направления. Недопустимо проведение исследований на основании устного запроса, без соответствующего письменного направления.

Направления и другие сопроводительные документы доставляются отдельно от контейнеров с мокротой. Направления, загрязненные материалом, автоклавируются или подвергаются термической обработке в сухожаровом шкафу при 85 °С в течение 45 минут.

В направлении представлена полная информация о больном: имя, фамилия, адрес, возраст, пол, цель исследования, регистрационный номер больного при условии анализа для контроля химиотерапии, фамилия направившего врача и медучреждения, категория больного (ранее леченный или новый случай до начала лечения), дата сбора материала. На контейнере также должна быть информация для однозначной идентификации пробы. Контейнеры, на которых невозможно разобрать надпись, не принимаются для исследования.

При приеме материала проводится его выбраковка в соответствии с установленными правилами. Выбракованные материалы и причины их выбраковки должны регистрироваться в журнале выбраковки.

Необходимо отмечать характер диагностического материала в лабораторном журнале и в бланке результатов исследования.

Разбитые или протекающие контейнеры с диагностическим материалом немедленно стерилизуются (автоклавированием, кипячением, химической обработкой), регистрируются в журнале выбраковки, и направляется запрос на повторный сбор мокроты.

Мониторинг качества доставляемого материала должен проводиться ежедневно.

При выявлении недостатков сотрудники лаборатории должны предпринять меры по специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы их исправлению: провести обучение медперсонала, осуществляющего взятие материала, информировать руководство медучреждения о выявленных проблемах и их последствиях для эффективности лабораторной диагностики.

соблюдение стандартных методик Для проведения лабораторных исследований с целью диагностики и контроля химиотерапии туберкулеза лаборатория должна применять только утвержденные приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации методы.

Лаборатория должна иметь описания применяемых методов и прописи реактивов.

Описание выполнения каждой методики, используемой в лаборатории, должно быть доступно для сотрудников, например, крепиться на стене возле рабочего места. Руководитель лаборатории должен регулярно проверять соответствие проводимых в лаборатории манипуляций утвержденным методикам.

Контроль правильности регистрации исследований Регистрация исследований должна производиться при поступлении материала в лабораторном журнале. Данные о пациенте и цель исследования вносятся в журнал на основании приложенных направлений. Результаты исследований также вносятся в лабораторный журнал.

Отрицательный ответ направившему на исследование материал врачу заполняется в соответствии с формой не позднее чем через 10 недель после посева. При получении положительного результата немедленно выдается предварительный ответ. Такая же форма заполняется в случае пророста материала: необходимо затребовать еще одну пробу и повторить анализ. Окончательный ответ о результатах посева дается после проведения определения вида микобактерий и определения их лекарственной чувствительности. Результаты определения вида микобактерий и лекарственной чувствительности вносятся в «Журнал определения лекарственной чувствительности». Все результаты исследования для каждого больного заносятся в компьютерную базу данных и/или бактериотеку. Все лабораторные документы должны храниться не менее 2 лет!

Правильность ведения регистрационных журналов, картотеки, своевременность выдачи результатов должна регулярно контролироваться руководителем лаборатории.

При проверке регистрационных журналов руководитель лаборатории ежемесячно должен мониторировать такие индикаторы, как:

количество проведенных исследований;

доля проростов;

доля положительных результатов;

доля образцов, исследование которых методом микроскопии дало положительный результат, а методом посева – отрицательный.

Отклонения этих показателей от обычных для данной лаборатории должны своевременно выявляться, их причины анализироваться, и при выявлении недостатков в проведении исследования (включая недостатки на преаналитическом этапе) они должны исправляться. Эффективность мероприятий по исправлению недостатков должна контролироваться.

166 Культуральные методы диагностики туберкулеза 5.2. Внешняя оценка качества исследований Внешняя оценка качества (ВОК) является ретроспективной оценкой качества результатов после передачи их в клинику: она позволяет подтвердить соответствие качества проводимых в лаборатории исследований установленным критериям или выявить неадекватность проводимого в лаборатории ВЛК.

Существуют различные методы ВОК:

проверка качества исследований при посещении лабораторий;

исследование набора контрольных препаратов;

повторное исследование рутинных препаратов;

ретроспективный анализ показателей работы лаборатории.

Проверка качества исследований при посещении лабораторий – наиболее эффективный метод оценки и улучшения качества, поскольку позволяет не только выявить недостатки на всех этапах лабораторного исследования, но и дать рекомендации по их исправлению и провести обучение персонала на месте. Однако этот метод является и наиболее дорогостоящим, поскольку подразумевает отвлечение от работы высококвалифицированного специалиста, затраты на его командирование в лабораторию.

ВОК с применением набора контрольных образцов является наиболее доступным способом оценки качества исследований в большом количестве лабораторий. Однако этот метод имеет определенные ограничения: обычно он позволяет оценить только аналитический этап исследования. В случае микробиологических исследований применяемые в настоящее время образцы не позволяют оценить качество деконтаминации и концентрации проб. Этот метод не позволяет оценить правильность регистрации образцов, правильность интерпретации и оформления результатов, безопасность проводимых исследований. Кроме того, как правило, не удается обеспечить исследование контрольных образцов в тех же условиях, что и проб от пациентов. Поэтому этот метод позволяет выявить наиболее грубые ошибки при проведении исследований.

При всех недостатках оценки качества с применением контрольных образцов этот метод широко применяется в мире для оценки качества микроскопических исследований и исследований лекарственной чувствительности.

ВОК с применением контрольных образцов имеет наиболее широкое применение в нашей стране: в рамках ФСВОК проводится оценка качества по следующим разделам лабораторной диагностики туберкулеза:

микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий методами световой и люминесцентной микроскопии;

культуральное выявление микобактерий туберкулеза;

исследование лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза;

ПЦР-выявление микобактерий туберкулеза.

Повторное исследование рутинных образцов применимо не ко всем видам исследований, а только к тем, образцы для которых возможно сохранить после завершения их исследования (например, окрашенные мазки для микроскопии, культуры для определения вида или лекарственной чувствительности). Необходимо учесть, что количество образцов, подвергнутых повторному исследованию, а также метод их выборки должны обеспечивать статистическую достоверность результатов внешней оценки качества. Этот метод требует значительных затрат на привлечение выучебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы сококвалифицированных специалистов и других ресурсов экспертных лабораторий, затрат на транспортировку образцов.

Подтверждение диагноза отдельного пациента не является целью Цель повторного тестирования – наиболее полное выявление недостатков в проведении исследований в лаборатории.

В случае исследований для диагностики туберкулеза метод повторного тестирования образцов широко применяется для оценки качества микроскопических исследований по методу Циля–Нильсена и исследований лекарственной чувствительности. В случае микроскопических исследований разработана и опубликована методика расчета и проведения статистически достоверной выборки мазков, оценки качества образцов экспертом. Принятая в мире методика подразумевает проведение случайной выборки образцов для тестирования и проведение «слепого» повторного тестирования (эксперты не знают результатов оценки мазков лабораторией). Рекомендовано проводить выборку из всех мазков, а не отдельно отрицательных и положительных.

В нашей стране повторное исследование мазков для оценки качества микроскопии по методу Циля–Нильсена и лекарственной чувствительности выделенных культур микобактерий проводится в ряде регионов курирующими учреждениями противотуберкулезной службы. ФСВОК начинает работы по оценке качества микроскопии по методу Циля–Нильсена путем повторного исследования мазков.

Метод ретроспективного анализа показателей работы лаборатории позволяет оценить соответствие регистрируемых показателей качества проводимых исследований установленным стандартам (например, доля положительных результатов среди всех культуральных исследований, доля проростов, доля выделения нетуберкулезных микобактерий и т. д.). Этот метод ВОК не требует значительных затрат, однако представляет ограниченную информацию для оценки качества исследований, проводимых в лаборатории. Он может применяться как составная часть проверок качества при посещении лабораторий, а также при внутренних аудитах лаборатории.

5.3. улучшение качества исследований Мероприятия по улучшению качества исследований являются обязательными в рамках программы по обеспечению качества в лаборатории. Проведение ВЛК и ВОК бессмысленно, если лаборатория не имеет возможности устранить выявленные недостатки или не предпринимает мер по их устранению.

Мероприятия по улучшению качества можно подразделить на административные, направленные на совершенствование методической базы, улучшение качества реактивов, расходных материалов, оборудования и его обслуживания, на поддержание и повышение квалификации персонала.

Административные мероприятия по улучшению качества направлены на более рациональное распределение обязанностей и организацию выполнения исследований. Руководство лаборатории должно проводить регулярный пересмотр применяКультуральные методы диагностики туберкулеза емых методик с учетом их соответствия действующим методическим указаниям для повышения их эффективности в соответствии с требованиями клиники и уровнем финансирования лаборатории.

Качество и достаточное количество оборудования лабораторий, а также качество и количество необходимых реактивов и расходных материалов является обязательным условием получения достоверных результатов исследования. При проведении исследований для диагностики туберкулеза должны использоваться соответствующие каждой процедуре реактивы, приборы и лабораторное оборудование, указанные в Приложениях №№ 10, 11 Приказа МЗ РФ № 109 от 21.03.03. «О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации». В рамках улучшения качества исследований в лаборатории должно анализироваться качество поступивших в лабораторию оборудования, реактивов и расходных материалов, условия их поставки. Руководство лаборатории совместно с администрацией медучреждения, к которому она относится, должно формировать требования к оборудованию, расходным материалам и реактивам, необходимым для проведения исследований, к условиям их поставки, а также требования к организациям, проводящим установку и техническое обслуживание оборудования.

Для поддержания и повышения квалификации персонала необходимо проведение его обучения стандартизованным методам исследования, планированию и организации работы лаборатории, технике безопасности при работе с инфекционным материалом. Кроме того, необходимо проведение повторных курсов, позволяющих обновить знания персонала, обменяться опытом и обсудить возникающие проблемы.

Эффективность мероприятий по улучшению качества работы должна отслеживаться с помощью внутрилабораторного и внешнего контроля качества.

Утвержденные правила проведения ВЛК (включая методы проведения ВЛК с использованием стандартных образцов, внутренние аудиты, формы регистрации их результатов) и ВОК, регистрация мероприятий по улучшению качества и их эффективности, правила закупки, хранения, использования и списания оборудования, реактивов и расходных материалов должны быть представлены в Руководстве по обеспечению качества. Решения о пересмотре критериев качества на основании вышеперечисленных мероприятий должны документироваться и фиксироваться в Руководстве по обеспечению качества. В этом случае должна быть оформлена новая версия этого документа.

1. Составьте список вопросов, которые должны проверяться при внутреннем аудите Вопросы и задания 2. Как проводится внутрилабораторный контроль качества процессов деконтаминации и посева в вашей лаборатории?

3. Перечислите методы внешней оценки качества, применяемые для лабораторных исследований при диагностике туберкулеза. Какие методы применяются для 4. Внешняя оценка качества выявила систематическую ошибку вашей лаборатории при определении чувствительности к стрептомицину. Какие действия вы предпримете для исправления ситуации?

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Приложение списки оборудования и расходных материалов для микробиологической лаборатории противотуберкулезной службы Минимальный стандартный список оборудования, необходимого для выполнения микробиологических (микроскопических и культуральных) исследований по диагностике и контролю химиотерапии туберкулеза Ламинарный шкаф для защиты персонала и окружающей среды I класса биологической безопасности с вертикальным потоком воздуха и фильтром «HEPA» (для проведения процесса пробоподготовки).

Рекомендуемая ширина рабочей поверхности шкафа – 1200–1500 мм, 2 электрические розетки, освещение, УФ-лампа Ламинарный бокс (для защиты персонала, окружающей среды и продукта) II класса биологической безопасности с вертикальным потоком воздуха и фильтром «HEPA» (для проведения посевов и приготовления мазков).

Рекомендуемая ширина рабочей поверхности бокса – 1500 мм, 2 электрические розетки, освещение, УФ-лампа Ламинарный бокс (для защиты персонала, окружающей среды и продукта) II класса биологической безопасности с вертикальным потоком воздуха и фильтром «HEPA» (для проведения тестов на лекарственную чувствительность и для процессов с использованием жидких питательных сред и автоматизированных или полуавтоматизированных систем).

Рекомендуемая ширина рабочей поверхности бокса – 1500–1800 мм, 2 электрические розетки, освещение, УФ-лампа Вытяжной шкаф (для окраски мазков).

Рекомендуемая ширина рабочей поверхности шкафа – 1200 мм.

В шкафу должен быть подвод воды и отвод для канализационного стока; рекомендуется наличие встроенной в шкаф двухсекционной раковины для окраски мазков, размер каждой из секций раковины приблизительно равен 400400 мм Микроскоп световой бинокулярный с иммерсионным объективом (90–100) и окулярами (8 или 10) и функционирующим предметным столиком Микроскоп люминесцентный Центрифуга антиаэрозольная рефрижераторная с ускорением 3000 g (рекомендуется модель, имеющая максимально возможное количество гнезд для центрифугирования пробирок объемом 50 мл).

Комплектование центрифуги:

бакет-ротором (с 4 подстаканниками) с адаптерами для каждого из стаканов ротора, позволяющими разместить в каждом стакане по 4 пластиковые центрифужные пробирки на 50 мл; крышками с зажимами для каждого стакана ротора, или угловым ротором на 14 гнезд для вышеуказанных центрифужных пробирок 170 Культуральные методы диагностики туберкулеза