БЕЛОРУССКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ФОНД

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ГРАНТ БРФФИ

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

К 60-летию кафедры генетики

ГЕНЕТИКА

И БИОТЕХНОЛОГИЯ

XXI ВЕКА.

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ

И ПРИКЛАДНЫЕ

АСПЕКТЫ

МАТЕРИАЛЫ

Международной научной конференции 3–6 декабря 2008 г., Минск Минск «Издательский центр БГУ»

УДК 575(063)+60(063) ББК 28.04я43+30.16я Г Редакционная коллегия:

Н.П. Максимова (ответственный редактор);

В. В. Гринев, С. С. Жардецкий, Ю. И. Кожуро, А. В. Лагодич Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты : материалы Г34 Междунар. науч. конф., 3–6 дек. 2008 г., Минск \ редкол.: Н.П. Максимова (отв. ред.) [и др.]. — Минск : Изд. центр БГУ, 2008. — 364 с.

ISBN 978-985-476-625-2.

В сборнике представлены материалы Международной научной конференцииенции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты» (3–6 декабря 2008 г., Минск, БГУ), посвященной 60-летию кафедры генетики биологического факультета БГУ. Тематика конференции охватывает актуальные вопросы и проблемы современной генетики и биотехнологии. В сборник включены материалы пленарных докладов, устных сообщений и постерной сессии.

Предусматривается широкая дискуссия о современном состоянии и перспективах развития генетики и биотехнологии, а также о методических аспектах преподавания предмета в высших учебных заведениях.

УДК 575(063)+60(063) ББК 28.04я43+30.16я ISBN 978-985-476-625- © БГУ,

КАФЕДРЕ ГЕНЕТИКИ 60 ЛЕТ

Кафедра генетики (первоначальное название – кафедра дарвинизма и генетики) была основана в 1947 году известным ученым-генетиком с мировым именем академиком АН Белоруссии А.Р. Жебраком. После отъезда А.Р. Жебрака в Москву заведование кафедрой взял на себя академик М.Е. Макушок (1949 – 1952), а затем кандидат сельскохозяйственных наук

И.А. Орловский (1952 – 1953). В тяжелое для отечественной науки время «лысенковщины» кафедра была временно объединена с кафедрой физиологии человека и животных под названием «Кафедра дарвинизма, генетики и ФЧЖ» (1953 – 1956).

Объединенную кафедру возглавил директор Института генетики и цитологии АН БССР, академик Н.В. Турбин – крупный ученый в области генетики растений, лауреат Государственной премии БССР. В начале 1957 года произошло разделение кафедры на самостоятельные структурные единицы, и академик Н.В. Турбин продолжил руководство одной из них – кафедрой дарвинизма и генетики до конца 1969 года. После него кафедру возглавляли – профессор А.В. Константинов – автор пяти учебников по цитологии, биологии индивидуального развития и эволюции (1969 – 1979), доцент В.С. Анохина (1979 – 1988), профессор Ю.К. Фомичев (1988 – 1993) – основатель школы молекулярной генетики в Беларуси, затем член-корр. НАН Беларуси О.Г. Давыденко (1993 – 1994). С 1995 года по настоящее время кафедрой генетики заведует доктор биологических наук, профессор Н.П. Максимова.

Научные подразделения на кафедре начали формироваться еще в 1963 году. Первую научную группу радиационной генетики возглавил профессор А.И. Ипатьев, которая в году была переименована в группу цитогенетики растений, а научное руководство ею было возложено на к.б.н. А.В. Константинова. В 1969 году группа вошла в общефакультетскую лабораторию – Проблемную НИЛ экспериментальной биологии. Исследования группы цитогенетики в новом составе продолжались под руководством профессора А.В. Константинова и были направлены на изучение генетических и цитологических механизмов развития растений и особенностей функционирования геномов у гибридных и мутантных форм растений. В 1975 году при кафедре начала работать вторая научная группа, основным направлением которой было изучение вопросов генетики и селекции безакколоидных форм люпина (руководитель – доцент В.С. Анохина, научный консультант – академик Н.В. Турбин). В 1977 году обе группы были объединены и на их основе создан Отдел цитогенетики растений, научное руководство которым в 1979 году было возложено на доцента В.С. Анохину. В период с 1977 по 1984 год Отдел входил в состав Проблемной НИЛ экспериментальной биологии, затем был вновь переведен на кафедру дарвинизма и генетики, переименован в НИЛ цитогенетики растений и в этом статусе лаборатория существует и сегодня.

В годы заведования кафедрой профессором Ю.К. Фомичевым на кафедре активизировались исследования молекулярно-генетического направления, в 1991 году при кафедре была создана НИЛ молекулярной генетики бактерий (зав. лабораторией – к.б.н.

Н.П. Максимова, научный руководитель – профессор Ю.К. Фомичев), которая образовалась из сектора биохимической генетики Проблемной НИЛ экспериментальной биологии.

Основным научным направлением лаборатории было изучение генетической регуляции метаболизма биологически активных соединений у важных в биотехнологическом отношении микроорганизмов. В 1997 году НИЛ молекулярной генетики была переведена на кафедру микробиологии и приобрела статус межкафедральной.

В настоящее время научные подразделения кафедры генетики представлены: НИЛ цитогенетики растений и 4-я отдельными научными группами – молекулярной генетики бактерий, клеточной и молекулярной биологии лейкозов, цитометрии и генетического мониторинга.

В составе кафедры 2 доктора наук, 4 кандидата наук и 2 преподавателя без степени.

Штат научных сотрудников в подразделениях представлен 11 единицами. В учебном процессе уже в течение многих лет принимают активное участие известные ученые, доктора и кандидаты наук ГНУ «Институт генетики и цитологии» НАН Беларуси – доктора и кандидаты наук. Учебный процесс обеспечивают 5 сотрудников учебно-вспомогательного персонала.

За кафедрой закреплено 7 общих курсов для студентов дневной формы обучения специальности «Биология» и «Биоэкология» и 3-х курсов для студентов заочной формы обучения:

• Цитология и гистология • Теория эволюции • Молекулярная биология гена • Селекция продуцентов • История биологии • Философские проблемы биологии (для философского факультета БГУ).

Преподаватели кафедры осуществляют чтение 12-и специальных курсов для студентов специальности «Биология» и «Биотехнология» дневного отделения, 4-х спецкурсов для заочного отделения и 2-х – для магистрантов.

Тематика специальных курсов, читаемых по кафедре генетики целиком отвечает специализации кафедры и соответствует нескольким направлениям:

классическая генетика и цитология (специальные курсы «Генетика человека», «Генетический анализ», «Патология клетки», «Частная генетика и селекция растений», «Прикладные аспекты генетики», «Современные аспекты биологии клетки»);

молекулярная генетика (спецкурсы «Молекулярная генетика», «Нехромосомная наследственность», «Непостоянство генома», «Современные аспекты генетического анализа», «Генетическая регуляция метаболизма про- и эукариот»);

биотехнология (спецкурсы «Биоинженерия растений и биобезопасность», «Генотерапия», «Введение в генотерапию»).

Высокий уровень образования на кафедре поддерживается внедрением современных технологий: учебно-методических комплексов, модульного обучения, рейтинговой системы оценки знаний студентов, компьютерные тестовые задания для контроля самостоятельной работы студентов в сетевой образовательной платформе e-UNIVERSITY, электронные версии курсов лекций и т.д. Большую помощь в практической подготовке студентов оказывают институты НАН Беларуси – ГНУ «Институт генетики и цитологии», ГНУ «Институт биоорганической химии», ГНУ «Центральный ботанический сад Национальной академии наук Беларуси», а также ряд Научно-исследовательских институтов и центров системы Минздрава Беларуси – РНПЦ гематологии и трансфузиологии, РНПЦ детской онкологии и гематологии, РНПЦ «Мать и дитя», где студент проходят производственную и преддипломную практику.

Обучение в аспирантуре осуществляется по специальности 03.00.15 – генетика, 03.00.26 – молекулярная генетика и 03.00.23 – биотехнология и предусматривает подготовку высококвалифицированных специалистов для учреждений соответствующего профиля Республики Беларусь. Из стен кафедры вышли 12 докторов наук 75 кандидатов наук, более 800 специалистов генетиков.

Развитие учебного процесса на кафедре тесно связано с разрабатываемыми научными направлениями:

• Изучение молекулярных механизмов синтеза биологически активных соединений ароматической природы у микроорганизмов, разработка подходов повышения их продуктивности генетическими методами, создание микробных продуцентов, пригодных для биотехнологического использования.

• Молекулярно-генетический анализ природных плазмид грамположительных и грамотрицательных бактерий: создание векторных систем для молекулярного клонирования и транспозонного мутагенеза.

• Частная генетика зернобобовых культур, гаметная селекция на устойчивость к стрессам, генетика алкалоидности, признаковая и генетическая коллекции люпина и молекулярные аспекты его эволюции.

• Естественные и искусственные микроРНК как триггеры РНК интерференции. Поиск и идентификация новых микроРНК с помощью компьютерного и экспериментального подходов. Гибридные гены как гены-мишени для искусственных микроРНК. Системы индуцибельной и конститутивной экспрессии генов искусственных микроРНК.

Лентивирусные системы доставки генов искусственных микроРНК в клетки человека.

• Цитометрия опухолевых клеток, изучение особенностей репарации ДНК при лейкозах.

• Программируемая клеточная гибель и окислительный стресс у растений.

Кафедра и научные подразделения ежегодно ведут исследования по 19-20 научным темам, включая задания фундаментальных и прикладных программ Республики Беларусь, ГКНТ, Международной программы INTAS.

Основными достижениями кафедры генетики в области фундаментальных наук являются следующие:

• Расшифрованы биохимические и генетические основы синтеза биологически активных соединений ароматической природы. Исследованы пути и механизмы генетической и биохимической регуляции синтеза первичных и вторичных метаболитов ароматической природы (аминокислот, пигментов, антибиотиков, ИУК) у ряда природных штаммов Pseudomonas, а также бактерий, способных утилизировать метилсодержащие соединения. Выявлены биосинтетические предшественники флуоресцирующего пигмента пиовердина, а также выявлена его высокая антиоксидантная и антимикробная активности.

Определены механизмы устойчивости бактерий к феназиновым антибиотикам.

• Впервые разработаны новые генетические подходы создания штаммов-продуцентов феназиновых антибиотиков, флуоресцирующего пигмента пиовердина, ароматических аминокислот бактерий, ИУК, АЦК-дезаминазы и других метаболитов и ферментов, перспективных в биотехнологическом отношении. Созданы штаммы-продуценты, пригодные для практического использования.

• Расшифрована генетическая организация внехромосомных элементов бактерий Pseudomonas и Bacillus, осуществлено создание на их основе векторов широкого круга хозяев. В ходе работы из природных штаммов бактерии рода Pseudomonas и Bacillus выделены плазмиды, характеризующиеся уникальной организацией систем инициации репликации. Установлены генетические детерминанты плазмидного и хромосомального происхождения, необходимые для наследования плазмид в клетках различных бактерий.

Плазмиды биодеградации и антибиотикорезистентности широкого круга хозяев бактерий Pseudomonas и новые криптические плазмиды семейства pBS72 бактерий Bacillus использованы для создания векторных систем для молекулярного клонирования и транспозонного мутагенеза в клетках грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также для создания эффективных штаммов-деструкторов полициклических ароматических углеводородов.

• Разработаны методы гаметной селекции растений на устойчивость к биотическим и абиотическим стрессам. Установлена роль различных генетических систем в формировании хозяйственно ценных признаков растений. Созданы новые ценные для сельского хозяйства безалкалоидных форм люпина желтого, которые в настоящее время проходят испытания в производственных условиях. Изучен генетический контроль признака алкалоидности этой культуры и разработаны теоретические подходы получения новых ценных для сельского хозяйства форм. Создана генетическая коллекция двух видов люпина, которая может быть использована в качестве исходного материала для разного рода селекционных работ.

• Создана тест-система для оценки функциональной активности РНК интерференции в клетках человека. Разработан новый метод конструирования генов, кодирующих искусственные микроРНК. Разработан алгоритм компьютерного поиска и идентификации новых кандидатур интронных микроРНК человека.

• Впервые обнаружен эффект стимуляции процессов репарации двойных разрывов ДНК в устойчивых к химиотерапии лейкозных клетках под влиянием противоопухолевого препарата цисплатин.

• Изучены особенности программируемой клеточной гибели у растений, индуцируемой гербицидами, нарушающими цитоскелет клеток.

За период с 2003 г. по 2007 г. опубликовано 281 научных работ, из них 172 статьи, 108 тезисов докладов.

Помимо фундаментальных работ кафедра ведет активную инновационную работу. К наиболее значимым прикладным разработкам можно отнести следующие:

• Препарат БАКТОГЕН на основе бактерий Bacillus subtilis КМБУ-30043 – высокоэффективный экологически безопасный биопрепарат для защиты растений от бактериозов и грибных инфекций внедрен в производство на РУП “Гидролизный завод” (г. Бобруйск) (удостоверение № 08-33-0.134650) и РУП «Новополоцкий завод белкововитаминных концентратов» (удостоверение № 08-33-0.240804). В 2006 году разработка «Бактоген» получила диплом на Международном салоне инновационных разработок в г. Москва.

• Препарат БАКТОФИЛ – на основе ризосферных бактерий Pseudomonas putida активен в отношении бактериозов, грибных инфекций и нематод. Является стимулятором роста растений. Не патогенен для растений, животных и человека, не фитотоксичен, хорошо сохраняется в ризосфере растений и в почве.

• Препарат АУРИН - биопестицид на основе генетически модифицированных ризосферных бактерий Pseudomonas aurantiaca. Обладает мощным стимулирующим рост растений действием. По активности превосходит все известные биопестициды. Препарат «Аурин» разрабатывается в рамках инновационного проекта Министерства образования Беларуси, по итогам участия в Международном салоне инновационных разработок в г. Москва в 2008 году препарат АУРИН награжден бронзовой медалью.

• Новые формы люпина, включенные в коллекцию ВИР им. Н.И. Вавилова.

Кафедра поддерживает контакты со многими научными учреждениями НАН Беларуси, России, Латвии, Англии, Германии.

Основной задачей кафедры генетики является подготовка высоквалифицированных биологов и биотехнологов, в совершенстве владеющих фундаментальными генетическими и биотехнологическими знаниями. Кафедра готовит специалистов для научноисследовательских лабораторий и институтов Беларуси, наукоемкого биотехнологического производства и педагогического процесса.

БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

БЕЛОРУССКИЙ РЕСПУБЛИКАНСКИЙ ФОНД ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ

ИССЛЕДОВАНИЙ

ГЕНЕТИКА И БИОТЕХНОЛОГИЯ

XXI ВЕКА

ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ

Председатель оргкомитета:

Зам. председателя оргкомитета:

Члены оргкомитета:

МОЛЕКУЛЯРНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНА uox

Южный федеральный университет, Ростов-на-Дону, Россия Кодирующие макромолекулы эволюционируют с разными скоростями. Наибольшую консервативность проявляют гены и белки «домашнего хозяйства» контролирующие основные и наиболее древние жизненные функции и процессы, которые идентичны или генетически подобны у многих форм жизни. Одним из таких древних метаболических путей является процесс катаболизма пуринов. Ключевой фермент пуринового метаболизма уриказа (uox), катализирует превращение мочевой кислоты в аллантоин. Аллантоин и мочевая кислота являются одними из важных звеньев «неферментативной части»

антиоксидантной системы, обеспечивающих адаптацию к воздействию разнообразных факторов [1, 2,]. Мочевая кислота, превращается под действием уриказы в аллантоин, который способен выполнять роль тушителя свободных радикалов как часть общей антиоксидантной системы. Помимо этого, экспериментально была показана высокая антимутагенная активность аллантоина [2]. Тем не менее, при интерпретации данных по антиоксидантной активности аллантоина у человека необходимо учитывать то, что мочевая кислота также обладает определенной антиоксидантной активностью. При этом нужно учесть, что урат является основным катаболитом азотсодержащих соединений у высших приматов. В связи с чем, целью данной работы было исследование антиоксидантного потенциала аллантоина и мочевой кислоты при помощи апробированной нами ранее методологии и анализ свойств и закономерностей в последовательности ДНК гена uox на молекулярно – генетическом уровне.

В ходе анализа были выявлены 12 консервативных регионов гена уриказы, которые практически неизменны у всех исследованных позвоночных, включая как несинонимичные, так и синонимичные мутации.

Данные регионы могут, как входить в состав активного центра, так и быть ответственными за формирование пространственной структуры. Присутствие таких консервативных участков может свидетельствовать о давление отбора направленного как на активный, так и на псевдо ген uox в случае высших приматов. Была предсказана вторичная структура аминокислотной последовательности уриказы. В результате структурного анализа выборки последовательностей, обнаружен детерминизм распределения локально упорядоченных жестких сегментов полипептидной цепи – альфа-спиралей и бета-тяжей.

Однако на протяжении длительной эволюции приматов ген uox сохранял функциональность и только у гоминид произошло превращение гена в псевдоген. В этой связи возникает вопрос, достаточно ли прошло времени, чтобы за счёт случайно фиксированных мутаций нарушились все поддерживающиеся до этого времени консервативные мотивы и предсказанная вторичная структура белка. Расстояние между геном мыши и человека замен, а расстояние между геном мыши и мартышек – 25. То есть в гене uox Н. sapience «сверхнормативно» фиксированных мутаций на общую длину 915 н.п., или 2.6 %. Можно предположить, что 2.6 % перечисленных замен локализуются в вариабельных областях по случайным причинам. С этой целью путём моделирования было внесено случайным образом по 24 мутации в последовательность функционального гена uox M. mulatta. На полученных таким образом 50 последовательностях, было проверено насколько нарушаются консервативные мотивы и предсказанная вторичная структура. Консервативные регионы, неизменные у всех исследованных позвоночных с активным геном uox, сохраняют эту тенденцию и у Н. sapience, где частота мутирования составляет 0.0 %. Частота мутирования этих участков в модельных последовательностях от 22 % до 46 %. То есть, в среднем вероятность возникновения случайной замены составляет 35.5 % для каждого консервативного региона, что на высоком уровне значимости (P = 0.001) отличается от последовательности Н. sapience. Следовательно, с высокой вероятностью можно судить, что разница между распределением мутаций носит не случайный, а систематический характер.

Анализируемые последовательности гена uox по значениям генетических дистанций образуют два крупных кластера, первый из которых состоит из последовательностей ДНК характерных для млекопитающих, а второй – для земноводных. Генетические дистанции между Xenopus tropicalis и млекопитающими находятся в пределах от 0.456 до 0.475, где минимально значение относится к Sus scrofa, а максимальное к M. musculus. Типы гена uox приматов по генетическим дистанциям вначале образуют 2 группы, разделяющие обезьян Нового и Старого света. Дистанция между Aotus trivirgatus и Н. sapience ровняется 0.054.

Наибольшее различие с приматами Нового света наблюдается для вида Gorilla gorilla (0.058), следующим идёт Hylobates lar и P. troglodytes (0.053). В общем, кластер, объединяющий Hominoidea, отличается боле высокими генетическими дистанциями в отношение Aotus trivirgatus, тогда как для кластера Cercopithecidae они снижены и приобретают наименьшее значение у Papio hamadryas (0.041). Генетические дистанции в группе приматов не превышают расстояние между близкими видами M. мusculus и Rattus norvegicus.

Результаты влияния урата и аллантоина на индуцированный перекисью водорода SOSответ клеток E. coli показали, что урат, также как и аллантоин, проявляет антимутагенную активность практически, во всех вариантах опыта. Максимальная активность регистрируется для концентрации 10-3 М. Максимальная активность регистрируется для аллантоина в концентрации 10-4 М. В отличие от урата, его активность сохраняется и при его малых концентрациях – 10-10 - 10-11М. Максимальное значение антимутагенной активности аллантоина превышает аналогичный показатель для урата в 1,37 раза.

Данные по СУА аллантоина и мочевой кислоты показывают, что для аллантоина увеличение концентрации не приводит к достоверному росту СУА, тогда как для урата обнаружена явная зависимость эффекта от дозы. Максимум супероксидустраняющей активности проявляет урат в концентрации 10-5М. Это указывает на значительную роль мочевой кислоты в качестве клеточного протектора от активных форм кислорода, таких как супероксид-анион.

Мочевая кислота, как показано выше, является эффективным тушителем гидроксильных и супероксид радикалов. С повышением концентрации урата, вследствие Uox- мутаций [3], связывают увеличение продолжительности жизни у человека и снижение уровня возрастных раковых заболеваний [1]. С другой стороны, в результате атаки мочевой кислоты свободными радикалами образуется аллантоин, обладающий свойствами антиоксиданта, антимутагена и витамина [2]. Таким образом, неферментативная генерация аллантоина у видов, потерявших уриказную активность, может отражать развитие адаптационной составляющей окислительного стресса. В организме существует целый ряд взаимосвязанных антиоксидантных систем, основная роль которых заключается в поддержании гомеостаза клеток и тканей при действии экстремальных факторов, обладающих прооксидантными свойствами. Низкомолекулярные антимутагены - это лишь часть системы защиты от ДНК-тропных воздействий. Но эта часть отражает эволюционное развитие метаболизма, сложившегося в аэробных условиях и несущего определенную антиокислительную нагрузку. Полученные в этой работе данные дают материал для рациональной оценки места урата и аллантоина в системе антиоксидантной защиты.

Совокупность таких антиоксидантов, как мочевая кислота и аллантоин, вносит вклад в общий антиоксидантный пул метаболизма, величина которого имеет важнейшее адаптивное значение.

1. Ames B.N.,Cathcart R., Schwiers E., Hochstein P. Uric acid provides an antioxidant defense in humans against oxidant- and radical-caused aging and cancer: a hypothesis // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1981. – vol. 11, - P.

6858-6862.

2. Гуськов Е.П., Клецкий М.Е., Корниенко И.В., Олехнович Л.П., Чистяков В.А., Шкурат Т.П., Прокофьев В.Н., Жданов Ю.А. Аллантоин как тушитель свободных радикалов // ДАН, серия Биохимия, Биофизика – М. Т. 383, № 2. -с.105-107.

3. Oda M., Satta Y., Takenaka O., Takahata N. Loss of urate oxidase activity in hominoids and its evolutionary implications // Molecular Biology and Evolution.- 2002.- vol. 19,- P. 640-653.

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ

УЛЬТРАФИОЛЕТА ДИАПАЗОНА UV-A

Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь Генотоксические и цитотоксические эффекты солнечного света исследуются уже давно.

Известно, что его ультрафиолетовый компонент вызывает повреждения ДНК и активирует репарационные системы клетки. Ввиду того, что ультрафиолет с длиной волны 280-320 нм (диапазон UV-B) поглощается азотистыми основаниями, вызывая, главным образом, образование димеров тимина, он рассматривается как более опасный для клеток, чем ультрафиолет с длиной волны 320-400 нм (диапазон UV-A), который прямо на ДНК не влияет [1].

Однако, в последнее время было показано, что облучение клеток ультрафиолетом диапазона UV-A также вызывает значительные повреждения ДНК, но не прямо, а индуцируя образование активных форм кислорода. Поэтому ультрафиолет диапазона UV-A может провоцировать нестабильность генома и, соответственно, активность систем быстрой репарации ДНК [2]. Недавно стало известно, что непосредственно после облучения ультрафиолетом диапазона UV-A в культуре кератиноцитов наблюдается резкий всплеск количества одинарных и двойных разрывов ДНК, которые затем репарируются [3].

Целью нашего исследования было проверить эффект быстрого повреждения ДНК непосредственно после облучения клеток ультрафиолетом диапазона UV-A и установить, в какой степени разрывы ДНК могут отразиться на структуре хроматина клеточного ядра.

Исследование проводилось на перевиваемой культуре клеток К562, которые облучали ультрафиолетом с длиной волны 365 нм. Энергетическая светимость источника 5 мВт/см2, высота источника над панелью с клетками - 20 мм. Экспозиция составляла 30, 60, 90 и секунд, контролем служили необлученные клетки. Уровень разрывов ДНК определяли методом comet assay. Для оценки структуры хроматина клетки окрашивали акридиновым оранжевым в концентрации 5 мкг/мл, фотографировали с помощью микроскопа Eclipse 50i фирмы Никон (объектив Plan Fluor 60/0.85, телекамера DS-5M), а затем измеряли размеры, яркость и текстурные параметры клеточных ядер.

Использованный нами щелочной вариант comet assay позволяет оценить суммарный уровень одинарных и двойных разрывов ДНК в клетках. Полученные результаты показывают, что после облучения ультрафиолетовым светом с длиной волны 365 нм в клетках культуры К562 наблюдается экспоненциальный рост количества разрывов ДНК пропорционально времени облучения (рис. 1).

У облученных клеток изменяется по сравнению с контролем ряд параметров клеточного ядра: уменьшаются размеры, увеличивается интегральная яркость, снижаются текстурные параметры “Shade” и “Promenance”, которые характеризуют тонкую структуру хроматина.

Однако эти изменения не коррелируют с полученной клетками дозой ультрафиолета.

Таким образом, ультрафиолет диапазона UV-A действительно непосредственно после облучения клеток, причем степень повреждения пропорциональна полученной дозе.

Одновременно наблюдаются также изменения структуры хроматина клеточного ядра, однако они, повидимому, в исследованных пределах не зависят от дозы. Эти наблюдения предположить, что возникающий под действием ультрафиолетового света диапазона UV-A окислительный стресс инициирует как разрывы ДНК, так и нарушения в структуре хроматина, но Рис. Зависимость количества разрывов ДНК в клетках эти процессы идут независимо друг от К562 от экспозиции ультрафиолетовым светом (длина друга.

1. J. Cadet, M. Berger, T. Douki, B. Morin, S. Raoul, J.L. Ravanat, S. Spinelli. Effects of UV and visible radiation on DNA-final base damage // Biol. Chem. –1997. – V. 378. –P. 275–1286.

2. R.P. Phillipson, S.E. Tobi, J.A. Morris, T.J. McMillan. UV-A induces persistent genomic instability in human keratinocytes through an oxidative stress mechanism // Free Radic. Biol. Med. – 2002. – V. 32. –P. 474–480.

3. N. Morley, A. Rapp, H. Dittmar, L. Salter, D. Gould, K.O. Greulich, A. Curnow. UVA-induced apoptosis studied by the new apo/necro-Comet-assay which distinguishes viable, apoptotic and necrotic cells // Mutagenesis. – 2006. – V. 21, №2. – P. 105–114.

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ

В КЛЕТКАХ ERWINIA CAROTOVORA ПРИ ПЕРЕХОДЕ В

«НЕКУЛЬТИВИРУЕМОЕ» СОСТОЯНИЕ

Ю.В. Гоголев, В.Ю. Горшков, О.Е. Петрова, Н.Е. Мухаметшина, А.Г. Даминова, Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН, Разнообразие клеточных форм неспорообразующих бактерий, механизмы их образования и выживания в природных экосистемах остаются мало изученными. Тем не менее, принято считать, что именно образование адаптированных форм со сниженной метаболической и пролиферативной активностью, определяет высокую устойчивость микроорганизмов к неблагоприятным факторам [1]. Для широкого круга бактерий, в основном патогенов теплокровных, показана возможность образования жизнеспособных, но «некультивируемых» клеток (ЖННК), обладающих способностью восстанавливать метаболическую активность, а также патогенный потенциал [2]. Покоящиеся формы фитопатогенных бактерий описаны лишь для нескольких видов. Их образование, как правило, связывают с воздействием тяжелых металлов [3]. В тоже время, подверженность данной экологической группы микроорганизмов сезонным циклам предполагает наличие у них чередования физиологических программ, включающих стадию конститутивного покоя.

Нами установлено, что при длительном культивировании (более 100 суток) фитопатогенной бактерии E. carotovora как на безуглеродной, так и на полноценной питательной среде клетки микроорганизмов теряли способность образовывать колонии на твердых питательных средах. Потеря пролиферативной активности существенно ускорялась при введении в культуральную жидкость синтетического аналога аутоиндуктора анабиоза С12-АОБ в концентрации 4 10-4 М (рис. 1). В тоже время, при помощи флуоресцентных красителей было показано, что до 90% клеток длительно инкубируемых культур E. carotovora с нулевыми значениями КОЕ сохраняли интактность мембран, что может свидетельствовать о сохранении ими способности к реверсии метаболической и пролиферативной активности.

Рис. 1. Динамика изменения численности клеток, выявляемая по титрам КОЕ (1; 3) и геномных копий (2; 4), в культурах E. carotovora, инкубированных в минеральной среде АВ (1; 2) и LB-бульоне (3; 4) в присутствии С12-АОБ в концентрации 410-4 М. Стрелкой указано время проведения процедуры «оживления».

Электронно-микроскопические исследования выявили существенные отличия клеток длительно инкубируемых в безуглеродной среде АВ от вегетативных клеток стационарной фазы роста. Так, вегетативные клетки характеризовались палочковидной формой, размерами 0.7 2.0 мкм, хорошо выявляемой наружной и цитоплазматической мембраной, электронноплотной цитоплазмой с мелкогранулярной текстурой, в которой нуклеоид распределен равномерно (рис. 2 А).

Рис. 2. Микрофотографии срезов клеток E. carotovora: А – вегетативные клетки, Б – клетки, инкубированные на безуглеродной среде АВ в течение 150 сут. НМ – наружная мембрана; ПП – периплазматическое пространство; ЦПМ – цитоплазматическая мембрана; Ц- цитоплазма; Н – нуклеоид.

В культурах, лимитированных по углероду, большинство клеток обладало сферической формой, диаметром меньшим 0.7 мкм, выявляемым электронно-плотным наружным и нижележащем обширным электронно-прозрачным слоями клеточной оболочки, цитоплазмой с крупногранулярной текстурой, в которой нуклеоид плохо выявлялся. Для части клеток характерны признаки плазмолиза, что, по-видимому, связано с их дегидратацией (рис. 2 Б).

Безусловным доказательством жизнеспособности некультивируемых клеток является восстановление их пролиферативной активности («оживление»). Воспроизводимые результаты были получены при двукратной отмывке некультивируемых клеток в среде АВ, которая восстанавливала колониеобразующую способность опытных культур от 0,5 % до 10 % от исходной (рис. 1). Поскольку среда АВ не поддерживала роста бактерий, появление такого значительного титра КОЕ культур может быть связано с восстановлением пролиферативной активности покоящихся клеток, а не ростом остаточного количества клеток, сохранивших пролиферативную активность.

Переход клеток E. carotovora в некультивируемое состояние сопровождался изменением нуклеинового обмена бактерий. Разработанная нами тестовая система для количественной детекции клеток E. carotovora на основе ПЦР в реальном времени, не позволяла обнаруживать ДНК в лизатах некультивируемых клеток при стандартных способах пробоподготовки (рис. 1). При этом нам также не удавалось выделить тотальную ДНК из некультивируемых клеток при помощи стандатного метода фенольной экстракции. Повидимому, изменение ультраструктуры клеток (утолщение клеточной стенки и периплазматического пространства) затрудняло лизис клеток и высвобождение нуклеиновых кислот при использовании детергентов и термической обработки. Более эффективным оказалось механическое воздействие на клетки (лизирование с применением френч-пресса). Однако для восстановления способности полученной матричной ДНК к амплификации требовалась дополнительная очистка с применением фенольной экстракции.

Это свидетельствует о накоплении в некультивируемых клетках ингибиторов ферментов нуклеинового обмена, инактивирующих процессы репликации и транскрипции и обеспечивающих сохранность генетического материала на фоне сниженной метаболической активности. Важно отметить, что вслед за восстановлением пролиферативной активности некультивируемых клеток, доступность ДНК-мишеней для ПЦР в лизатах «оживленных»

клеток восстанавливалась. Постановка воспроизводимых реакций в этом варианте не требовала специальных приемов для разрушения клеток и методов дополнительной очистки матричной ДНК (рис. 1).

Таким образом, впервые показана способность E. carotovora к переживанию условий неблагоприятных для роста посредством спонтанной и индуцированной индукторами анабиоза трансформации клеток бактерий в ЖННК. При этом лимитирование субстрата не является критическим фактором. Реализация данной физиологической программы, связанной с угнетением процессов роста и деления клеток и, вероятно, способствующей повышению устойчивости популяции микроорганизмов, обеспечивается изменениями нуклеинового обмена, отражающимися на эффективности ПЦР-тестов по общепринятым методикам. В результате этого, использование некоторых диагностических подходов с применением ПЦР для детекции некультивируемых микроорганизмов может приводить к неоднозначным результатам и является актуальной темой для обсуждения.

1. Rоszak D.B., Colwell R.R. Survival strategies of bacteria in the natural environment // Microbiol. Rev. 1987. V. 51.

№ 3. Р. 365-379.

2. Oliver, J. D. The viable but nonculturable state in bacteria // J. Microbiol. 2005. V. 43. P. 93-100.

3. Ordax M, Marco-Noales E, Lpez MM, Biosca EG. Survival strategy of Erwinia amylovora against copper:

induction of the viable-but-nonculturable state // Appl. Environ. Microbiol. 2006. V. 72. № 5. Р. 3482-3488.

ЗАВИСИМОСТЬ МЕЖДУ ФУНКЦИНИРОВАНИЕМ

АППАРАТА ДЕЛЕНИЯ КЛЕТОК И РАЗВИТИЕМ РЕАКЦИИ

ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У БЕЛОРУССКИХ СОРТОВ ЯЧМЕНЯ

Ю.И. Кожуро, Е.А. Семенчик, Н.П. Максимова Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь В последние годы стремительно развиваются исследования сигнальных систем клеток растений, которые участвуют в формировании адаптационного синдрома (стресса), вызванного действием факторов различной природы [1]. Вместе с тем, с сигнальной сетью связаны компоненты цитоскелета, изменения в функционировании которого приводят к активации защитных механизмов клеток [2]. Несмотря на интерес к этой проблеме, практически не изучены ответные реакции растительных клеток на целый ряд веществ, воздействующих на такие специфические клеточные мишени как генетический аппарат и цитоскелет. Тем не менее, такого рода исследования имеют практическое значение, так как вещества, индуцирующие нарушения цитоскелета и процесса деления клеток, используются в сельском хозяйстве в качестве гербицидов.

При патологических состояниях растительных клеток часто происходит накопление тех или иных активных форм кислорода (АФК). Полученные данные показывают, что устойчивость растительных организмов к разнообразным воздействиям во многом определяется состоянием систем детоксикации АФК [3]. Выяснение этих особенностей для конкретных растительных форм является основанием для проведения поиска и получения, устойчивых к действию гербицидов форм сельскохозяйственных растений.

В связи с выше сказанным изучена зависимость между степенью нормального функционирования микротрубочек цитоскелета и развитием реакции окислительного стресса у растений ячменя Hordeum vulgare L. сортов «Гонар», «Дзивосны», «Атаман» и «Сталы». Дестабилизацию микротрубочек цитоскелета индуцировали гербицидом трефланом (2,6-динитро-4-(трифторметил)-N,N-дипропиланилин). Степень дестабилизации цитоскелета оценивали с помощью цитогенетического анализа по количеству многоядерных интерфазных клеток и клеток с микроядрами, возникающих в зоне деления корня, а реакцию окислительного стресса – по изменению пероксидазной активности и концентрации восстановленной формы глутатиона в клетках растений.

Анализ динамики появления многоядерных клеток при обработке ячменя сорта «Гонар»

трефланом в концентрации 0,1 мг/л показал, что у двухдневных проростков их количество не превышает контрольного значения (0,20±0,20 %), а у трех- и четырехдневных проростков возрастает до 3,00±0,76 % и 6,77±1,12 % соответственно (рис. 1 А).

При обработке растений гербицидом в концентрации 1,0 мг/л более 1/3 всех клеток содержат нарушения. Аналогичные результаты получены при обработке трефланом растений сортов «Дзивосны» и «Атаман».

У растений ячменя сорта «Сталы» микротрубочки цитоскелета повреждались в значительно меньшей степени, чем у растений выше указанных сортов (рис. 1 Б). Об этом свидетельствует появление меньшего количества клеток с нарушениями генетического аппарата. Так, при обработке растений трефланом в концентрации 0,1 мг/л появления таких клеток не наблюдалось. У двухдневных проростков обработанных трефланом в концентрации 1,0 мг/л 18,40±1,73 % клеток содержат подобные нарушения, а в последующие сроки фиксации количество клеток с нарушениями хроматина постепенно снижалось, и у трех- и четырехдневных проростков составляло 6,80±1,13 % и 3,40±0,81 % соответственно. У растений, не подвергавшихся обработке трефланом, количество аберрантных клеток в разные сроки фиксации не превышало 0,20±0,20 %.

Рис. 1. Динамика появления многоядерных клеток в зоне роста корней растений ячменя сортов «Гонар» (А) и «Сталы» (Б) после обработки трефланом.

Нарушение стабильности микротрубочек цитоскелета сопровождалось развитием реакции окислительного стресса. Об этом свидетельствует анализ пероксидазной активности в клетках корней растений (рис. 2). Показано, что трефлан индуцирует увеличение активности ферментов пероксидазного комплекса у растений ячменя сортов «Гонар», «Дзивосны» и «Атаман» более чем в 2 раза. Следует отметить, что у обработанных гербицидом растений ячменя сорта «Сталы» увеличения пероксидазной активности не наблюдалось.

Активность пероксидазы, % Рис. 2. Пероксидазная активность в клетках корней растений ячменя сортов «Гонар» (А) и «Сталы» (Б) после обработки трефланом.

Известно, что устойчивость растений к неблагоприятным внешним воздействиям коррелирует с уровнем глутатиона – низкомолекулярного тиолового соединения [4]. Нами показано, что в условиях индуцированного окислительного стресса значительного изменения уровня восстановленной формы глутатиона у проростков изученных сортов растений не наблюдается. Однако, концентрация восстановленной формы глутатиона у различных сортов варьировала в значительной степени: у растений сорта «Сталы» более чем в 3 раза превышала таковой показатель для сорта «Дзивосны», и в 1,5-2 раза – сортов «Атаман» и «Гонар».

Индуцируемые трефланом изменения числа клеток с нарушениями хроматина, увеличение пероксидазной активности, а также количество восстановленной формы глутатиона в клетках исследуемых сортов ячменя коррелировали со степенью ингибирования ростовых процессов. Динамика роста корневой системы ячменя в присутствии трефлана при концентрации 0,1 мг/л свидетельствует о более сильном фитотоксическом действии гербицида на растения сортов «Гонар» и «Дзивосны». В меньшей степени гербицид при концентрации 0,1 мг/л угнетал рост корневой системы проростков ячменя сортов «Сталы» и «Атаман». Сильный ростугнетающий эффект, который проявляется у растений всех изученных сортов при концентрации трефлана 1,0 мг/л не позволяет выявить дифференциальной чувствительности к гербициду.

Таким образом, гербицид трефлан, индуцирует реакцию окислительного стресса у ячменя, что связано с нарушением полимеризации микротрубочек цитоскелета. Растения ячменя сорта «Сталы» обладают меньшей чувствительностью к гербицидному препарату трефлану. Об этом свидетельствуют меньшая степень повреждений микротрубочек цитоскелета, отсутствие индукции пероксидазной активности и более высокий уровень глутатиона в клетках.

Установлено, что маркерами устойчивости различных форм ячменя к воздействию гербицидов, как неблагоприятного фактора внешней среды, могут служить не только биохимические (степень индукции ферментов пероксидазного комплекса, количество восстановленного глутатиона в клетках растений), но и цитогенетические (количество клеток с нарушениями генетического аппарата) критерии. Полученные результаты могут являться основой для разработки подходов направленной селекции устойчивых к действию гербицидов сельскохозяйственных растений.

1. Signal transduction networks and the biology of plant cells / M.J. Chrispeels [et al.] // Biol. Res. 1999. Vol. 32, № 1. P. 35–60.

2. Papakonstanti E.A., Vardaki E.A., Stournaras C. Actin cytoskeleton: a signaling sensor in cell volume regulation // Cell Physiol. Biochem. 2000. Vol. 10, № 5/6. P. 257–264.

3. Alscher R.G., Donahue J.L., Cramer C.L. Reactive oxygen species and antioxidants: relationships in green cells // Physiol. Plant. 1997. Vol. 100, № 2. P. 224–233.

4. Vanacker H., Carver T.L.W., Foyer C.H. Pathogen-induced changes in the antioxidant status of the apoplast in barley leaves // Plant Physiol. 1998. Vol. 117. P. 1103–1114.

DspE-ЗАВИСИМАЯ СИСТЕМНАЯ ИНДУКЦИЯ PR-ГЕНОВ РАСТЕНИЙ

SOLANUM LYCOPERSICUM ПРИ КОНТАКТЕ

С БАКТЕРИЯМИ PECTOBACTERIUM CAROTOVORUM

Е.А. Николайчик, О.К. Присяжненко, Л.Н. Валентович, В.Д. Поликсенова Белорусский государственный университет, Минск, Беларусь Белок DspE фитопатогена Pectobacterium carotovorum (Pca) был охарактеризован нами недавно как основной индуктор реакции гиперчувствительности (РГ) этими бактериями у устойчивых растений [1]. В отличие от других продуцируемых бактериями Pca белковых элиситоров РГ (например, харпинов HrpN и HrpW) белок DspE неспособен индуцировать РГ при контакте с поверхностью клеток растений, а должен быть доставлен (при помощи системы секреции III типа) непосредственно внутрь растительной клетки [1, 2, 3]. Многие данные указывают на важную роль DspE в процессе колонизации растения бактериальным патогеном, однако до сих пор информация о молекулярном механизме действия этого белка внутри растительной клетки отсутствует.

Целью настоящей работы было исследование участия DspE в индукции системного защитного ответа растений, сопровождающего развитие РГ при контакте с бактериями Pca.

Растения томата Solanum lycopersicum не являются естественным хозяином для бактерий Pca, поэтому такое взаимодействие является несовместимым (заметны только симптомы РГ в месте контакта с патогеном, заболевание не развивается).

В работе были использованы шестинедельные растения S. lycopersicum с тремя настоящими листьями, а также бактерии вирулентного белорусского штамма Pca 3-2 и его dspE-мутанта. Семядольные листья растений были инокулированы суспензиями клеток штамма 3-2 и его dspE-мутанта, а также не содержащим клеток буферным раствором.

Образцы тканей растений из незараженного (второго настоящего) листа для оценки развития защитных реакций отбирались через 24 часа после инокуляции. Развитие системного ответа растений детектировалось методом количественной ПЦР по уровню экспрессии известных PR-генов S. lycopersicum. Для выделения РНК из отобранных образцов был использован Tri reagent (Sigma), для синтеза кДНК – обратная транскриптаза M-MLV (Promega), для ПЦР – реагенты компании ПраймТех.

Полученные данные (рисунок) четко демонстрируют значительно более высокий уровень экспрессии нескольких PR-генов в растениях S. lycopersicum, инокулированных суспензиями клеток бактерий штамма 3-2, по сравнению с интактными или инокулированными только буфером растениями. Наиболее существенной оказалась индукция PR-генов осмотина (PR-5o), PR-2, а также маркерa РГ HSR515; в меньшей степени были индуцированы гены PR-1В и PR-5x. В то же время в незараженных листьях не было отмечено значительного изменения уровня экспрессии генов PR-3 и PR-1А.

Рис. Индукция экспрессии PR-генов Solanum lycopersicum при контакте с бактериями Pectobacterium carotovorum. Представлены средние трех измерений со стандартным отклонением.

Инактивация гена DspE существенно повлияла на спектр PR-генов растений S. lycopersicum, индуцирумых бактериями Pca. При использовании для инокуляции растений клеток dspE-мутанта степень индукции обоих генов семейства PR-5, а также PR- была меньшей по сравнению с исходным штаммом, однако все равно более высокой, чем в контроле. В то же время при инокуляции растений суспензиями клеток dspE-мутанта степень индукции гена PR-1B была существенно выше, чем при использовании клеток немутантного штамма.

С учетом имеющихся в литературе сведений по контролю экспрессии PR-генов S. lycopersicum наши данные позволяют говорить о двоякой роли белка DspE бактерий Pca при взаимодействии с этими растениями. С одной стороны, продукция этого белка немутантными бактериями (и доставка его в клетки растений) очевидно усиливает индукцию нескольких PR-генов (PR-2, PR-5x и PR-5), что соответствует характеру наблюдаемого взаимодействия бактерий с устойчивыми растениями. С другой стороны, существенно большая индукция PR-1В клетками штамма дикого типа в сравнении с клетками dspE-мутанта может свидетельствовать об участии эффекторного белка DspE в супрессии этого PR-гена растения, что может быть выгодным для патогена при инфекции чувствительного растения. Следует также отметить несколько неожиданную DspEнезависимую индукцию маркера РГ (HSR515) в клетках листьев, непосредственно не контактировавших с патогеном.

1. Николайчик Е.А., Овчинникова Т.В., Валентович Л.Н., Губич О.И., Шолух М.В., Евтушенков А.Н.

Транслокация белка DspE фитопатогенными бактериями Erwinia carotovora subsp. atroseptica в клетки Nicotiana tabacum и его необходимость для индукции реакции гиперчувствительности // Доклады НАН Беларуси. 2005. т.49,№5. с. 81- 2. Николайчик Е.А., Лагоненко А.Л., Валентович Л.Н., Присяжненко O.K., Евтушенков А.Н. Сравнительная характеристика харпинов HrpN Erwinia carotovora и Erwinia amylovora // Докл. НАН Б. 2007.Т.51, №3. С.

81- 3. Лагоненко А.Л., Николайчик Е.А., Евтушенков А.Н. Характеристика харпина HrpW бактерий Erwinia carotovora subsp. atroseptica // Докл. НАН Б. 2006. Т.50, №1. С. 7073.

ИЗУЧЕНИЕ ОТВЕТА НА ХОЛОД И ЯРКИЙ СВЕТ

МУТАНТА NFZ24 ARABIDOPSIS THALIANA

Биологический факультет МГУ им. М.В.Ломоносова, Москва, Россия Холодовой стресс один из главных лимитирующих факторов развития и продуктивности растений в России. Адаптация растений к стрессу включает как морфологийеские, физиологические так и биохимические изменения. Один из важнейших регуляторов, который контролирует не только рост и развитие, но и ответы на воздействия окружающей среды, является гормон абсцизовая кислота (АБК). АБК играет важную роль во многих клеточных процессах и ответax на абиотические стрессы, в том числе низкую температуру.

Анализ мутантов с измененной чувствительностью к стрессовым факторам – один из эффективных методов выявления генов, контролирующих адаптивный ответ. Arabidopsis thaliana является модельным растением, геном которого полностью секвенирован и для которого получены мутанты с измененной чувствительностью к разным абиотическим факторам. К сожалению, большинство исследований таких мутантов ограничиваются анализом чувствительности/устойчивости к отдельным стрессовым факторам, что не позволяет оценить всех последствий мутационных изменений для растения, а значит и перспектив использования мутантных генов этого вида для улучшения адаптивных свойств у хозяйственно ценных растений.

В данной работе исследован мутант nfz24, выделенный на кафедре генетики МГУ с помощью химического мутагенеза по устойчивости к индуктору окислительного стресса гербициду норфлуразону, который ингибирует биосинтез каротиноидов, вызывает фотодеструкцию хлорофилла и гибель растений. Мутант nfz24 имеет светлую желтозеленую окраску листьев и стебля, и, по данным проведенных ранее исследований, проявляет перекрестную устойчивость к другому индуктору окислительного стресса – параквату. В то же время, при воздействии низких положительных температур мутант nfz показывает большую чувствительность к холоду, чем растения дикого типа расы Dijon-М [1, 2]. Такая высокая чувствительность мутанта nfz24 к гипотермии может быть связана с дефицитом каротиноидах (до 30 % от дикого типа), хотя по соотношению разных форм каротиноидов растения мутанта и дикого типа практически не различались (рис. 1).

Рис. 1. Хроматограмма содержания пигментов в контрольной расе Dijon-M (серая линия) и в мутанте nfz (черная линия).

Методом полуколичественного ПЦР-анализа продуктов обратной транскрипции (ОТПЦР) изучили экспрессию генов АБК-зависимого и АБК-независимого ответа на холодовой стресс в растениях, выращиваемых при температуре +20 оС (контроль) и подвергнутых холодовому воздействию (+4 оС). Уровень экспрессии АБК-зависимого гена RAB18, который кодирует гидрофильный белок из семейства дегидринов, в растениях мутантной линии оказался в три раза ниже в контрольных условиях, чем в растениях дикого типа (рис. 2).

Рис. 2. Относительный уровень транскрипции генов холодового ответа ABA1, COR15A, CBF1 и RAB18 в растениях дикого типа (серый) и мутанта nfz24 (черный). Данные ОТ-ПЦР и расчитанный по ним относительный уровень экспрессии генов. Содержание кДНК выравнивали по контрольному гену UBS.

Ранее было показано, что существует прямая зависимость концентрации мРНК гена RAB18 от содержания АБК в растении, поэтому по уровню экспрессии этого гена можно оценивать относительный уровень эндогенной АБК в растениях [3]. При холодовом стрессе количество транскрипта RAB18 в растениях мутанта и дикого типа становится близким (рис. 2), что можно объяснить индукцией под действием холода синтеза эндогенной АБК не только в растениях дикого типа, но и у мутанта nfz24. При совместном действии холода и экзогенной АБК уровень экспрессии гена RAB18 увеличивался еще значительнее в равной степени у мутанта и дикого типа. Экспрессия гена АВА1 (LOS6), контролирующего синтез АБК, в растениях мутанта существенно ниже (более, чем в 8 раз), чем в контрольных растениях дикого типа (рис. 2). При холодовом воздействии в растениях дикого типа экспрессия гена ABA1 повышалась, в то время как у мутанта она оставалась на низком уровне. При совместном действии холода и АБК экспрессия гена ABA1 в растениях дикого типа практически не изменялась по сравнению с холодовой обработкой, а в растениях мутанта увеличивалась в 10 раз, достигая уровня транскрипции этого гена в растениях дикого типа после воздействия холода (рис. 2). Холодовое воздействие незначительно повышало экспрессию гена CBF1, кодирующего транскрипционный фактор, в растениях дикого типа и мутанта (рис. 2), но практически не влияло на уровень экспрессии гена COR15a, который кодирует гидрофильный белок, находящийся в строме хлоропласта (рис. 2). Таким образом, анализ транскрипции генов, контролирующих разные пути холодового ответа показал, что у мутанта nfz24 наблюдается изменение экспрессии генов АБК-зависимого холодового ответа (RAB18, АВА1), но практически не изменена (по сравнению с диким типом) экспрессия генов не регулируемых (CBF1) или частично (COR15a) регулируемых АБК.

Измененный ответ на пониженную температуру и на яркий свет были продемонстрированы ранее для мутантов ячменя [4]. Мутант nfz24 показал более высокий уровень устойчивости к воздействию яркого света по сравнению с растениями дикого типа.

В контрольных условиях (150 мкЕ, 14 ч/с) растения дикого типа в возрасте четырех недель переходили к стадии цветения и начинали формировать цветонос, в то время как растения мутанта nfz24 находились на стадии розетки. После воздействия ярким светом (300 мкЕ, 14 ч/с) в течение недели у растения расы Dijon-М прирост числа листьев и увеличение длины цветоноса не были значительным (рис. 3).

Рис. 3. Изменение морфометрических показателей (увеличение числа листьев (слева), удлинение цветоноса (справа)) растений мутанта nfz24 (черный) и дикого типа (серый) в процентах от контроля.

В отличие от оставленных в контрольных условиях растений nfz24, которые так и оставались на стадии розетки, на ярком свету растения мутанта характеризовались значительным приростом числа листьев и высоты цветоноса (рис. 3). Эти результаты могут быть объяснены тем фактом, что АБК регулирует не только холодовой ответ, но также и передачу светового сигнала и ответ на изменение интенсивности освещения [5] (рис. 4).

Рис. 4. Рабочая модель ответа A. thaliana на холод и яркий свет [по 5].

Для изучение причины толерантности к яркому свету исследовали уровень транскрипции генов антиоксидантных систем: sApx (стромальной аскорбатпероксидазы), CSD2 (магний/цинк супероксиддисмутазы) и PrxRQ (пероксиредуксина), поскольку эти гены участвуют в детоксикации радикалов кислорода и перекиси водорода, в том числе и при гипотермии [6, 7]. Нами установлено, что исходный уровень транскрипции гена sАрхd в растениях мутантной линии nfz24 ниже, чем в растениях расы Dijon-М, но при воздействии холодом, этот уровень значительно повышается по сравнению с диким типом (рис. 5 A).

Аналогично, но менее выражено ведет себя ген из семейства супероксиддисмутаз CSD (рис. 5 A).При совместном воздействии холода и АБК уровень экспрессии гена sАрхd в растениях расы Dijon-М повышается в три раза по сравнению с контрольным уровнем. Это значение у мутанта nfz24 достигает лишь уровня в растениях дикого типа под воздействием только холода. Транскрипция гена PrxQ в контрольных условиях в растениях мутанта сравнима с таковой в растениях расы Dijon-М. Под воздействием холода, как и под совместным воздействием холода и экзогенной АБК, в растениях дикого типа экспрессия снижается. В то же время транскрипция гена PrxQ в растениях мутанта nfz24 под воздействием холода не изменяется, и повышается под совместным воздействием холода и АБК. Изменение уровня транскрипции данных генов в условиях разной освещенности представлена на рис. 5 Б.

Таким образом, при воздействии холода и яркого света выявляются различия в ответе мутанта на уровне транскрипции генов по сравнению с диким типом. Следовательно, мутант nfz24 характеризуется повышенной активностью антиоксидантных систем не только при действии гербицидов, но и при воздействии других стрессовых факторов, одной из составляющих которых является повышение уровня активированного кислорода и перекисей. В то же время эта активация недостаточна для обеспечения устойчивости мутанта к холоду.

Рис. 5. Пояснения в тексте.

Автор выражает глубокую благодарность доктору Т. Ежовой и профессору Б. Гримму за помощь в проведении исследований.

Работа поддержана грантами РФФИ (проект 07-04офи), ФЦП «Ведущие научные школы» (НШ-4202.2008.4).

1. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Маманова Л.Б., Мусин С.М., Гримм В., Шестаков С.В. Коллекция мутантов Arabidopsis thaliana с измененной чувствительностью к индукторам окислительного стресса. Известия РАН.

2001. №5б C. 533-543.

2. Волкова Л.А., Бургутин А.Б., Солдатова О.П., Ежова Т.А., Лапшин П.В. Влияние параквата и гипотермии на устойчивые к норфлуразону мутанты Arabidopsis thaliana и полученные из них клеточные культуры.

Физиология растений. 2005, 52 (3).C. 421-429.

3. Parcy F., Giraudat J. 1997. Interactions between the ABI1 and the ectopically expressed ABI3 genes in controlling abscisic acid responses in Arabidopsis vegetative tissues // Plant J. Vol. 11 (4). P. 693–702.

4. Marcin Rapacz, Barbara Wolanin, Katarzyna Hura, Miroslaw Tyrka 2008 The effects of cold acclimation on photosynthetic apparatus and the expression of COR14b in four genotypes of barley (Hordeum vulgare) contrasting in their tolerance to freezing and high-light treatment in cold conditions // Ann Bot. vol. 101 (5) pp. 689-99.

5. Chang-Hyo Goh, Hong Gil Nam, Yu Shin Park 2003 Stress memory in plants: a negative regulation of stomatal response and transient induction of rd22 gene to light in abscisic acid-entrained Arabidopsis plants // Plant J. vol.

36 (2) pp. 240-55.

6. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. Superoxide dismutase in Arabidopsis: An eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 637-650.

7. Miller E., Schreier P. Stadies on flavonol degradation by peroxidase (donor H2O2-oxidoreductase, EC 1.11.1.7) Part 1: kaempferol // Food Chem. 1985 V. 17. P. 143-154.

СИСТЕМНАЯ АКТИВАЦИЯ ФАГОЦИТОВ КАК ВОЗМОЖНАЯ ПРИЧИНА

РАДИАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННОЙ НЕСТАБИЛЬНОСТИ ГЕНОМА

ГНУ «Институт радиобиологии НАН Беларуси», Гомель, Беларусь В последние десятилетия изучение молекулярных механизмов воздействия на организм малых доз ионизирующего излучения (ИИ) и оценка отдалённых последствий облучения стало одной из основных задач радиационной биологии. Зачастую последствия действия малых доз радиации носят стохастический характер и демонстрируют проявление немишенных или опосредованных эффектов облучения. Наибольший интерес представляют такие феномены как «нестабильность генома», «адаптивный ответ» и «эффект свидетеля»

(bystander effect). Суть последнего явления заключается в том, что эффекты облучения выявляются не только в пораженных радиацией клетках, но и в соседних. Этот эффект выявляется как на клеточных культурах, так и в целостном организме [1-3]. Так сыворотка облучённых организмов при внесении в среду культивирования способна вызывать повышение количества генетических аномалий в культуре клеток, не подвергавшихся облучению, а облучение отдельных частей тела приводит к увеличению количества выявляемых генетических перестроек в клетках необлучённых тканей. Среди идентифицированных факторов, обладающих подобным эффектом, выделяют провоспалительные цитокины, свободные радикалы и некоторые продукты перекисного окисления липидов (ПОЛ). Эти соединения являются кластогенными факторами и играют важную роль в индукции нестабильности генома [3, 4].

Среди отдалённых эффектов воздействия на организм ионизирующего излучения нестабильность генома остаётся наиболее загадочным феноменом. Это явление характеризуется появлением у потомков облучённых клеток неклональных мутаций и аберрантного кариотипа, т.е. повышенный уровень генетических нарушений выявляется спустя длительный срок после облучения, а выявленные нарушения не могут являться прямым следствием воздействия радиации [1, 3]. По нашему мнению одной из причин индукции нестабильности генома является усиление эндогенной продукции свободных радикалов в облучённом организме и формирование состояния называемого окислительным стрессом. Известно, что повышенный уровень продукции свободных радикалов и продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) наравне с истощением антиокислительных, детоксикационных и репарационных систем организма приводит к увеличению регистрируемого количества мутаций и хромосомных аберраций, т.е. формированию спектра генетических нарушений подобных тем, которые регистрируются после воздействия многих генотоксических факторов и при старении [1, 5].

Ранее мы сообщали о немонотонных изменениях интенсивности процессов ПОЛ в пострадиационный период [8]. Результаты пяти независимых экспериментов были нормализованы относительно контроля, и на основе полученных данных была реконструирована динамика изменения концентрации продуктов ПОЛ в сыворотке периферической крови после воздействия ИИ на организм в дозе 1 Гр (Рис. 1). В ранние сроки наблюдали характерный радиационно-индуцированный пик повышения концентрации продуктов ПОЛ. Наиболее интересным оказался феномен повторного повышения уровня продуктов ПОЛ в сыворотке крови, который мы регистрировали на протяжении второго месяца после облучения и назвали «вторичным окислительным стрессом» в связи с тем, что этот эффект развивается на фоне нормализации первичных радиационно-индуцированных изменений.