1

На правах рукописи

СОЛОВЬЕВА

ИРИНА ВЛАДЛЕНОВНА

МИКРОЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ КОРРЕКЦИИ

«ДИСБИОЗНОЙ» МИКРОБИОТЫ ЧЕЛОВЕКА

03.02.08 – экология (биология)

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Нижний Новгород 2013 2

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. академика И.Н.Блохиной» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека и Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждением высшего профессионального образования «Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского» – Национальный исследовательский университет (ННГУ) доктор биологических наук, профессор Научные консультанты:

Гелашвили Давид Бежанович доктор медицинских наук, профессор Ефимов Евгений Игоревич Зав. отделом биологических исследований

Официальные оппоненты:

НИИ Химии ННГУ, доктор биологических наук, профессор Смирнов Василий Филиппович Директор ФБУН «ННИИГП»

Роспотребнадзора, доктор медицинских наук, профессор Рахманов Рофаиль Салыхович профессор кафедры микробиологии и иммунологии НижГМА, доктор биологических наук Заславская Майя Исааковна ГНЦ РФ Институт медико-биологических

Ведущая организация:

проблем РАН, (г. Москва) в 1300 часов на заседании

Защита диссертации состоится «16» октября 2013 г.

диссертационного совета Д 212.166.12 при ННГУ по адресу: 603950 г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, ауд. 321, биологический факультет.

факс: (831) 462-30- E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ, с авторефератом - в сети Интернет на сайте ННГУ по адресу: http://www.unn.ru, на сайте ВАК России – http://vak2.ed.gov.ru/catalogue

Автореферат разослан «30» августа 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.С. Снегирева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Изучение микробной эндоэкологии человека (микроэкологии) относится к одному из наиболее актуальных направлений прикладных и фундаментальных исследований в области экологии, биологии, и медицины. Это связано с важной ролью, которую играет микробиота в жизнедеятельности макроорганизма, а также с повсеместно наблюдаемыми изменениями экологии микроорганизмов, повлекшими нарастание удельного веса заболеваний, вызываемых микробами-оппортунистами. В связи с этим большой интерес представляет изучение видового разнообразия и структуры сообщества симбиотических микроорганизмов человека. В организме человека наибольшим видовым богатством характеризуется микробное сообщество толстой кишки.

Известно, что нет ни одной функции макроорганизма, на которую прямо или косвенно не влиял бы микробиоценоз этого биотопа (Ткаченко, 2009).

Следует отметить, что, несмотря на большое количество работ, посвященных микробиоценозам кишечника, изучением качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки у «здоровых» людей разных возрастных групп занималось не так много исследователей, а выбранные группы «здоровых» были довольно малочисленны. Это обусловлено тем, что понятие «здоровье» не имеет четкого определения и носит, скорее, философский характер, в связи с чем затруднительно формировать группы «действительно здоровых» людей для определения «нормальных» показателей микрофлоры. Фактически это десять крупных исследований (Перетц, 1955; Геймберг, 1964; Гончарова, Вильшанская, 1968; Ленцнер, 1968; Haenel, 1970; Марко, 1970; Лизько, 1970; Куваева,1976;

Эпштейн-Литвак, Вильшанская, 1977; Козлова, 1978). В большое количество монографий по этой тематике, выпущенных в последние годы, включены результаты именно этих исследований, они же обобщены в ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника». Другой аспект этой темы сводится к частным вопросам: частоте обнаружения того или иного вида микроорганизмов в микробиоте, изучению микрофлоры определенных возрастных групп при различной патологии и т.п. В этих исследованиях за показатели «нормы» до сих пор принимают данные 50-70гг. прошлого века.

В настоящее время появились новые доступные высокотехнологичные методы исследований, позволяющие более подробно изучать видовую структуру симбиотических сообществ микробиоты организма человека. Современные информационные технологии дают возможность структурировать обширные базы данных, оценивать как множество единичных показателей, так и их совокупность в многомерном пространстве показателей, проводить статистический и экологический анализ. В частности, экологический анализ успешно применен при изучении эндоэкологии симбиотических сообществ микробиоценоза миндалин человека (Бухарин и др., 2011). Однако масштабные исследования видовой структуры симбиотических сообществ микробиоценозов толстой кишки человека до настоящего времени не проводились. В связи с этим актуальным вопросом является изучение закономерностей, управляющих динамикой численности популяций микроорганизмов в составе микробиоты, ее пространственной и видовой структурой, изучение разнообразных типов межпопуляционных отношений, обеспечивающее образование сообществ как систем с относительно стабильным видовым составом.

Понимание и теоретическое осмысление экологических закономерностей функционирования симбиотической микрофлоры является необходимой предпосылкой для развития и совершенствования способов влияния на ее формирование и нормализацию с помощью различных форм пробиотиков из представителей резидентной микрофлоры. Широкое распространение дисбиотических нарушений ставит на повестку дня важность разработки методов комплексной коррекции микробиоты, направленных не только на восстановление эволюционно обусловленных микробных популяций, но и обеспечивающих воздействие на макроорганизм в целом.

Цель работы: на основании изучения экологических закономерностей формирования сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп, проживающих на территории крупного промышленного мегаполиса, создать новые пробиотики в форме бактериальных концентратов, восстанавливающие эволюционно обусловленную микробиоту человека.

Задачи исследования:

1. Изучить видовую структуру сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп (от периода новорожденности до старости), проживающих на территории города Нижнего Новгорода.

2. Провести выбор параметров оценки состояния микробиоценозов толстой кишки.

3. Создать базу данных результатов исследования качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки «больных» и «здоровых»

людей разных возрастных групп, и систему управления базой данных для сбора, хранения, статистической обработки и графического представления данных.

4. На основе анализа результатов структурирования базы данных произвести отбор видов микроорганизмов, перспективных в качестве стартерных культур пробиотиков.

5. Изучить биологические и молекулярно-генетические свойства микроорганизмов продуцентов пробиотиков с целью подбора производственно перспективных штаммов.

6. Сконструировать новые пробиотики для коррекции микробиоты человека и отработать технологии их производств.

7. Оценить эффективность введения новых пробиотиков в комплексы профилактических, лечебно-оздоровительных и реабилитационных мероприятий у разных возрастных групп населения с различными нозологическими формами заболеваний, протекающих на фоне «дисбиозной» микробиоты.

8. Разработать алгоритмы комплексной коррекции микробиоты желудочнокишечного тракта разных возрастных групп населения.

бактериологических исследований качественного и количественного состава микрофлоры толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп, проживающих на территории г. Нижнего Новгорода, и система управления базой данных, позволившая провести синэкологический анализ сообществ симбиотических микроорганизмов (Свидетельство о госрегистрации № РФ). Доказано, что в процессе формирования микрофлоры кишечника человека участвуют как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы, причем в равных соотношениях с первого часа жизни, процесс нарастания анаэробной компоненты (представители родов Lactobacillus, Lactococcus и Bifidobacterium) идет параллельно с ростом условно-патогенных микроорганизмов и кишечной палочки, минуя стадию «трансформации». С наибольшей частотой 92% оппортунистические микроорганизмы в значимых количествах (> 10 КОЕ/г) выделяются в группе «здоровых» детей в возрасте от одного месяца до года. Частота обнаружения УПМ в микрофлоре толстой кишки здорового человека начинает снижаться после первого года жизни и составляет 18% в возрастной группе 60 лет и старше. Доказано, что общее количество симбиотических микроорганизмов различных видов, выделяемых из толстой кишки «здоровых» людей во всех возрастных группах, на один-два порядка выше, чем у больных (p 105 КОЕ/г) выделяются у «здоровых» детей в возрастной группе 1- месяцев с последующим резким снижением в возрасте от года до 17 лет, с дальнейшим сохранением стабильно невысокой частоты выделения у взрослых.

4. Численность бактерий родов Lactobacillus и Bifidobacterium, а также E. coli, Enterococcus spp, S.epidremidis, S. aureus, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Proteus spp., Enterobacter spp. относится к «информационно-значимым показателям», поскольку их численность статистически значимо различается у «здоровых» и «больных» людей одного возраста и между возрастными группами, что позволяет верифицировать классификационные решения по разделению пациентов на категории «здоровые» и «больные» с учетом возраста в многомерном пространстве показателей.

5. Видовая структура сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека, представленных фиксированным набором клинически значимых культивируемых видов, может быть описана в рамках экологического анализа при помощи канонических индексов и показателей экологического разнообразия, что свидетельствует о применимости положений современной теоретической экологии к характеристике микробиоценозов макроорганизма.

6. Выявлен феномен усиления антагонистической активности по отношению к грибам вида C. albicans совместно выращенной композиции штаммов лактобацилл L.plantarum 8RA-3 и L. fermentum 39 по сравнению с их аксеничными культурами.

7. Для контроля динамики роста стартерных культур при совместном периодическом и непрерывном культивировании целесообразно использовать метод индикации и идентификации симбиотических видов бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium на основе гнездовой ПЦР гена 16S рРНК.

8. Высокая эффективность дополнения базовой терапии различных нозологических форм заболеваний, осложненных дисбиозами, новыми жидкими мультиштаммовыми пробиотиками из лакто- и бифидобактерий доказывает лидирующее значение последних в обеспечении образования сообществ как систем с относительно стабильным видовым составом у людей разного возраста.

Апробация работы и публикации. Основные положения диссертации доложены на всероссийской конференции с международным участием «Пробиотики и пробиотические продукты в профилактике и лечении наиболее распространенных заболеваний человека» (г. Москва, 1999); всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Гигиена детей и подростков на пороге третьего тысячелетия. Основные направления развития» (г. Москва, 1999); IV международном симпозиуме «Биологически активные добавки к пище: XXI век (г.

Москва, 2000); международной конференции, посвященной памяти академика РАМН и АМТН И.Н.Блохиной (г. Москва, 2001); I-м всероссийском конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва, 2002); XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». г. Москва, 19- апреля, 2004г.; Международной конференция «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Современное состояние и перспективы». Форум «Новые технологии. Экология и здоровье». г. Москва, 2- июня, 2004.; III съезде Всероссийского общества биотехнологов России. г. Москва, 25-27.10.2005.; 6-м съезде научного общества гастроэнтерологов России, г. Москва, 1-3 февраля 2006; 4-м съезде биотехнологов России, г. Пущино. 5-7.12.2006;

Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», г.Санкт-Петербург, 15-18.05 2007; Международном форуме «Современные технологии на службе охраны здоровья россиян» в рамках выставки «Медицина+», г. Нижний Новгород, 27.04.2010; круглом столе в рамках конференции, посвященной долгожителям Грузии в Сендайском университете (г.Сендай, Япония), 24.07.2010; конференции Японского общества по молочнокислым бактериям (г.Сендай, Япония), 26-27.07.2010; кафедре микробиологии университета Киорин (Токио), 28.07.2010; международной конференции «Пробиотики и здоровье», г.

Ереван, Армения, 05-07.10.2010; Международная конференция «Пробиотики и бактериофаги как альтернатива антибиотиков», Тбилиси, Грузия, 29.06.-04.07.2012;

Научно-практический конгресс с международным участием «Актуальные вопросы детской гастроэнтерологии», Киев, 28-29 ноября 2012; XIV Международном медицинском форуме «Технологии профилактики – современный путь развития здравоохранения», Н.Новгород, 28-30 мая 2013.

По материалам диссертации опубликовано 53 работы, из них 28 в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка цитированной литературы и приложения. Диссертация иллюстрирована 123 рисунками и 63 таблицами.

Основной текст изложен на 396 страницах. Библиографический указатель включает 373 источника литературы (282 отечественных и 91 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

СОВРЕМЕННЫЕ АСПЕКТЫ СИНЭКОЛОГИИ СИМБИОТИЧЕСКИХ

МИКРООРГАНИЗМОВ ТОЛСТОЙ КИШКИ ЧЕЛОВЕКА И ПРИНЦИПЫ

КОРРЕКЦИИ МИКРОБИОТЫ С ПОМОЩЬЮ ПРЕПАРАТОВ ИЗ

ШТАММОВ-СИМБИОНТОВ

В главе на основе данных отечественной и зарубежной литературы приведены сведения о видовой структуре биотических сообществ как объекта биоэкологических исследований, о роли симбиотической микробиоты в процессе жизнедеятельности макроорганизма, представлена структурная организация микробиоценоза пищеварительного тракта. Приведена информация о качественном, количественном составе и функциях «нормальной» микрофлоры желудочнокишечного тракта (ЖКТ), о процессе ее формирования в младенческом и раннем детском возрасте, а также о факторах и механизмах развития дисбиоза. Даны представления о средствах и принципах коррекции «дисбиозной» микрофлоры различных биотопов организма человека. Освещены вопросы конструирования пробиотических препаратов, продуктов питания и БАД к пище и методов их контроля.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Исходя из цели настоящей работы был определен дизайн исследования:

1. Обозначены возрастные группы.

2. Определены критерии оценки состояния здоровья для каждой возрастной группы для выделения категорий «здоровых» и «больных».

3. Изучен качественный и количественный состав микрофлоры просвета толстой кишки и определен характеризующий его перечень показателей.

4. Создана электронная база данных и система управления базой данных (СУБД).

5. Проведено структурирование базы данных.

6. В результате структурирования базы данных определены информационнозначимые виды микроорганизмов с точки зрения понятий «здоровье» и «болезнь»

для каждой возрастной группы.

7. Из информационно-значимых видов выбраны представители индигенной микрофлоры, безусловные пробиотические микроорганизмы – представители родов Bifidobacterium и Lactobacillus.

8. В результате изучения биологических и молекулярно-генетических свойств культур в соответствии с требованиями, предъявляемыми к пробиотическим микроорганизмам, отобраны производственно-перспективные штаммы лакто- и бифидобактерий.

9. Сконструирована гипоаллергенная питательная основа, в качестве полупродукта которой использован гидролизат белка, позволяющая проводить культивирование как лакто-, так и бифидобактерий с достаточной степенью выхода биомассы и сохранностью готового продукта в течение 60 суток.

10. Сконструированы новые жидкие пробиотики в форме бактериальных концентратов, содержащие в качестве стартерных культур отобранные штаммыпродуценты, разработаны технологии производства, оформлены пакеты нормативно-технической документации и налажен выпуск пробиотиков.

11. Изучена эффективность коррекции микробного симбиоза с помощью вновь сконструированных пробиотиков у больных с различными нозологическими формами заболеваний, а также использования их для профилактики дисбиоза у лиц из контингента риска по его формированию.

12. Созданы алгоритмы коррекции «дисбиозной» микробиоты.

Количество обследованных людей по возрастным группам 1. Изучен качественный и количественный состав микрофлоры толстой кишки 3268 «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп, всего проведено 5837 анализов (табл. 1).

2. В процессе исследования выделено 32 784 культуры, идентифицировано до вида 23 497 штаммов микроорганизмов, как представителей облигатной микрофлоры, так и условно-патогенных и патогенных микроорганизмов различных родов. Из них выбрано для изучения антагонистической активности производственно-перспективных штаммов 453 штамма патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, 314 культур С. albicans, а также эталонные штаммы S. flexneri 170, S. flexneri 337, S. sonnei 5063, E. coli 157, S. aureus 209, P. mirabilis H-237, P. vulgaris 177, E. coli M-17 из коллекции ФГБУ НЦЭСМП. В исследовании использовали 53 штамма лактобацилл из ВКПМ ФГУП «ГосНИИгенетика», коллекции ФГБУ НЦЭСМП, ВКМ ИБФМ РАН, ГК лактобацилл ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н. Блохиной, а также штаммы бифидобактерий: B. bifidum 1, B. bifidum 791, B. longum 379 из ГКНМ ФБУН МНИИЭМ имени Габричевского.

2.3. Методы изучения видового состава и численности симбиотических Изучение микрофлоры толстой кишки проводилось в соответствии с Методическими указаниями «Бактериологическая диагностика дисбактериоза кишечника», по методу разработанному Р.В. Эпштейн-Литвак и Ф.Л. Вильшанской (1969) и модифицированному в ННИИЭМ (Диагностика и биокоррекция, 2004).

Оценку результатов бактериологического исследования проводили в соответствии с ОСТ 91500.11.0004-2003.Протокол ведения больных…, (2003).

Изучение микрофлоры репродуктивного тракта проводилось по методу, разработанному ранее в лаборатории кишечных инфекций ГНИИЭМ (Соловьева, 1987).

Идентификация патогенных и условно-патогенных микроорганизмов проводилась в соответствии с Приказом Минздрава СССР от 22.04.1985 №535 «Об унификации микробиологиченских (бактериологических) методов исследования, применяемых в клнико-диагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений»; методическими рекомендациями Минздрава РСФСР "Методы бактериологического исследования условно-патогенных микроорганизмов в клинической микробиологии", от 19.12.1991, а также с рекомендованными Лабораторным Советом Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ методиками (Пивоваров, Королик, 2000; Донецкая, 2011; Поздеев, Федоров, 2007.) Для выделения Candida spp. использовали соскобы с кожи или слизистых оболочек, ногтевые чешуйки, мочу, фекалии, полученные от больных различных возрастных групп с разнообразными заболеваниями кандидозной этиологии и кандидоносителей (Реброва, 1989; Егорова, Минскер, 1988; Андреев и др., 2008).

Биохимическую идентификацию бактерий рода Lactobacillus и Bifidobacterium проводили классическим методом с использованием дисков с углеводами и бульона с бромкрезоловым пурпурным производства «HiMedia Laboratories Pvt. Limited», Индия, и тест-систем Api-20CHL, Api-50CHL производства bioMerieux, Франция.

Биосовместимость штаммов-продуцентов изучали методом наложенных капель на твердой среде МРС-4 (Глушанова, 2005, МУ 2.3.2.2789-10).

Антагонистическую активность штаммов-продуцентов в отношении УПМ выявляли методом отсроченного антагонизма на плотной среде по методу Фредерика в модификации А.А. Ленцнера (Ленцнер, 1964; ФС Лактобактерин сухой, 2000).

Изучение антибиотикорезистентности штаммов-продуцентов проводили в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам» и МУ 2.3.2.2789-10. В исследовании использовали препараты 14 фармакологических групп – по одному антибиотику из каждой группы.

Выживаемость штаммов-продуцентов пробиотиков в кислой среде и способности к деканьюгации желчных солей изучали in vitro по МУ 2.3.2.2789- «Методические указания по санитарно-эпидемиологической оценке безопасности и функционального потенциала пробиотических микроорганизмов, используемых для производства пищевых продуктов».

Установление сроков годности пробиотиков проводили в соответствии с МУК 4.2.1847-04 от 20 июня 2004 года «Санитарно-эпидемиологическая оценка обоснования сроков годности и условий хранения пищевых продуктов», причем устанавливали количество живых микроорганизмов каждого входящего в композицию штамма с помощью классической идентификации по биохимическим свойствам.

Методика молекулярно-генетического анализа. Пробоподготовка к проведению полимеразно-цепной реакции, ПЦР и ее модификации, электрофорез в агарозном геле, учет результатов электрофореза, выделение и очистка амплифицированной ДНК, секвенирование фрагментов генов проводились по стандартным методикам (МУ 2.3.2.2789-10).

В работе использованы праймеры, предложенные в научной литературе, (Ward, Timmins, 1999; Walter, Tannock, Tilsava-Timisjarvi, 2000 Chagnaud, 2001), а также родовые праймеры для индикации лактобацилл и бифидобактерий и видовой праймер специфичный для L. delbrueckii, сконструированные в рамках работы Точилиной (2009).

Исследована динамика роста бактерий в условиях раздельного и совместного культивирования (Точилина,2009).

Выбор показателей, учитываемых в данной работе при характеристике качественного и количественного состава микрофлоры ЖКТ человека осуществлялся с помощью метода экспертных оценок (Орлов, 2002).

Статистическая обработка полученных результатов. Проверка данных на нормальность распределения проводилась с применением статистических критериев Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка. Дальнейший статистический анализ проводился с помощью непараметрических критериев Манна-Уитни и КрускалаУоллиса (Гланц, 1998; Сергиенко, Бондарева, 2006; Банержи, 2007). В работе использован многомерный кластерный анализ методом Варда, данные кластеризации проанализированы с помощью метода К-средних. Статистическая обработка материала была проведена с использованием прикладной программы STATISTICA 8.0 фирмы StatSoft и созданной нами программы для ЭВМ «Автоматизированная система микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)» (свидетельство о государственной регистрации программы № 2011614233, зарегистрировано в реестре программ для ЭВМ 30.05.2011). Критический уровень значимости принимали р=0,05. В случае множественных сравнений производилась корректировка критического уровня значимости с помощью поправки Бонферрони (Гланц, 1998).

Для описания ранговых распределений симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека применялась гиперболическая модель, адекватность которой оценивали при помощи коэффициента детерминации (Левич и др., 2009).

Для сравнительного анализа перестройки ранговых распределений численности микрофлоры толстой кишки человека в возрастном аспекте был использован прием с фиксацией порядка показателей для «референс-группы» «здоровых» и «больных», который сохранялся для последующих возрастных групп, так называемые ранговые профили (Гелашвили и др., 2001).

Экологический анализ исходных данных. Для количественного описания видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека проведены расчеты с использованием общепринятых в экологии индексов:

видового разнообразия Шеннона (Мэгарран, 1992; Одум, 1975), доминирования Симпсона (Одум, 1975), видового богатства Маргалефа (Маргалеф, 1992) и выравненности Пиелу (Мэгарран, 1992; Одум, 1975). Для подтверждения сделанных обобщений и получения статистически корректных оценок различий (t-критерий Стьюдента) в видовом разнообразии микрофлоры толстой кишки разновозрастных групп здоровых и больных людей, был применен индекс Шеннона, для которого разработаны соответствующие алгоритмы (Мэгарран, 1992).

ГЛАВА 3. СИНЭКОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СИМБИОТИЧЕСКОЙ

МИКРОБИОТЫ ТОЛСТОЙ КИШКИ ЛЮДЕЙ РАЗНЫХ ВОЗРАСТНЫХ

В процессе проведения исследования проведен выбор параметров оценки состояния микробиоценозов толстой кишки, создана база данных результатов бактериологических анализов и система управления базой данных для сбора, хранения, статистической обработки и графического представления данных.

позволившая провести синэкологический анализ видовых сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп.

Все обследованные люди были разделены на возрастные группы.

Группы «здоровых» людей были сформированы по критериям здоровья, определенным для каждой возрастной группы в отдельности (Вельтищев, Ветров, 2002; Казин, Блинова, Литвинова, 2000). Критерии подробно описаны в диссертации в разделе «Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» людей».

Группы «больных» в возрасте от 7 дней и более были сформированы по следующим критериям: «больные» – лица, в анамнезе которых на момент обследования отмечались хронические заболевания в стадии обострения или клинические проявления острой формы, на фоне применения антибактериальных и/или других лекарственных средств, так и при первичном обращении до назначения этиотропной терапии, а также все не вошедшие в группу «здоровые».

К группам «больных» детей в возрасте 0 ч. - 23 ч. и 24 ч. – 6 с. были отнесены доношенные дети без врожденных уродств и выраженной патологии, отнесенные к подгруппе риска по развитию гнойно-воспалительных заболеваний по клиническим показателям состояния здоровья новорожденного по шкале Апгар (менее 8 баллов) и факторам пренатального риска у матери.

3.1. Выбор параметров оценки состояния микробиоценоза Правильная трактовка результата бактериологического исследования имеет исключительное значение для эпидемиолога и клинициста при решении вопроса о природе кишечного заболевания и соответствующих методах лечения. Однако, несмотря на то, что в упоминавшемся отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» представлены унифицированные критерии оценки состояния микробиоценозов, большую роль при диагностике нарушений микрофлоры по-прежнему играет фактор субъективности.

На основании углублнного анализа литературных данных, опыта работы ФБУН ННИИЭМ им. академика И.Н.Блохиной Роспотребнадзора, других ведущих НИИ в России и за рубежом по проблеме микроэкологии человека методом экспертных оценок из числа клинически значимых родов и видов микроорганизмов, определяющих качественный и количественный состав микрофлоры, были выделены 29 показателей, наиболее полно отражающих состояние микробиоценоза ЖКТ человека (это микроорганизмы родов Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Clostridium spp., Fusobacterium spp., Peptococcus spp, Peptostreptococcus spp., Eubacterium spp., Bacteroides spp., все роды семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus spp., Enterococcus spp., Pseudomonas spp., Acinetobacter spp., Alcaligines spp. и др., грибы родов Candida spp. и др.), включающих 70 родов, клинически значимых видов. Полный перечень 29-ти показателей представлен в тексте диссертации. В соответствии с выбранными показателями результаты бактериологических анализов (количества микроорганизмов в 1г субстрата) были занесены в электронные таблицы, создана электронная база данных; разработан программный продукт, позволяющий обрабатывать и систематизировать результаты бактериологических исследований качественного и количественного состава микрофлоры желудочно-кишечного тракта из базы данных – система управления базой данных (СУБД) «Автоматизированная система микробиологического мониторинга микробиоценозов желудочно-кишечного тракта (ЖКТ)», которая написана на языке FoxPro в среде программирования Microsoft Visual FoxPro 8. (файл-серверная реляционная СУБД) в рамках операционной системы Windows.

На этапе инфологического проектирования было выделено 5 основных сущностей: человек, возрастная группа, лечебное учреждение, в котором обследовался пациент, микроорганизм, анализ. Для проектирования был выбран метод сущность-связь. Доступ к базе программно организован таким образом, что пользователь может модифицировать и обрабатывать данные на уровне доступного и понятного ему графического интерфейса. Для удобства работы в программный продукт также встроено руководство пользователя, где можно найти всю необходимую информацию о работе с программой.

Следует отметить, что для пополнения базы данных наличие СУБД не обязательно. Данные можно экспортировать из таблиц Microsoft Excel 2003, организованных по определнным правилам. Возможен и импорт результатов анализов для последующего хранения и обработки. Получено свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ №2011614233 от 30 мая 2011г.

3.2. Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» людей Кишечная микрофлора, в частности бактерии толстой кишки, рассматривается как основная детерминанта здоровья и заболевания людей (Тутельян, Попова, 2002).

Первичная колонизация бактериями новорожденного в раннем неонатальном периоде является важным и определяющим звеном в процессе формирования микробиоценоза, так как в дальнейшем состояние здоровья индивидуума, и резистентность к целому ряду заболеваний во многом зависит от характера кишечной микрофлоры и ее активности (Нетребенко, 2005).

По данным литературы известно, что колонизация кишечника человека определенным набором родов и видов микроорганизмов обуславливает этапность становления микрофлоры желудочно-кишечного тракта в онтогенезе (Ткаченко Е.И., 2009). Внутриутробно развивающийся плод не является стерильным, а получает от матери какое-то количество индигенных микроорганизмов in utero (Глушкова, 2000; Бочков и др., 2004; Martin R, 2004). Далее до семидневного возраста микрофлора претерпевает три стадии становления: первая – «условноасептическая» начинается с момента рождения; вторая – «нарастающей колонизации» наступает через 10-20 часов после родов. В этот период колонизация осуществляется гетерогенными микроорганизмами, в первую очередь аэробными и факультативно аэробными бактериями, такими как E.coli, Staphylococcus spp., Klebsiella spp., Enterococcus spp. и др. Третья стадия - «трансформации микрофлоры» - наступает с 5-7 дня после родов, в результате которой происходит вытеснение бифидофлорой других микроорганизмов.

Обобщив данные, полученные по каждой возрастной группе, можно представить процесс изменения микрофлоры «здоровых» людей в течение жизни, от рождения до старости.

В период формирования микрофлоры во вторую стадию «нарастающей колонизации» у «здоровых» младенцев идет активный рост как анаэробных микроорганизмов (лактобацилл, лактококков и бифидобактерий), так и аэробных (кишечной палочки, энтерококка и группы УПМ) в количествах 10 5 – 107 КОЕ/г.

(рис. 1 А, Б) Рис. 1. Характеристика численности аэробной и анаэробной симбионтной микрофлоры толстой кишки "здоровых" людей различных возрастных групп (количество микроорганизмов приведено в усредненных значениях).

На вторые сутки до 108КОЕ/г увеличивается количество E.coli, на третьи сутки количество облигатных анаэробов, а на пятые количество УПМ. К шестым суткам, то есть к моменту выписки из родильного дома в микрофлоре устанавливается равновесие аэробной и анаэробной части флоры, далее происходит нарастание лакто- и бифидофлоры, и к 2 месяцам жизни ребенка ее численность достигает значений 109-1010КОЕ/г. На таком уровне количество анаэробов сохраняется и в более старшие возрастные периоды. Снижение количества лакто- и бифидобактерий начинается ближе к 60 годам. Количество нормальной E.coli со вторых суток не изменяется и остается на уровне 108КОЕ/г на протяжении практически всей жизни человека. Падение количества УПМ начинается с трехмесячного возраста, к шести годам снижается до уровня 106КОЕ/г и далее не изменяется.

Рис. 2. Распределение частоты выделения (по оси ординат) облигатной микрофлоры и УПМ из кишечника «здоровых» людей разных возрастных групп.

Анализ тенденции распределения частоты выделения представителей микробиоценоза толстой кишки в микрофлоре «здоровых» людей разных возрастных групп позволяет выделить три типа распределения частоты выделения по возрастным группам. К первому типу (распределение с насыщением) относятся зависимости для Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp и E. coli, характеризующиеся нарастанием частоты выделения в первые часы и сутки с последующим насыщением, выходящим на стационарный уровень в период от одного года жизни и до 60 лет и более. Второй тип – трехфазная зависимость частоты выделения по возрастным группам характерная для Lactococcus spp. Эта зависимость имеет максимальное значение частоты выделения в первые сутки жизни с последующим снижением и выходом на стационарный уровень у детей. Вторичное снижение частоты выделения наблюдается уже у взрослых. Наконец, третий тип – колоколообразная функция отклика, характеризующая возрастание частоты выделения УПМ от первых часов до одного года жизни, с последующим резким снижением частоты выделения в возрасте от одного года до 17 лет, затем переходящая в стационарную фазу. Обращает на себя внимание тот факт, что третий тип распределения частоты выделения по возрастным группам, характерный для УПМ, подчиняется одному из фундаментальных законов теоретической экологии – закону толерантности Шелфорда (Одум, 1975). (рис. 2) Следует также отметить, что в 93,8% дети рождаются с бактериальной флорой ЖКТ, причем в первые 24 часа жизни преобладающей флорой являются микроаэрофильные бактерии родов Lactobacillus и Lactococcus, а также факультативно-анаэробные микроорганизмы родов Staphylococcus и Escherichia (рис. 2).

Условно-патогенные формы уже присутствуют в микрофлоре здоровых новорожденных, причем в 8,1% случаев в количествах >105КОЕ/г. Далее, во время пребывания в родильном доме (1-6 суток) и в домашних условиях (от 7 суток до года) происходит нарастание количества как анаэробной, так и аэробной компонент микрофлоры (рис. 2). Частота выделения, видовое разнообразие условно-патогенной флоры в значимых количествах (>105КОЕ/г) и обнаружение их в ассоциациях по три, четыре и более вида нарастает в период сукцессий и достигает своего пика в возрасте от одного месяца до одного года.

Бифидобактерии и лактобациллы, начиная с одного месяца жизни, встречаются в 100% случаев. Кишечная палочка выделяется у 95% детей (105 – 107КОЕ/г) в возрасте от одного месяца до года. В возрасте 7 – 17 лет частота обнаружения E.coli снижается до 76% (105 – 107КОЕ/г), а затем снова повышается, и достигает 100% у людей пожилого и старческого возраста. Частота обнаружения УПМ в микрофлоре толстой кишки здорового человека начинает снижаться после первого года жизни, и составляет 18% в возрастной группе 60 лет и старше.

Таким образом, в результате проведенных исследований установлено, что в процессе формирования микрофлоры с первых часов жизни участвуют как аэробные, так и анаэробные микроорганизмы, причем в равных соотношениях.

Процесс нарастания анаэробной компоненты (лакто- и бифидофлоры) идет параллельно с ростом УПМ и кишечной палочки, минуя стадию «трансформации».

Уменьшение количества УПМ в микрофлоре «здоровых» детей начинается после года. С наибольшей частотой УПМ (> 105 КОЕ/г) выделяются в группе «здоровых»

детей в возрасте от одного месяца до года.

3.3. Особенности возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «больных» людей Обобщив полученные данные, мы смогли представить процесс изменения микрофлоры «больных» людей выбранных возрастных групп.

В первые 24 часа жизни процесс формирования микрофлоры в группе «больных» детей не отличается от такового у «здоровых» (рис. 3 А,Б).

На вторые сутки до 108 КОЕ/г увеличивается количество бифидобактерий и E.coli, количество лактобацилл и лактококков остается на уровне 107 КОЕ/г. Уже к третьим-четвертым суткам пребывания в родильном доме устанавливается равновесие аэробной и анаэробной части флоры на уровне 10 8КОЕ/г. К седьмым суткам (к моменту выписки из родильного дома) отмечается незначительное снижение количества УПМ до 107 КОЕ/г.

Рис. 3. Характеристика численности аэробной и анаэробной симбионтной микрофлоры толстой кишки "больных" людей различных возрастных групп (количество микроорганизмов приведено в усредненных значениях).

Количество кишечной палочки и облигатных анаэробов остается на уровне 10 КОЕ/г. Затем, вплоть до трех месяцев, количественное соотношение микроорганизмов не меняется, и только на четвертый месяц увеличивается количество лактобацилл и лактококков до 109 КОЕ/г. Далее количественное соотношение микроорганизмов не меняется до шестилетнего возраста. С шести лет количество лактобацилл и лактококков начинает постепенно снижаться, и в возрастной группе 60 лет и более составляет бифидобактерий, кишечной палочки, энтерококка и УПМ остается постоянным.

3.4. Сравнение возрастной динамики численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей Характер распределения тенденции частоты выделения облигатных представителей микробиоценоза толстой кишки по возрастным группам в микрофлоре «больных» людей имеет отличия от «здоровых». Так, несмотря на сохранение тенденции для Lactobacillus spp, Bifidobacterium spp и E. coli к распределению с насыщением, они реже встречаются у «больных» детей. Однако наиболее резкие изменения частоты выделения у «больных» людей касаются УПМ:

типичная колоколообразная кривая заметно уплощается, демонстрируя резко сниженную и упрощенную возрастную динамику. И только трехфазная зависимость частоты выделения по возрастным группам, характерная для Lactococcus spp.

сохраняется и у «больных» детей.(рис. 4) По сравнению с детьми из подгруппы «здоровых», у «больных» детей в возрасте от одного месяца до года наблюдается резкое снижение частоты выделения представителей анаэробной части флоры (лактобацилл и бифидобактерий), а также условно-патогенных видов в значимых количествах заметно в возрастных группах 7 - 29 суток и от 1 - 11 месяцев (37% и 50%, 29.5 и 91.6% соответственно) (рис. 4). У детей от года до 17 лет и у взрослых частота обнаружения УПМ в группе «больных» достоверно выше, чем у «здоровых», частота выделения анаэробов снижена.

Рис. 4. Распределение частоты выделения (по оси ординат) облигатной микрофлоры и УПМ из кишечника «больных» людей разных возрастных групп.

В ассоциациях УПМ выделяются чаще у «больных» людей, чем у «здоровых» во всех возрастных группах, кроме группы детей от 1 - 11 месяцев (рис. 5).

Рис.5. Частота обнаружения (по оси ординат) ассоциаций УПМ у «здоровых» и «больных»

людей разного возраста.

Полученные результаты можно объяснить с точки зрения процесса формирования местной толерантности к резидентной микрофлоре и существующей теорией эндогенного инфицирования, описанных в трудах зарубежных и отечественных ученых. В результате воздействия на резидентную флору неблагоприятных факторов – самого заболевания, химиотерапевтических и антибактериальных средств, применяемых для лечения, изменяются антигенные свойства микроорганизмов за счет образования стресс-индуцибельных белков, то есть белков теплового шока или стресс-белков. Микроорганизмы, приобретшие новые свойства и набор антигенов, воспринимаются организмом человека как чужеродные. Как следствие, снижается местная толерантность клеток хозяина к представителям резидентной микрофлоры. В эпителиальных клетках резко возрастает продукция хемокинов, запускается воспалительный процесс с повреждением слизистой кишечника, что окончательно снимает местную толерантность клеток хозяина. В связи с этим, возникновение патологического процесса можно объяснить не количеством выделяемых УПМ, а их измененными свойствами и подавлением лакто- и бифидобактерий (Бондаренко, 2007).

3.5. Синэкологический анализ микробиоценозов толстой кишки Применение синэкологического анализа видовой структуры сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп позволило количественно оценить видовую структуру исследуемых сообществ при помощи индексов видового богатства Маргалефа, видового разнообразия Шеннона, выравненности Пиелу, доминирования Симпсона и др. (Животовский, 1980; Мэгарран, 1992; Маргалеф, 1992), а также ранговых распределений численностей видов (Левич, 1980; Мэгарран, 1992; Пузаченко, Пузаченко, 1996).

Анализ ранговых распределений. Сравнительная характеристика видовой структуры сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки «здоровых» и «больных» людей разных возрастных групп проводилась путем анализа ранговых распределений. В работе апробированы две модели ранговых распределений: экспоненциальная ni n1 z i 1 и гиперболическая ni n1 / i.

Полученные параметры обеих моделей (z и ) для всех возрастных групп «здоровых» и «больных» людей, были использованы для расчета теоретических значений численностей микроорганизмов толстой кишки человека и оценки адекватности исследованных моделей. С целью более точной визуализации результатов анализируемых параметров (показателей) были использованы ранговые профили, предложенные Гелашвили и соавторами (Гелашвили и др., 2001).

В качестве примера на рис. 6 а представлено каноническое ранговое распределение численностей симбиотических микроорганизмов толстой кишки детей в возрасте от 0 часов до шести суток. Для сравнительного анализа перестройки ранговых распределений численностей микрофлоры толстой кишки человека в возрастном и функциональном аспекте был применен прием с фиксацией последовательности показателей, задаваемой вектор-строкой выбранной «референсгруппы» (рис. 6 а) и сохраняемой для последующей исследуемой группы (рис. 6 б).

Так, например, если последовательность показателей для «референс-группы»

группы «здоровых» детей в возрасте 0 ч. - 6 с. (рис. 6 а) сохраняется и для «больных» детей этого же возраста, то можно получить наглядную картину (ранговый профиль) (рис. 6 б), демонстрирующий как перестройку численностей показателей (количественный аспект), так и появления новых, либо исчезновения имевшихся показателей (качественный аспект). Например, в данном случае, у «больных» детей в возрасте 0ч. - 6 с. (рис. 6 б) по сравнению со «здоровыми» (рис.

6 а) этой же возрастной группы наблюдается появление новых видов микроорганизмов. Появляется 3 новых вида: Bacteroides spp., E. coli (гем+) (позиции 16, 17, соответственно) и P. vulgaris (позиция 20). Подобные выпадения или появления новых микроорганизмов наблюдаются во всех возрастных группах людей. Соответствующие ранговые профили приведены в тексте диссертации.

Рис. 6. Сравнение профилей 29 показателей, характеризующих микрофлору толстой кишки у «здоровых» (а) и «больных» (б) детей в возрасте 0ч. – 6с. Порядок показателей задается векторстрокой для «референс-группы» «здоровых» детей и сохраняется для «больных».

Кластерный анализ. Далее для верификации правильности и полноты экспертного разбиения исходного массива данных на категории «здоровые» и «больные» был применен многомерный кластерный анализ по методу Варда (рис.

7).

Многомерный кластерный анализ не только подтвердил, что микрофлора толстой кишки различается у «здоровых» и «больных» людей по фиксированному набору 29-ти показателей, но также позволил разбить и упорядочить объекты (пациенты) по микробиологическим данным внутри каждого из двух крупных кластеров на непересекающиеся подмножества – кластеры, соответствующие выбранным возрастным группам (табл. 2).

Рис. 7. Многомерный кластерный анализ методом Варда сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки здоровых и больных людей разных возрастных групп (n=1115).

Расшифровка результатов многомерного кластерного анализа методом Варда Метод К-средних подтвердил результаты, полученные многомерным кластерным анализом.

Таким образом, в период постнатального онтогенеза здорового человека (0- лет) происходят статистически значимые изменения видовой структуры микрофлоры толстой кишки, характерные для определенных возрастных групп, требующие для правильной оценки состояния микрофлоры подразделение каждой из крупных возрастных групп (0-1 год и 1год – 60 лет по ОСТ 91500.11.0004-2003) минимум на подгруппы: 24 часа – 6 суток, 7 – 29 суток, 1 – 11 месяцев и 1год – 6 лет, 7-17 лет, 18лет.

Статистический анализ методом Манна-Уитни. Для ответа на вопрос о наличии или отсутствии различий в численности симбиотических микроорганизмов толстой кишки между «здоровыми» и «больными» людьми, относящимися к одной возрастной группе, был проведен статистический анализ попарных различий с применением критерия Манна-Уитни. В анализ были включены 29 показателей – роды и виды симбиотических микроорганизмов толстой кишки, встречающиеся одновременно у здоровых и больных людей 7-ми возрастных групп.

В ходе анализа в каждой возрастной группе пациентов были выявлены «информационно значимые показатели» - виды микроорганизмов, численность которых статистически значимо различается как у «здоровых» и «больных» людей одного возраста, так и между возрастными группами. (табл. 3) Информационно-значимые показатели микрофлоры толстой кишки человека, выявляемые при попарном сравнении на основе критерия Манна-Уитни между больными и здоровыми людьми, относящимися к одной возрастной группе