Этот результат отражает наличие функционального взаимодействия между двумя Wariинсуляторами. Как говорилось выше, такое функциональное взаимодействие было показано для других инсуляторов. Наиболее вероятно, что происходит физическое взаимодействие между двумя Wari-инсуляторами, приводящее к выпетливанию участка ДНК между инсуляторами, более эффективно изолируя промоторы генов от энхансеров.

Рис. 4. Влияние Wari-инсулятора, расположенного за геном mini-white, на энхансерблокирующую активность Wari-инсулятора, расположенного между энхансером и промотором: усиление инсуляции. Обозначения: черный семиугольник – инсулятор Wari.

Сокращения в названиях линий: En – энхансеры тела и крыльев гена yellow и энхансер глаз гена white; Y – ген yellow; W – ген white; элементы, заключенные в скобки, фланкированы сайтами frt или lox, символом обозначена делеция Wari-инсулятора за геном mini-white.

Серым курсором на цифровой панели указано среднее значение фенотипа в анализируемых линиях мух. Остальные обозначения как на рис. 2.

Полученные данные о таком сильном эффекте второй копии Wari-инсулятора привели к закономерному вопросу о возможности влияния Wari-инсулятора,расположенного за геном mini-white, на энхансер-блокирующую активность других инсуляторов. Для ответа на это вопрос были выбраны два хорошо изученных инсулятора: Su(Hw)-инсулятор из ретротранспозона МДГ4 и 1A2-инсулятор. Активности обоих инсуляторов зависят от ДНКсвязывающего белка Su(Hw).

Были созданы две аналогичные предыдущей (рис. 4) конструкции: одна – с Su(Hw)инсулятором (рис. 5A), вторая – c 1A2-инсулятором (рис. 5Б). Su(Hw)- и 1A2-инсуляторы, как и Wari-инсулятор в предыдущей конструкции, были встроены между группой энхансеров и промотором гена yellow в положение -893 относительно старта транскрипции гена yellow.

Рис. 5. Влияние Wari-инсулятора, расположенного за геном mini-white, на проявляемую Su(Hw)-инсулятором (А) и 1A2-инсулятором (Б) энхансер-блокирующую активность:

усиление инсуляции. Обозначения как на рис. 4. Вертикальные стрелки с символом «sce»

обозначают сайты эндонуклеазы рестрикции SceI.

Активность энхансеров в трансгенных линиях мух, несущих данные конструкции, была полностью заблокирована в ситуации с Su(Hw)-инсулятором (рис. 5А, [(En)(Su)YW(Wari)]) и практически полностью заблокирована в ситуации с 1A2-инсулятором (рис. 5Б, [En(1A2)YW(Wari)]).

При делеции Wari-инсулятора наблюдалось значительное падение энхансерблокирующей активности Su(Hw)- и 1A2-инсуляторов (рис. 5А, [(En)(Su)YW] и рис. 5Б, [En(1A2)YW]) как для гена mini-white, так и гена yellow.

Таким образом, показано, что Wari-инсулятор, находящийся за геном mini-white, влияет на энхансер-блокирующую активность Su(Hw)- и 1A2-инсуляторов, находящихся между энхансерами и промотором гена yellow, усиливая инсуляцию.

2) Влияние Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность Wari-, Su(Hw)и 1A2-инсуляторов, «нейтрализация» инсуляции.

Как было сказано выше, функциональные взаимодействия между инсуляторами могут приводить к «нейтрализации» инсуляции.

функциональных взаимодействий между Wari-инсулятором и Wari-, Su(Hw)- и 1A2инсуляторами в эффекте «нейтрализации» инсуляции.

В других работах нашей лаборатории эффект нейтрализации инсуляции наблюдался, если два инсулятора находились между энхансером и промотором на расстоянии в несколько тысяч пар нуклеотидов друг от друга.

Были созданы три конструкции, в которых попарно тестировалась способность инсуляторных элементов к нейтрализации: Wari-Wari, Wari-Su(Hw), 1A2-Wari. Один из инсуляторов был встроен между энхансерами и промотором гена yellow, а другой инсулятор, фланкированный LOX-сайтами, был встроен между генами yellow и mini-white (рис. 6).

Расстояние между инсуляторами составляло около 5 т.п.н.

Оказалось, что, если между энхансером глаз и геном mini-white находились два инсулятора (один из которых Wari-), то во всех трех конструкциях экспрессия гена mini-white была на более высоком уровне, чем в случае, когда присутствовал только один инсулятор (рис. 6). Более высокий уровень экспрессии гена mini-white в линиях с двумя инсуляторами отражает стимуляцию промотора гена mini-white энхансером глаз, присутствующим в конструкции EnWariY(Su)W, так как удаление этого энхансера приводило к резкому падению экспрессии (конструкция EneWariY(Su)W, рис. 6Б). В то же время, экспрессия гена yellow не зависела от присутствия инсулятора между генами yellow и mini-white.

Рис. 6. Влияние Wari-инсулятора на проявляемую другим Wari-инсулятором (A), Su(Hw)-инсулятором (Б) и 1A2-инсулятором (В) энхансер-блокирующую активность:

«нейтрализация» инсуляции. Обозначения как на рис. 5. Ene обозначает делецию энхансера глаз.

Таким образом, инсулятор, расположенный между генами yellow и mini-white, «нейтрализует» инсулятор, расположенный между энхансерами и промотором гена yellow в отношении энхансера глаз гена mini-white. Эффект «нейтрализации» инсуляции отражает наличие функциональных взаимодействий между инсуляторами. Наиболее вероятно, что инсуляторы физически взаимодействуют между собой, что, в свою очередь, приводит к выпетливанию ДНК гена yellow, сближая, таким образом, энхансер глаз с промотором гена mini-white. В то же время, промотор гена yellow остается заблокирован инсулятором.

Таким образом, функциональные взаимодействия между парами инсуляторов WariWari, Wari-Su(Hw) и 1A2-Wari могут проявляться в эффекте «нейтрализации»

инсуляции. В нашем случае это происходит, когда оба инсулятора находятся между энхансерами и промотором гена на расстоянии 5 т.п.н. друг от друга.

3) Wari-инсулятор отличается от других найденных ранее инсуляторов.

Tак как инсуляторы осуществляют свои функции посредством специфических ДНКсвязывающих белков, то закономерен вопрос: с помощью каких белков осуществляется энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора и с помощью каких белков реализуется взаимодействие Wari-инсулятора с инсуляторами Su(Hw) и 1A2. Однако анализ ДНКпоследовательности Wari-инсулятора не выявил сходств ни с ДНК-последовательностями Su(Hw)- и 1A2-инсуляторов, ни с ДНК-последовательностями других регуляторных элементов, обладающими энхансер-блокирующими активностями. Тестирование ДНКпоследовательности Wari-инсулятора на наличие уже известных консенсусов сайтов связывания также не дало результатов: используемая нами программа TRANSFAC(R) Professional r10.2 не выявила сайтов связывания для известных ДНК-связывающих инсуляторных белков: Su(Hw), dCTCF, GAGA, Zw5. Этот факт отличает Wari-инсулятор от других обнаруженных инсуляторных элементов, таких как scs-инсулятор, Fab6, Fab-8 и Mcp, Su(Hw)-инсулятор, 1A2-инсулятор, других Su(Hw)-зависимых инсуляторов. Но так как отсутствие консенсуса сайта связывания для белка не является доказательством неспособности этого белка связываться с последовательностью ДНК, то было решено дополнительно проверить, могут ли самые распространенные инсуляторные белки, а именно Su(Hw) и dCTCF, быть вовлечены в энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора.

С использованием метода торможения ДНК-белковых комплексов в геле Wariинсулятор был протестирован на способность связываться с белками Su(Hw) и dCTCF. Белки Su(Hw) и dCTCF получали in vitro с помощью системы сопряженной транскрипциитрансляции. В качестве положительного контроля были использованы 1A2-инсулятор, который имеет 2 сайта связывания белка Su(Hw), и Fab8, который имеет 2 сайта связывания белка dCTCF. В то время как белок Su(Hw) связывался с последовательностью ДНК инсулятора 1A2, а белок dCTCF связывался с последовательностью ДНК инсулятора Fab8, связывания этих белков с последовательностью ДНК Wari-инсулятора не наблюдалось.

Следовательно, эти белки, по крайней мере in vitro, в отсутствие каких-либо дополнительных факторов, не связываются с последовательностью ДНК Wari-инсулятора.

Эксперименты с линиями мух с мутациями в генах su(Hw) и mod(mdg4)также не выявили участия белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 в энхансер-блокирующей активности Wariинсулятора. Белок Mod(mdg4)-67.2 является вторым белковым компонентом инсуляторного комплекса Su(Hw)-зависимых инсуляторов, он связывается непосредственно с белком Su(Hw) и так же, как и белок Su(Hw), необходим для энхансер-блокирующей активности инсуляторов Su(Hw) и 1A2. В данной работе были использованы линии со следующими мутациями:

mod(mdg4)u1 – мутация гена mod(mdg4), представляющая собой вставку ретротранспозона Stalker в третий экзон гена, в результате чего у белка Mod(mdg4)-67.2 отсутствует С-концевой домен, отвечающий за взаимодействие с белком Su(Hw); su(Hw)v – делеция локуса su(Hw), приводящаяся к полному отсутствию белка Su(Hw); su(Hw)2 – инсерция мобильного элемента jockey в первый интрон, приводящая к десятикратному снижению экспрессии гена su(Hw).

Были проанализированы девять независимых линий мух, несущих мутации генов su(Hw)v/su(Hw)2 и mod(mdg4)u1/mod(mdg4)u1 и содержащих конструкцию, в которой два Wariинсулятора фланкировали гены yellow и mini-white (рис. 4). Оказалось, что данные мутации никак не влияют на энхансер-блокирующую активность Wari-инсулятора. Следовательно, белки Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 не нужны для энхансер-блокирующей активности Wariинсулятора.

Таким образом, белки, отвечающие за энхансер-блокирующую активность Wariинсулятора, и белки, посредством которых реализуется способность Wari-инсулятора взаимодействовать с инсуляторами Su(Hw) и 1A2, еще предстоит открыть. Пока можно лишь утверждать, что Wari-инсулятор отличается от ранее обнаруженных инсуляторов ДНКсвязывающими белковыми компонентами, а также, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не связана с инсуляторными белками Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2.

ГЛАВА III. Выявление функциональной области Wari-инсулятора В геноме Drosophila melanogaster Wari-инсулятор находится между генами white и CG32795, в непосредственной близости от предсказанного начала транскрипции гена CG32795 и включает сигнал полиаденилирования гена white.

Было решено более детально проанализировать 825 п.н. Wari инсулятор и выявить функциональную область Wari-инсулятора.

Для сокращения функциональной области Wari-инсулятора за основу была взята тестсистема с двумя маркерными генами, использованная нами для тестирования Wari-инсулятора на энхансер-блокирующую активность (рис. 2Б и рис. 7А), но, в отличие от предыдущей системы, энхансер глаз был фланкирован сайтами FRT для сайт-специфической рекомбиназы flp с целью более четкого контроля активности энхансера глаз. Исследуемые фрагменты Wariинсулятора были фланкированы LOX-сайтами и встроены между энхансерами и промотором гена yellow в положение –893 относительно начала транскрипции гена yellow (рис. 7А).

Для определения функциональной области Wari-инсулятора, соответствующей меньшей длине ДНК-последовательности, было протестированно 6 фрагментов ДНК Wari-инсулятора:

5'-концевой фрагмент длиной 150 п.н., включающий сигнал полиаденилирования гена white;

фрагмент длиной 554 п.н., содержащий весь Wari-инсулятор, кроме 5'-концевого фрагмента длиной 150 п.н. и 121 п.н 3'-области, содержащей 50 п.н. P-элемента (рис. 7Б). Дополнительно фрагмент Wari-инсулятора длиной 554 п.н. был разбит на два фрагмента, длиной 368 п.н. и 191 п.н., и на два пересекающихся фрагмента, длиной 271 п.н. и 215 п.н (рис. 7Б).

В результате анализа трансгенных линий мух было выяснено, что делеция 150 п.н.

области, содержащей сигнал полиаденилирования гена white, не влияла на энхансерблокирующую активность инсулятора, так как фрагмент длиной 554 п.н. обладал полной инсуляторной активностью Wari-инсулятора (рис. 7Б). по себе 150 п.н. фрагмент инсуляторной активностью не обладал (рис. 7Б). Это означает, что активность Wariинсулятора не ассоциирована с сигналом полиаденилирования гена white. Дополнительная делеция 3'-области Wari-инсулятора также не влияла на способность блокировать энхансеры:

фрагмент длиной 191 п.н. инсуляторной активностью не обладал (рис. 7Б), в то время как фрагмент длиной 368 п.н. обладал полной инсуляторной активностью Wari-инсулятора (рис.

7Б).

В результате проведенных экспериментов функциональная область Wari-инсулятора была сокращена до 368 п.н. (45% исходной длины). Однако дальнейшее сокращение Wariинсулятора привело к резкому уменьшению способности тестируемых фрагментов блокировать энхансеры генов yellow и white. Два перекрывающихся фрагмента длиной п.н. и 215 п.н. лишь частично (по сравнению с полным инсулятором) блокировали энхансеры (рис. 7Б).

Рис. 7. Поиск функциональной области Wari-инсулятора.

А) Модельная система для тестирования ДНК-фрагментов Wari-инсулятора на способность блокировать энхансеры тела и крыльев гена yellow и энхансер глаз гена mini-white.

Б) Сверху представлено схематическое изображение изучаемой области. Черные прямоугольники – кодирующие части генов white и CG32795, белые прямоугольники – 3'НТО и 5'-НТО генов white и CG32795, соответственно.

P* – 50 п.н. фрагмент P-элемента из вектора pCaSpeR, содержащийся в 825 п.н. Wariинсуляторе.

Цифрами обозначено положение тестированных ДНК фрагментов в геноме относительно старта транскрипции гена white. Сверху схематически изображенных фрагментов обозначена их длина. Колонка справа суммирует результаты энхансер-блокирующей активности тестированных фрагментов.

«+» – фрагменты Wari-инсулятора, обладающие исходной энхансер-блокирующей активностью;

«–» – фрагменты Wari-инсулятора, не способные блокировать энхансеры;

«+/–» – фрагменты Wari-инсулятора, обладающие частичной, по сравнению с полным Wariинсулятором, энхансер-блокирующей активностью.

Таким образом, можно сделать вывод, что энхансер-блокирующая активность Wariинсулятора не зависит от присутствия сигнала полиаденилирования гена white.

Выявлена функиональная область Wari-инсулятора: она расположена внутри 825 п.н.

фрагмента и её длина не превышает 368 п.н.

ГЛАВА IV. Проверка Wari-инсулятора на наличие в его составе промотора гена CG Существует несколько моделей действия инсуляторов. Часть из них основана на конкуренции инсулятора с промотором за активность энхансера. Такие модели предполагают, что инсулятор может являться промотором и выступать как «псевдопромотор», перехватывая сигнал энхансера. Как было сказано, в геноме Drosophila melanogaster Wari-инсулятор находится между генами white и CG32795, в непосредственной близости от предсказанного начала транскрипции гена CG32795. Таким образом, нельзя исключить, что 825 п.н.

тестируемый фрагмент может содержать промотор гена CG32795, и что именно промоторная активность обуславливает способность Wari-инсулятора блокировать энхансеры.

Для выяснения этого вопроса в данной работе применили систему определения промоторной активности в эмбриональной клеточной линии S2 Drosophila с использованием плазмид, несущих гены люциферазы светлячка и люциферазы медузы.

Для тестирования промоторной активности Wari-инсулятора было выбрано фрагментов ДНК: полный Wari-инсулятор (длиной 825 п.н); фрагменты Wari-инсулятора, использованные ранее (длиной 554 п.н. и 191 п.н.); фрагмент 1291 п.н. (содержащий область геномной ДНК, 5'-конец которой соответствовал 554 п.н. фрагменту, а 3'-конец заканчивался перед инициаторным кодоном трансляции, т.е. данный фрагмент содержал сокращенный до 368 п.н. инсулятор и всю 5'-НТО гена CG32795; фрагмент длиной 736 п.н., содержащий всю 5'-НТО гена CG32795, за исключением Wari-инсулятора; фрагмент длиной 285 п.н., содержащий 3'-конец полного Wari-инсулятора и область до предсказанного старта транскрипции гена CG32795; фрагмент длиной 93 п.н., содержащий область от Wariинсулятора до предсказанного старта транскрипции гена CG32795 (рис. 8).

Все тестируемые фрагменты были встроены в плазмидный вектор pGL-3-Basic перед кодирующей областью гена люциферазы светлячка (Fluc, firefly luciferase) в двух ориентациях. Исходный плазмидный вектор pGL-3-Basic перед кодирующей частью гена люциферазы светлячка не содержит своего промотора. Для контроля эффективности трансфекции S2 клетки были котрансфецированы тестируемыми плазмидами и плазмидой pAcRL. Плазмида pAcRL содержит кодирующую часть гена люциферазы медузы (Rluc, Renilla luciferase) под контролем актинового промотора. Активности люцифераз определяли на люминометре с помощью системы детекции, позволяющей отдельно измерять активность люциферазы медузы и активность люциферазы светлячка в одной пробе.

Специфический сигнал определяли по отношению активности люциферазы светлячка к активности люциферазы медузы. Фоновый уровень определяли по уровню люминесценции не трансфецированных клеток. Уровень люминесценции клеток, трансфецированных вектором pGL3-Basic, не содержащим промотора, был равен уровню люминесценции не трансфецированных клеток.

Рис. 8. Определение промоторной активности Wari-инсулятора.

Сверху представлено схематическое изображение изучаемой области. Черные прямоугольники – кодирующие части генов white и CG32795, белые прямоугольники – 3'НТО и 5'-НТО генов white и CG32795, соответственно. Цифрами обозначено положение анализируемых ДНК-фрагментов относительно старта транскрипции гена white.

Сверху схематически изображенных фрагментов обозначена их длина.

«+» – фрагменты, обладающие промоторной активностью; «–» – фрагменты, не обладающие промоторной активностью.

В результате анализа люциферазной активности в клетках, трансфецированных тестируемыми плазмидами, нами было обнаружено, что промоторной активностью обладали только два фрагмента в прямой ориентации: фрагмент длиной 1291 п.н. и фрагмент длиной 736 п.н. (рис. 8). Ни 825 п.н. фрагмент, ни другие фрагменты, не включающие 5' – НТО гена CG32795, промоторной активностью не обладали (рис. 8), что говорит о том, что промотор гена CG32795 не входит в состав Wari-инсулятора.

Следовательно, можно утверждать, что энхансер-блокирующая активность Wariинсулятора не ассоциирована с промоторной активностью гена CG32795.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Продемонстрировано, что Wari-инсулятор, находящийся за геном mini-white, усиливает инсуляцию своей собственной копии, расположенной между энхансером и промотором гена.

Этот эффект можно объяснить физическим взаимодействием между двумя Wariинсуляторами. Вероятно, в результате такого взаимодействия, ДНК между инсуляторами образует петлю, а блокирование энхансеров усиливается за счет образования более массивного белкового комплекса, ограничивающего энхансеры от промоторов генов.

Выяснено, что белки Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2, являющиеся белковыми компонентами Su(Hw)-зависимых инсуляторов, не требуются для проявления энхансер-блокирующей активности Wari-инсулятора. Тем не менее, Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать, хотя и слабее, чем с Wari-инсулятором (своей второй копией), с Su(Hw)- и 1A2-инсуляторами, влияя на их энхансер-блокирующую активность. Это свойство Wariинсулятора может объясняться возможным участием общих белковых компонентов инсуляторных комплексов. Так, недавно в одной из работ другой лаборатории было показано, что, хотя Su(Hw) и dCTCF белки не взаимодействуют друг с другом и их сайты связывания не перекрываются на политенных хромосомах, они оба взаимодействуют с белком CP190.

Возможно, что CP190 или другой аналогичный белок, присутствующий сразу в нескольких инсуляторных комплексах, может принимать участие во взаимодействиях между разными инсуляторами. Однако какие белки взаимодействуют с Wari-инсулятором, еще предстоит выяснить.

В данной работе показано, что функциональное взаимодействие Wari-инсулятора c Wari-, Su(Hw)- и 1A2-инсуляторами может выражаться как в усилении, так и в «нейтрализации» инсуляции. Полученные данные отражают сложность функциональных взаимодействий между регуляторными элементами в геноме и подчеркивают неприемлемость упрощенных моделей их действия. В любом случае, становится очевидно, что изучение функциональных свойств инсуляторов должно включать, а предлагаемые модели механизмов их действия должны учитывать возможность взаимодействия с другими инсуляторами.

Одним из важных результатов данной работы является обнаружение ранее неизвестного инсулятора в трансгенной модельной системе, используемой во многих лабораториях мира.

Такие трансгенные системы, содержащие ген mini-white и, как оказалось, одновременно Wariинсулятор, использовались для тестирования инсуляторов на энхансер-блокирующую активность, анти-инсуляторную активность регуляторных элементов PTS, барьерную активность инсуляторов и MAR-элементов и просто в качестве маркерного гена.

Как было показано в данной работе на примере инсуляторов Su(Hw) и 1A2, обнаруженный инсулятор мог влиять на проявляемые свойства тестируемых элементов.

Вполне вероятно, что Wari-инсулятор мог оказывать влияние и на другие получаемые результаты, и, по-крайней мере, некоторые из них должны быть пересмотрены с учетом присутсвия в системе Wari-инсулятора и проанализированы в его отсутствие.

ВЫВОДЫ

2. Продемонстрировано, что Wari-инсулятор способен функционально взаимодействовать со своей второй копией, а также с Su(Hw)- и 1A2-инсуляторами.

3. Выяснено, что энхансер-блокирующая активность Wari-инсулятора не зависит от сигнала полиаденилирования гена white. Показано, что функциональным (обладающим полной энхансер-блокирующей активностью) является участок Wari-инсулятора длиной 368 п.н.

4. Показано, что Wari-инсулятор не обладает промоторной активностью.

СПИСОК ПЕЧАТНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

2. Максименко О.Г., Четверина Д.А., Георгиев П.Г. 2006. Свойства, механизмы действия инсуляторов высших эукариот и их роль в регуляции транскрипции. Генетика 42 (8), 1029Тезисы конференций:

1. Darya Chetverina, Ekaterina Savitskaya, Olga Zaytseva, Alexander Parshikov, Pavel Georgiev.

CHARACTERIZATION OF NEW ENDOGENOUS INSULATOR FOUND BETWEEN WHITE

2. D. Chetverina, E. Savitskaya, A. Parshikov, M. Karakozova and P. Georgiev. Characterization of new endogenous insulator located downstream the white gene in Drosophila melanogaster. 7th Young Scientist Forum Molecular Networks (YSF Vienna) July 5-7 2007 and 32nd FEBS Congress MOLECULAR MACHINES July 7-12, Vienna, Austria.

3. Pavel G Georgiev, Darya Chetverina. Study of an endogenous insulator found downstream of the Drosophila mini-white gene. 48th Annual Drosophila Research Conference, Philadelphia, PA, March 7-11, 2007.

4. Daria Chetverina. Properties of new insulator located at the end of the white gene in D.

melanogaster. 4th Elmau Conference On Nuclear Organization At Gostau, Austria. October 12th – October 15th 2006. EMBO Workshop on Nuclear Organization: Systems Biology Meets Chromatin Function.

5. Daria Chetverina. Study of new insulator located downstream of the white gene in D.melanogaster.

40 Years’ Spetsai Summer School Anniversary. Workshop on Molecular and Cell Biology at Spetsai: Past, Present and Future – A Forty Years Anniversary. Island of Spetses, Greece – 1- September 2006.

6. Четверина Д.А., Савицкая Е.Е., Каракозова М.В., Георгиев П.Г. Изучение свойств нового инсулятора, локализованного в 3'-нетранслируемой области гена white у D.melanogaster.

Материалы 10-й Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 17-21 апреля 2006 г.

7. P. Georgiev, M. Kostuchenko, E. Kravchenko, D. Chetverina, O. Maksimenko, A. Parshikov, L.

Melnikova, A. Golovnin. The mechanisms of long-distance interactions and insulator action in Drosophila melanogaster. HHMI, Merida, Mexico