«2.7. исследование лекарственной чувствительности микобактерий 2.7.1. основные понятия Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза (ЛУ МБТ) является одной из самых серьезных проблем современной фтизиатрии. ...»

2.7. исследование лекарственной чувствительности

микобактерий

2.7.1. основные понятия

Лекарственная устойчивость микобактерий туберкулеза (ЛУ МБТ) является одной

из самых серьезных проблем современной фтизиатрии. Определение лекарственной

чувствительности (ЛЧ) микобактерий является решающим фактором для выбора

оптимальной химиотерапии туберкулеза, прогноза и своевременной коррекции лечения, а также служит важным показателем эпидемиологической напряженности по

туберкулезу в отдельных регионах или даже в масштабах страны.

Чувствительность микобактерий к противотуберкулезным препаратам – это неспособность бактериальных клеток штамма расти на питательной среде с минимальной ингибирующей концентрацией препарата, задерживающей рост микобактерий при стандартных условиях постановки опыта.

Чувствительными к данному препарату считаются те штаммы микобактерий, на которые этот препарат в критической концентрации оказывает бактерицидное или бактериостатическое действие.

Устойчивость (резистентность) определяется как снижение чувствительности до такой степени, что данный штамм микобактерий способен размножаться при воздействии на него препарата в критической или более высокой концентрации.

Уровень (или степень) устойчивости данного штамма в целом выражается той максимальной концентрацией препарата (мкг/мл), при которой еще наблюдается размножение микобактерий.

Критическая концентрация – это концентрация препарата, подавляющая рост возбудителя дикого типа, но не устойчивых мутированных штаммов.

Для различных противотуберкулезных препаратов установлена определенная критическая концентрация. Она отличается от минимальной ингибирующей концентрации и имеет клиническое значение, так как отражает воздействие препарата на МБТ в условиях макроорганизма и выбрана с учетом фармакокинетических и фармакодинамических свойств ПТП.

Для разных по составу питательных сред критическая концентрация одного и того же препарата различна. Значения критических концентраций ПТП существенно отличаются при использовании разных методов определения ЛЧ МБТ.

Большое значение для принятия конкретных решений о проведении терапии больного туберкулезом имеет структура лекарственной резистентности МБТ.

В соответствии с международными стандартами различают следующие категории ЛУ МБТ.

Монорезистентность – устойчивость только к одному (любому) противотуберкулезному препарату.

учебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Полирезистентность – устойчивость к двум и более противотуберкулезным препаратам, исключая резистентность одновременно к изониазиду и рифампицину.

Множественная лекарственная устойчивость, или мультирезистентность (МЛУ, или MDR от англ. Multy Drug Resistance), – это особая категория среди полирезистентных штаммов, у которых имеется устойчивость по меньшей мере к изониазиду и рифампицину одновременно, независимо от резистентности к другим препаратам.

Лечение больных с МЛЧ МБТ представляет особенные трудности, так как изониазид и рифампицин остаются до настоящего времени наиболее эффективными ПТП, а устойчивость к ним сопровождается, как правило, резистентностью к стрептомицину, а также нередко и к другим противотуберкулезным препаратам.

Чрезвычайная лекарственная устойчивость. В 2006 году в международной классификации появилось понятие чрезвычайной лекарственной устойчивости (XDR), которая определяется как устойчивость, по крайней мере, к изониазиду, рифампицину, фторхинолонам и к одному из трех инъекционных препаратов (капреомицину, канамицину или амикацину).

Для оценки эпидситуации в международной практике принято различать лекарственную устойчивость микобактерий у ранее не леченных (первичную) и ранее леченных больных (приобретенную).

Лекарственная устойчивость микобактерий у ранее не леченных больных определяется как устойчивость, обнаруженная у микобактерий, выделенных от пациента, никогда не лечившегося от туберкулеза или получавшего лечение менее одного месяца.

В данном случае подразумевается, что больной заразился лекарственно-устойчивым штаммом микобактерий. Первичная лекарственная устойчивость характеризует состояние микобактериальной популяции, циркулирующей в данной территории, и ее показатели важны для оценки степени напряженности эпидемической ситуации.

ЛУ микобактерий у ранее не леченных больных имеет большое клиническое и эпидемиологическое значение, поэтому для правильной ее оценки чрезвычайно важно исследовать культуру, выделенную из диагностического материала, собранного до начала лечения.

Частота лекарственной устойчивости у ранее не леченных больных рассчитывается как отношение количества впервые выявленных больных туберкулезом с резистентными МБТ ко всем обследованным впервые выявленным бациллярным больным за определенный период (как правило, календарный год).

Лекарственная устойчивость микобактерий у ранее леченных больных определяется как устойчивость, выявленная у больного туберкулезом, получавшего лечение в течение одного месяца и более.

Развитие приобретенной ЛУ у больного с впервые выявленным туберкулезом является обычно результатом неэффективного лечения. Приобретенная ЛУ МБТ у хроКультуральные методы диагностики туберкулеза нических больных туберкулезом характеризует состояние так называемого «бациллярного ядра» в отдельных регионах.

Частота приобретенной лекарственной устойчивости рассчитывается как отношение количества ранее леченных больных туберкулезом с резистентными МБТ ко всем обследованным ранее леченным бациллярным больным за определенный период (как правило, календарный год).

Чрезвычайно полезным для оценки эффективности лечения является показатель нарастания лекарственной устойчивости микобактерий, выделяемых от больных, в процессе лечения. Он оценивается как доля больных, сохранивших бактериовыделение, у которых была выделена культура с измененным спектром лекарственной чувствительности по сравнению с культурой, выделенной до начала лечения (например, культура, выделенная из материала, собранного до начала лечения, была устойчива к стрептомицину, а культура, выделенная из материала, собранного через 5–6 месяцев лечения, оказалась устойчива к стрептомицину и рифампицину), ко всем больным, сохранившим бактериовыделение и обследованным на лекарственную чувствительность за выбранный период лечения (например, 6 месяцев химиотерапии).

2.7.2. механизмы развития лекарственной устойчивости Проблема лекарственной устойчивости является актуальной не только для фтизиатрии, но и для антибактериальной химиотерапии в целом. Выработка устойчивости к неблагоприятным внешним воздействиям является проявлением высокой способности микроорганизмов к адаптации. В ее основе лежит спонтанный мутагенез, происходящий в каждой бактериальной клетке. В результате этого процесса случайным образом возникают повреждения молекулы ДНК – мутации. Вероятность повреждения в результате мутации того или иного гена в значительной степени зависит от его линейной протяженности (размера). Часть возникающих мутаций повреждают гены, ответственные за реализацию антибактериального действия лекарственных веществ, что может приводить к снижению чувствительности мутировавшей клетки к действию соответствующего вещества.

Как уже упоминалось выше, частота возникновения мутаций, приводящих к устойчивости клетки к антибактериальному соединению, во многом зависит от линейных размеров участков ДНК, в которых локализуются гены, ответственные за антибактериальное действие этого вещества: чем больше длина таких участков ДНК, тем выше частота возникновения мутаций, приводящих к устойчивости.

Например, частота возникновения мутаций, приводящих к устойчивости к стрептомицину, механизм антибактериального действия которого связан со связыванием его молекулы со сравнительно значительным участком 30S субъединицы бактериальной рибосомы, составляет для E. coli 10–6, т. е. одна мутантная клетка возникает на 1 млн нормальных клеток. В МБТ, в отличие от других патогенов, имеется только одна копия 16S РНК, поэтому одна мутация в соответствующем гене уже ведет к ЛУ, то есть все рибосомы в полисоме будут устойчивы к ингибиторам белкового синтеза (стрептомицин и другие аминогликозиды). У других микробов множественность копий рибосомальных генов требует для образования клеток, устойчивых к стрептомицину, мутационных изменений в каждой копии.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Частота возникновения устойчивости к рифампицину или офлоксацину значительно меньше и составляет 10–9 и 10–12 соответственно.

Различные гены имеют различное значение для проявления антибактериального эффекта препаратов, поэтому их мутационные повреждения могут приводить к различному уровню устойчивости бактериальной клетки. Уровень устойчивости культуры микобактерий, выделенной от пациента, зависит от доли устойчивых бактерий в этой культуре.

В отличие от других патогенных микроорганизмов микобактерии туберкулеза имеют естественную устойчивость ко многим классам антибактериальных препаратов широкого спектра действия (например, антибиотики бета-лактамного и тетрациклинового ряда), обусловленную особенностями метаболизма: наличием беталактамазы и/или непроницаемостью клеточной стенки.

Устойчивые к антибактериальным препаратам бактериальные клетки возникают в популяции инфекционных бактерий в организме хозяина. При воздействии на нее антибактериального препарата чувствительные к нему клетки погибают, а устойчивые бактерии получают селективные преимущества для выживания и распространения в организме.

При применении монотерапии, сниженных доз или укороченных курсов возникает ситуация, способствующая выживанию и распространению лекарственно устойчивых форм. Частота возникновения одновременно двух мутаций, приводящих к устойчивости к двум препаратам, значительно ниже, чем для одной, приводящей к моноустойчивости. Однако при применении второго препарата для лечения инфекции, уже устойчивой к одному из препаратов, и при недостаточной эффективности терапии в организме больного возникнет популяция бактерий, устойчивых уже к двум антибактериальным препаратам. Таким образом, распространение лекарственной устойчивости является следствием неадекватной химиотерапии и считается явлением, сотворенным человеком. Для преодоления возможного умножения лекарственной устойчивости во фтизиатрии применяется химиотерапия не менее чем 4 антибактериальными препаратами.

Проблема развития и распространения лекарственной устойчивости во фтизиатрии обостряется в связи с ограниченностью спектра антибактериальных препаратов, эффективных при этом заболевании, и продолжительностью курса лечения. Прерывание лечения, отказ от приема препаратов, самолечение считаются основными причинами нарастания лекарственной устойчивости к туберкулезу.

2.7.3. организация исследования лекарственной чувствительности микобактерий Для исследования лекарственной чувствительности микобактерий требуется соблюдать определенные стандарты исследований.

Исследование лекарственной устойчивости микобактерий необходимо производить в шкафах биологической безопасности 2-го класса, которые обеспечивают не только защиту оператора, но и сохранность от контаминации биологического объекта.

При получении от больного культур МБТ из различного патологического материала (мокрота, лаважная жидкость, моча, гной, биопсийный и послеКультуральные методы диагностики туберкулеза операционный материал) необходимо исследование каждого выделенного При одновременном получении от больного двух и более культур МБТ из однородного диагностического материала достаточно исследовать один штамм из пробирки с наиболее массивным ростом.

При скудном росте (1–2 колонии в пробирке) допускается собрать бактериальную массу из различных пробирок либо из разных штаммов однородного диагностического материала.

При выделении культуры МБТ в количестве, недостаточном для получения микобактериальной суспензии необходимой концентрации (менее 3 колоний), исследование ЛЧ не производить, культуру пересеять.

Определение лекарственной устойчивости микобактерий необходимо производить только с использованием чистых субстанций противотуберкулезных препаратов.

На результаты тестирования ЛЧ МБТ существенную роль оказывают такие факторы, как используемая для тестирования питательная среда и стабильность вносимых в нее лекарственных препаратов.

В различных партиях сред минимальная ингибирующая концентрация лекарственного препарата может существенно различаться. Под воздействием ряда компонентов сред может происходить инактивация некоторых лекарственных препаратов.

Например, фосфолипиды в яичных средах инактивируют стрептомицин, D-аланин нейтрализует циклосерин, полиамины подавляют активность этамбутола и т. д. Существенное влияние на стабильность лекарственных препаратов оказывают также условия их стерилизации и хранения.

Многие лекарственные препараты представляют собой соли, таким образом, биологически активные субстанции являются только частью общей массы молекулы, в то время как другие радикалы (например, сульфаты, гидрохлориды и т. д.) могут составлять значительную долю общего веса. В связи с этим при приготовлении питательных сред с препаратами необходимо учитывать количество активного вещества и молекулярную формулу препарата.

Во всем мире в качестве стандартной среды для определения лекарственной чувствительности применяется среда Левенштейна–Йенсена. Эта среда рекомендуется для использования всеми микробиологическими лабораториями противотуберкулезной службы РФ для получения сравнимых результатов. Соблюдение стандартной технологии приготовления питательной среды с препаратами имеет важнейшее значение для получения достоверных результатов тестирования. Как уже указывалось выше, для приготовления питательных сред с целью определения ЛЧ МБТ должны использоваться только химически чистые субстанции препаратов. При приготовлении рабочих растворов с необходимыми концентрациями активной субстанции расчеты количества взвешиваемых навесок следует производить с учетом процента активности препарата, которая может варьировать от серии к серии.

Следует отметить, что особенностью такого противотуберкулезного препарата, как пиразинамид, является его высокая противотуберкулезная активность при сниженных значениях кислотности среды (рН 6,0). В то же время для культивирования МБТ на плотных яичных средах оптимальным является значение рН, близкое к нейтральному. Эти обстоятельства не позволяют использовать стандартные методики для определения ЛЧ МБТ к пиразинамиду на плотных яичных питательных средах.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Большое значение при постановке тестов на ЛЧ МБТ имеет правильная подготовка инокулята. На контрольную и содержащую препарат среды должны вноситься надлежащие количества микроорганизмов. Если число бактериальных единиц слишком мало, стандартного количества инокулята будет недостаточно для определения критической доли устойчивых штаммов. Если число микобактерий слишком велико, рост естественным образом образующихся резистентных штаммов может симулировать лекарственную устойчивость.

Важное значение имеет также возраст культуры, использованной для приготовления посевной суспензии. Тесты на определение лекарственной чувствительности должны проводиться только с активно растущими культурами. Использование старой культуры для приготовления посевной суспензии может привести к искажению результата исследования.

Поскольку в случае использования непрямых методов тестирования ЛЧ МБТ подготовка бактериального инокулята проводится в лаборатории, при приготовлении микобактериальной суспензии для засева может быть выбрано такое соотношение чувствительных и резистентных микроорганизмов, которое не соответствует действительной ситуации в пораженном органе пациента. В связи с этим необходимо правильно производить отбор бактериальной массы для исследования (обязательно выбирать несколько колоний с различных участков пробирки с ростом культуры либо делать смыв со всей поверхности косяка с культурой).

Важное значение при тестировании ЛЧ МБТ имеет также длительность инкубации.

2.7.4. методы исследования лекарственной чувствительности микобактерий Для определения ЛЧ МБТ должны использоваться только стандартизованные методы исследования, что позволяет:

правильно вести лечение пациентов;

интерпретировать и сравнивать данные, полученные из различных источников;

проводить оценку уровней лекарственной устойчивости и тенденций, наблюдаемых в разных регионах или странах.

В настоящее время нет единого универсального метода определения ЛЧ МБТ. Имеются культуральные методы с использованием плотных и жидких питательных сред, с полуавтоматической и автоматической детекцией роста микобактерий, а также молекулярно-генетические экспрессные методы.

Выбор того или иного метода определяется традиционно сложившимися методическими подходами, используемыми в данной стране. Для эффективного управления мониторингом, обеспечения эпидемиологического надзора за лекарственной устойчивостью микобактерий и распространением лекарственно-устойчивых штаммов возбудителя, а также для сопоставления результатов исследований и эффективности лечения в пределах мирового сообщества в масштабах каждой стра­ ны рекомендуется использовать только один из имеющихся унифицированных методов, регламентированный внутренними нормативными документами данной страны.

124 Культуральные методы диагностики туберкулеза Все имеющиеся методы определения ЛЧ МБТ можно условно разделить на 2 категории:

методы прямого определения ЛЧ МБТ;

методы непрямого определения ЛЧ МБТ.

При использовании методов прямого определения ЛЧ МБТ мокрота или другие клинические материалы, предварительно обеззараженные и прошедшие гомогенизацию, высеваются непосредственно на среды, содержащие и не содержащие соответствующий препарат. Количество инокулята определяется в зависимости от количества КУМ, определенного при микроскопии мазка.

Методы прямого определения ЛЧ имеют ряд недостатков:

для исследования нельзя использовать образцы диагностического материала, имеющие отрицательный результат микроскопии;

при проведении данного исследования повышается риск контаминации;

может наблюдаться недостаточный рост культуры, не позволяющий сделать достоверные выводы.

При использовании методов непрямого определения ЛЧ МБТ проводится выделение микроорганизмов из клинических образцов при культивировании, а затем на контрольную и содержащую препарат яичную или плотную агаровую среду высевается гомогенная суспензия или культура, выросшая на бульоне.

В литературе описаны три основных классических микробиологических метода непрямого определения ЛЧ МБТ:

Метод пропорций, предложенный в 1963 г. Canetti, Rist and Grosset и детализированный в 1985 г. Middlebrook and Cohn.

Метод коэффициента устойчивости, разработанный в 1961 г. Mitchison и др.

Метод абсолютных концентраций на плотных и жидких средах, модифицированный в 1970 г. Meissener.

В России наиболее распространенным и традиционно используемым методом определения ЛЧ МБТ является непрямой метод абсолютных концентраций на плотной яичной питательной среде Левенштейна–Йенсена. Остальные методы тестирования ЛЧ МБТ являются альтернативными.

2.7.5. определение лекарственной чувствительности микобактерий непрямым методом абсолютных концентраций Суть метода заключается в том, что осуществляют дозированный посев тщательно подготовленной микобактериальной суспензии из выросшей культуры МБТ на пробирки с питательной средой Левенштейна–Йенсена, содержащие определенные концентрации противотуберкулезных препаратов и контрольные пробирки без препаратов. Обычно используются несколько концентраций препаратов, устойчивость определяется с помощью минимальной ингибирующей концентрации препарата, которая ингибирует рост всех или почти всех микобактерий, что обычно определяется как наличие 20 или менее колоний возбудителя.

При использовании данного метода удовлетворительные результаты получаются только тогда, когда:

стандартизовано количество инокулята;

критическая концентрация препарата была стандартизована по штаммам возбудителя дикого типа.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Непрямой метод абсолютных концентраций характеризуется тем, что:

позволяет выявить устойчивость возбудителя туберкулеза как к основным, так и к резервным противотуберкулезным препаратам;

выполняется с использованием чистой культуры клинического изолята микобактерий;

период определения ЛЧ МБТ составляет 3 (4) недели;

заключение о результатах определения ЛЧ МБТ поступает к лечащему врачу не ранее чем через 2–2,5 месяца после посева диагностического материала.

Приготовление питательных сред с препаратами Среды для исследования лекарственной чувствительности должны содержать точные концентрации антибактериальных препаратов, соответствующие их активности. Поэтому при приготовлении растворов препаратов необходимо учитывать их антибактериальную активность. Показатели антибактериальной активности должны быть указаны в паспорте к препарату.

Для приготовления растворов используйте только химические субстанции, в паспорте к которым указаны их антибактериальная Храните субстанции препаратов строго в соответствии Не используйте субстанции с истекшими сроками годности!

Для определения лекарственной чувствительности к лекарственным препаратам в лаборатории должны иметься поверенные весы, позволяющие производить взвешивание с точностью до 0,2 мг, что обеспечит точность навески препаратов с погрешностью не более ±1,5%.

При хранении разведенных препаратов при температуре +5 °С и выше более 6 часов может произойти снижение их активности. Поэтому растворы необходимо готовить непосредственно перед приготовлением сред. В лабораториях, имеющих морозильные камеры, поддерживающие температуру ниже 20 °С, возможно хранение разведенных препаратов в течение 6 месяцев при условии недопущения их оттаивания и повторного замораживания. Такая технология дает определенные преимущества: приготовление большего объема раствора позволяет взвешивать большую навеску препарата, что уменьшает ошибку взвешивания и потери вещества при взвешивании. В случае замораживания раствора препарата он должен быть разлит по криопробиркам в объеме, необходимом для добавления в одну порцию среды.

Для исследования лекарственной чувствительности применяется плотная яичная среда Левенштейна–Йенсена. После добавления препарата в среду необходимо тщательно ее перемешать, не допуская образования пузырьков и пены и обеспечивая равномерное распределение препарата в среде. Свертывание среды с препаратом должно проводиться в тех же условиях, что и среды без препарата – коагуляция проводится при 82–83 °С в течение 40 минут.

126 Культуральные методы диагностики туберкулеза В набор сред для исследования лекарственной чувствительности входят: контрольная среда (без препаратов), среды, содержащие ПТП, а также среды с веществами, применяемыми для видовой идентификации микобактерий.

С целью снижения экономических затрат на одно исследование определение лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза непрямым методом абсолютных концентраций рекомендуется проводить к одной, критической концентрации для каждого из исследуемых противотуберкулезных препаратов, определяемой как предельная или критерий устойчивости. Штаммы, которые культивируются при более высоких, чем критическая, концентрациях препарата, относят к лекарственноустойчивым.

В таблице 6 указаны критические концентрации противотуберкулезных препаратов, к которым в обязательном порядке должно проводиться исследование ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций.

Критические концентрации противотуберкулезных препаратов для определения лекарственной устойчивости методом абсолютных концентраций на среде Примечание. Выделенные жирным шрифтом препараты составляют обязательный набор противотуберкулезных препаратов I ряда, к которым определяется ЛЧ МБТ. Тестирование ЛЧ МБТ к остальным препаратам рекомендуется проводить при наличии резистентности к основным противотуберкулезным препаратам.

* Критические концентрации препаратов II ряда носят ориентировочный характер. В настоящее время критерии определения ЛЧ МБТ к ПТП II ряда остаются нечеткими и спорными.

Таким образом, комплект для определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза должен включать в себя контрольную пробирку, не содержащую препаратов, и пробирки с препаратами в критических концентрациях, указанных выше (см. табл. 6). Помимо этого, в комплект для тестирования ЛЧ МБТ должны быть включены: пробирка с добавлением салициловокислого натрия в концентрации 1000 мкг/мл и пробирка с ТСН (thiophene-2-carboxylis acid hydrazide) в концентрации 2 мкг/мл. Наличие двух последних пробирок необходимо для проведения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы обязательной первичной идентификации микобактерий, выполняемой в ходе тестирования ЛЧ МБТ.

Все среды, входящие в набор для тестирования одного штамма, должны гото­ виться из одной партии среды Левенштейна–Йенсена в один день!

Схемы разведений противотуберкулезных препаратов и методика приготовления питательных сред с препаратами изложены в Приложении 3.

Приготовление и засев микобактериальной суспензии Подготовка к выполнению процедуры приготовления и засева микобактериальной суспензии включает в себя следующие подготовительные операции.

Проверенные и отобранные для тестирования ЛЧ культуры микобактерий расставляют в штативе в порядке номеров (номера отобранных культур заносят в лабораторный журнал регистрации лекарственной чувствительности выделенных культур).

Необходимо также заранее расставить в штативах наборы питательных сред для каждой из исследуемых культур. На каждой пробирке со средой надписывают номер культуры и название препарата. Для удобства последующего считывания результатов исследования ЛЧ рекомендуется выполнять надписи на верхней части пробирки, с той ее стороны, где находится скос питательной среды; кроме того, пробирки из каждого набора сред следует размещать в штативах в одинаковой определенной последовательности (в соответствии с графами лабораторного журнала).

Организация рабочего места для приготовления и засева микобактериальной суспензии в ходе постановки тестов на ЛЧ МБТ представлена на рис. 35.

Рис. 35 Рабочее место для приготовления и засева микобактериальной суспензии 128 Культуральные методы диагностики туберкулеза Приготовление микобактериальной суспензии Приготовление микобактериальной суспензии является чрезвычайно важным компонентом определения ЛЧ микобактерий.

Для приготовления посевной суспензии микобактериальную массу (10–20 мг) из нескольких колоний отбирают серебряным шпателем или специальной бактериологической лопаточкой из нихрома (платины).

В шкафах биологической безопасности 2­го класса шпатели и лопаточки реко­ мендуется прожигать в электрических стерилизаторах для металлических инс­ трументов (печках для обжига петель)! (рис. 36).

При отсутствии в лаборатории указанной печки рекомендуется при тестировании ЛЧ заранее подготовить требуемое для постановки опыта количество стерильных лопаток (по числу исследуемых культур). Для отбора микобактериальной массы можно также использовать стерильную одноразовую бактериологическую петлю.

Существует несколько способов приготовления суспензии.

1. Собранную биомассу помещают в сухую толстостенную пробирку. Стеклянной палочкой тщательно растирают культуру микобактерий и по каплям добавляют 2–3 мл физиологического раствора.

2. Микобактериальную массу помещают в толстостенную пробирку из боросиликатного стекла с завинчивающейся пробкой со стерильными стеклянными бусами и стерильным физиологическим раствором с добавлением 0,05% Твина и встряхивают на встряхивателе типа Vortex (рис. 37) в течение 20–25 секунд.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Рис. 37 Встряхиватель Vortex-Genie- 3. Микобактериальную массу помещают в толстостенную пробирку с завинчивающейся пробкой со стерильными стеклянными бусами и стерильным физиологическим раствором. Уровень жидкости в пробирке не должен превышать уровня бус (приблизительно 1 мл). Суспензию обрабатывают на встряхивателе типа Vortex в течение 120–150 секунд. После окончания встряхивания в пробирку доливают еще 1–2 мл стерильного физиологического раствора.

ВНИМАНИЕ! Процедура приготовления суспензии приводит к образованию инфекционного аэрозоля! Она должна проводиться только с использованием толстостенных (предпочтительно боросиликатных) пробирок без видимых повреждений!

При встряхивании суспензии на встряхивателе типа Vortex должны использоваться герметично закрывающиеся пробирки с завинчивающимися крышками! Процедура должна проводиться Приготовленной суспензии дают отстояться в течение 15–30 минут и полученный супернатант отсасывают стерильной пипеткой, стараясь забирать только верхний слой жидкости и оставлять в пробирке крупные частицы нерастертой культуры.

10 Культуральные методы диагностики туберкулеза Суспензию переносят в стерильную пробирку, диаметр которой соответствует диаметру пробирки с оптическим стандартом мутности 5 ЕД. Затем микобактериальную суспензию титруют по стандарту мутности № 5 ГНИИСК (500 млн микробных клеток/мл, см. Приложение 6). Использованную пипетку опускают в емкость с дезинфицирующим раствором.

По окончании процедуры растирания и стандартизации по оптическому стандарту мутности № 5 всех взятых в опыт культур переходят к дальнейшему разведению этих суспензий.

Каждую отстандартизованную по оптическому стандарту мутности № 5 суспензию разводят в 10 раз стерильным физиологическим раствором. Для этого следует заранее приготовить ряд пробирок по числу исследуемых культур микобактерий, подписать на них номера культур и расставить их в штативе в порядке номеров регистрации. В каждую пробирку налить по 9 мл стерильного физиологического раствора.

При разведении приготовленных суспензий в каждую из подготовленных пробирок с физраствором следует внести стерильной пипеткой по 1 мл приготовленной по стандарту № 5 суспензии микобактерий соответствующего номера. Посев на среды с лекарственными препаратами производят из этих разведенных суспензий (суспензия, приготовленная по стандарту № 5 и разведенная в 10 раз).

Засев микобактериальной суспензии Из пробирки с разведенной 1:10 микобактериальной суспензией набрать в мерную пипетку объемом 1–2 мл бактериальную суспензию и произвести засев по 0,2 мл (10 млн микробных клеток) в пробирки с контрольной средой Левенштейна–Йенсена и пробирки, содержащие ПТП в определенных концентрациях. Суспензию вносят на верхнюю треть косяка во все пробирки с питательной средой, приготовленной для определения ЛЧ культуры данного номера, тщательно сверяя номер культуры засеваемой суспензии с номерами, написанными на пробирках. Во избежание ошибок все пробирки, подготовленные для засева одной культуры, следует расставлять в одном ряду штатива.

Каждую засеянную суспензией пробирку закрывают ватно-марлевой, резиновой или недренированной силиконовой пробкой и ставят в вертикальный штатив, с тем чтобы за время постановки опыта суспензия равномерно стекала по поверхности косяка среды к дну пробирки.

По завершении засева всех суспензий засеянные пробирки перемещают в горизонтальные штативы и помещают для инкубирования в термостат при температуре 37 °С. При этом поверхность косяка питательной среды должна находиться в горизонтальной плоскости, а наклон штатива должен исключить смачивание пробки материалом засева; засеянная суспензия должна равномерно покрывать всю поверхность косяка среды.

Через 2–3 суток можно перевести пробирки в вертикальные штативы, однако эта процедура не носит обязательного характера, так же, как и замена ватно-марлевых пробок на резиновые или силиконовые. Это объясняется тем, что при постановке опытов по определению ЛЧ продолжительность инкубации посевов при 37 °С, как правило, не превышает 3–4 недель, и в течение этого периода среда сохраняет свою влажность.

ВНИМАНИЕ! При исследовании лекарственной чувствительности нескольких штаммов МБТ на всех пробирках для приготовления микобактериальной суспензии специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы и пробирках с плотной питательной средой должны быть заранее надписаны номера культур микобактерий, соответствующие лабораторному регистрационному журналу. Во избежание контаминации для каждой культуры должна быть заготовлена своя стерильная пробирка с физраствором. Не используйте физраствор из одного сосуда для разведения суспензий различных культур!

оценка результатов определения лекарственной устойчивости Оценку результатов определения лекарственной устойчивости микобактерий производят через 3 недели инкубации в термостате. При плохом росте МБТ на контрольной питательной среде следует выждать еще 1–2 недели до получения выраженного роста в контроле, после чего выдают окончательный ответ.

При использовании метода абсолютных концентраций культура МБТ счита­ ется устойчивой, если на питательной среде с определенным препаратом вырас­ тает 20 и более колоний микроорганизмов при обильном росте на контрольной пробирке (без препарата).

использование дополнительных концентраций препаратов Кроме критических концентраций при использовании метода абсолютных концентраций в ряде случаев целесообразно использовать и дополнительные концентрации ПТП для определения порога устойчивости. Это дает возможность клиницисту варьировать дозировки и лекарственные режимы за счет повышения дозы, методов введения и использования аддитивных и синергидных свойств различных комбинаций ПТП. Например, устойчивость МБТ к изониазиду в ряде случаев может быть преодолена путем применения повышенных доз и внутривенного введения противотуберкулезного препарата.

Таким образом, при диагностической необходимости по запросу клинициста возможно проводить исследование лекарственной чувствительности микобактерий к следующим дополнительным концентрациям противотуберкулезных препаратов:

изониазид – 10 мкг/мл;

этамбутол – 5 мкг/мл.

2.7.6. альтернативные методы исследования лекарственной чувствительности микобактерий Кроме непрямого метода абсолютных концентраций для определения ЛЧ МБТ могут быть использованы альтернативные методы:

метод пропорций;

метод коэффициента устойчивости;

методы с использованием автоматизированных и полуавтоматизированных систем: BACTEC 460ТВ; BBL MGIT и BACTEC MGIT 960 (BD); MB/BacT (BacT/ ускоренный биохимический метод с использованием реактива Грисса;

прямой метод абсолютных концентраций.

12 Культуральные методы диагностики туберкулеза Из классических культуральных методов наиболее известны метод пропорций и метод коэффициента резистентности, которые позволяют установить, какая часть микобактериальной популяции в процентном отношении является устойчивой к данному препарату.

исследование лекарственной чувствительности микобактерий методом пропорций В отличие от непрямого метода абсолютных концентраций при исследовании ЛЧ микобактерий методом пропорций микобактериальную суспензию готовят, исходя не из 5 мг/мл, а 1 мг/мл полувлажного веса культуры.

Метод приготовления суспензии тот же, что и для метода абсолютных концентраций. Приготовленную микобактериальную суспензию разводят до концентрации и 106 и высевают суспензию в двух разведениях по 0,2 мл на пробирки с контрольной питательной средой Левенштейна–Йенсена и с противотуберкулезными препаратами.

Культура микобактерий считается устойчивой, если на среде с ПТП первого ряда вырастает более 1% КОЕ по сравнению с количеством КОЕ на контрольной питательной среде (критерий устойчивости). Критерием устойчивости для препаратов второго ряда является 10% содержание устойчивых бактерий в исследуемой популяции.

Метод пропорций более трудозатратный по сравнению с методом абсолютных концентраций. Кроме того, манипуляции с разведением микобактериальной суспензии повышают риск внутрилабораторного инфицирования персонала.

исследование лекарственной чувствительности микобактерий методом коэффициента резистентности Сущность метода заключается в определении минимальной ингибирующей концентрации (МИК) противотуберкулезных препаратов для клинических штаммов микобактерий и соотношения МИК тех же препаратов для заведомо чувствительного лабораторного штамма микобактерий (как правило, H37Rv). Это самый трудозатратный и дорогостоящий метод, так как требует использования большого количества пробирок с питательной средой, поэтому он применяется в основном для научных исследований.

2.7.7. ускоренный метод определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза с помощью реактива грисса Краткая характеристика метода Существенным недостатком определения ЛЧ МБТ методом абсолютных концентраций, который в настоящее время используется в большинстве бактериологических лабораторий противотуберкулезных учреждений России, являются длительные сроки исследования.

Использование жидких сред и автоматизированных систем позволяет заметно сократить сроки исследования ЛЧ МБТ, однако автоматические анализаторы и расходные материалы к ним являются дорогостоящими и для практических учреждений здравоохранения не всегда доступны.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы В ЦНИИТ РАМН был разработан ускоренный метод определения ЛЧ МБТ на плотных питательных средах, который позволяет сократить сроки получения результатов на среде Левенштейна–Йенсена до 8–12 суток за счет использования биохимической реакции, выявляющей ферментативную активность жизнеспособных микобактерий при отсутствии видимого роста культуры. Метод основан на определении нитратредуктазной активности микобактерий туберкулеза с помощью реактива Грисса.

При добавлении последнего в пробирку, где имеется рост микобактерий туберкулеза, происходит нитратредуктазная реакция, приводящая к изменению цвета реактива Грисса и питательной среды с конденсатом.

Предлагаемый метод является модификацией традиционного метода абсолютных концентраций и наряду с ним может быть рекомендован к применению во всех бактериологических лабораториях противотуберкулезных учреждений России. Ускоренный метод Грисса может использоваться выборочно, в частности для тех случаев, когда врачу необходимо срочно получить результаты ЛЧ МБТ (например, для больных с остропрогрессирующими формами туберкулеза).

Процент совпадения результатов при использовании традиционного и ускоренного методов определения ЛЧ МБТ составляет (по некоторым данным) 96,6%. Частота и спектр лекарственной устойчивости МБТ, определенные традиционным и ускоренным методами, не имеют достоверных различий. Таким образом, ускоренный метод определения ЛЧ МБТ является достаточно точным и не уступает по чувствительности традиционному методу абсолютных концентраций, обеспечивая полноценное определение спектра лекарственной устойчивости. Кроме того, использование предлагаемого ускоренного метода является экономически выгодным, поскольку позволяет сократить стоимость анализа, как по сравнению с традиционным методом абсолютных концентраций, так и, безусловно, с методами, использующими автоматизированные системы.

описание метода В основе метода лежит использование нитратредуктазной активности микобактерий туберкулеза в качестве критерия их роста на плотных яичных средах с небольшим количеством конденсата.

Культуры микобактерий туберкулеза, обладающие положительной нитратредуктазной активностью, характеризуются способностью редуцировать нитраты в нитриты. В качестве индикатора разложения нитрата калия или нитрата натрия используется стандартный реактив Грисса в виде 7,5% водного раствора. При закапывании реактива Грисса в пробирку, где имеется рост микобактерий туберкулеза, происходит его взаимодействие с образовавшимися нитритами, и поверхность среды и конденсат в пробирке окрашиваются в ржаво-красный цвет. Таким образом, использование биохимической реакции с реактивом Грисса позволяет зафиксировать размножение микобактерий туберкулеза при отсутствии видимого роста культуры.

Данный метод пригоден для определения ЛЧ микобактерий туберкулеза человеческого вида, имеющих в своем составе фермент нитратредуктазу. В связи с тем что микобактерии бычьего вида этим методом определить невозможно, в состав диагностического ряда, используемого для определения ЛЧ, включена пробирка с TCH (тиофен-2-карбоксил-гидразид) для дифференциации M. tuberculosis от M. bovis. Отсутствие роста на среде с ТСН и отрицательная нитратредуктазная реакция характеризуКультуральные методы диагностики туберкулеза ют штаммы M. bovis. Рост на среде с ТСН и положительная нитратредуктазная реакция позволяют идентифицировать микобактерии как M. tuberculosis.

Для определения ЛЧ МБТ ускоренным методом используется плотная яичная среда Левенштейна–Йенсена с добавлением нитрата калия или нитрата натрия в количестве 1 г на 1 литр готовой среды. Среду Левенштейна–Йенсена готовят в соответствии со стандартной прописью и способом приготовления. В готовую к свертыванию среду вносят нитрат калия или натрия из расчета 100 мг на 100 мл среды. Для повышения гарантии стерильности питательных сред указанное количество нитрата может быть введено в объеме 1 мл 10% раствора, предварительно прокипяченного 5 минут.

Комплект для определения ЛЧ МБТ ускоренным методом состоит из 2 контрольных пробирок, не содержащих препаратов, ряда пробирок с противотуберкулезными препаратами, а также одной пробирки с TCH и одной пробирки с салициловокислым натрием.

Для определения ЛЧ МБТ ускоренным методом в каждую из пробирок комплекта перед посевом вносят по 0,2–0,3 мл физиологического раствора или любой жидкой питательной среды (желательно после этого выдержать пробирки в течение суток в горизонтальном положении). Затем в каждую пробирку комплекта засевают по 0,2 мл стандартной суспензии клинического изолята микобактерий туберкулеза и помещают пробирки в термостат для инкубации.

Для ускоренного определения ЛЧ МБТ используют реактив Грисса в двух модификациях:

1) 7,5% раствор стандартного реактива Грисса, выпускаемого промышленно. Он представляет собой смесь 1-нафтиламина (-нафтиламина) (10 г) с сульфаниловой кислотой (100 г) и винной кислотой (890 г). 7,5% раствор реактива Грисса готовится на стерильной дистиллированной воде и может храниться в холодильнике, в посуде из темного стекла, до 2 недель.

2) Реактив Грисса готовят в лаборатории на основе 5-нормального раствора ледяной уксусной кислоты (143 мл ледяной уксусной кислоты довести дистиллированной водой до 500 мл). Далее приготовить растворы А и Б.

Раствор А: 2 г сульфаниловой кислоты растворить в 250 мл 5Н уксусной кислоты.

Раствор Б: 1,25 г 1-нафтиламина (-нафтиламина) растворить в 250 мл 5Н уксусной кислоты.

Растворы А и Б хранить в посуде из темного стекла в холодильнике 1 год (или до появления осадка). Перед употреблением растворы А и Б смешиваются в равных объемах. Полученный реактив Грисса используют сразу.

Ускоренное определение ЛЧ МБТ на плотной питательной среде Левенштейна– Йенсена проводят на 8–12-е сутки от момента посева.

В одну из контрольных пробирок от каждой выделенной культуры закапывают с помощью медицинской капельницы 2–3 капли 7,5% раствора Грисса. При появлении в контрольной пробирке в течение последующих 1–3 минут красного или ржаво-красного окрашивания поверхности среды и конденсата, а также изменении цвета реактива в пробирке от слабо-красного (розоватого) до ржаво-красного, реактив Грисса закапывают в опытные пробирки с препаратами и салициловокислым натрием и учитывают результат нитратредуктазной реакции по окрашиванию поверхности среды и жидкости.

При наличии роста микобактерий туберкулеза в пробирке с препаратом происходит изменение окраски среды и реактива, которая варьирует от малинового до бурого. При отсутствии роста микобактерий туберкулеза реактив Грисса не меняет цвет, а поверхность среды приобретает ярко-синий цвет или слабо-фиолетовое окрашивание либо не меняет окраски (рис. 38).

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Микобактерии считаются устойчивыми к испытуемому препарату, если интенсивность окрашивания реактива и среды в пробирке с препаратом соответствует интенсивности окраски в контрольной пробирке. Если среда и реактив в пробирке с препаратом не меняют окраски либо имеют слабо-розовое окрашивание, то микобактерии считаются чувствительными к данному препарату. В качестве отрицательного контроля для микобактерий туберкулеза служит пробирка с салициловокислым натрием. В качестве положительного контроля для микобактерий туберкулеза служит пробирка с ТСН, которая окрашивается так же, как и контрольная, не содержащая препаратов.

INH RIF SM EMB

Штамм МБТ, устойчивый ко всем препаратам Штамм МБТ, чувствительный ко всем препаратам Штамм МБТ, устойчивый к RIF Рис. 38 Тестирование ЛЧ МБТ с помощью реактива Грисса Если на 8–12-й день от момента посева (первое тестирование) в контрольной пробирке отсутствует реакция с раствором Грисса, то проводят повторное закапывание реактива во вторую контрольную пробирку еще через 5 дней культивирования от момента первого тестирования. При повторной отрицательной реакции в контрольной пробирке определение ЛУ МБТ проводят обычным методом (по видимому росту) в установленные сроки.

Отсутствие нитратредуктазной активности у некоторых исследуемых культур может объясняться их замедленными ростовыми свойствами и низкой нитратредуктазной активностью, которая определяется только при повторном тестировании (на 13– 17-е сутки от момента посева культуры).

16 Культуральные методы диагностики туберкулеза В процессе определения ЛУ МБТ ускоренным методом проводят также первичную идентификацию выделенных культур. Для дифференциации микобактерий туберкулеза человеческого и бычьего видов от других микобактерий используется среда с салициловокислым натрием. Среда с этим препаратом ингибирует рост M. tuberculosis и M. bovis. Наличие роста на этой среде характерно для атипичных (нетуберкулезных) микобактерий. Для дифференциации M. tuberculosis от M. bovis используют комбинированную среду с ТСН и нитратом калия или нитратом натрия. M. tuberculosis в отличие от M. bovis растет на среде с ТСН. Кроме того, присутствие в среде нитрата позволяет с помощью реактива Грисса провести определение нитратредуктазной активности, свойственной M. tuberculosis, но не M. bovis.

Использование предлагаемого метода определения ЛЧ МБТ позволяет приблизительно в 2,5 раза сократить сроки получения результатов. Ускоренный метод прост в выполнении, не требует дополнительных сред и дорогостоящих реактивов, доступен для любой микробиологической лаборатории и сокращает время проведения анализа до 8–12 суток вместо 21–28 суток, как при использовании традиционного метода абсолютных концентраций, что позволяет врачу своевременно назначить рациональный режим химиотерапии. Кроме того, параллельно, предлагаемый метод позволяет провести первичную идентификацию между микобактериями человеческого и бычьего видов и атипичными (нетуберкулезными) микобактериями.

2.7.8. исследование лекарственной чувствительности микобактерий прямым методом абсолютных концентраций Основным недостатком традиционных культуральных методов определения ЛЧ МБТ, таких, как непрямой метод абсолютных концентраций и альтернативные методы (пропорций и коэффициента устойчивости), является их чрезвычайная длительность. Результаты исследования ЛЧ выросшей культуры МБТ учитываются через 3– 4 недели инкубации в термостате, поэтому необходимая коррекция химиотерапии может быть проведена в лучшем случае лишь через 2–2,5 месяца от момента поступления в лабораторию диагностического материала.

Для ускорения исследований может быть использован прямой метод абсолют­ ных концентраций. При постановке данного метода производится прямой посев осадка обработанного детергентами диагностического материала одновременно на контрольную питательную среду и среды с соответствующими противотуберкулезными препаратами. Параллельно производится посев материала на стандартные питательные среды (с целью получения культуры для постановки традиционного непрямого метода абсолютных концентраций).

Культура микобактерий считается устойчивой, как при непрямом методе абсолютных концентраций, если на среде с ПТП вырастает 20 и более колоний.

Преимущества данного метода заключаются в сокращении времени проведения исследования, расходных материалов (в два раза) и трудозатрат.

Однако прямой метод абсолютных концентраций может быть использован только для исследования бактериоскопически положительного материала с массивностью бактериовыделения не менее ++. В этом случае повышается риск контаминации.

Кроме того, следует учитывать, что при этом методе производится недозированный посев, что может затруднить интерпретацию результатов. Поэтому в ряде случаев специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы полученные результаты могут оказаться недостоверными. В сомнительных случаях рекомендуется повторить исследование лекарственной чувствительности со штаммом микобактерий, выделенным от больного.

Метод носит предварительный характер и увеличивает стоимость исследования ЛЧ МБТ в целом.

2.7.9. Контроль качества исследования лекарственной чувствительности микобактерий Для обеспечения достоверности получаемых результатов необходимо проводить контроль качества выполняемых лабораторией тестов по исследованию лекарственной чувствительности микобактерий.

Внутрилабораторный контроль качества сред для определения лЧ методом абсолютных концентраций Необходимо проверять качество каждой партии сред для определения лекарственной чувствительности микобактерий.

С этой целью каждая партия вновь приготовленной питательной среды должна быть проверена на стерильность (инкубация в термостате).

Также для каждой партии среды при тестировании ЛЧ клинических образцов необходимо одновременно провести тест на чувствительность стандартного штамма M. tuberculosis H37Rv ко всем исследуемым противотуберкулезным препаратам. Если среда с препаратами приготовлена правильно, то контрольная культура не должна расти при тех концентрациях препаратов, при которых не растут чувствительные к данному препарату штаммы. Появление роста контрольного штамма в пробирке с препаратом указывает на то, что при приготовлении среды с препаратом была допущена ошибка, или на то, что неправильно приготовлена бактериальная суспензия.

Для более полной оценки качества сред рекомендуется при постановке тестов на ЛЧ для клинических изолятов наряду с тестированием стандартного чувствительного штамма провести тест на чувствительность со стандартными штаммами, устойчивыми к тем препаратам, к которым должна быть установлена чувствительность клинических образцов.

При отсутствии в лаборатории стандартных (коллекционных) штаммов лаборатория может использовать выделенные от пациентов штаммы, которые в многократных исследованиях подтверждают свою чувствительность и/или устойчивость.

Регистрация результатов ВЛК каждой партии сред должна производиться в журнале приготовления сред.

Внутрилабораторный контроль качества включает в себя также регулярную проверку используемого лабораторного оборудования – АСПС, термостатов, рН-метра, автоматических дозаторов, стандартов мутности и др.

Внешняя оценка качества Внешняя оценка качества исследований ЛЧ обеспечивается внешней лабораторией, которая, например, является членом супранациональной лабораторной сети.

18 Культуральные методы диагностики туберкулеза В РФ, начиная с 2005 г., в рамках Федеральной системы внешней оценки качества совместно с супранациональными лабораториями ВОЗ проводится независимая оценка качества исследований ЛЧ с использованием наборов контрольных образцов (международные панели из 20 тест-штаммов для профессионального тестирования).

2.8. регистрация бактериологических исследований и их результатов В отличие от исследований методом прямой микроскопии при регистрации бак­ териологических исследований каждому исследованию диагностического материа­ ла присваивается индивидуальный номер.

Все поступившие в лабораторию образцы (за исключением выбракованных) должны быть зарегистрированы в Журнале регистрации исследований. Исследованию поступившего образца должен быть присвоен лабораторный номер. Нумерация исследований должна начинаться в первый рабочий день года и продолжаться непрерывно в течение всего года. Регистрационный номер, присвоенный образцу, должен быть нанесен на контейнер с образцом и сопровождать его на всех этапах бактериологического исследования: на центрифужной пробирке, в которой образец центрифугируют после деконтаминации, на пробирках с ростовой средой, на предметных стеклах, на которые наносится материал для микроскопии перед посевом и для подтверждения принадлежности выросшей культуры к кислотоустойчивым бактериям (окраска по Цилю–Нильсену).

В Журнал регистрации исследований из направления вносятся данные о пациенте. Необходимо наиболее полно внести эти данные, поскольку лабораторный журнал может стать единственным источником данных о бациллярном больном туберкулезом. В некоторых лабораториях дополнительно ведется журнал выделенных культур, в который вносят все данные о пробах, из которых были выделены культуры микобактерий.

Данные о враче или медицинском учреждении необходимы для того, чтобы:

1) передать результаты исследования направившему материал врачу;

2) в случае выбраковки результатов (пророст, неудовлетворительная деконтаминация, прочее) сообщить о случившемся лечащему врачу и совместно принять решение о целесообразности повторного исследования.

В графе «Диагностический материал» указывается вид диагностического материала в соответствии с направлением.

В графе «Цель исследования» отмечают галочкой случаи ранее не леченных (н/л) и ранее леченных (р/л) больных в соответствии с отметкой в направлении. В случае контроля химиотерапии в соответствующих клетках формы (н/л или р/л) указывают регистрационный номер больного (из направления).

Данные о виде диагностического материала и целях исследования необходимы для проведения ретроспективного анализа эффективности работы лаборатории (см. раздел «Обеспечение качества исследований»).

В графе «Результат микроскопии» указывают результат микроскопии препаратов из диагностического материала (прямая микроскопия) или из осадка деконтаминированного материала после центрифугирования в соответствии с полуколичественучебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы ной градацией (см. раздел 3.7.1 учебного пособия «Выявление туберкулеза методом микроскопии» и раздел 5.3 учебного пособия «Люминесцентная микроскопия»).

В графе регистрации роста указывается интенсивность роста для каждой из использованных сред по полуколичественной шкале.

«Интенсивность роста»:

(2+) 21 – 100 КОЕ;

(3+) > 100 КОЕ.

В журнале необходимо также зарегистрировать время появления роста или, в случае отсутствия роста, даты выдачи заключения об этом. Прежде чем дать отрицательный результат, необходимо убедиться в отсутствии роста очень медленно растущих микобактерий после 10 недель культивирования.

В примере Журнала регистрации, приведенном выше (форма 1), журнал располагается на развороте страниц.

В некоторых лабораториях дополнительно ведется журнал выделенных культур, в который вносятся только те номера исследований, которые дали положительные результаты.

Если лаборатория сама не проводит видовую идентификацию и исследования лекарственной чувствительности выделенных культур, а пересылает их в лабораторию более высокого уровня, результаты исследования этой лаборатории должны быть внесены в графу «Комментарии» с указанием лаборатории, выдавшей результаты исследований.

Исследования лекарственной чувствительности и результаты видовой идентификации выделенных культур регистрируются в специальном журнале (форма 2). Нумерация исследований в этом журнале ведется с начала каждого календарного года непрерывно.

Порядковый номер регистрации исследования из Журнала регистрации исследований лекарственной чувствительности наносится на пробирки для определения лекарственной чувствительности и/или для видовой идентификации. В журнал также вносится и регистрационный номер бактериологического исследования из Журнала регистрации бактериологических исследований, для того чтобы установить соответствие между исследованием лекарственной чувствительности и/или видовой идентификации и образца от пациента.

В случае если лаборатория получает культуры, выделенные в других лабораториях, в журнал вносится регистрационный номер культуры, присвоенный ей выделившей ее лабораторией, с индексом, позволяющим однозначно идентифицировать лабораторию, направившую культуру для исследования.

Для однозначного определения пациента, из диагностического материала которого выделена исследуемая культура, целесообразно переписать из Журнала регистрации бактериологических исследований в Журнал регистрации исследований лекарственной чувствительности его фамилию, имя, отчество и адрес.

В соответствующие графы лаборатория вносит название применяющихся для дифференциации методов. В журнале регистрации исследования лекарственной чувствительности должны быть приведены названия противотуберкулезных препаратов и их концентрации, к которой определяется чувствительность выделенной культуры. В ячейках, соответствующих исследуемой культуре и препарату, указывают количество колоний, выросших на пробирке с препаратом. Интенсивность роста в соответствии с полуколичественной шкалой указывают в графе «Контроль».

140 Культуральные методы диагностики туберкулеза В лабораториях третьего уровня дополнительно целесообразно вести Журнал регистрации нетуберкулезных микобактерий.

На каждого пациента, из диагностического материала которого выделены культуры микобактерий, в лаборатории должна быть заведена карточка (форма 3), в которой помимо паспортных данных и данных о заболевании бактериовыделителя регистрируются результаты всех бактериологических исследований (в том числе и отрицательных при контроле химиотерапии), проведенных в течение его лечения.

В эту форму также вносятся результаты исследования лекарственной чувствительности и видовой идентификации выделенных культур. В графе «Лекарственная чувствительность» указывают спектр выявленной устойчивости, обозначенный латинскими буквами: H – изониазид, R – рифампицин, E – этамбутол, S – стрептомицин, Kn – канамицин, Et – этионамид, Cs – циклосерин, Cp – капреомицин, Ofl – офлоксацин. Культура считается устойчивой, если она устойчива к критической концентрации препарата. Например, спектр устойчивости культуры, устойчивой к 1 мкг/мл изониазида, 40 мкг/мл рифампицина, 2 мкг/мл этамбутола и 10 мкг/мл стрептомицина, должен быть обозначен как HRES. В случае если штамм чувствителен ко всем исследованным препаратам в критической концентрации, он определяется как чувствительный. В графе «Лекарственная чувствительность» отмечается «чувств».

Результаты исследования переносятся из журналов регистрации исследований в форму для представления результатов в клинику. Бактериологическое исследование включает в себя несколько исследований: бактериоскопическое, посев, определение видовой принадлежности, исследование лекарственной чувствительности выделенной культуры. Эти исследования выполняются последовательно и различаются по своей продолжительности, что создает определенные трудности в их регистрации и оформлении их результатов. В медицинском управлении ФСИН была разработана и в течение нескольких лет успешно применяется форма отчета о результатах исследований, которая учитывает последовательное выполнение различных видов исследования (форма 4).

В наиболее короткие сроки после получения диагностического материала возможно получить результаты микроскопического исследования. Форма результата микроскопического исследования расположена с нижнего края формы направления, что позволяет вырезать ее после заполнения и передать в клинику. При этом направление с оставшимися формами отчета о результатах остается в лаборатории, что дает возможность дополнительного контроля за своевременностью выдачи результатов дальнейших видов бактериологических исследований. Следующим по очередности следует исследование методом посева. Его результаты, включающие предварительную идентификацию (позволяющую утверждать, что выделенная культура относится к КУМ и сходна с МБ туберкулезного комплекса), вносятся в форму при обнаружении роста в пробах, засеянных диагностическим материалом, и рассматриваются как предварительный результат. Оценка представляется в соответствии с полуколичественной шкалой интенсивности роста. Заполненный талон вырезается из формы направления и передается в клинику. Аналогичным образом заполняется и направляется в соответствующее клиническое подразделение и оставшаяся форма отчета о результатах дальнейших исследований (таких, как видовая идентификация и определение ЛЧ).

На оборотной стороне формы приведен список диагностических материалов с кодовыми номерами, которые указываются в направлении в пункте «Диагностический материал» (см. раздел 2.1).

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Для выдачи результатов видовой идентификации и исследования лекарственной чувствительности целесообразно использовать дополнительную форму (форма 5).

Какую бы форму представления результатов ни выбрала лаборатория, она должна быть утверждена администрацией медучреждения, представлена в Руководстве по качеству лаборатории. В отчете должны содержаться сведения, представленные в форме 5. Результаты должны быть представлены в соответствии с Приложением Приказа № 109 МЗ РФ и соответствовать зарегистрированным в лабораторном журнале исследований.

Результаты исследования не выдаются на руки пациенту, а передаются в направившее материал на исследование медучреждение или лечащему врачу. Сроки выдачи результатов: микроскопия (из осадка) – 2 рабочих дня, посев – 2–10 недель, лекарственная чувствительность – в соответствии с применяемым методом исследования. Сроки выдачи результатов должны быть утверждены и указаны в Руководстве по обеспечению качества каждой лаборатории.

В заключение отметим, что в современной специализированной бактериологической лаборатории противотуберкулезного учреждения необходимо наличие компьютерной базы данных.

В настоящее время в большинстве лабораторий России используются бумажные носители. Однако большой объем регистрации образцов (включая информацию о пациенте) и результатов исследования, а также необходимость составлять статистические отчеты, представляют собой рутинную, требующую много времени работу, в ходе которой возможны ошибки. Поэтому наряду с бумажными носителями в лаборатории должна быть компьютерная система и база данных. Преимущества компьютерной системы очевидны: упрощение работы и исключение ошибок; сортировка данных; учет результатов исследования; возможность получения информации о предыдущих результатах исследования для каждого пациента; легкое, быстрое и аккуратное составление годовых отчетов; контроль за уровнем доступа к информации и ее изменением.

1. Перечислите регистрационные формы, которые должны быть в лабораториях разного уровня.

2. Внесите данные на пациента Иванова Михаила Николаевича, 52 лет, проживающего по адресу: Новосадская ул., д. 7 кв. 25. Образец мокроты поступил 30 января 2007 г. Результат люминесцентной микроскопии – 5 КУМ в 100 п.з. Результат посева: 5 февраля, 3+. Каких данных не хватает в задании для правильной регистраВопросы и задания ции образца для исследования? Какие комментарии вы можете сделать по приведенным данным? Какие дополнительные исследования вы можете рекомендовать?

3. Заполните направление на культуральное исследование на пациента Сидорову Наталью Петровну, 35 лет, проживающую по адресу: Садовая, д. 6, кв. 17; образец мокроты, начало лечения – декабрь 2007 года. Дата сбора материала – март 2008 г.

Какие данные дополнительно вам требуются для заполнения направления?

4. Из диагностического материала на среде Левенштейна–Йенсена 26 ноября 2006 г.

выросло 25 колоний, на среде Финна-II – 95 колоний. Внесите эти данные в журнал регистрации исследований и в форму выдачи ответа. Можете ли вы выдать ответ о выявлении МБТ? Каких данных вам для этого не хватает?

142 Культуральные методы диагностики туберкулеза Форма Лабораторный журнал регистрации анализов Год _ (баклаборатория противотуберкулезной службы) Лабораторный журнал регистрации анализов (форма 1), страница 2.

Цель исследования Диагнос- Контроль * н/с – новый случай – ранее не леченный пациент ** р/л – ранее леченный пациент специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Культуральные методы диагностики туберкулеза Адрес Тип больного: «впервые выявленный (новый случай)» «Рецидив» «Лечение после неэфф. курса химиотерапии» «Лечение после прерывания курса химиотерапии» «Переведенный» «Прочие»

Форма тб лабораторная форма направление на проведение анализа (для бактериологических лабораторий) Название лечебного учреждения: Фамилия И.О. больного: _ Год рождения: _ Пол: м/ж Адрес (полностью): _ Район: _ Классификация заболевания: Легочный Внелегочный _ Причины проведения анализа: Диагностика _ Контроль химиотерапии _ Категория пациента: _ новый случай _ ранее лечившийся Лабораторный номер образца: _ Районный рег. номер больного _ Вид анализа: бактериоскопия посев Дата сбора материала Подпись лечащего врача ---------------------------------------- линия отрыва ---------------------------------------Результат микробиологического Результат микробиологического (люминесцентный метод) Диагностика _Контр/х Диагностика _Контр/х Новый случай _Р/леченный Новый случай _Р/леченный Результат _ Результат _ Дата «»_200 г. Дата «»_200 г.

Подпись Подпись специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Форма тб лабораторная форма результатов видовой идентификации и лекарственной чувствительности (для бактериологических лабораторий) Определение лекарственной чувствительности МБТ Лабораторный номер исследования Материал Дата Название лечебного учреждения: Фамилия И.О. больного: _ Год рождения: Пол: м/ж Адрес (полностью):_ Район: Классификация заболевания: Легочный Внелегочный_ Причины проведения анализа: Диагностика _ Контр. химиотерапии _ Категория пациента: _ новый случай _ ранее лечившийся Выделена культура _ (указать вид культуры или комплекс микобактерий туберкулеза – МБТ) Препараты (мкг/мл):

Стрептомицин Дата «»_200 г. Подпись 146 Культуральные методы диагностики туберкулеза 2.9. Планирование работы бактериологической лаборатории.

расчет потребностей лаборатории в расходных материалах и реагентах Планирование работы лаборатории Планирование работы лаборатории должно обеспечить ее бесперебойную работу.

Это относится как к расходным материалам и реактивам, так и к нагрузке на персонал, плановому обслуживанию приборов и оборудования и их списанию.

Руководитель лаборатории в начале года должен составить расписание возможных перерывов в проведении исследований, соответственно планируя поступление материалов для исследования и отпусков сотрудников.

Объем и номенклатура проводимых исследований должны соответствовать количеству и специальной подготовке персонала. Оснащение лаборатории также должно отвечать спектру и количеству проводимых в ней исследований.

Оборудование При планировании закупок оборудования лаборатория должна исходить из номенклатуры и объема проводимых ею исследований. Необходимо помнить, что оборудование подвержено износу и подлежит списанию в соответствии с указаниями производителя. Износ и старение оборудования происходит и в тех случаях, когда оно не используется, а хранится на складе. Например, через 10 лет износ даже неиспользовавшегося микроскопа достигнет 100%, и потребуется его замена.

Расходные материалы и реактивы При планировании использования расходных материалов необходимо в первую очередь использовать реактивы с истекающими сроками годности. При планировании закупок необходимо избегать закупки избыточного количества реактивов и расходных материалов: закупки должны производиться в соответствии с рассчитанной прогнозируемой потребностью.

расчет необходимого запаса реактивов Расход материалов на 1 исследование представлен в таблице 7. При расчете заказа сухих реактивов на 1 год исходят из количества проведенных исследований в прошедшем полугодии и необходимости дополнительного полугодового запаса, уменьшенного на остаток реактивов на складе. Такие расчеты проводятся для реактивов и расходных материалов, подлежащих длительному хранению. В случае быстропортящихся материалов (например, яиц) необходимо наладить их регулярную поставку в течение года.

Пример. В лаборатории «А» в прошедшем году было проведено 25 000 посевов.

На следующий год лаборатория должна заказать 25 кг трехзамещенного фосфата натрия, а с учетом полугодового запаса – 37,5 кг. Однако на складе еще хранится 10 кг этого реактива. Значит, лаборатория должна заказать 27,5 кг этой соли.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Культуральные методы диагностики туберкулеза ** Расчет приведен на количество препарата со 100% активностью. Примеры расчетов с учетом истинной активности антибактериального препарата (чисспециалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Составьте график поставки в лабораторию яиц на I квартал, если она производит поЗадача сев 150 образцов диагностических материалов на 2 пробирки яичной среды еженедельно.

В прошедшем году лаборатория провела 15 000 посевов диагностических материаЗадача лов на пробирки со средами Левенштейна–Йенсена и Финна-II каждый. Какое количество глицерина должна закупить лаборатория на следующий год, если на складе у нее хранится 1500 мл этого реактива?

На 1 февраля 2007 года на складе лаборатории хранится 5 г стрептомицина с активностью 75% и сроком годности до июня 2008; рифампицина – 10 г с активностью Задача 99% и сроком годности до июня 2008; этамбутола – 500 мг с активностью 80% и сроком годности до 1 января 2010 г. Сделайте заключение о рациональности проведенных закупок реактивов в этой лаборатории, если она проводит 1000 исследований лекарственной чувствительности в год.

150 Культуральные методы диагностики туберкулеза 3.1. автоматические и полуавтоматические анализаторы Необходимость внедрения новых методов современной и качественной культуральной диагностики туберкулеза очевидна, поскольку использование традиционных методик не всегда позволяет получить своевременные, информативные и надежные результаты.

Основным недостатком классического метода выделения микобактерий на плотных средах является его продолжительность. Сокращение сроков культивирования микобактерий с сохранением или увеличением чувствительности и специфичности метода является основным направлением развития культуральной диагностики туберкулеза.

К настоящему времени микобактериологическая лаборатория прошла несколько этапов по пути сокращения сроков культуральной диагностики туберкулеза, начиная с практического использования в 80-х годах прошлого столетия принципиально нового радиометрического метода выявления роста и определения лекарственной чувствительности микобактерий с помощью системы ВАСТЕС 460, разработанной компанией Becton Dickinson (BD).

Известно, что жидкие среды, или бульоны, обеспечивают более быстрое получение результата по сравнению с плотными. Фаза логарифмического роста популяции микобактерий достигается уже к 5–10-му дню после инокуляции в бульон материала от больного туберкулезом. В то же время применение жидких сред осложняется трудоемким процессом собственно детекции размножения микобактерий, а также высоким уровнем их контаминации другими микроорганизмами.

Эволюция методов культивирования микобактерий в жидких средах происходила в направлении разработки относительно дешевого и технически доступного метода быстрой детекции, осуществимого с наибольшей степенью биозащиты персонала.

В 1977 г. G. Middlebrook описал способ радиометрической детекции роста микобактерий в селективной жидкой среде, что положило начало созданию наиболее распространенных и комерчески доступных систем бульонного культивирования:

BACTEC 460 (BD), BBL Septi-Chek AFB (BD), BBL MGIT (BD), BACTEC MGIT 960 (BD), MB/BacT (Organon Teknika) и ВасТ/Аlert 3D (BioMerioux).

Полуавтоматическая система BACTEC 460 (рис. 39) для выращивания и идентификации микобактерий использует жидкую среду Middlebrook 7Н12. Рост микобактерий в ней определяется путем регистрации уровня меченого СО2, который образуется в процессе микробной утилизации субстрата с пальмитиновой кислотой, содержащей радиоактивный 14С. Внедрение BACTEC 460 позволило сократить сроки выявления возбудителя туберкулеза до 14 дней, а также проводить быструю идентификацию комплекса M. tuberculosis и определять лекарственную чувствительность микобактерий.

В индустриально развитых странах система BACTEC 460 получила широкое распространение и стала своеобразным референс-методом для вновь создаваемых систем бульонного культивирования. Золотым диагностическим стандартом для пракучебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Рис. 39 Первая полуавтоматическая система BACTEC тических лабораторий является сочетание подобной системы с плотными средами, что позволяет добиться лучших результатов как по срокам, так и по эффективности культурального выявления микобактерий.

Отражением этого принципа является разработанная в дальнейшем, оригинальная и достаточно простая мануальная двухфазная система BBL Septi-Chek AFB, объединяющая в единое целое флакон с жидкой средой и косяки плотных сред.

Помимо жидкой фазы, бульона Middlebrook 7H9, в системе BBL Septi-Chek AFB присутствуют три плотные среды: неселективный агар Middlebrook 7H11, яичная среда Левенштейна–Йенсена и шоколадный агар, которые формируют плотную фазу в атмосфере, обогащенной СО2. Посевной материал инокулируют в бульон, заполняющий флакон в нижней части системы. Ежедневно вручную флакон переворачивают, чтобы бульон омывал косяки. Помимо микобактерий на средах данной системы могут расти и другие микроорганизмы. Скорость роста микобактерий туберкулеза (МБТ) на Septi-Chek AFB выше, чем на изолированной плотной среде, но несколько ниже, чем на системе ВАСТЕС 460.

При очевидных достоинствах радиометрическая система BACTEC 460 имеет ряд недостатков – таких, как полуавтоматический мониторинг роста культуры, значительная трудоемкость операций, работа с радиоизотопами и необходимость утилизации радиоактивных отходов. Для их преодоления была предложена более совершенная технология флуоресцентной регистрации роста микроорганизмов, которая легла в основу разработки мануальной (неавтоматизированной) системы BBL MGIT (BD), появившейся в лабораториях с 1994 года.

Пробирка MGIT (Mycobacteria Growth Indicator Tube), кроме 4 мл модифицированной среды Middlebrook 7Н9, содержит в придонной части под силиконом флуоресцентный индикатор – Трис 4,7-дифенил-1,10-фенантролин рутениум хлорид пенКультуральные методы диагностики туберкулеза тагидрат, «погашенный» высокими концентрациями кислорода (рис. 24, а). В процессе потребления растущими клетками растворенного в среде О2 индикатор начинает светиться в лучах источника ультрафиолетового облучения (рис. 40). Увеличение микробной популяции сопровождается усилением свечения, интенсивность которого можно оценить при помощи трансиллюминатора или портативного светоизмерительного прибора Micromgit.

Относительно недорогая и компактная система BBL MGIT, предназначенная для быстрой культуральной диагностики микобактериозов и определения чувствительности микобактерий к лекарственным препаратам, может быть использована в качестве экспресс-метода, при полевых испытаниях, в условиях ограниченных ресурсов. В дальнейшем описанный принцип флуоресцентной детекции роста был использован при разработке полностью автоматизированной системы бульонного культивирования микобактерий BACTEC MGIT 960 (BD), которая, являясь наиболее совершенной среди существующих аналогичных систем, широко распространена в лабораториях всего мира.

Одна из коммерчески доступных автоматизированных систем MB/BacT была запатентована голландской фирмой Organon Teknika в 1995 г. на базе Флуоресценция пробирок MGIT Рис. BacT/ALERT – системы для автоматического тестирования био- и гемокультур.

Для определения роста микобактерий в системе MB/BacT используется технология колориметрического СО2-детектирования. Уникальные MB/BacT-флаконы со штрихкодом содержат придонный сенсор, изменение цвета которого наблюдается при закислении среды вследствие микробного метаболизма, что регистрируется компьютером, который анализирует и интерпретирует данные.

Система MB/BacT состоит из нескольких инкубаторно-детекторных модулей (до 9), управляемых одним компьютером. Вместимость одного MB/BacT-модуля составляет 240 или 120 пробирок. Культуральный флакон MB/BacT, так же, как пробирка MGIT, содержит бульон Middlebrook 7Н9, который перед посевом диагностического материала обогащают питательными веществами, антиоксидантами и альбумином, связывающим токсины, которые образуются в процессе роста микроорганизмов. Для подавления контаминирующей микрофлоры, аналогично системам MGIT, использующим смесь бактериостатических препаратов PANTA, в бульон добавляют раствор, содержащий полимиксин, амфотерицин, налидиксовую кислоту, триметоприм, азлоциллин. Особенностью MB/BacT-флакона является закрепленная резиновая пробка, через которую иглой со шприцем инокулируют посевной материал, что, по-видимому, также позволяет предохранять жидкую среду от контаминации. После внесения исследуемого образца флаконы помещают в инкубаторно-детекторные блоки. Когда в 1 мл среды количество колониеобразующих единиц начинает превыучебное пособие для проведения базового курса обучения специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы шать 106, звуковой сигнал, сопровождающийся появлением информации на дисплее, указывает на завершение исследования.

В подавляющем большинстве случаев положительный результат, свидетельствующий о росте МБТ, регистрируется системой в течение 2–3 недель. При отрицательном результате удаление флаконов из инкубатора производят через 42 дня.

Другим более совершенным представителем вышеописанного семейства является система нового поколения BacT/ALERT 3D, которую представляет компания BioMerieux (рис. 41). Помимо выявления роста микобактерий система предназначена также для определения бактерий и грибов в гемокультурах.

Прибор состоит из контрольного модуля, под управлением которого могут находиться до 6 инкубационных модулей, рассчитанных на 60, 120 или 240 ячеек для процессорных флаконов. Инкубационный модуль состоит из выдвижных секций, имеющих по три блока на 20 ячеек каждый. При включении шейкера для стимуляции роста модуль работает в режиме получения гемокультуры. При отключении шейкера и использовании специальных программных алгоритмов для медленно растущих микроорганизмов модуль работает в режиме культивирования микобактерий. В системе BacT/ALERT 3D для получения бульонной культуры микобактерий применяют процессорные флаконы со средой Middlebrook 7Н9, такие же, как в системе МВ/ВасТ.

Значительным шагом в развитии ускоренных методов культурального выявления микобактерий стала инновационная система BACTEC MGIT 960 (BD), появившаяся в лабораториях в середине 90-х годов прошлого столетия. Она представляет собой Рис. 41 Автоматическая система BacT/ALERT 3D 154 Культуральные методы диагностики туберкулеза полностью автоматизированный комплекс для одновременной инкубации и мониторинга 960 пробирок (рис. 42). Прибор BACTEC 960 предназначен для исследования в течение года примерно 8000 образцов диагностического материала. Культивирование микобактерий осуществляется в индикаторной пробирке MGIT, содержащей 7 мл модифицированной среды Middlebrook 7H9. Данная система позволяет выявлять в клинических образцах большинство штаммов МБТ в течение 10–20 дней и определять лекарственную чувствительность культуры возбудителя в период, не превышающий двух недель.

Следует подчеркнуть, что BACTEC MGIT 960 является единственной полностью автоматизированной системой для определения лекарственной чувствительности микобактерий, которая обеспечивает ускоренное тестирование культуры ко всем препаратам первого ряда, в том числе и к пиразинамиду (рис. 43).

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Как показали многочисленные испытания, внедрение диагностической цепочки, включающей, помимо традиционных плотных сред, систему ВАСТЕС MGIT 960, вдвое сокращает время получения культуры и определения лекарственной чувствительности микобактерий, увеличивает частоту обнаружения возбудителя в олигобактериальном материале от больных туберкулезом, а также повышает точность и воспроизводимость результатов микробиологического исследования.

Подробное описание культурального метода диагностики туберкулеза с использованием автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 изложено в Приложении 5.

3.2. основные принципы культивирования микобактерий на жидких средах Учитывая существенные трудозатраты персонала при выполнении процедур исследования, а также достаточно высокую стоимость расходных материалов, микробиологические исследования диагностического материала с использованием автоматизированных систем бульонного культивирования рекомендуется проводить в следующих случаях:

для дифференциальной диагностики туберкулеза;

впервые выявленным больным туберкулезом (не менее 1 раза до начала лечения или при поступлении в противотуберкулезное учреждение);

больным с распространенным и остро прогрессирующим туберкулезным процессом;

при рецидивах туберкулеза;

при прочих обстоятельствах, требующих получения культуры микобактерий в кратчайшие сроки.

Материалом исследования могут служить респираторные образцы, в первую очередь мокрота, любые биологические жидкости, кроме крови и мочи, а также отделяемое ран, промывные воды желудка и ткани организма, полученные при хирургических вмешательствах. Условия сбора диагностического материала и его качество должны соответствовать существующим требованиям, поскольку преаналитический этап оказывает значительное влияние на результаты исследования. Наиболее удобной емкостью для сбора клинических образцов следует считать стерильную градуированную пробирку на 50,0 мл с завинчивающейся крышкой, препятствующей разбрызгиванию материала при открывании. Оптимальное количество жидкого диагностического материала должно составлять примерно 5,0 мл.

Успех культурального исследования с помощью анализаторов в значительной степени зависит от качества пробоподготовки диагностического образца. Перед инокуляцией в жидкие среды разжижение и деконтаминацию материала реко­ мендуется проводить с использованием NALC­NAOH (по методу Kubika) с последующим получением осадка в результате центрифугирования (при 3000 g в течение 15 минут). Этот метод позволяет преобразовать образец в сконцентрированную гомогенную взвесь, в которой практически уничтожена любая микрофлора, кроме микобактерий, сохранивших жизнеспособность. При такой обработке одним из факторов увеличения эффективности культурального (как и микроскопического) исследования является сохранение реакции среды, близкой к нейтральной (рН 6,8).

156 Культуральные методы диагностики туберкулеза Выявление микобактерий с использованием автоматизированной системы бульонного культивирования обязательно предполагает параллельный посев образца на плотную яичную среду. Инокуляцию диагностического материала в жидкую среду проводят одновременно с посевом на плотную яичную среду, что необходимо для возможно более полного удовлетворения питательных потребностей микобактерий, которые могут дать рост только на одной из сред. Этот принцип позволяет также избежать некоторых ошибок, связанных с техническими погрешностями, неверной интерпретацией роста в позитивной пробирке и т. д.

С целью подтверждения принадлежности культуры, выросшей на жидкой среде любого анализатора, к комплексу МБТ необходимо проводить бактериоскопию по Цилю–Нильсену и субкультивирование на плотной яичной среде содержимого по­ зитивной процессорной емкости. Использование ПЦР-анализа с целью дифференцировки комплекса МБТ и НТМБ при получении положительных результатов на автоматизированной системе может на 7 дней и более сократить время культуральной диагностики туберкулеза.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы методы молекулярно-генетической диагностики микобактерий туберкулеза. общая характеристика и место в цикле диагностических исследований Молекулярно-генетические методы основаны на применении полимеразной цепной реакции (ПЦР), получившей широкое распространение в диагностике различных инфекционных агентов, том числе M. tuberculosis.

Принцип метода ПЦР состоит в амплификации – многократном, в миллионы раз, умножении участков специфической последовательности ДНК M. tuberculosis в пробирочном микрообъеме при циклическом повторении следующих 3 стадий реакции, каждая из которых проходит в различном температурном режиме:

1­я стадия – изменение структуры ДНК (денатурация) при нагревании с расхождением ее цепей;

2­я стадия – связывание с денатурированной ДНК синтетических последовательностей нуклеотидов (праймеров или затравочных олигонуклеотидов), комплементарных к концевым участкам фрагмента ДНК, специфичного для M. tuberculosis (гибридизация);

3­я стадия – синтез или достройка цепи ограниченного по флангам фрагмента ДНК с помощью термостабильной ДНК-полимеразы.

Многократное, в течение 40–50 циклов, удвоение специфичных фрагментов ДНК приводит к увеличению их количества в геометрической прогрессии до уровня, детектируемого существующими методами. Результаты ПЦР оценивают как с помощью агарозного гельэлектрофореза, при котором оценивается размер образовавшегося фрагмента ДНК, в сопоставлении со стандартными фрагментами ДНК с известным числом пар нуклеотидов (по расстоянию пробега от старта в виде флуоресцирующей полосы), так и с помощью различных методов гибридизации продукта со специфическими комплементарными мечеными олигонуклеотидами – ДНКзондами.

В 1998 году была проведена полная расшифровка генома микобактерий туберкулеза. Это позволило выделить специфичные для генома микобактерий туберкулеза нуклеотидные последовательности ДНК, которые используются при ПЦР-выявлении МБТ в различных диагностических материалах в настоящее время.

В последнее время были разработаны коммерческие тест-системы (наборы реагентов) для выявления МБТ с использованием этих специфичных фрагментов ДНК. Некоторые из этих систем прошли государственные испытания и были зарегистрированы как в России, так и в других развитых странах.

Для подтверждения наличия микобактерий в диагностическом материале необходимо выделить ДНК микобактерий из клинического образца и затем провести ПЦР. Минимальное время, требующееся для проведения исследования, не превышает 2 часов.

Выявление возбудителя туберкулеза Применение ПЦР-анализа для быстрого обнаружения возбудителя туберкулеза в диагностических материалах и идентификации M. tuberculosis отражено и в Приказе Минздрава РФ № 109 2003 года.

158 Культуральные методы диагностики туберкулеза Наряду с высокой чувствительностью исследования при выявлении M. tuberculosis в клинических образцах (10–100 клеток в образце) ПЦР имеет важнейшее преимущество для клинической практики, заключающееся в краткосрочности (1–2 дня) проведения анализа.

Чувствительность ПЦР при исследовании образцов мокроты больных туберкулезом составляет в среднем около 80%, а специфичность – не менее 99%. Возможность получения ложноположительных результатов при использовании технологии ПЦР в диагностике туберкулеза обусловлена внутрилабораторной контаминацией, в связи с тем что продукты амплификации (фрагменты ДНК) могут, особенно при использовании гельэлектрофореза, попадать в исследуемые образцы и служить матрицей для новых реакций, которые приводят к ложноположительным результатам. Однако развитие ПЦР-технологий и появление метода ПЦР в реальном времени резко уменьшило эту вероятность. Метод ПЦР в реальном времени позволяет детектировать результаты реакции на мониторе компьютера одновременно с проведением реакции в системе одной закрытой пробирки, в связи с чем продукты реакции не попадают во внешнюю среду. При этом используют флуорогенные ДНК-зонды, гибридизация которых приводит к измеряемому уровню флуоресценции, пропорционально количеству продукта реакции. Таким образом, могут быть получены количественные данные о наличии M. tuberculosis в исследуемом клиническом образце.

Видовая идентификация микобактерий Метод ПЦР и метод ДНК-зондов могут быть использованы для быстрой видовой идентификации микобактерий. В частности, после получения положительного сигнала в ускоренных системах культивирования микобактерий типа BACTEC идентификация M. tuberculosis complex с помощью ПЦР может быть проведена в течение 3 часов. Применяемые в настоящее время тест-системы на основе ПЦР позволяют провести быстрое определение M. avium, и M. intracellulare и других медленно растущих видов микобактерий, имеющих клиническое значение, а также дифференцировать M. bovis (BCG) от вирулентных видов.

исследование лекарственной чувствительности Молекулярно-генетические методы на основе ПЦР-анализа используются и для быстрого определения лекарственной чувствительности МБТ. Разработанные методы позволяют определять лекарственную устойчивость пока в основном лишь в отношении рифампицина и изониазида. Это может быть проведено с помощью считывания (секвенирование) нуклеотидных последовательностей ДНК после амплификации в ПЦР участков хорошо изученных генов, ответственных за лекарственную чувствительность. Расшифровка специфических участков ДНК позволяет установить определенные точки мутаций, которые приводят к изменениям структуры рецептора лекарственного агента и потере лекарственной чувствительности микобактерий. Однако этот метод весьма дорог.

Для определения мутаций в генах, ответственных за лекарственную чувствительность, после проведения ПЦР используются различные методы, основанные на гибридизации амплифицированных участков с ДНК-зондами, комплементарных к мутантным последовательностям.

специалистов бактериологических лабораторий учреждений противотуберкулезной службы Хорошо апробирована известная коммерческая тест-система INNO-LIPA фирмы Innogenetics, Бельгия, для определения наиболее встречаемых мутаций к рифампицину, основанная на гибридизации продуктов ПЦР с зондами на нитроцеллюлозной мембране.

В России получил известность метод микробиочипов (зарегистрирован в РФ), основанный на этом принципе, но благодаря использованию большого числа коротких зондов, фиксированных в микрообъеме на поверхности предметного стекла, он позволяет выявить большее число точковых точечных мутаций, а результаты анализа оценивают с помощью компактного флуоресцентного микроскопа с компьютерным обеспечением. Метод был предложен для быстрого определения лекарственной устойчивости к рифампицину и изониазиду.

Наряду с очевидными преимуществами ПЦР-методы имеют недостатки, связанные с возможностью внутрилабораторной контаминации продуктами ПЦР, поскольку для проведения анализа требуют нескольких последовательных стадий.

При использовании метода «ПЦР в реальном времени» применяется набор флуоресцентно меченных праймеров, комплементарных к сайтам мутаций, ответственных за возникновение лекарственной устойчивости. При этом исследование может проводиться в одну стадию в режиме закрытых пробирок. Результаты анализируются с помощью компьютерной программы.

Необходимо отметить, что молекулярные методы определения лекарственной устойчивости МБТ весьма эффективны при исследовании культур МБТ, однако для исследования непосредственно клинического материала (образцов мокроты) результаты могут быть получены в основном при наличии значительного бактериовыделения, т. е. образцы должны быть положительными по мазку.

молекулярная эпидемиология туберкулеза Задачами молекулярной эпидемиологии возбудителя туберкулеза могут быть: определение региональных характеристик штаммов возбудителя туберкулеза с последующим изучением связей (общих черт) между региональными штаммами и возможным анализом переноса инфекции в данный регион; изучение микровспышки (случаев заболевания в группе контактировавших лиц) туберкулеза; изучение роли суперинфекции возбудителя туберкулеза для реактивации или рецидива заболевания;

определение возможности переноса инфекции в условиях фтизиатрического стационара; изучение роли переноса туберкулезной инфекции в распространении штаммов микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью.

Штаммовая, или внутривидовая, идентификация МБТ для эпидемиологического мониторинга, основанная на молекулярно-генетическом анализе, пока остается технологией научных исследований, однако ее практическое значение для контроля за туберкулезной инфекцией в конкретных регионах имеет очень большое значение уже в настоящее время.