3. Характеристика зеленой зоны – донора фотоассимилятов 3.1. Количественный состав пигментов в зеленой зоне зрелых листьев Ficus benjamina ‘Starlight’ в сравнении со зрелыми листьями нехимерного Ficus benjamina ‘Daniel’ Содержание хлорофиллов a и b, а также суммарных каротиноидов в зеленой зоне пестролистной химеры снижено по сравнению с зеленым сортом ‘Daniel’:

так, содержание хлорофилла a составляет 60,0 ± 1,02 % от такового в зеленом сорте, хлорофилла b – 57,5 ± 0,69 %, суммарных каротиноидов – 75,1 ± 1,26 %.

Однако, отношение a/b в зеленой зоне увеличено – 2,96 против 2,83 в сорте ‘Daniel’. Доля суммарных каротиноидов также несколько увеличена и составляет 14% против 11% у ‘Daniel’. Выявленные отличия могут быть связаны с сортовыми особенностями.

3.2. Характеристика функционального состояния фотосинтетического аппарата в зеленой зоне листьев пестролистной химеры F.benjamina ’Starlight’ и цельнозеленого F.benjamina ’Daniel’ Функциональное состояние фотосинтетического аппарата в зеленой зоне пестролистного фикуса, а также в листьях сорта 'Daniel' было охарактеризовано методом индукции флуоресценции. Квантовая эффективность работы ФСII в зеленой зоне пестролистного растения ниже, чем в зеленом сорте 'Daniel' - 0,54 ± 0,03 против 0,68 ± 0,01 соответственно. Снижены и другие параметры индукционной кривой, в особенности Fv и Fm.

Нами было показано отсутствие зависимости функциональной активности фотосинтетического аппарата в зеленой зоне листа химеры от доли белой зоны.

При интенсивности 330 мкмоль/м2*с были сделаны измерения на листьях 1, 3 и групп среднего яруса F.benjamina ‘Starlight’. Достоверных различий в квантовом выходе, фото- и нефотохимическом тушении, фотосинтетическом электронном транспорте нет, следовательно, различий в активности фотосинтетического аппарата листьев разных групп нет. Это означает, что у F.benjamina реализуются другие возможности регуляции продукции фотоассимилятов, например, за счет ростовых процессов.

3.3 Характеристика ультраструктуры хлоропластов зеленой зоны молодых Клетки мезофилла зеленой зоны молодого листа имеют обычный набор иста органелл, целостность мембран не нарушена. Хлоропласты зеленой зоны занимают значительную часть площади клетки на срезе (до 50%), все они обладают крупными каплями с низкой электронной плотностью, занимающими значительную часть хлоропласта (20% и более). Это указывает на участие хлоропластов зеленой зоны в синтетических процессах, возможно, связанных со вторичным метаболизмом. Тилакоидные мембраны плотно компактизированы, расстояние между мембранами мало. Структура хлоропластов гранальная.

Изредка встречаются крахмальные зерна, их доля от общей площади хлоропласта на срезе мала (1-2%). Для некоторых клеток характерны группы, состоящие из хлоропластов, митохондрий и пероксисом. Все эти факты указывают на высокую функциональную активность хлоропластов, жизнеспособность клеток мезофилла зеленой зоны, а также на их высокую метаболическую активность.

Зеленая зона зрелого листа обладает хлоропластами меньшего размера, чем в молодом листе, они не имеют капель с низкой электронной плотностью, крахмальные зерна не встречаются. Отсутствие крахмальных зерен указывает на высокий экспортный отток фотоассимилятов, связанный с появлением дополнительного акцептора фотоассимилятов (белой зоны) в пределах зрелого 4. Функциональная активность фотосинтетического аппарата белой зоны 4.1. Количественный состав пигментов в белой зоне зрелых листьев Ficus benjamina ‘Starlight’ Содержание хлорофиллов a и b в белой зоне сильно снижено по сравнению с зеленой. Так, содержание хлорофилла a составляет 1,36 ± 0,02 мкг/см2против 12,30 ± 0,21 мкг/см2 в зеленой зоне, хлорофилла b – 0,79 ± 0,02 мкг/см2 против 4,16 ± 0,05 мкг/см2. Доля хлорофилла a при этом значительно снижена по сравнению с зеленой зоной и генетически однородным сортом и составляет 1, против 2,96 в зеленой зоне и 2,83 у сорта ‘Daniel’. Соотношение хлорофиллов a и b является важным параметром, отражающим относительные доли двух фотосистем – поскольку хлорофилл b по большей части ассоциирован с ФСII, а хлорофилл а – с ФСI, и, соответственно, характеризующим структурное состояние фотосинтетического аппарата (Мокроносов и др., 2006). Доля хлорофилла а в белой зоне снижена, что может говорить об измененном соотношении фотосистем в пластидах белой зоны.

В белой зоне отмечено наиболее высокое отношение каротиноидов к хлорофиллам. Очевидно, это связано с фотопротекторной функцией каротиноидов при действии высоких интенсивностей освещения.

4.2. Характеристика функционального состояния фотосинтетического аппарата в белой зоне листьев пестролистной химеры F.benjamina ’Starlight’ Таблица Параметры индукционной кривой флуоресценции хлорофилла листьев F.benjamina’Starlight’ (средние из 200 измерений) Fv/Fo Функциональное состояние фотосинтетического аппарата в белой зоне пестролистного фикуса было охарактеризовано методом индукции флуоресценции. Данные анализа кривых индукции флуоресценции, полученные на листьях среднего яруса пестролистной химеры, приведены в таблице 4.1.

Абсолютные параметры индукционной кривой для белой зоны снижены в сравнении с зеленой, однако относительные показатели, такие, как (Fm-Fo)/Fm, характеризующий квантовый выход, и Fv/Fo, близки к значениям, полученным для зеленой зоны. Это характеризует хлоропласты белой зоны пестролистной химеры как функционально активные, и говорит о том, что фотосистема II функционирует в белой зоне практически с такой же квантовой эффективностью, что и в зеленой.

4.3. Характеристика ультраструктуры клеток мезофилла белой зоны молодых и зрелых листьев Белая зона молодого листа характеризуется небольшими (5-7% от общей площади клетки на срезе), очень редкими хлоропластами преимущественно агранальной структуры. На полученных нами срезах хлоропласты встречались с частотой примерно один на каждые 20 клеток на площадь среза. В отдельных хлоропластах тилакоидные мембраны довольно далеко отстоят друг от друга.

Имеются крупные крахмальные зерна (от 8 до 50% от площади хлоропласта), в отдельных хлоропластах встречаются электронно-плотные липидные капли (3от площади), являющиеся пластоглобулами или пластоглобуло-подобными частицами. Это может указывать на высокую синтетическую активность хлоропластов белой зоны молодого листа (Austin et al., 2006) и, с другой стороны, на накопление продуктов катаболизма мембран тилакоидов, фотопротекторных соединений и начало литических процессов. В митохондриях изредка встречаются электронно-плотные липидные капли. Клетки мезофилла белой зоны молодого листа имеют обычный набор органелл, целостность мембран не нарушена. В белой зоне зрелого листа пластид не встречено, клетки мезофилла при этом деградируют (см. 5.1.).

5. Цитологические особенности клеток белой и зеленой зон листьев разного возраста 5.1. Возрастная динамика состояния клеток мезофилла белой и зеленой зон жизнеспособными клетками с функционально активными хлоропластами. Однако в конце стадии роста листа растяжением клетки мезофилла белой зоны начинают деградировать. Нами показано, что лист пестролистной химеры F.benjamina ’Starlight’ заканчивает рост растяжением через 11-12 дней после разворачивания из почки. Методом ТЭМ показан начинающийся процесс деградации в белой зоне листьев через 10 дней после раскрытия почки. Для этого этапа развития клеток белой зоны характерно образование крупных литических вакуолей, пристеночного слоя цитоплазмы, формированием групп митохондрий и появление электронно-плотных капель в них. При этом среди клеток мезофилла встречаются хлоропласты с крахмальными зернами (без признаков деградации). В листьях возраста 30 и более дней выявлен процесс частичной деградации клеток мезофилла: появляются крупные вакуоли с остатками клеточных структур, в результате деградации пластид возникают «миелиноподобные» структуры (Douce, Joyard, 1980). При этом образуются стопки из 4-5 штук тесно прижатых друг к другу митохондрий. Можно предположить, что белая зона зрелого листа испытывает углеводное голодание, что ведет к полной или частичной деградации клеток. Похожая картина описана при анализе автофагии клеток Acer pseudoplatanus L. в условиях углеводного голодания (Aubert et al., 1996). Следует отметить большую временную длительность этих процессов – через 95 дней после раскрытия листа содержимое клеток мезофилла полностью не деградирует, что гораздо выше сроков деградации в приведенных ссылках (не более 7 дней).

5.2. Электронно-микроскопические особенности метаболизма клеток белой и зеленой зон Нами показано, что пластиды, встречающиеся в белой зоне молодых листьев, обильно накапливают крахмал в виде зерен (до 27% от площади пластиды на срезе). Для них же обычны электронно-плотные капли, предположительно пластоглобулы, занимающие довольно большую площадь – до 37% от площади пластиды на срезе. Доля хлоропластов от площади клетки мала – до 7% на срезе.

крахмальные зерна малого размера – до 2,4% от площади хлоропласта на срезе.

Практически во всех хлоропластах имеются крупные электронно-прозрачные липидные капли – до 31,3% от площади хлоропласта на срезе.

Примечательно, что в зеленой зоне в составе пластид встречаются исключительно электронно-прозрачные капли, а в белой зоне – только электронно-плотные. Это указывает на метаболические особенности генетически разнородных белой и зеленой зон. Но, возможно, между двумя зонами листа может существовать разделение синтетических функций.

5.3. Гетерогенность клеток белой зоны в пределах одной ткани Можно отметить гетерогенность деградации в пределах белой зоны одного листа. Нами было обнаружено, что клетки мезофилла, контактирующие с проводящими тканями, находятся на более ранней стадии деградации, чем клетки, не контактирующие с проводящим пучком. Так, в 30-дневном листе клетки мезофилла, находящиеся вблизи флоэмных элементов, имеют уровень деградации, более характерный для отдаленных от флоэмы участков мезофилла 10-дневных листьев. Это говорит в пользу нашей гипотезы об углеводном голодании как о причине деградации мезофилла. Не зависимо от направления потока сахаров – в белую зону или из нее – через передаточные клетки мезофилла (клетки обкладки в терминологии Гамалея (2004)) проходят фотоассимиляты, что приостанавливает деградацию клеток.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Однако причины пестролистности могут быть различны. Часто это связано с дефектами в цепи биосинтеза хлорофилла, однако известны и другие причины, такие как, например, фотодеструкция зеленых пигментов (Takahashi et al., 2002).

Ультраструктурные особенности хлоропластов белой зоны, идентичность качественного состава пигментов в белой и зеленой зонах листа химеры и отсутствие продуктов деградации хлорофилла a и b свидетельствуют о том, что биосинтез пигментов у F.benjamina ’Starlight’ не нарушен. В белой зоне листа химеры фотодеструкция также не наблюдается, а хлоропласты функционально активны.

Таким образом, как нами впервые показано, белый фенотип F.benjamina ’Starlight’ объясняется снижением числа хлоропластов на клетку в процессе развития листа.

Электронно-микроскопические исследования показали частичную деградацию содержимого клеток мезофилла в белой зоне, начинающейся практически сразу после окончания роста листа растяжением. Пластиды и эндоплазматический ретикулум деградируют с образованием миелиноподобных структур (Douce, Joyard, 1980; Гамалей, 2004), формируются электронно-плотные пластоглобулы, и в зрелом листе белый мезофилл не содержит хлоропластов. В таком состоянии белая зона, безусловно, является нефотосинтезирующей тканью и может быть фотосинтетического аппарата зеленой зоны листа химеры F.benjamina ’Starlight’.

Зеленая зона обладает функционально активным фотосинтетическим аппаратом, что было показано методами индукции флуоресценции, электронной микроскопии, а также количественным определением пигментов. Несомненно, зеленая зона является полноправным источником фотоассимилятов для нефотосинтезирующих частей растения.

Для пестролистных бело-зеленых растений отмечена способность зеленой ткани компенсировать отсутствие фотосинтеза в белой за счет приобретения параметров, характерных для «световых» листьев (Aluru et al., 2001). Данная работа сделана на мутанте по ядерному гену, рисунок листа и соотношение зон неизменно и, т.о., морфологическая компенсация наличия белой зоны не реализуется. Пестролистные бело-зеленые химеры обладают, по сути, автотрофной и гетеротрофной тканями в пределах одного органа – листа и проявляют большую вариабельность развития, чем генетически однородные растения (Dulieu, 1967; Pohlheim, 1973). Таким образом, пестролистные химеры физиологической компенсации ослабления донорной функции в пределах целого листа. Вариабельность развития зачастую связана с координацией клеточных делений и растяжений при формировании органа. Так, F. benjamina ‘Curly’ формирует деформированную листовую пластинку, вероятно, в связи с неоднородностью ростовых процессов в белой и зеленой зонах (Лабунская, 2007).

Однако сорт ‘Starlight’ имеет форму листа, соответствующую генетически однородному сорту, т.е., пролиферация и растяжение клеток разных зон при формировании листа скоординированы. Вариабельность развития и автономность зеленых и белых клеток проявляется на стыке зеленой и белой зон, где автономно формируются два слоя столбчатого мезофилла вместо одного.

Пестролистная химера F.benjamina ’Starlight’ имеет листья с разным соотношением зеленой и белой зон в пределах одного растения. Нами была показана независимость доли белой зоны в листьях пестролистной химеры от интенсивности освещения. Более того, квантовый выход эффективности функционирования фотосистемы II не зависит от соотношения зон в листе, Это указывает на регуляцию продукции фотоассимилятов другими способами, в частности, изменением доли фотоассимилирующей поверхности в листе и в целом растении.

Для понимания причин и роли вариабельности соотношения зон в листе необходимо было охарактеризовать структуру меристемы и закладку примордия листа. Так, в работе было показано, что апикальная меристема побега пестролистной химеры сорта ’Starlight’ обладает тремя слоями туники и корпусом, что означает наличие отдельных клеточных генетически разнородных линий, равноправно участвующих в закладке примордия листа, что характерно для периклинальных химер. Таким образом, вариативное соотношение зон в листе не связано с различными начальными порциями зеленых и белых клеток в примордии. Мы также показали, что соотношение зон в листе определяется до момента разворачивания листа, т.е., при закладке примордия (Лабунская и др., 2007). Следовательно, есть факторы, влияющие на пролиферацию и/или растяжение клеток будущих зон листа. Известны множественные примеры различий в параметрах клеточного цикла генетически разнородных клеток (Marcotrigiano, Bernatzky, 1995; Marcotrigiano, 2001). В последние годы выявлено влияние развития пластид на морфологию клетки (Chatterlee et al., 2007), структуру листа (Ahlert et al., 2003) и даже на эмбриогенез целого растения (Berg et al., 2005; Baldwin et al., 2005). Однако до сих пор не была показана возможность регуляции пролиферации или растяжения клеток меристемы или примордия какими-либо эндогенными параметрами. Для растущего раскрывшегося листа показана прямая связь между доступностью сахаров и интенсивностью ростовых процессов (Wiese et al., 2007), роль сахаров как тонких регуляторов состояния клетки в последнее время активно обсуждается (Aubert et al., 1996; Toyooka, 2001;

Walter et al., 2003; Wiese et al., 2007; Usadel et al., 2008; Wingler et al., 2009). В фотоассимилирующей поверхности в примордии напрямую зависит от имеющейся суммарной фотосинтезирующей поверхности во всех листьях растения одного порядка: при накоплении зеленой суммарной площади доля зеленой зоны в каждом новом листе становится меньше (Лабунская и др., 2007).

Таким образом, продукция фотоассимилятов в растении оказывает влияние на пролиферацию клеток генетически разнородных зон в примордии. Следует также обратить внимание на поддержание оптимального соотношения зон в листьях обильно ветвящегося растения: мы выяснили, что наиболее часто встречающееся соотношение зон в листе – 50 – 75% зеленой зоны. При черенковании уже через год молодое растение формирует крону, где преобладают листья с тем же оптимальным соотношением, хотя на исходном черенкованном побеге были более белые листья. Можно предположить, что меристема при закладке примордия фотосинтезирующих органов, что определяет соотношение зеленой и белой зон в примордии нового листа и дальнейшую продукцию фотоассимилятов в растении.

Донорно-акцепторные отношения оказывают серьезное влияние и на функциональное состояние клеток разных зон в пределах одного листа. Растущий лист исходно является акцептором фотоассимилятов, но по достижении 60 – 90% от своей максимальной площади акцепторная функция сменяется донорной (Мокроносов, 1983). При этом поток сахаров в листе однонаправлен – он ориентирован либо на разгрузку флоэмы, либо на ее загрузку, одновременный приток сахаров и их отток по проводящей системе невозможен (Turgeon, 2006).

Смена акцепторно-донорного статуса влияет на состояние мезофилла белой зоны:

в акцепторный период роста листа белая зона жизнеспособна, содержит хлоропласты с крахмалом. Накопление крахмала часто является одним из признаков нарушения оттока фотоассимилятов у симпластных растений, однако при этом коллапс клеток происходит по градиенту от терминальных комплексов флоэмы к удаленным участкам мезофилла (Гамалей. 2004), а не наоборот, как это происходит далее у нас. Возможно, накопление крахмала связано с более ранней дифференциацией клеток мезофилла белой зоны и переходом их к активному фотосинтезу, поскольку край листа (Tsukaya, 2005) и пластиды в его мезофилле (Walter et al., 2004) дифференцируются раньше центральной зоны. При этом лист еще находится в акцепторной фазе. Переход к донорному статусу происходит в конце фазы растяжения, и в нашей работе показано начало процессов деградации именно на этом этапе. Далее в зрелом листе эти процессы развиваются по типу автофагии, однако их протекание сильно замедленно (месяцы, а не дни, как это показано в ряде работ (Aubert et al., 1996; Toyooka, 2001)). Это свидетельствует о снабжении белой зоны фотоассимилятами. Однако массовый ток сахаров направлен на экспорт из листа, и дополнительный приток фотоассимилятов из других листьев мало вероятен. Очевидно, что в системе зрелого листа зеленая зона функционирует как донор, а белая – как акцептор фотоассимилятов. При этом нагрузка на фотосинтетический аппарат зеленой зоны повышена, что подтверждается исчезновением крахмальных зерен в зеленой зоне зрелого листа по сравнению с молодым. Кроме того, уровень растворимых сахаров в белой зоне листа через 5 месяцев после раскрытия составляет 20% от зеленой зоны. Эти данные указывают на донорно-акцепторные взаимодействия автотрофной и гетеротрофной зон в пределах листа.

ВЫВОДЫ

2. Функциональная активность хлоропластов в белой зоне листа Ficus benjamina ‘Starlight’ доказана рядом независимых методов (анализ пигментного состава, ультраструктурных признаков и индукции флуоресценции хлорофилла).

В мезофилле белой зоны зрелого листа пластид не обнаружено. Выявлены литические процессы, схожие с автофагией при углеводном голодании.

3. Показано, что в апикальной меристеме побега химеры Ficus benjamina ‘Starlight’ есть трехслойная туника, в которой слои L1 и L3 являются инициалями зеленых клеток, а слой L2 производит белые клетки. Вариабельность соотношения зон в листе определяется регуляторными событиями на уровне примордия листа. Соотношение зон в листе и их контуры после разворачивания листа не меняются.

4. При развитии примордия листа рост генетически разнородных клеток в длину и ширину скоординирован. Обнаружено, что дифференциация мезофилла на столбчатый и губчатый в генетически разнородных группах клеток происходит автономно.

5. Выявлена зависимость состояния клеток мезофилла белой зоны от донорно-акцепторного статуса листа. Начало литических процессов коррелирует со сменой акцепторной функции листа на донорную и с замедлением роста. В пределах зрелого листа высокий отток сахаров из зеленой зоны выражается в исчезновении крахмальных зерен. Доказано снабжение белой зоны зеленой фотоассимилятами.

6. Обнаружено, что соотношение зон в листе пестролистной химеры Ficus benjamina ‘Starlight’ не зависит от интенсивности освещения. Выявлена эндогенная регуляция соотношения зеленой и белой зон в примордии по принципу обратной связи: с увеличением суммарной фотоассимилирующей площади всего растения возрастает доля белой зоны при закладке каждого нового листа.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Лабунская Е.А., Жигалова Т.В., Чуб В.В. Анатомическое строение листа пестролистного Ficus benjamina сорта ‘Starlight’и взаимное влияние фотосинтезирующего и акцепторного компонентов химеры. // Онтогенез. 2007. Т.

38. №6. С. 471- 2. Лабунская Е.А. Откуда у фикуса пестрые листья. // Цветоводство. 2007.

№ 6. С. 52 – II. Прочие публикации.

3. Лабунская Е.А. Пестролистные химеры как модель для изучения донорно-акцепторных отношений у растений. Материалы докладов XII молодежной научной конференции «Актуальные проблемы биологии и экологии». Сыктывкар, 4-7 апреля 2005 г.. С. 129- 4. Лабунская Е.А. Зависимость соотношения зеленой и белой зон в листьях пестролистной химеры Ficus benjamina ‘Starlight’ от метаболического сигнала: анатомо-морфологический анализ. Материалы I(IX) Международной конференции молодых ботаников в Санкт-Петербурге. Санкт-Петербург, 21- мая 2006 г. С. 163- 5. Лабунская Е.А., Чуб В.В., Жигалова Т.В. Регуляция соотношения автотрофной и гетеротрофной ткани в процессе развития химерного листа Ficus benjamina ‘Starlight’. VI Съезд Общества физиологов растений России и Международная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем», Сыктывкар, 18–24 июня 2007 г. Материалы докладов. Часть 1. С. 313Labunskaya E.A., Leonteva M.R., Choob V.V. Interaction of source and sink components in the green-white chimera Ficus benjamina cv.’Starlight’. XVI Congress of the Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB), Tampere, Finland, 17-22 August 2008. FESPB 2008 abstracts in: Physiologia Plantarum. 2008. V.

133. N3. P06- 7. Лабунская Е.А., Леонтьева М.Р., Чуб В.В. Сравнительный анализ ультраструктуры пластид белой и зеленой зон пестролистной химеры Ficus benjamina cv.’Starlight’. XII Съезд Русского ботанического общества и Всероссийская конференция «Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века, Петрозаводск, 22-27 сентября 2008 г. Материалы конференции. Часть 6. С. 69-