«МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ 2-Е ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ В 3 томах 3 Перевод с английского канд. биол. наук В. П. Коржа, канд. биол. наук Н.В. Сониной, канд. биол. наук Н. М. Руткевич, канд. биол. наук Г. ...»

1

2

3

Б. Албертс

Д. Брей

Дж. Льюис

М. Рэфф

К. Робертс

Дж. Уотсон

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

2-Е ИЗДАНИЕ, ПЕРЕРАБОТАННОЕ И ДОПОЛНЕННОЕ

В 3 томах

3

Перевод с английского

канд. биол. наук В. П. Коржа,

канд. биол. наук Н.В. Сониной, канд. биол. наук Н. М. Руткевич, канд. биол. наук Г. И. Эйснер, Т. Д. Аржановой, Г. В. Крюковой, А. В. Никашина под редакцией акад. Г. П. Георгиева, д-ра биол. наук Ю.С. Ченцова Москва ББК 28. М УДК 576.32/ Издание выпущено в счет дотации, выделенной Комитетом РФ по печати Авторы: Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж., Рэфф М., Роберте К., Уотсон Дж.

Молекулярная биология клетки: В 3-х т. 2-е изд., М75 перераб. и доп. Т. 3. Пер. с англ.-М.: Мир, 1994.-504 с., ил.

ISBN 5-03-001985- Созданный коллективом известных американских ученых (в их числе - лауреат Нобелевской премии Джеймс Уотсон) современный учебник молекулярной биологии. Энциклопедическая полнота охвата материала позволяет использовать его как справочное пособие. На русском языке выходит в 3-х томах. Читатель уже знаком с 1-м изданием (М.: Мир, 1986-1987). Новое издание переработано авторами и дополнено современным материалом. В т. 3 рассматриваются проблемы клеточной дифференцировки и организации специализированных тканей, анализируются общебиологические и молекулярно-генетические аспекты злокачественного перерождения клеток.

Для биологов всех специальностей, преподавателей и студентов университетов, медицинских, педагогических и сельскохозяйственных институтов.

ББК 28. Учебное издание Лицензия Л.Р. № 010174 от 22.01.92 г.

Зав. редакцией канд. биол. наук М. Д. Гроздова Брюс Албертс, Ведущие редакторы: Ю. И. Лашкевич, М. Б. Николаева, М. Р. Погосбекова Деннис Брей, Редактор Н. В. Пересыпкина Джулиан Льюис, Художник Е. И. Волков Мартин Рэфф, Художественные редакторы А. Е. Волков, Л. М. Аленичева Кейт Робертс Технический редактор М. А. Страшнова Джеймс Д. Уотсон Корректор Н. Н. Светлова МОЛЕКУЛЯРНАЯ ИБ №

БИОЛОГИЯ

КЛЕТКИ Сдано в набор 19.11.92г. Подписано к печати 21.09.94г. Формат 84 х 108 1/16. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура таймс. Объем 15,75 бум. л. Усл. печ.л. 52,93.

2-е издание, переработанное и дополненное Усл.кр.-отт. 103,74. Уч.изд.л. 55,25. Изд. № 4/7793. Тираж 10000 экз. Зак. 2292.

В 3-х томах Издательство «Мир» Комитета Российской Федерации по печати 129820, ГСП, Москва, Ий Рижский пер., д. Том Можайский полиграфкомбинат Комитета Российской Федерации по печати 143200, г.

Можайск, ул. Мира, Редакция литературы по биологии © 1989 by Bruce Alberts, Dennis Bray, Julian Lewis, Martin Raff, Keith ISBN 5-03-001988-Х (русск.) Roberts, and James D. Watson ISBN 5-03-001985- © перевод на русский язык, Корж В. П., Сонина Н. В., Руткевич Н.М., ISBN 0-8240-3965-6 (англ.) Эйснер Г. И., Никашин А. В., Аржанова Т. Д., Крюкова Г. В.

III От клеток к многоклеточным организмам 15-дневный эмбрион мыши Сперматозоид на поверхности яйцеклетки морского ежа. Фотография, полученная с помощью растрового электронного микроскопа. (С 15 Половые клетки и оплодотворение Размножение возможно и без полового процесса. Одноклеточные организмы могут размножаться простым митотическим делением.

Многие растения размножаются вегетативным путем, образуя многоклеточные дочерние особи, которые впоследствии отделяются от материнского организма. Подобные явления имеют место и в животном царстве: так, одиночная многоклеточная гидра производит потомков, отпочковывая их от своего тела (рис. 15-1). Актинии и некоторые морские черви делятся на две половинки, каждая из которых регенерирует недостающую часть организма. У ящериц встречаются даже такие виды, которые представлены лишь женскими особями и размножаются без спаривания. Такого рода бесполое размножение - процесс весьма несложный и не ведет к образованию новых форм: все потомство генетически идентично родительскому организму. В отличие от этого при половом размножении происходит смешивание геномов двух разных особей данного вида, и образующиеся в результате потомки обычно генетически отличаются друг от друга и от обоих родителей. Половое размножение, по-видимому, имеет большие преимущества, так как оно свойственно подавляющему большинству растений и животных. Даже многие прокариоты и некоторые другие организмы, обычно размножающиеся неполовым путем, в некоторых случаях переходят к половому размножению, в результате которого возникают новые комбинации генов. В этой главе мы познакомимся с клеточными механизмами, функционирующими при половом размножении, но прежде чем переходить к подробностям, мы рассмотрим причины возникновения этого аппарата и преимущества, которые он дает.

15.1. Преимущества полового процесса Цикл полового размножения включает чередование гаплоидных поколений клеток, каждая из которых имеет одинарный набор хромосом, с диплоидными поколениями, где клетки обладают двойным хромосомным набором (рис. 15-2). Смешивание геномов происходит благодаря слиянию двух гаплоидных клеток, из которых образуется одна диплоидная. В свою очередь новые гаплоидные клетки образуются из диплоидных в результате деления особого типа, называемого мейозом. В процессе генетической рекомбинации в мейозе парные хромосомы обмениваются ДНК, после чего новые их комбинации расходятся в разные клетки, которые теперь содержат одинарные наборы хромосом (см. разд.

15.2.2). В результате каждая клетка нового гаплоидного поколения получает новое сочетание генов, происходящих частично от одной родительской клетки предыдущего гаплоидного поколения и частично от другой. Таким образом, благодаря циклам, включающим гаплоидную фазу, слияние гамет, диплоидную фазу и мейоз, распадаются старые комбинации генов и создаются новые.

Рис. 15-1. Гидра, от которой отпочковываются две новые особи (указаны стрелками). Потомки генетически идентичны родительскому организму; они в конце концов, отделяются и переходят к независимому существованию. (С любезного разрешения Matai Hornbruch.) 15.1.1. У многоклеточных животных диплоидная фаза бывает сложной и продолжительной, а гаплоидная - простой и кратковременной В ходе полового цикла клетки размножаются путем обычного митотического деления - чаще всего во время диплоидной фазы (см. разд.

13.5). Исключение составляют некоторые простые организмы, например дрожжи (путем митоза у них размножаются только гаплоидные клетки, диплоидная же клетка, образовавшись, сразу переходит к мейозу), а также растения, хотя и не в столь яркой форме; у последних митотические деления происходят и в гаплоидной, и в диплоидной фазах. При этом у всех растений, за исключением наиболее примитивных, гаплоидная фаза очень короткая и простая, тогда как диплоидная представлена длительным периодом развития и роста. Почти у всех многоклеточных животных, и в том числе у всех позвоночных, гаплоидная фаза еще короче. Практически весь свой жизненный цикл они проводят в диплоидном состоянии;

гаплоидные клетки живут очень недолго, они совсем не делятся и специально приспособлены для полового слияния (рис. 15-3).

Гаплоидные клетки, которые сливаются при оплодотворении, называются гаметами. В типичном случае образуются гаметы двух типов:

крупные неподвижные яйцеклетки (или яйца) и мелкие, способные передвигаться спермии (или сперматозоиды) (рис. 15-4). Во время диплоидной фазы, начинающейся сразу после слияния гамет, клетки размножаются и специализируются, образуя сложный многоклеточный организм. У большинства животных (но не растений) полезно различать клетки зародышевой линии (зачаткового пути), от которых берет начало Рис. 15-2. Жизненный цикл организма, размножающегося половым путем, включает чередование диплоидного поколения клеток с гаплоидным.

Рис. 15-3. Эта схема показывает, как размножаются в диплоидной фазе клетки высших эукариот, образуя многоклеточный организм, в котором гаплоидными становятся только гаметы. Напротив, у некоторых низших эукариот размножаются именно гаплоидные клетки, а единственной диплоидной клеткой является зигота, которая существует очень недолго после оплодотворения. Гаплоидные клетки выделены цветом Рис. 15-4. Яйцеклетка двустворчатого моллюска с многочисленными спермиями, прикрепившимися к ее поверхности. Микрофотография получена с помощью сканирующего электронного микроскопа. (С любезного разрешения David Epel.) следующее поколение гамет, и соматические клетки, образующие весь остальной организм и не оставляющие потомства. В некотором смысле соматические клетки нужны только для того, чтобы способствовать выживанию и размножению клеток зачаткового пути (половых клеток).

15.1.2. Половое размножение делает организмы конкурентоспособными в условиях изменчивости окружающей среды Аппарат полового размножения сложен, и средства, «затрачиваемые» на него, очень велики. Какие же преимущества он дает, и почему он выработался в процессе эволюции? При наличии генетической рекомбинации родительские особи производят потомков, которые будут отличаться от них самым непредсказуемым образом, причем среди новых случайных сочетаний генов, по крайней мере, половина может оказаться хуже родительских генотипов. Но если это так, то почему половое размножение должно быть выгоднее бесполого, при котором потомки будут сохранять все родительские гены? Хотя для специалистов по генетике популяций этот вопрос все еще до конца не ясен, основной вывод, повидимому, состоит в том, что перетасовка генов в процессе полового размножения способствует выживанию вида при изменении условий среды.

Если родительская особь производит много потомков с самыми разнообразными комбинациями генов, имеется больше шансов на то, что хотя бы один потомок окажется хорошо приспособленным для будущих жизненных обстоятельств, какими бы они ни были. Для объяснения преимуществ полового размножения в борьбе за существование было предложено много гипотез. Одна из них дает представление о том, какими могли быть первые этапы эволюции полового размножения. Ход эволюции в значительной мере зависит от мутаций, которые изменяют существующие гены, образуя вместо них новые аллели (варианты) этих генов. Предположим, что у двух особей в некоторой популяции возникли благоприятные мутации, затрагивающие разные генетические локусы, а значит, и разные функции.

У бесполого вида каждая из этих особей даст начало клону мутантных потомков, и два новых клона будут конкурировать до тех пор, пока один из них не одержит верх. Один из благоприятных аллелей, появившихся благодаря мутациям, будет, таким образом, распространяться, тогда как другой в конце концов исчезнет. Теперь представим себе, что один из исходных мутантов обладает генетически обусловленной особенностью, позволяющей ему время от времени включать в свой геном гены из других клеток. В условиях борьбы за существование приобретение генов у клеток конкурирующего клона равносильно созданию клетки, несущей все благоприятные мутации. Такая клетка будет обладать наибольшей приспособленностью, и полученные ею преимущества обеспечат распространение в популяции особенности, позволяющей включать в свой геном гены других клеток. Естественный отбор будет благоприятствовать такому примитивному половому размножению.

Какими бы ни были истоки полового размножения, поразительно то, что эволюция практически всех сложных организмов, доживших до наших дней, протекала благодаря чередованию многих поколений, размножавшихся половым путем. Несмотря на обилие бесполых организмов, они, по-видимому, остались весьма примитивными. Почему? Возможно, ответ состоит в том, что половое размножение создает особые возможности для генетического обновления, ведущего к развитию сложных организмов. Обо всем этом мы будем говорить дальше.

15.1.3. Новые гены появляются в результате дупликаций и дивергенции Для эволюции сложного организма требуется нечто большее, чем улучшение уже имеющихся генов: нужны новые гены для осуществления новых функций. Как они появляются?

Многие белки многоклеточного животного могут быть сгруппированы в семейства: коллагены, глобины, сериновые протеазы и т. п.

Белки одного семейства близки как по своей функции, так и по аминокислотной последовательности. Вряд ли можно сомневаться в том, что гены белков каждого такого семейства произошли от единственного предкового гена в результате процессов дупликации и дивергенции (разд. 10.5.3).

Разные члены одного семейства белков часто бывают характерны для различных тканей тела, где они выполняют похожие, но несколько различающиеся функции. Создание новых генов благодаря дивергенции и специализации имеющихся играло, очевидно, решающую роль в эволюции сложных многоклеточных организмов. В этом отношении диплоидные организмы обладают важным преимуществом: у них имеется добавочная копия каждого гена, и эта копия может мутировать и служить исходным материалом для создания чего-то нового. Гаплоидные виды не могут так же легко вступать на путь, ведущий к увеличению и усложнению генома. Чтобы механизм этих процессов стал ясен, нам нужно будет несколько подробнее рассмотреть связь между половым размножением и диплоидией.

15.1.4. Половое размножение сохраняет диплоидность у диплоидных видов У диплоидного организма имеются две копии каждого гена - по одной от каждого из родителей; однако для выживания и нормальной жизнедеятельности в большинстве случаев бывает достаточно одной копии. Мутация, нарушающая функцию жизненно важного гена, для гаплоидного организма летальна, но она может оказаться безвредной организм гибнет. Однако в диЧукучановые (Catostomidae)-семейство пресноводных рыб отряда карпообразных.- Прим. ред.

Рис. 15-5. Из этой схемы видно, каким образом при половом размножении диплоидные организмы сохраняют диплоидность в ходе эволюции. Для простоты рассматриваются только летальные рецессивные мутации.

Аналогичным образом обстоит дело и с вредными рецессивными мутациями.

плоидном организме подобного рода мутация в одной из двух копий гена не просто терпима - она приносит пользу. Даже небольших преимуществ, которые получит организм благодаря новому мутантному гену, будет достаточно, чтобы перекрыть ущерб, нанесенный потерей одной из двух исходных копий гена: гетерозиготная особь будет извлекать пользу как из старой, так и из новой функции гена. Гомозиготы, имеющие две копии старого аллеля или две копии нового, окажутся менее приспособленными. В подобных случаях, когда имеется преимущество гетерозигот, мутантный ген быстро распространяется в диплоидной популяции с половым размножением - до тех пор, пока не будет достигнуто равновесие, при котором и старые, и новые аллели представлены с высокой частотой и доля гетерозиготных особей велика. Это явление называется сбалансированным полиморфизмом. Однако кое-чем приходится расплачиваться: при скрещивании двух гетерозигот значительная часть потомков в соответствии с обычными законами Менделя окажется гомозиготной и поэтому хуже приспособленной. Но такое положение не будет сохраняться вечно - из него есть выход.

15.1.6. Диплоидный вид может быстро обогащать свой геном, приобретая новые гены Время от времени у всех организмов происходит спонтанное удвоение генов: хромосома, содержащая одну копию гена G, в результате ошибки в репликации ДНК дает начало хромосоме, в которую входят уже две копии этого гена, расположенные одна за другой. Такие дупликации сами по себе не дают никаких преимуществ и встречаются, как правило, у очень немногих особей. Предположим, однако, что дупликация произошла в локусе, содержащем полезный мутантный аллель G*, который с высокой частотой присутствует в популяции в связи с отбором в пользу гетерозигот и сосуществует в геноме с исходным аллелем G (рис. 15-6). Тогда велика вероятность того, что в диплоидной клетке, содержащей хромосому GG (несущую дупликацию), ее гомолог будет содержать аллель G*, так что получится генотип GG/G*. Затем в результате генетической рекомбинации в мейозе (см. ниже) могут образоваться гаметы с генотипом GG*. В этих гаметах исходный ген G и мутантный G*.

расположенные один за другим, не будут уже двумя аллелями, конкурирующими за один и тот же локус; теперь это два отдельных гена, каждый из которых занимает собственный локус. Такая комбинация выгодна, и она станет быстро распространяться, пока, наконец, вся популяция не будет состоять из гомозигот GG*/GG* (см. рис. 15-6). Преимущество особей с таким генотипом состоит не только в обладании обоими генами - старым G и новым G*, но и в том, что они могут передавать это преимущество всем своим потомкам.

Таким образом, у диплоидного вида с половым размножением могут возникать новые гены в результате мутаций в добавочных копиях имеющихся генов; эти новые гены могут распространиться в популяции благодаря отбору в пользу гетерозигот, причем не будут потеряны и исходные гены; и наконец, новые гены могут дополнительно включаться в геном в результате процессов дупликации генов и генетической рекомбинации. Такая последовательность событий возможна только у диплоидных видов. Обогащение генома у гаплоидного вида связано с большими трудностями. Если в процессе приобретения нового гена вид должен сохранить и старый ген, то ему придется ждать возникновения нужной мутации у одной из очень немногих особей, у которых уже произошла дупликация соответствующего локуса. А поскольку и мутации, и дупликации в определенном локусе происходят очень редко, гаплоидному виду приходится дожидаться совпадения этих событий Рис. 15-6. Возникновение нового гена (G*) по схеме «мутация распространение дупликация» в процессе полового размножения чрезвычайно долго (рис. 15-7). Детальные расчеты показывают, что обычно (за исключением ситуаций, когда частота дупликаций генов очень велика) диплоидный организм способен расширять свой геном и добавлять к нему новые гены с новыми функциями в сотни или даже тысячи раз быстрее, чем это происходит у гаплоидного организма. Наиболее ярко различие выражено в отношении тех мутаций, которые происходят с низкой частотой, а именно такие редкие мутации необходимы для обновления генома.

Итак, половое размножение идет «рука об руку» с диплоидностью, которая в свою очередь обеспечивает особо благоприятные условия для создания более крупного, более сложного и более гибкого генома. Конечно, эволюция может протекать по-разному, и указанный нами путь дупликаций и дивергенции генов, безусловно, далеко не единственный. Тем не менее, половое размножение, по-видимому, оказало огромное влияние на истоки и способы распространения в популяции генетических изменений, сделав возможным появление столь сложных организмов, как мы сами.

Теперь можно перейти к детальному описанию клеточных механизмов полового процесса. В последующих разделах сначала будет рассмотрен мейоз, в ходе которого осуществляется генетическая рекомбинация и из диплоидных клеток образуются гаплоидные гаметы; затем мы обратимся к самим гаметам и, наконец, познакомимся с процессом оплодотворения, при котором гаметы сливаются, образуя новый диплоидный организм.

При половом размножении происходит циклическое чередование диплоидного и гаплоидного состояний: диплоидная клетка делится путем мейоза, порождая гаплоидные клетки, а гаплоидные клетки попарно сливаются при оплодотворении и образуют новые диплоидные клетки.

Во время этого процесса происходит перемешивание и рекомбинация геномов, в результате чего появляются особи с новыми наборами генов.

Высшие растения и животные большую часть жизненного цикла проводят в диплоидной фазе, а гаплоидная фаза у них очень короткая. Вероятно, процесс эволюции благоприятствовал половому размножению, так как случайная генетическая рекомбинация увеличивала шансы организмов на то, что хотя бы некоторые из их потомков выживут в непредсказуемо изменчивом мире. Половой процесс необходим также для поддержания диплоидности; он способствует созданию условий для быстрой выработки новых генов у высших растений и животных.

15.2. Мейоз Понимание того факта, что половые клетки гаплоидны и поэтому должны формироваться с помощью особого механизма клеточного деления, пришло в результате наблюдений, которые к тому же едва ли не впервые навели на мысль, что хромосомы содержат генетическую информацию. В 1883 г. было обнаружено, что ядра яйца и спермия определенного вида червей содержат лишь по две хромосомы, в то время как в оплодотворенном яйце их уже четыре. Хромосомная теория наследственности могла, таким образом, объяснить давний парадокс, состоящий в том, что роль отца и матери в определении признаков потомства часто кажется одинаковой, несмотря на огромную разницу в размерах яйцеклетки и сперматозоида.

Еще один важный смысл упомянутого открытия состоял в том, что половые клетки должны формироваться в результате ядерного деления особого типа, при котором весь набор хромосом делится точно пополам. Деление такого типа носит название мейоз (слово греческого происхождения, означающее «уменьшение». Название другого вида деления клеток-митоз-происходит от греческого слова mitos, означающего «нить»; в основе такого выбора названия лежит нитеподобный вид хромосом при их конденсации во время деления ядра - данный процесс имеет место как при обычном, так и при мейотическом делении.) Поведение хромосом во время мейоза, когда происходит редукция их числа, оказалось более сложным, чем предполагали раньше. Поэтому важнейшие особенности мейотического деления удалось установить только к началу 30-х годов в итоге огромного числа тщательных исследований, объединивших цитологию и генетику.

15.2.1. При мейозе происходит не одно, а два деления ядра Диплоидные ядра содержат по две копии каждой хромосомы (это не относится лишь к половым хромосомам), одна из которых происходит от мужского родителя, а другая - от женского. Эти две копии называются гомологами, и в большинстве клеток они ведут себя как совершенно независимые хромосомы. Когда благодаря репликации ДНК каждая хромосома удваивается, две ее копии остаются сначала соединенными вместе (их называют сестринскими хроматидами). При обычном клеточном делении (описанном в гл. 13) сестринские хроматиды выстраиваются в экваториальной плоскости веретена таким образом, что их кинетохорные волокна направлены к противоположным полюсам. В результате сестринские хроматиды в анафазе отделяются друг от друга (теперь они называются хромосомами), и каждая дочерняя клетка наследует по одной копии каждого гомолога (см. разд. 13.5). Между тем гаплоидные гаметы, образовавшиеся при делении диплоидной клетки путем мейоза, содержат по одной хромосоме каждой гомологичной пары (отцовского или материнского происхождения), т. е. только половину исходного числа хромосом. В связи с этим к аппарату клеточного деления здесь предъявляется дополнительное требование: гомологи должны иметь возможность «узнавать» друг друга и соединяться в пары, перед тем как они выстроятся на экваторе веретена. Такое спаривание, или конъюгация, гомологичных хромосом материнского и отцовского происхождения происходит только в мейозе (рис. 15-8); подробности этого процесса будут рассмотрены позже.

При наличии механизма конъюгации отцовских и материнских гомологичных хромосом и их последующего расхождения мейоз мог бы в принципе осуществляться путем видоизменения одного митотического цикла, если бы в нем выпала фаза удвоения хромосом (S) и гомологи спаривались перед фазой М. Тогда в результате следующего клеточного деления могли бы непосредственно образоваться две гаплоидные клетки.

Однако на самом деле процесс мейоза более сложен. Перед конъюгацией каждый из гомологов подвергается удвоению, образуя пару тесно связанных сестринских хроматид аналогично тому, как это происходит при обычном клеточном делении. Специфические особенности мейоза проявляются лишь после завершения репликации ДНК. Вместо того чтобы отделиться друг от друга, сестринские хроматиды ведут себя как единое целое (как будто дупликация хромосом не произошла): каждый дуплицированный гомолог конъюгирует с партнером, образуя структуру, состоящую из четырех хроматид и называемую бивалентом. Бивалент располагается на экваторе веретена, и в анафазе дуплицированные гомологи (каждый из которых состоит из двух сестринских хроматид) отделяются друг от друга и расходятся к противоположным полюсам причем в каждом из них две сестринские хроматиды остаются соединенными. Таким образом, при первом делении мейоза каждая дочерняя клетка наследует две копии одного из двух гомологов и поэтому содержит диплоидное количество ДНК. Однако она отличается от обычных диплоидных клеток в двух отношениях: 1) обе копии ДНК каждой хромосомы происходят лишь от одной из двух гомологичных хромосом, имевшихся в исходной клетке (хотя, как мы увидим, в результате генетической рекомбинации происходит некоторое перемешивание материнских и отцовских ДНК), и 2) эти две копии клетка получает в виде тесно связанных сестринских хроматид, составляющих единую хромосому (рис. 15-8).

Теперь образование гаплоидных ядер гамет может очень просто происходить в результате второго деления мейоза, при котором хромосомы выстраиваются на экваторе нового веретена и без дальнейшей Рис. 15-8. Сравнение мейоза с обычным митозом (схема). Для простоты показана только одна пара гомологичных хромосом. Спаривание гомологичных хромосом происходит только в мейозе; поскольку перед спариванием каждая хромосома удваивается и состоит из двух сестринских хроматид, для образования гаплоидных гамет необходимы два клеточных деления. Поэтому из любой диплоидной клетки, вступающей в мейоз, образуются четыре гаплоидные клетки. В мейозе при конъюгации гомологичных хромосом между ними осуществляется кроссинговер; объяснение репликации ДНК сестринские хроматиды отделяются друг от друга, как при обычном митозе, образуя клетки с гаплоидным набором ДНК. Таким образом, мейоз состоит из двух клеточных делений, следующих за единственной фазой удвоения хромосом, так что из каждой клетки, вступающей в мейоз, получаются в итоге четыре гаплоидные клетки (рис. 15-8). Иногда процесс мейоза протекает аномально, и гомологи не могут отделиться друг от друга - это явление называется нерасхождением хромосом. Некоторые из образующихся в этом случае гаплоидных клеток получают недостаточное количество хромосом, в то время как другие приобретают их лишние копии. Из подобных гамет формируются неполноценные эмбрионы, большая часть которых погибает.

Рис. 15-9. Схема, иллюстрирующая два основных механизма перераспределения генетического материала во время мейоза. А. У организма с п хромосомами в результате независимого расхождения гомологичных хромосом в первом делении мейоза может получиться 2" различных гаплоидных гамет.

В данном случае п = 3 и может быть 8 различных типов гамет. Б. В I профазе мейоза происходит кроссинговер-гомологичные хромосомы обмениваются участками, что ведет к перераспределению генов. В последовательностях ДНК двух гомологов всегда имеется большое число незначительных различий, поэтому оба механизма увеличивают наследственную изменчивость организмов, 15.2.2 Пересортировка генов усиливается благодаря кроссинговеру между гомологичными несестринскими хроматидами Как мы уже видели, гены могут перемешиваться благодаря слиянию гамет двух различных особей. Однако генетические изменения осуществляются не только этим путем. Никакие два потомка одних и тех же родителей (если только это не идентичные близнецы) не будут абсолютно одинаковыми. Дело в том, что задолго до слияния двух гамет, во время мейоза, осуществляются два различных вида пересортировки генов.

Один вид пересортировки - это результат случайного распределения разных материнских и отцовских гомологов между дочерними клетками при 1-м делении мейоза; каждая гамета получает свою, отличную от других выборку материнских и отцовских хромосом (рис. 15-9 А). Из одного только этого факта следует, что клетки любой особи могут в принципе образовать 2" генетически различающихся гамет, где n-гаплоидное число хромосом. Например, у человека каждый индивидуум способен образовать по меньшей мере 223 = 8,4-106 генетически различных гамет.

Однако на самом деле число возможных гамет неизмеримо больше из-за кроссинговера (перекреста) - процесса, происходящего во время длительной профазы 1-го деления мейоза, когда гомологичные хромосомы обмениваются участками. У человека в каждой паре гомологичных хромосом кроссинговер происходит в среднем в двух-трех точках. Как показано на рис. 15-9 Б, такой процесс «перетасовывает» гены любой хромосомы в гаметах.

При кроссинговере происходит разрыв двойной спирали ДНК в одной материнской и одной отцовской хроматиде, а затем получившиеся отрезки воссоединяются «наперекрест» (процесс генетической рекомбинации). То, что известно о деталях молекулярного механизма этого процесса, в общих чертах представлено в гл. 5. Рекомбинация происходит в профазе 1-го деления мейоза, когда две сестринские хроматиды так тесно сближены друг с другом, что их невозможно увидеть в отдельности (см. ниже). Гораздо позже в этой растянутой профазе становятся ясноразличимы две отдельные хроматиды каждой хромосомы. В это время видно, что они связаны своими центромерами и тесно сближены друг с другом по всей длине. Два гомолога остаются связанными в тех точках, где произошел кроссинговер между отцовской Рис. 15-11. Световая микрофотография бивалентов с множественными хиазмами на стадии диплотены. Изображенные здесь крупные хромосомы прямокрылого особенно удобный объект для цитологических исследований. (С любезного разрешения Bernard John.) и материнской хроматидами. Видно, что в каждой такой точке, которую называют хиазмой, две из четырех хроматид перекрещиваются (рис. 15Таким образом, хиазмы - это морфологический результат произошедшего кроссинговера, который сам по себе недоступен для наблюдения.

На этой стадии мейоза гомологи в каждой паре (или биваленте) остаются связанными друг с другом по меньшей мере одной хиазмой. Во многих бивалентах бывает большее число хиазм, так как возможны множественные перекресты между гомологами (рис. 15-11 и 15-12).

15.2.3. В конъюгации хромосом участвует синаптонемальный комплекс В профазе 1-го деления мейоза во время конъюгации (синопсиса) и разделения хромосом в них происходят сложнейшие морфологические изменения. В соответствии с этими изменениями профаза делится на пять последовательных стадий - лептотену, зиготену, пахитену, диплотену и диакинез (рис. 15-13). Самое поразительное явление - это инициация тесного сближения хромосом в зиготене, когда между парами сестринских хроматид в каждом биваленте начинает формироваться специализированная структура, называемая синаптонемальным комплексом. Момент полной конъюгации хромосом считают началом пахитены, которая обычно продолжается несколько дней; после разделения хромосом наступает стадия диплотены, когда впервые становятся видны хиазмы.

Для генетической рекомбинации необходимо тесное сближение рекомбинирующих хромосом. Синаптонемальный комплекс, который формируется перед самой пахитеной и распадается сразу после нее, удерживает гомологичные хромосомы рядом, скрепляя их по всей длине;

полагают, что он необходим для осуществления кроссинговера. Синаптонемальный комплекс представляет собой длинное белковое образование, напоминающее веревочную лестницу, к противоположным сторонам которого плотно прилегают два гомолога (бивалент, рис. 15-14). Сестринские хроматиды каждого гомолога остаются тесно сближенными, а их ДНК образует многочисленные петли по ту же сторону от белковой «лестницы».

Таким образом, хотя гомологичные хромосомы в синаптонемальном комплексе сближены по всей длине, материнские и отцовские хроматиды, которые впоследствии будут обмениваться участками, остаются по разные стороны от «лестницы», причем разделяющее их расстояние превышает 100 нм.

Как показывают цитологические исследования, конъюгации хромосом предшествует формирование белковой нити вдоль каждого из гомологов. По мере осуществления конъюгации эти нити, по-видимому, сближаются, превращаясь в боковые элементы синаптонемального комплекса и образуя две стороны белковой «лестницы». И первоначальные нити, и эти боковые элементы содержат белок, который очень хорошо окрашивается серебром, что позволяет видеть эти структуры как с помощью светового микроскопа, так и на электронных микрофотографиях (рис.

15-15).

Мы не знаем, что заставляет гомологичные участки хромосом точно ориентироваться друг против друга на стадии зиготены. Вряд ли для этого необходимо спаривание комплементарных оснований по всей длине взаимодействующих хромосом, поскольку хроматин одного из гомологов в синаптонемальном комплексе расположен достаточно далеко от хроматина другого гомолога, а в отдельных случаях синаптонемальный комплекс может объединять участки двух негомологичных хромосом. Одно из возможных объяснений состоит в том, что конъюгаРис. 15-13. Последовательность событий при синапсисе и разъединении хромосом в I профазе мейоза. Полностью сформированный ция хромосом начинается с взаимодействия комплементарных пар оснований ДНК в небольших специфических участках каждой хромосомы. Затем синаптонемальный комплекс соединяет оставшиеся области ориентированных друг против друга хромосом. Какой-то механизм такого рода локального соответствия необходим для объяснения того факта, что наличие в одной из двух гомологичных хромосом инвертированного участка обычно (хотя и не всегда) приводит к местному нарушению нормального синапсиса во время зиготены, так что гомологичные гены могут конъюгировать даже в области инверсии (рис. 15-16 и 15-17). Отдельные стадии мейоза показаны на рис. 15-18, где дается и подробное описание соответствующих процессов.

15.2.4. Как полагают, обмены между хроматидами происходят при участии рекомбинационных узелков Синаптонемальный комплекс обеспечивает структурную основу, необходимую для рекомбинационных событий, но сам он, вероятно, непосредственно в них не участвует. Как полагают, важную роль в этих событиях играют рекомбинационные узелки, которые представляют собой очень крупные белковые комплексы с диаметром около 90 нм (для сравнения заметим, что крупная молекула глобулярного белка массой 400000 дальтон имеет диаметр порядка 10 нм). Рекомбинационные узелки «сидят» на некоторых расстояниях друг от друга на «лестнице»

синаптонемального комплекса, между двумя гомологичными хроматидами (см. рис. 15-14). Предполагается, что это место расположения крупных мультиферментных «рекомбинационных аппаратов», которые подтягивают друг к другу локальные участки ДНК материнской и отцовской хроматид через область синаптонемального комплекса шириной 100 нм.

О такой функции рекомбинационных узелков говорят некоторые косвенные данные:

1. Общее число узелков примерно равно общему числу хиазм, наблюдаемых позже в профазе.

2. Узелки распределены вдоль синаптонемального комплекса таким же образом, как и перекресты; например, подобно перекрестам, узелки отсутствуют в тех областях, где синаптонемальный комплекс соединяет отрезки гетерохроматина. Кроме того, генетические и цитологические исследования показывают, что произошедший кроссинговер препятствует осуществлению другого кроссинговера в близлежащем участке хромосомы. Точно так же и узелки, как правило, не располагаются очень близко друг к другу.

Рис. 15-14. Схематическое изображение типичного синаптонемального комплекса. Здесь представлен лишь небольшой участок этого длинного, похожего на лестницу образования. Показаны боковые и осевой (центральный) элементы комплекса, а также рекомбинационный узелок. Сходные синаптонемальные комплексы обнаруживаются у самых различных организмов - от дрожжей до человека. Однако об образующих эти комплексы Рис. 15-15. Электронные микрофотографии полных наборов хромосом в окрашенных серебром давленых препаратах сперматоцитов мыши на (А) ранней (зиготена), (Б) средней (пахитена) и (В) поздней (диплотена) стадиях профазы первого деления мейоза. (Фото любезно предоставлены Montrose J. Moses.) А. Спаривание (зиготена). Перед конъюгацией хромосом белковые нити отделены друг от друга; затем они сближаются и, когда в одном или нескольких местах инициации синапсиса между хромосомами установится надлежащее расстояние, начинает формироваться синаптонемальный комплекс (часто с конца хромосомы). На примере половых хромосом (X и Y) видно, что для спаривания нередко приходится преодолевать огромные расстояния внутри ядра, однако механизм этого движения неизвестен. Темные тельца-ядрышки.

Б. Завершение спаривания (пахитена). Синапсис завершается, когда синаптонемальные комплексы связывают попарно все гомологичные аутосомы. Х- и Y-хромосомы конъюгируют не полностью. Происходит кроссинговер между хроматидами, которые на таких фотографиях неразличимы.

В. Расхождение хромосом (диплотена). Перед разрушением белковых нитей последние отделяются друг от друга, что означает окончание синапсиса. На препарате они еще кое-где связаны сохранившимися отрезками синаптонемального комплекса;

как полагают, это те места, в которых произошел кроссинговер.

Позже, когда хроматин конденсируется и становятся различимыми хроматиды, на места кроссинговера указывают хиазмы Рис. 15-16. Схема образования синаптонемального комплекса между нормальной хромосомой и ее гомологом, имеющим инвертированный участок.

Подобные структуры указывают на то, что гомологичные хромосомы конъюгируют благодаря локальному сходству определенных участков.

3. Некоторые мутации у дрозофилы приводят к аномальному распределению перекрестов по длине хромосом и резко пониженной частоте рекомбинаций; при этом у мух оказывается меньше рекомбинационных узелков и их размещение вдоль хромосомы изменено так же, как и распределение перекрестов. Такая корреляция служит веским доводом в пользу того, что каждый кроссинговер определяется локализацией одного узелка.

4. Как полагают, при генетической рекомбинации в области каждого кроссинговера происходит синтез некоторого количества ДНК (см.

разд. 5.4.5). Метод радиоавтографии в сочетании с электронной микроскопией позволяет показать, что радиоактивные предшественники включаются в пахитенную ДНК главным образом в области рекомбинационных узелков или поблизости от них.

Поскольку рекомбинационных узелков бывает примерно столько же, сколько происходит перекрестов, можно думать, что эти узелки очень эффективно вызывают рекомбинацию между хроматидами двух гомологичных хромосом. К сожалению, о структуре рекомбинационных узелков и механизме их действия пока ничего не известно.

15.2.5. Хиазмы играют важную роль в расхождении хромосом во время мейоза Кроссинговер не только способствует перетасовке генов, но играет также важнейшую роль при расхождении двух гомологов в дочерние ядра. Дело в том, что именно хиазмы удерживают вместе материнские и отцовские гомологи до анафазы I, выполняя здесь ту же функцию, что Рис. 15-17. Тесная конъюгация двух гомологичных хромосом мыши, одна из которых содержит инверсию, на стадии пахитены. В петле виден рекомбинационный узелок (см. разд. 15.2.4). Слева - электронная микрофотография; справа поясняющая схема. (P. A. Poorman et al., Chromosoma, Рис. 15-18. Схемы, показывающие видимые изменения двух гомологичных хромосом на протяжении мейоза. Представлен ход событий в клетках млекопитающих, хотя весьма сходную картину можно наблюдать и в клетках многих других организмов. А - пять стадий первой профазы мейоза (А); Б - последующие стадии мейоза.

хромосомам бивалента несколько отодвинуться друг от друга. Однако они все еще связаны одной или несколькими хиазмами, т. е. местами, где произошел кроссинговер. В ооцитах (развивающихся яйцеклетках) диплотена может растянуться на месяцы или годы, так как именно на этой стадии хромосомы конденсируются и синтезируют РНК, обеспечивая яйцеклетку резервными веществами. В особых случаях диплотенные хромосомы становятся исключительно активными в отношении синтеза РНК; такие хромосомы типа ламповых щеток находят у амфибий и некоторых других организмов ДИАКИНЕЗ. Диплотена незаметно переходит в диакинез - стадию, предшествующую метафазе, когда прекращается синтез РНК и хромосомы конденсируются, утолщаются и отделяются от ядерной мембраны. Теперь ясно видно, что каждый бивалент содержит четыре отдельные хроматиды, причем каждая пара сестринских хроматид соединена центромерой, тогда как несестринские хроматиды, претерпевшие кроссинговер, связаны хиазмами. После окончания длительной профазы I два ядерных деления без разделяющего их периода синтеза ДНК доводят процесс мейоза до конца. Эти стадии обычно занимают не более 10% всего времени, необходимого для мейоза, и они носят те же названия, что и соответствующие стадии митоза. В оставшейся части первого деления мейоза различают метафазу I, анафазу I и телофазу I. К концу первого деления хромосомный набор редуцируется, превращаясь из тетраплоидного в диплоидный, совсем как при митозе, и из одной клетки образуются две. Решающее различие состоит в том, что при первом делении мейоза в каждую клетку попадают две сестринские хроматиды, соединенные в области центромеры, а при митозе - две разделившиеся хроматиды. Далее, после кратковременной интерфазы II, в которой хромосомы не удваиваются, быстро происходит второе деление - профаза II, анафаза II и телофаза II. В результате из каждой диплоидной клетки, вступившей в мейоз, образуются четыре гаплоидных ядра.

Рис. 15-19. Сравнение механизмов упорядоченного расположения хромосом в метафазе и их расхождения в анафазе при первом и втором делениях мейоза. Во втором делении используются те же механизмы, что и в обычном митозе (см. гл. 13).

стадий мейоза, представленных на рис. 15-18.

Показаны примерные временные интервалы для самца млекопитающего (мыши) и растения (лилии). Эти интервалы различны для женских и мужских гамет (яиц и спермиев) одного и того же вида и для одинаковых гамет разных видов.

Например, мейоз у мужчины длится 24 дня, а у самца мыши 12 дней. Однако во всех случаях профаза первого деления мейоза намного продолжительнее, чем все остальные стадии, рует процесс развития эмбриона, у которого, в свою очередь, формируются первичные половые клетки, т. е. открывается новый цикл.

Пока не ясно, по какой именно причине определенные клетки у зародыша млекопитающего превращаются в половые клетки, но известно, что, по крайней мере, у одного организма определяющим фактором служит какой-то компонент (или компоненты) цитоплазмы яйца: у дрозофилы специфическая область цитоплазмы - полярная плазма, расположенная на заднем полюсе яйца, - содержит мелкие гранулы, богатые РНК (полярные гранулы); клетки, образующиеся в этой части яйца и содержащие полярные гранулы, становятся первичными половыми клетками и, в конечном счете, мигрируют в гонады, где из них развиваются гаметы. Если полярную плазму ввести в передний полюс яйца, то клетки, которые должны были стать соматическими, превратятся в половые.

15.3.1. У высших животных яйцеклетка это единственная клетка, из которой может развиться новая особь По крайней мере, в одном отношении яйцеклетки - самые удивительные из всех животных клеток: будучи активированы, они могут дать начало целому новому организму, причем иногда для этого достаточно нескольких дней или недель. У высших животных это исключительная привилегия яйцеклеток. Активация обычно является следствием слияния яйцеклетки со спермием при оплодотворении, хотя, как мы позже увидим, во многих случаях яйцеклетку можно активировать иными, зачастую поразительно простыми способами (см. разд. 15.4.3). Активация яйцеклетки запускает программу развития, постепенное развертывание которой приводит к образованию новой особи.

У большинства животных, не относящихся к млекопитающим, ранний этап развития яйцеклетки сводится главным образом к ряду быстрых клеточных делений, или дроблению, при котором общая масса эмбриона остается, как правило, неизменной. В процессе дробления яйца образующиеся клетки постепенно становятся все меньше, пока не достигнут обычной величины зрелой соматической клетки. Хотя на ранних стадиях дробления синтезируются огромные количества ДНК и белков, в это время нет необходимости в синтезе РНК (в транскрипции генов). Это объясняется тем, что еще до оплодотворения в клетках накапливаются огромные резервы информационных РНК, рибосом, транспортных РНК и всех предшественников, необходимых для синтеза макромолекул, а также особых информационных РНК, кодирующих белки, которые необходимы для протекания ранних стадий развития.

Особенно большие запасы питательных веществ требуются тем яйцеклеткам, которые проходят длительный период эмбрионального развития вне родительского организма; в связи с этим яйца земноводных и птиц значительно крупнее, чем, например, яйцеклетки млекопитающих.

Пресноводные и морские беспозвоночные, развивающиеся из небольших яйцеклеток вне родительского организма (такие, как морские ежи), обычно быстро превращаются в способных к самостоятельному питанию личинок.

Во взрослом организме из яйцеклетки может образоваться клетка любого типа. Тем не менее, ее отнюдь нельзя считать недифференцированной клеткой. Она в высшей степени специализирована для выполнения одной-единственной функции - построения новой особи. Прежде чем обсуждать вопрос о том, как протекает развитие яйцеклетки до того момента, когда она становится готова к оплодотворению, рассмотрим вкратце некоторые из ее уникальных особенностей.

15.3.2. Яйцеклетки представляют собой высокоспециализированные клетки, способные к независимому развитию и обладающие большими запасами питательных веществ и совершенной оболочкой [10] Наиболее очевидная отличительная черта яйцеклетки - это ее большие размеры. Типичная яйцеклетка имеет сферическую или овальную форму, а диаметр ее составляет у человека и морского ежа около 100 мкм, у лягушек и рыб от 1 до 2 мм, а у птиц и рептилий измеряется сантиметрами (напомним, что величина типичной соматической клетки всего лишь около 20 мкм) (рис. 15-21 и 15-22). Столь же внушительными могут быть размеры ядра; например, в яйце лягушки величиной 1500 мкм диаметр ядра составляет около 400 мкм; в преддверии быстрых делений, следующих сразу за оплодотворением, в таком ядре откладываются запасы белков.

Потребность клетки в питательных веществах удовлетворяет в основном желток - материал протоплазмы яйца, богатый липидами и белками. Он обычно содержится в дискретных образованиях, называемых желточными гранулами. В яйцеклетках, развитие которых протекает вне материнского организма и приводит к формированию крупных животных, желток может занимать более 95% всего объема, тогда как у млекопитающих, чьи эмбрионы получают большую часть питательных веществ от матери, объем желтка составляет менее 5% объема яйцеклетки.

Другой важной специфической структурой яйцеклетки является наружная яйцевая оболочка покров из особого неклеточного вещества, состоящего в основном из гликопротеиновых молекул, часть которых секретирует сама яйцеклетка, а другую часть - окружающие клетки. У многих видов оболочка имеет внутренний слой, непосредственно прилегающий к плазматической мембране яйцеклетки и называемый у млекопитающих zona pellucida (рис. 15-23), а у других позвоночных и беспозвоночных (например, у морского ежа) - вителлиновым слоем. Этот слой защищает яйцеклетку от механических повреждений; в некоторых яйцеклетках он действует также как видоспецифический барьер для спермиев, позволяющий проникать внутрь только спермиям того же вида или очень близких видов (см. разд. 15.4.2). У животных, не относящихся к млекопитающим, соседние клетки часто выделяют добавочные оболочки, покрывающие вителлиновый слой. Например, когда яйца лягушки проходят из яичника по яйцеводу (трубка, по которой яйца выводятся наружу), их оболочка приобретает несколько дополнительных слоев из студнеобразного вещества, выделяемого эпителиальными клетками яйцевода. Аналогичным образом у куриного яйца при прохождении его по яйцеводу (после оплодотворения) появляются «белок» и твердая скорлупа, тогда как яйца насекомых покрываются тонкой прочной оболочкой, получившей название хориона и выделяемой фолликулярными клетками, окружающими каждое яйцо.

Многие яйцеклетки (в том числе и яйцеклетки млекопитающих) содержат специализированные секреторные пузырьки, находящиеся под плазматической мембраной в наружном, или кортикальном, слое цитоплазмы (рис. 15-24). При активации яйцеклетки спермием эти кортикальные гранулы высвобождают содержимое путем экзоцитоза, в результате свойства яйцевой оболочки изменяются таким образом, что через нее уже не могут проникнуть внутрь яйцеклетки другие спермин (см. разд. 15.4.5).

В то время как кортикальные гранулы обычно равномерно распределены во всем кортексе яйцеклетки, другие компоненты цитоплазмы могут располагаться крайне асимметрично. Например, в яйце лягушки Рис. 15-21. Три различных яйца в натуральную величину. Диаметр Рис. 15-23. А. Микрофотографии яйцеклетки хомячка, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа.

Хорошо видна zona pellucida; на фото Б эта оболочка (к которой прикрепилось много спермиев) частично отогнута и можно видеть лежащую под ней плазматическую мембрану яйцеклетки с многочисленными микроворсинками. (М. Pillips, J. Ultrastruct.

Рис. 15-24. Схематический разрез яйца морского ежа; видно расположение гранул.

Обратите внимание на то, что вителлиновый слой покрыт студенистой оболочкой, толщина которой доходит до 30 мкм.

Рис. 15-25. Различные стадии оогенеза. Из первичных половых клеток, мигрирующих в яичник на ранней стадии эмбриогенеза, развиваются оогонии. После ряда митотических делений оогонии приступают к первому делению мейоза, и на этой стадии их называют уже ооцитами первого порядка. У млекопитающих ооциты первого порядка формируются очень рано и остаются на стадии профазы I (у человека это происходит между 3м и 8-м месяцами эмбрионального развития) до тех пор, пока самка не достигнет половой зрелости. После этого под влиянием гормонов периодически созревает небольшое число ооцитов, которые завершают первое деление мейоза и превращаются в ооциты второго порядка;

последние претерпевают второе деление мейоза и становятся зрелыми яйцеклетками. Стадия, на которой яйцеклетка выходит из яичника и оплодотворяется, у разных животных различна. У большинства позвоночных созревание ооцитов приостанавливается на стадии метафазы II и ооцит второго порядка завершает мейоз лишь после оплодотворения. Все полярные тельца в конечном счете дегенерируют. Однако у большинства животных, в том числе и у млекопитающих, полярные тельца остаются внутри яйцевой оболочки, а у некоторых видов первое полярное тельце этой стадии каждая из хромосом все еще состоит из двух сестринских хроматид; в таком виде хромосомы остаются вплоть до второго деления мейоза, когда хроматиды отделяются друг от друга в результате процесса, сходного с анафазой митоза (см. разд. 15.2.7). После окончательного расхождения хромосом в анафазе II цитоплазма большого ооцита второго порядка вновь делится асимметрично, что ведет к образованию зрелой яйцеклетки (или яйца) и еще одного маленького полярного тельца; при этом обе клетки получают гаплоидное число одиночных хромосом (см. рис. 15-25). Благодаря двум несимметричным делениям цитоплазмы ооциты сохраняют большую величину, хотя они и претерпели два деления мейоза. Все полярные тельца очень малы, и они постепенно дегенерируют.

У большинства позвоночных созревание ооцитов продолжается до метафазы II и приостанавливается на этой стадии. При овуляции ооцит второго порядка освобождается из яичника и в том случае, когда происходит оплодотворение, завершает мейоз.

15.3.4. Яйцеклетка достигает крупных размеров благодаря специальным механизмам [10, 11] Небольшой соматической клетке диаметром 10-20 мкм обычно требуется около суток, для того чтобы удвоить массу при подготовке к делению. Той же клетке при таких же скоростях синтеза макромолекул понадобилось бы очень много времени, чтобы достичь в тысячу раз большей массы, характерной для яйцеклетки млекопитающего (диаметр 100 мкм), или в миллион раз большей массы яйца насекомого (диаметр 1000 мкм). Между тем некоторые насекомые живут всего лишь несколько дней и ухитряются производить яйца, диаметр которых даже больше 1000 мкм. Ясно, что их яйцеклетки должны обладать особыми механизмами для достижения столь крупных размеров.

Одним из факторов, способствующих такому росту, является наличие в клетке дополнительных копий генов. У яйцеклеток многих животных завершение мейоза откладывается почти до самого конца созревания, так что эти яйцеклетки содержат удвоенный диплоидный набор хромосом в течение большей части периода их роста. Таким образом, они содержат вдвое больше ДНК для синтеза РНК, чем имеет средняя соматическая клетка в фазе клеточного цикла. В некоторых яйцеклетках процесс накопления дополнительной ДНК идет еще дальше, приводя к образованию большого числа добавочных копий определенных генов. В гл. 9 мы уже видели, что для образования достаточного числа рибосом, на которых происходит синтез белков, соматическим клеткам большинства организмов требуется от 10 до 500 копий генов рибосомной РНК.

Поскольку яйцеклетки нуждаются в еще большем количестве рибосом для белкового синтеза на ранних стадиях эмбриогенеза, в яйцеклетках многих животных гены рРНК амплифицируются; так, в яйцах рыб и амфибий содержится 1-2 млн. копий таких генов (рис. 15-26).

Рост многих яиц в какой-то степени зависит от биосинтетической активности других клеток. Например, один из важных компонентов крупной яйцеклетки - желток - обычно синтезируется вне яичника и затем переносится в ооцит. У птиц, амфибий и насекомых белковые вещества желтка образуются в клетках печени (или их функциональных аналогах), которые выделяют эти вещества в кровь. Ооциты, находящиеся в яичниках, извлекают эти будущие белковые компоненты желтка из внеклеточной жидкости путем эндоцитоза при участии специфических рецепторов (см. рис. 6-72). Питанию ооцитов могут также способствовать вспомогательные клетки, находящиеся в яичнике. Эту функцию в оогенезе в зависимости от вида организма выполняют вспомогательные клетки яичника двух различных типов. У некоторых беспозвоночных имеются клетки-кормилицы: они обычно окружают яйцеклетку и соединены с ней цитоплазматическими мостиками, по которым макромолекулы могут прямо переходить в ее цитоплазму. Клетки-кормилицы синтезируют для яйцеклеток насекомых такие компоненты (рибосомы, Рис. 15-26. Микрофотография изолированного ядра из яйца лягушки. Ядро окрашено крезиловым фиолетовым, чтобы можно было видеть множество ядрышек результат многократной амплификации генов рибосомной РНК. (D. D. Brown., I. Dawid, Science, 160, 273-275, 1968.) мРНК, белки и т. п.), которые у позвоночных яйцеклетка производила бы для себя сама.

У некоторых видов клетки-кормилицы происходят из того же оогония, из которого образуется соединенный с ними ооцит. Например, у дрозофилы оогоний претерпевает четыре митотических деления, в результате которых образуется 16 клеток. Одна из этих клеток становится яйцом, а другие превращаются в клетки-кормилицы и остаются соединенными друг с другом и с яйцом цитоплазматическими мостиками (рис. 15-27). В клетках-кормилицах происходит многократная репликация ДНК без деления самой клетки, поэтому каждая клетка постепенно достигает очень больших размеров, а количество ДНК в ней в тысячу раз превосходит обычную величину (такая ДНК находится в политенных хромосомах; см.

разд. 9.2.5). Все 15 клеток-кормилиц, содержащих сотни и тысячи эквивалентов генома, синтезируют вещества, необходимые для однойединственной яйцеклетки.

Еще один вид клеток, которые помогают обеспечить питание развивающихся ооцитов,- это фолликулярные клетки, имеющиеся как у позвоночных, так и у беспозвоночных. Они расположены вокруг ооцита в виде эпителиального слоя (рис. 15-28) и связаны с ним щелевыми контактами, через которые могут проходить малые молекулы, но не макромолекулы (разд. 14.1.5). Хотя подобные клетки не могли бы через эти контакты снабжать ооцит готовыми макромолекулами, возможно, что они помогают обеспечить его малыми молекулами-предшественниками, из которых образуются макромолекулы. Кроме того, фолликулярные клетки часто выделяют макромолекулы, которые либо входят в состав оболочки яйцеклетки, либо путем эндоцитоза поступают в растущий ооцит.

Благодаря вспомогательным клеткам, окружающим ооцит, становится возможным продолжение его развития; и у позвоночных, и у беспозвоночных именно вспомогательные клетки реагируют на действие полипептидных гормонов (гонадотропинов), в результате чего прерывается задержка ооцитов в профазе I и они становятся готовыми к дальнейшему созреванию.

15.3.5. Созревание ооцитов у позвоночных инициируется уменьшением внутриклеточной концентрации циклического AMP [12] У многих животных завершение ооцитом мейоза I происходит лишь с наступлением половой зрелости, когда в крови появляются гонадотропины. Эти полипептидные гормоны стимулируют вспомогательные клетки яичника, побуждая их к выделению вторичного медиатора, который в свою очередь воздействует на ооциты и индуцирует процесс их созревания. Для большинства позвоночных созреванием яйцеклетки считается процесс развития ооцита первого порядка, охватывающий период времени от первого деления мейоза до новой задержки ооцита в метафазе II; на этой стадии теперь уже ооцит второго порядка остается до оплодотворения, под влиянием которого происходит завершение мейоза (рис. 15-25).

Процесс созревания яйцеклетки лучше всего изучен у амфибий. У этих животных гонадотропины, находящиеся под контролем гипофиза, действуя на окружающие ооциты фолликулярные клетки, инициируют выделение последними стероидного гормона прогестерона. Подобно другим стероидным гормонам, прогестерон диффундирует через плазматические мембраны большинства клеток-мишеней и связывается с внутриклеточными рецепторными белками, регулирующими транскрипцию специфических генов (см. разд. 12.2.1). Однако в созревании ооцита прогестерон, по-видимому, участвует иначе: полагают, что он связывается с рецепторными белками плазматической мембраны. При этом происходит инактивация аденилатциклазы плазматической мембраны ооцита, в результате чего снижается концентрация циклического AMP в цитозоле и соответственно активность сАМР-зависимой протеинкиназы (А-киназы, см. разд. 12.4.1).

Имеются убедительные свидетельства того, что снижение активности А-киназы является необходимым и достаточным условием для запуска программы созревания ооцита. Микроинъекции каталитически активного фрагмента киназы, активного в отсутствие циклического AMP (см. разд. 12.4.2), ингибируют созревание, индуцируемое прогестероном, тогда как микроинъекции специфического ингибитора киназы инициируют созревание даже при отсутствии прогестерона. Эксперименты на мышиных ооцитах, проводившиеся также с помощью метода микроинъекций, показали, что у млекопитающих действует аналогичный внутриклеточный механизм передачи сигналов. Субстраты А-киназы пока не выявлены, однако полагают, что ими могут быть фосфопротеины, входящие в систему прерывания мейотического деления I, ответственную за задержку ооцита в профазе I. По имеющейся гипотезе, активность таких фосфопротеинов определяется фосфорилированием, осуществляемым А-киназой; падение уровня циклического AMP снимает блокировку мейоза и инициирует его продолжение.

15.3.6. Созревание ооцитов связано с активацией фактора инициации М-фазы [13] Пока еще не выяснено, как развиваются события после падения уровня циклического AMP, но в конце концов они приводят к активации белкового комплекса, называемого фактором инициации М-фазы (ФИМ); полагают, что он необходим для выхода из профазы I мейоза. В гл. говорилось о том, что ФИМ крайне мало изменился в процессе эволюции эукариот. Его ключевая роль в обычном цикле клеточного деления обусловлена тем, что он инициирует переход клетки из G2 в М-фазу (см. разд. 13.1.10). Как уже упоминалось, профаза I мейоза, несмотря на свое традиционное название, очень похожа на фазу G2 обычного клеточного цикла: ДНК уже реплицировалась и является активной в отношении транскрипции, ядерная оболочка интактна, а митотическое веретено деления еще не сформировалось. Более того, подобно переходу из G2 в М-фазу обычной делящейся клетки, переход от профазы I к М-фазе мейоза запускается ФИМ. В действительности ФИМ был впервые обнаружен в ооцитах лягушки в качестве фактора, инициирующего созревание. Зрелые ооциты лягушки задерживаются на стадии метафазы II, когда уровень ФИМ высок (см. далее). Если небольшую часть цитоплазмы такого зрелого ооцита ввести в незрелый ооцит, то под воздействием содержащегося в инъекции ФИМ нарушится целостность мембраны и начнется конденсация хромосом, т. е. будут наблюдаться эффекты, характерные для М-фазы и свидетельствующие о зрелости ооцита.

Замечательное свойство ФИМ состоит в том, что его можно неограниченно долго последовательно переносить из одного ооцита в другой без потери активности, несмотря на то что при подобных последовательных переносах разбавление раствора с ФИМ достигает огромных значений.

Это означает, что инъекции ФИМ стимулируют синтез в реципиенте-ооците еще больших количеств ФИМ. Амплификация происходит даже в безъядерных ооцитах и в присутствии ингибиторов синтеза белков; такой факт указывает на то, что ФИМ скорее всего активирует уже существующие ФИМ, а не индуцирует синтез новых ФИМ.

Какой механизм лежит в основе такой автокаталитической реакции саморазмножения? Несмотря на то что к настоящему времени ФИМ еще не изучен досконально, имеются свидетельства того, что он фосфорилирован, что фосфорилированию принадлежит важная роль в возбуждении активности ФИМ и что по меньшей мере один из компонентов ФИМ является протеинкиназой. Таким образом, ФИМ может сам себя фосфорилировать и, следовательно, активировать. В ооцитах лягушки инактивация А-киназы под действием прогестерона инициирует сложную последовательность событий (сопряженную с синтезом белков), которая в конце концов приводит к активации небольших количеств ФИМ, которые, в свою очередь, активируют новые ФИМ. Интенсивное фосфорилирование структурных белков ядерных оболочек и хромосом характерно для процессов, наблюдаемых в М-фазе (см. разд. 13.5.11), поэтому напрашивается предположение о том, что ФИМ синтезирует еще и неизвестную протеинкиназу, которая вызывает такого рода дальнейшие изменения (рис. 15-29).

Считают, что циклические изменения активности ФИМ, по-видимому, являются решающим фактором регуляции обычного митотического клеточного цикла, определяя моменты вступления клетки в митоз и выхода из него (см. разд. 13.1.10). По-видимому, при созревании ооцитов ФИМ претерпевает аналогичные циклические изменения. Увеличение количества ФИМ сначала запускает прохождение ооцита через профазу и вступление его в метафазу I деления мейоза. Затем последующая инактивация ФИМ позволяет ооцитам завершить деление ядра, а новая активация ФИМ инициирует переход клетки в М-фазу II деления мейоза.

Полагают, что система задержки II мейотического деления (ее иногда отождествляют с цитостатическим фактором, или ЦСФ, свойства которого слабо изучены) на этой стадии предотвращает инактивацию ФИМ, приостанавливая таким образом зрелые яйцеклетки на стадии метафазы П. Оплодотворение, возможно, благодаря повышению концентрации Са2+ в цитозоле (см. разд. 15.4.5), позволяет ооцитам завершить II деление мейоза и вместе с последовательными сериями активации и инактивации ФИМ, определяющими прохождение клеток через повторяющиеся митотические деления, запускает процесс развития эмбриона.

15.3.7. Большая часть ооцитов, не созревая, погибает в яичнике человека [14] Несмотря на то что молекулярные механизмы, лежащие в основе важнейших моментов в процессе развития и созревания ооцитов, по всей видимости, весьма сходны у всех позвоночных, временные параметры этих процессов и характер запускающих их внеклеточных сигналов могут варьировать весьма значительно. Например, у человека эти сигналы значительно более сложны и гораздо менее изучены, чем у амфибий. Более того, количества зрелых яйцеклеток, образующихся у представителей этих двух видов, различаются поразительным образом. У самки лягушки в каждый сезон размножения на протяжении всего репродуктивного периода жизни из оогоний образуются ооциты; сотни их делятся и претерпевают овуляцию под действием гормонов. У женщины же лишь в первые месяцы внутриутробного развития из оогоний образуется несколько миллионов ооцитов, и все они, за исключением нескольких сотен, не созревая, погибают в яичнике.

Ооциты первого порядка у новорожденной девочки останавливаются в профазе I мейоза (подобно ооцитам первого порядка у амфибий), и большая их часть окружена одним слоем фолликулярных клеток; такой ооцит вместе с этими фолликулярными клетками представляет собой примордиальный фолликул (рис. 15-28). За некоторое время до рождения небольшая доля примордиальных фолликулов периодически начинает расти, превращаясь в развивающиеся фолликулы: их клетки увеличиваются и размножаются, образуя вокруг ооцита первого порядка многослойную оболочку; сам ооцит, оставаясь в профазе 1, растет, и у него формируются zona pellucida и кортикальные гранулы (рис. 15-30). В некоторых из развивающихся фолликулов образуется наполненная жидкостью полость, или antrum, при этом они превращаются в антральные фолликулы (рис. 15-31). Чем индуцируется первоначальный рост отдельных примордиальных фолликулов и превращение их в развивающиеся фолликулы, пока неясно. Однако продолжение развития, вероятно, зависит от гонадотропных гормонов гипофиза [в основном от фолликулостимулирующего гормона (ФСГ)] и от эстрогенов, секретируемых самими фолликулярными клетками.

Все развивающиеся фолликулы продолжают расти и в конце концов либо дегенерируют, либо в процессе овуляции высвобождают находящиеся внутри них ооциты. Однако созревание ооцита (прохождение через профазу I) и овуляция происходят лишь после наступления половой зрелости. С этого времени раз в месяц (примерно в середине менструального цикла) резкий подъем уровня другого гонадотропина лютеинизирующего гормона (ЛГ), выделяемого гипофизом, - стимулирует рост в яичнике 15-20 тыс. развивающихся фолликулов. Из всех этих фолликулов лишь один завершает свое развитие: заключенный в нем ооцит первого порядка созревает, доходит до метафазы II деления мейоза и останавливается на этой стадии. Единственный стимулированный фолликул тем временем быстро увеличивается в размерах и разрывается на поверхности яичника, освобождая находящийся внутри него ооцит второго порядка, который к этому времени все еще остается заключенным в оболочку из фолликулярных клеток, внедренную в студРис. 15-31. Микрофотография антрального фолликула в яичнике Рис. 15-32. Здесь схематически показаны стадии развития ооцита у человека. 1. До рождения небольшая доля примордиальных фолликулов последовательно начинает расти, и эти фолликулы называют теперь развивающимися. 2. Некоторые из развивающихся фолликулов накапливают жидкость, превращаясь в антральные фолликулы. 3. С наступлением половой зрелости раз в месяц волна лютеинизирующего гормона (ЛГ) побуждает примерно 20 антральных фолликулов к ускоренному росту, однако завершает созревание и претерпевает овуляцию лишь один из этих фолликулов; ооцит первого порядка, находящийся в этом фолликуле, завершает первое деление мейоза, образуя полярное тельце и превращаясь в ооцит второго порядка (рис. 15-25). 4. Ооцит второго порядка, который был остановлен на стадии метафазы мейоза II, вместе с полярным тельцем и частью окружающих полярных клеток освобождается в тот момент, когда фолликул разрывается на поверхности яичника. Ооцит второго порядка завершает второе деление мейоза только в том случае, если он будет оплодотворен. После овуляции опустевший фолликул превращается в эндокринное образование (желтое тело), которое секретирует прогестерон, тем самым готовя матку к приему оплодотворенного ооцита. Если оплодотворение не наступает, желтое тело претерпевает обратное развитие, а внутренняя слизистая оболочка матки отслаивается и выводится из необразный матрикс (рис. 15-32). Инициация завершения мейоза у освобожденного ооцита произойдет лишь в том случае, если он будет оплодотворен спермием не позже, чем через сутки (или чуть более того).

Каким образом подъем уровня ЛГ, происходящий в середине менструального цикла, инициирует созревание ооцита? По-видимому, фолликулярные клетки, окружающие ооцит, обычно оказывают ингибирующее воздействие на его созревание, поскольку ооциты спонтанно возобновляют ход мейоза в том случае, когда от них удаляют антральные фолликулы и лишают среду, в которой культивируется ооцит, стимулирующих гормонов.. Подъем уровня ЛГ может стимулировать созревание яйцеклетки путем устранения ингибирующего воздействия фолликулярных клеток.

Одна из загадочных особенностей созревания яйцеклетки у человека состоит в том, что лишь малая часть из многочисленных антральных фолликулов, имеющихся в яичниках к моменту ежемесячного выброса ЛГ, начинает расти, и из этих растущих фолликулов только один завершает созревание и освобождает ооцит: остальные обречены на дегенерацию. Вероятно, тотчас после того, как созревание «избранного» фолликула достигло определенной критической точки, вступает в действие некий механизм обратной связи, благодаря которому никакой другой фолликул не может созреть и претерпеть овуляцию в том же цикле. Это означает, что в течение примерно 40-летнего репродуктивного периода у женщины выделяется лишь 400-500 яйцеклеток. Оставшиеся 3 млн. ооцитов первого порядка, имевшиеся в организме к моменту рождения, дегенерируют. До сих пор остается загадкой, почему огромное число яйцеклеток формируется лишь для того, чтобы погибнуть в яичниках.

Ооциты второго порядка, освобождающиеся из яичника (при овуляции) к концу репродуктивного периода, образуются из ооцитов первого порядка, которые провели в остановленной профазе I от 40 до 50 лет. Дефекты, возникающие за это время в яйцеклетке, могут быть причиной высокой частоты генетических аномалий среди детей, рожденных немолодыми женщинами. Например 1% детей у женщин старше 40 лет страдает синдромом Дауна, обусловленным трисомией по 21-й хромосоме (следствие нерасхождения соответствующих гомологов при делении ядра созревающего ооцита в мейозе I) (рис. 15-33).

15.3.8. Спермии отлично приспособлены для внесения своей ДНК в яйцеклетку [15] У большинства видов имеется два вида гамет, поразительно отличающихся друг от друга. Если яйцеклетка - одна из самых крупных клеток Рис. 15-33. Увеличение числа случаев трисомии обычно состоит из двух морфологически и функционально различающихся частей, по 21-й хромосоме (синдрома Дауна) у заключенных в единую плазматическую мембрану: из головки, содержащей необычайно новорожденных в зависимости от возраста сильно уплотненное гаплоидное ядро, и хвоста, который продвигает всю клетку по матери. (По: L. Mastroianni, Jr. and J. D. Digger, направлению к яйцу и способствует прохождению головки через яйцевую оболочку. ДНК в eds. Fertilization and Embryonic Development in ядре неактивна и исключительно плотно упакована, так что объем ее доведен до Vitro, p. 260, Plenum, 1981. минимума. Хромосомы многих сперматозоидов обходятся даже без гистонов, Рис. 15-34. Сперматозоид человека, схематически представленный в продольном разрезе.

15.3.9. У многих млекопитающих спермии образуются постоянно [16] Между процессами образования яйцеклеток (оогенез) и сперматозоидов (сперматогенез) у млекопитающих существует ряд важных различий. Например, мы уже говорили о том, что у женщин на ранней стадии эмбриогенеза из размножающихся оогоний образуется ограниченное число ооцитов, которые через определенные промежутки времени по очереди претерпевают овуляцию. С другой стороны, сперматогенез у мужчин начинается только после полового созревания и затем непрерывно продолжается в эпителиальной выстилке очень длинных, сильно извитых трубочек, называемых семенными канальцами, которые находятся в семенниках. Незрелые половые клетки, называемые сперматогониями, располагаются на самой периферии канальца, у базальной мембраны, где они все время делятся путем митоза. Некоторые из дочерних клеток перестают делиться и дифференцируются в сперматоциты первого порядка. Эти клетки вступают в I профазу мейоза, в которой происходит кроссинговер между их спаренными гомологичными хромосомами, а затем заканчивают первое деление, образуя по два сперматоцита второго порядка; у человека каждый из них содержит 22 дуплицированные аутосомы и одну дуплицированную хромосому X или Y. Каждая хромосома попрежнему состоит из двух сестринских хроматид, и когда оба сперматоцита второго порядка претерпевают второе деление мейоза, образуются четыре сперматиды с гаплоидным числом одиночных хромосом. Затем такие гаплоидные сперматиды в результате морфологической дифференцировки превращаются в зрелые спермии, которые выходят в просвет семенного канальца (рис. 15-37 и 15-38), а позднее - в придаток семенника, представляющий собой извитую трубочку, охватывающую семенник; здесь спермии накапливаются и здесь же продолжается их созревание.

Подобно оогенезу, сперматогенез находится под влиянием гормональной регуляции. После наступления половой зрелости гипофиз мужчины начинает выделять гормон, о котором уже говорилось при обсуждении оогенеза у млекопитающих; это лютеинизирующий гормон (ЛГ).

Под воздействием ЛГ клетки Лейдига, расположенные между семенными канальцами в семенниках, выделяют большие количества мужского полового гормона тестостерона. Последний в свою очередь инициирует сперматогенез; возможно, это происходит благодаря действию тестостерона на клетки Сертоли, которые сплошным слоем покрывают развивающиеся спермии, защищая их и обеспечивая их питание (рис. 15Одна из загадочных и уникальных особенностей спермиев состоит в том, что в процессе их развития митотические и мейотические деления не сопровождаются полным, доведенным до конца делением цитоплазмы (цитокинезом); поэтому все дифференцирующиеся дочерние клетки, происходящие из одного сперматогония, соединены цитоплазматическими мостиками (рис. 15-39). Такие мостики остаются до самого конца дифференцировки спермиев, т. е. до того момента, когда отдельные Рис. 15-37. Различные стадии сперматогенеза. Сперматогонии развиваются из первичных половых клеток, мигрирующих в семенники на ранней стадии эмбрионального развития. Когда животное достигает половой зрелости, сперматогонии начинают быстро размножаться, причем часть из их потомков сохраняет способность к непрерывным неограниченным делениям (сперматогонии типа стволовых клеток), а другая часть (созревающие сперматогонии) после ограниченного числа последовательных митозов приступает к мейозу, превращаясь в сперматоциты первого порядка. После завершения второго деления мейоза сперматоциты первого порядка превращаются в гаплоидные сперматиды, дифференцирующиеся в зрелые спермии. Сперматогенез отличается от оогенеза (рис. 15-25) в нескольких отношениях: 1) после полового созревания в мейоз непрерывно вступают новые клетки; 2) из каждой приступившей к мейозу клетки образуется не одна, а четыре зрелые гаметы и 3) зрелые спермии формируются после Рис. 15-38. Крайне упрощенная схема поперечного разреза семенного канальца из семенника млекопитающего. А. На всех представленных здесь стадиях сперматогенеза развивающиеся гаметы тесно связаны с клетками Сертоли; последние представляют собой крупные клетки, занимающие пространство от базальной мембраны до просвета семенного канальца. На ход сперматогенеза оказывает влияние тестостерон, выделяемый клетками Лейдига, которые располагаются в промежутках между семенными канальцами. Б. Делящиеся сперматогонии находятся вблизи базальной мембраны. Некоторые из этих клеток перестают делиться путем митоза и приступают к мейозу, превращаясь в сперматоциты первого порядка. В конце концов зрелые спермии выходят в просвет канальца. Завершение сперматоцитом мейоза и превращение его в сперматиду занимает у человека около 24 дней, и еще 5 недель требуется на превращение сперматиды в спермий. Спермии претерпевают дальнейшее созревание, обретают подвижность в придатке яичка и лишь тогда становятся совершенно зрелыми.

сперматозоиды переходят в просвет канальцев. Группа клеток, связанных подобным образом, называется синцитием. Наличие этой структуры объясняет синхронность появления зрелых спермиев в любом данном участке семенного канальца.

15.3.10. Ядра спермиев гаплоидны, однако, процессом дифференцировки этих клеток управляет диплоидный геном [17] В отличие от яйцеклеток у сперматозоидов дифференцировка в основном осуществляется после того, как они завершают мейоз и становятся гаплоидными. Благодаря цитоплазматическим мостикам, каждый развивающийся гаплоидный спермий может получать весь набор продуктов полного диплоидного генома. То, что дифференцировкой спермиев, так же как и дифференцировкой яйцеклеток, управляет диплоидный геном, важно по двум причинам. Во-первых, в исходном диплоидном геноме, как правило, содержится некоторое число дефектных аллелей рецессивных летальных мутаций (разд. 15.1.4); гаплоидная клетка, получившая один из этих дефектных аллелей, весьма вероятно, погибнет, если она не будет обеспечена продуктами нормального аллеля, закодированными в других ядрах, которые его содержат. Во-вторых, у некоторых организмов (например, у человека) одни спермии получают при мейозе Х-хромосому, а другие - Y-хромосому. Поскольку Х-хромосома содержит много весьма важных генов, отсутствующих в Y-хромосоме, можно думать, что если бы не цитоплазматические мостики между развивающимися спермиями, то те из них, которые получили Y-хромосому, не выжили бы, и в результате в следующем поколении не было бы ни одного мужчины.

И в самом деле, имеются прямые экспериментальные данные о том, что дифференцировкой спермиев управляют продукты диплоидного Рис. 15-39. Эта схема показывает, каким образом потомки одного созревающего сперматогония на протяжении всего периода дифференцировки их в зрелые спермии остаются связанными друг с другом цитоплазматическими мостиками. Для простоты показано, что в митоз вступают только два созревающих соединенных сперматогония, из которых в конечном счете образуются восемь связанных между собой гаплоидных сперматид. На самом деле число связанных клеток, проходящих два деления мейоза и совместно дифференцирующихся, значительно больше, чем здесь показано.

генома. Часть таких данных была получена при исследовании дефектных в отношении расхождения хромосом мутантов дрозофилы, у которых в процессе мейоза хромосомы неравномерно распределяются между дочерними клетками; в результате одни сперматозоиды содержат слишком мало хромосом, другие - слишком много, а у некоторых их вообще нет. Поразительно то, что дифференцировка всех этих клеток, даже тех, в которых вовсе нет хромосом, протекает нормально. Этот факт можно объяснить на основе упомянутого выше предположения: продукты недостающих хромосом могли бы доставляться путем диффузии по цитоплазматическим мостикам, связывающим соседние клетки. Не исключено и иное объяснение: в диплоидных сперматогониях или сперматоцитах первого порядка могут заранее, еще до мейоза, создаваться «инструкции» для дифференцировки спермия (предположительно в виде долгоживущих мРНК), так что нет необходимости в функционировании гаплоидного генома в период самой дифференцировки. Независимо от того, какое из этих объяснений верно, очевидно, что при дифференцировке спермии используются продукты обоих хромосомных наборов, хотя собственное ядро клетки при этом гаплоидно.

Яйцеклетки развиваются из первичных половых клеток, которые на ранней стадии развития организма мигрируют в яичник и превращаются там в оогонии. После периода митотического размножения оогонии становятся ооцитами первого порядка, которые, вступив в первое деление мейоза, задерживаются в профазе I на время, измеряемое сутками или годами в зависимости от вида организма. В период этой задержки ооцит растет и накапливает рибосомы, мРНК и белки, зачастую используя при этом другие клетки, включая окружающие вспомогательные клетки. Дальнейшее развитие (созревание яйцеклетки) зависит от полипептидных гормонов (гонадотропинов), которые, воздействуя на окружающие каждый ооцит вспомогательные клетки, побуждают их индуцировать созревание небольшой части ооцитов. Эти ооциты завершают первое деление мейоза, образуя маленькое полярное тельце и крупный ооцит второго порядка, который позже переходит в метафазу второго деления мейоза; у многих видов ооцит задерживается на этой стадии до тех пор, пока оплодотворение не инициирует завершение мейоза и начало развития эмбриона.

Спермий обычно представляет собой маленькую и компактную клетку, которая в высокой степени специализирована для функции внесения своей ДНК в яйцеклетку. В то время как у многих организмов весь пул ооцитов образуется еще на ранней стадии развития самки, у самцов после наступления половой зрелости в мейоз непрерывно вступают все новые и новые половые клетки, причем каждый сперматоцит первого порядка дает начало четырем зрелым спермиям. Дифференцировка спермиев осуществляется после мейоза, когда ядра гаплоидны.

Однако, поскольку при митотическом делении зрелых сперматогониев и сперматоцитов цитокинез не доводится до конца, потомки одного сперматогония развиваются в виде синцития. В связи с этим дифференцировка спермия может контролироваться продуктами хромосом от обоих родителей.

15.4. Оплодотворение [18] После своего выхода из гонады как яйцеклетка, так и спермий обречены на гибель в считанные часы, если они не отыщут друг друга и не сольются в процессе оплодотворения. Оплодотворение спасает эти клетки от гибели: яйцеклетка активируется и приступает к осуществлению программы развития, а ядра двух гамет сливаются, формируя таким образом геном нового организма. Большая часть того, что нам известно об оплодотворении, - это результат исследований на морских беспозвоночных, в особенности на морских ежах (рис. 15-40). У подобных организмов оплодотворение осуществляется в морской воде, куда выводятся огромные количества сперматозоидов и яиц. Такой процесс наружного оплодотворения гораздо более доступен для изучения, чем внутреннее оплодотворение у млекопитающих, осуществляющееся в половых путях самки. В связи с этим наше обсуждение оплодотворения будет относиться главным образом к морским ежам. Несмотря на огромную эволюционную дистанцию, которая отделяет млекопитающих от морских ежей, клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе процесса их оплодотворения, по-видимому, весьма сходны.

Рис. 15-40. Фотография двух видов морских ежей, обычно используемых при изучении оплодотворения. Наверху показан Strongylocentrotus purpuratus, внизу Strongylocentrotus franciscanus. Фотографии почти в натуральную величину. (С любезного разрешения Victor Vacquier.) 15.4.1. Контакт со студенистой оболочкой яйца инициирует у спермии морского ежа акросомальную реакцию [19] У самки типичного морского ежа в организме содержится 107 яиц, а у самца - 1012 спермиев, что дает возможность получать гаметы морского ежа в очень больших количествах в виде чистых популяций, где все клетки находятся на одинаковой стадии развития. При смешении гамет различные этапы взаимодействия спермиев с яйцеклетками протекают синхронно с точностью до секунд. Процесс оплодотворения начинается в тот момент, когда головка спермия приходит в соприкосновение со студенистой оболочкой (рис. 15-24) яйцеклетки. Такой контакт инициирует у спермия акросомальную реакцию. В этой реакции содержимое акросомы выводится в окружающее пространство. У морских ежей и многих других морских беспозвоночных высвобождение содержимого акросомы сопровождается образованием длинного содержащего актин акросомального отростка, который вытягивается из переднего конца спермия. Как показано на рис. 15-41, кончик этого отростка покрывается компонентами бывшей мембраны акросомы, а также содержимым акросомы, включающим: 1) гидролитические ферменты, с помощью которых спермий проходит через студенистую оболочку яйцеклетки и достигает вителлинового слоя; 2) специфические белки, обеспечивающие связывание верхушки отростка с вителлиновым слоем (см. ниже), и 3) гидролитические ферменты, благодаря которым акросомальный отросток прокладывает себе путь сквозь этот слой к плазматической мембране яйцеклетки. При контакте мембрана на кончике акросомального отростка сливается с мембраной яйцеклетки, что позволяет ядру сперматозоида войти в яйцеклетку (рис. 15-41).

У спермиев морского ежа акросомальную реакцию вызывает полисахаридный компонент (полимер сульфатированной фруктозы) студенистой оболочки яйца: если выделить это вещество из яиц и добавить его к сперматозоидам, оно за несколько секунд инициирует обычную акросомальную реакцию. Полисахарид студенистой оболочки связывается с гликопротеиновым рецептором плазматической мембраны спермия, вызывая ее деполяризацию; по-видимому, в результате такой деполяризации в мембране открываются каналы для Са2 +, что позволяет ионам Са2+ войти в спермий. В то же время полисахарид студенистой оболочки активирует протонные насосы плазматической мембраны спермия; эти насосы обеспечивают отток из клетки ионов Н + в обмен на Рис. 15-41. На этой схеме показаны подробности акросомальной реакции у морского ежа. При соприкосновении спермия со студенистой оболочкой яйца содержимое акросомы высвобождается путем экзоцитоза (1), после чего следует бурная полимеризация актина, в результате которой образуется длинный акросомальный отросток, проникающий в студенистую оболочку (2). Вышедшие из акросомы белки (показаны черными точками) прилипают к поверхности акросомального отростка и служат как для связывания спермия с вителлиновым слоем, так и для разрушения этого слоя (3). Когда бывшая акросома (мембрана которой образует теперь верхушку акросомального отростка) приходит в контакт с плазматической мембраной яйца (3), две мембраны сливаются, происходит распад актиновых нитей и спермий проникает в яйцо (4). Как спермий находит яйцеклетку для оплодотворения после того, как гаметы выходят в морскую воду? Яйца морского ежа выделяют пептид, называемый резактом, который является видоспецифическим хемоаттрактантом для спермиев морского ежа. Резакт связывается на поверхности спермия с трансмембранным рецептором, который, как обнаружено, представляет собой фермент гуанилатциклазу. Этот фермент катализирует синтез Na +. Обусловленное этим повышение рН в головке спермия и увеличение концентрации цитозольного Са2 + инициируют акросомальную реакцию.

Было высказано предположение, что при повышении внутриклеточного рН неполяризованный актин в цитоплазме спермия отделяется от особых белков, в норме связывающих актин и блокирующих его полимеризацию (см. разд. 11.2.12); это приводит к формированию акросомального отростка в результате «взрывной» полимеризации актина.

Однако удлинение акросомального отростка связано не только с полимеризацией актина. Приток ряда ионов (Са2 +, Na + и С1-) повышает количество осмотически активных молекул в головке спермия, что приводит к притоку в спермий воды. Вызванное этим резкое повышение гидростатического давления, вероятно, способствует удлинению акросомального отростка.

15.4.2. Связывание спермия с яйцеклеткой осуществляется при помощи видоспецифических макромолекул [20] Видоспецифичность оплодотворения особенно важна для обитающих в воде животных, яйцеклетки и спермии которых выводятся в водную среду; ведь в этих условиях возможно их слияние с яйцеклетками и спермиями других видов. У морских ежей такая специфичность проявляется в связывании спермия с вителлиновым слоем, лежащим под студенистой оболочкой: иногда спермии претерпевают акросомальную реакцию при контакте с яйцеклеткой животного другого вида, однако спермии не могут связываться с такими яйцеклетками и, следовательно, не могут оплодотворять их.

Из спермы морского ежа было выделено вещество, которое считают ответственным за видоспецифическое связывание сперматозоидов с вителлиновым слоем. Это белок, получивший название байндина, содержится в акросоме. После своего высвобождения в акросомальной реакции он покрывает поверхность акросомального отростка и способствует прикреплению спермия к яйцу. У каждого вида морских ежей вырабатывается свой особый тип байндина, и молекулы этого байндина связываются с вителлиновым слоем яиц морского ежа только того же вида. Оказалось, что вителлиновый слой одного из видов морских ежей содержит видоспецифический гликопротеин, который выступает в роли рецептора байндина в процессе связывания. Есть данные о том, что байндин действует подобно лектину, узнающему специфические углеРис. 15-42. Молекулы байндина, покрывающие поверхность акросомального отростка сперматозоида морского ежа (схематизировано). Как полагают, эти молекулы связываются специфической сахаридной цепью рецепторной молекулы, находящейся в вителлиновом слое яйца.

водные детерминанты в молекулах гликопротеинов (рис. 15-42). Предполагается, что, поскольку байндин способен инициировать слияние искусственных липидных пузырьков in vitro, он может быть катализатором слияния плазматических мембран акросомального отростка и яйцеклетки после того, как эти мембраны пришли в соприкосновение (разд. 6.5.16).

15.4.3. Активация яйцеклетки опосредуется изменениями внутриклеточных концентраций ионов [21] Как только активированный спермий морского ежа прикрепляется к яйцу, акросомальный отросток быстро прокладывает себе путь через вителлиновый слой. Мембрана на верхушке отростка сливается с плазматической мембраной на кончике микроворсинки (рис. 15-43). Соседние микроворсинки быстро удлиняются и группируются вокруг спермия; затем, по мере того как микроворсинки постепенно растворяются, спермий головкой вперед затягивается в яйцо.

Сперматозоид запускает программу развития, заложенную в яйце. Перед оплодотворением яйцеклетка метаболически неактивна: она не синтезирует ДНК, а РНК и белки образуются в ней очень медленно. Яйцеклетка, вышедшая из яичника и лишенная теперь поддержки окружавших ее клеток, погибает в считанные часы, если не будет спасена спермием. Связывание спермия с поверхностью яйцеклетки индуцирует повышение ее метаболической активности, синтез ДНК и последующее дробление. Однако сам спермий служит лишь устройством для запуска уже заложенной в яйцеклетке программы. Сам он для этого не столь нужен: яйцеклетку можно активировать с помощью множества неспецифических химических или физических воздействий. Например, для яйца лягушки эффективным стимулом может быть укол иглой. (Развитие яйцеклетки, активированной в отсутствие спермия, называется партеногенезом; ряд организмов, в том числе некоторые позвоночные, обычно размножаются путем партеногенеза.) Начальные стадии активации яйцеклетки не могут зависеть от образования каких-либо новых белков, так как они протекают совершенно нормально в присутствии ядов, ингибирующих белковый синтез.

У морских ежей все ранние стадии активации яйца связаны с изменением концентраций содержащихся в нем ионов. Уже в первые секунды или минуты после внесения спермы в суспензию яйцеклеток в них происходят три различных сдвига: 1) увеличение проницаемости Рис. 15-43. Один из моментов в процессе оплодотворения яйца морского ежа спермием (электронная микрофотография). Мембрана на верхушке акросомального отростка слилась с плазматической мембраной яйца на кончике одной из микроворсинок его поверхности. Неоплодотворенное яйцо морского ежа покрыто более чем 100 000 микроворсинками. (С любезного разрешения Frank Collins.) Рис. 15-44. Два ионных сдвига, ответственные за активацию яйца морского ежа после оплодотворения. Примерно через 10 с после оплодотворения начинается высвобождение ионов Са2+ из внутриклеточных хранилищ в цитозоль; их концентрация через 2,5 мин возвращается к уровню, несколько превышающему тот, который свойствен неоплодотворенному яйцу. Приблизительно через 60 с включается механизм выведения ионов Н, сопряженного с притоком Na +, что ведет уже к длительному повышению внутриклеточного рН.

плазматической мембраны для Na + вызывает деполяризацию мембраны в течение нескольких секунд; 2) массовое высвобождение ионов Са 2 + из внутриклеточного хранилища кальция (разд. 11.6.3) ведет к заметному повышению их концентрации в цитозоле в течение примерно 10 с; 3) не более чем через 60 с начинается выведение ионов Н +, сопряженное с поглощением ионов Na +, что приводит к значительному повышению внутриклеточного рН (рис. 15-44). Как будет описано ниже, эти ионные сдвиги обусловливают два физиологических эффекта: во-первых, благодаря им яйцо становится недоступным для проникновения других спермиев и, во-вторых, с их помощью осуществляются первые этапы в развертывании программы развития.

15.4.4. Деполяризация плазматической мембраны яйца обеспечивает быструю блокаду полиспермии [22] Хотя к яйцеклетке может прикрепиться большое число сперматозоидов, только один из них обычно сливается с ее плазматической мембраной и вносит в клетку свое ядро. Если с яйцеклеткой сольются два или несколько спермиев (это называют полиспермией), то будут формироваться добавочные митотические веретена, что приведет к аномальному расхождению хромосом при дроблении; в таких случаях образуются недиплоидные клетки и развитие вскоре прекращается. Это означает, что яйцеклетки, окруженные большим количеством сперматозоидов, после оплодотворения одним из них должны каким-то образом быстро создать препятствие для проникновения дополнительных спермиев. Механизм такой быстрой блокады полиспермии не у всех одинаков.

У рыб в оболочках яиц имеется узкий канал, называемый микропиле, через который спермии могут проходить лишь один за другим;