На правах рукописи

КАЗАКОВ

Василий Иванович

Ретропозоны Alu-семейства и их роль в геноме человека

03.01.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора

биологических наук

Санкт-Петербург 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, заслуженный деятель науки РФ Самойлов Владимир Олегович Федеральное государственное бюджетное военное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Военномедицинская академия им. С.М.Кирова» МО РФ. Зав. кафедрой нормальной физиологии.

доктор биологических наук, профессор, член-корреспондент РАСХН, лауреат Премии Совета Министров СССР, заслуженный деятель науки РФ Яковлев Александр Федорович Государственное научное учреждение Всероссийский научноисследовательский Институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН. Зав. отделом генетики и биотехнологии и лаб. молекулярной цитогенетики.

доктор биологических наук, профессор, Михельсон Виктор Михайлович Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии РАН. Зав. лаб. радиационной цитологии

Ведущая организация:

Национальный исследовательский центр «Курчатовский институт». Федеральное государственное бюджетное учреждение Петербургский институт ядерной физики им. Б.П.Константинова

Защита состоится «» июня 2014 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. Сайт института: www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: [email protected] Факс института: (812) 297-35-

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН

Автореферат разослан «_» 2014 года

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В.Каминская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Если обратиться к базе данных Human Genome Resours, annotation Release 104 (URL http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/index.shtml), можно увидеть, что суммарная ядерная ДНК (диплоидный набор хромосом) женщины состоит из 6 072 607 692 н.п., а мужчины из 5 976 710 698 н.п. По разным оценкам количество нуклеотидов, необходимое для кодирования всех белков и функционально значимых РНК человека не превышает 2–3 % от этого количества. Таким образом, основная часть молекул ДНК человека, как и других эукариот, не несет информации об аминокислотной последовательности белков, не кодирует структуру рибосомных и транспортных РНК, а представляет собой некую "избыточную" ДНК, функциональное значение (или отсутствие такового) которой во многом остается не понятным. И если в конце ХХ века некодирующую часть генома относили к «эгоистической ДНК», то в последние годы появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что те или иные некодирующие элементы генома выполняют важные функции, в частности прямо или косвенно участвуют в регуляции экспрессии белок-кодирующих генов. Но все же, получается, что человек на сегодняшний день слабо представляет себе функциональную роль основной части (97 %) своего генома.

Особое место среди некодирующих элементов генома человека занимают ретропозоны относящиеся к классу повторов (короткие диспергированные Alu-семейства, SINE нуклеотидные элементы). Alu-повторы представлены в геноме человека 1,1х106 копиями, что составляет более 10% всей длины его генома.

Инсерции Alu-повторов в экзоны и промоторы белок-кодирующих генов, в область экзон-интронных границ, а также незаконная гомологичная рекомбинация между различными копиями Alu-повторов могут приводить к возникновению различных наследственных заболеваний. Многие факты свидетельствуют о том, что Alu-повторы могут участвовать в регуляции генной экспрессии, как на уровне транскрипции, так и на уровне трансляции. Так, например, Alu-повторы встречаются в 3'-нетранслируемой области некоторых мРНК и могут существенно влиять на их стабильность. Alu-повторы содержат в своем составе множественные CpG-динуклеотиды, являющиеся сайтами метилирования в геноме. Как известно, степень метилирования цитозина в последовательностях 5'-CG, фланкирующих 5'-область гена, коррелирует с уровнем экспрессии генов. Помимо этого в составе Alu-повторов было показано наличие сайтов связывания транскрипционных факторов (ССТФ). Однако функциональное значение единичных, изолированных ССТФ не совсем ясно, поскольку такие сайты встречаются по всему геному. Вероятно, большинство из них не играют никакой роли в регуляции экспрессии генов. Недавние исследования регуляции транскрипции у Drosophila melanogaster показали, что важную роль в регуляции играет кластеризация (как в промоторной области, так и вне ее) потенциальных сайтов связывания функционально близких транскрипционных факторов. Такие кластеры получили название цис-регуляторных модулей (ЦРМ).

Вышесказанное дает основание предполагать, что ЦРМ могут играть важную роль в регуляции экспрессии генов и у человека. Более того, поскольку ЦРМ встречаются и в составе Aluповторов, то экспериментальное доказательство влияния таких ЦРМ на экспрессию генов было бы одновременно и доказательством участия Alu-повторов в регуляции экспрессии.

Кроме того, Alu-повторы могут служить своеобразными маркерами ДНК человека как биологического вида, так как довольно равномерно распределены по всему геному человека. В сочетании с их огромным количеством это приводит к тому, что Alu-повторы гарантированно встречаются даже в относительно коротких (несколько килобаз) фрагментах ДНК человека.

Изучение этой части генома имеет большой теоретический и практический интерес, так как позволит понять механизмы эволюции и функционирования генома, что может дать возможность влиять на работу генов, выявлять предрасположенность к различным наследственным патологиям, идентифицировать личность на генетическом уровне. Эти работы весьма актуальны для судебной и практической медицины Данная работа посвящена изучению происхождения, распределения в геноме и функционального значения основного семейства умеренно повторяющихся последовательностей генома человека – Alu-повторов.

Цели и задачи исследования. Выяснить функциональное значение, происхождение и распределение ретропозонов Alu-семейства в геноме человека.

Научная новизна Статья «Внеклеточная ДНК в крови беременных женщин» (Казаков В.И., Божков В.М., Линде В.А., Репина М.А., Михайлов В.М., 1995) явилась одной из публикаций, которые легли в основу современных методов неинвазивной пренатальной диагностики.

Впервые экспериментально доказано, что Alu-повторы, входящие в состав промоторов генов лизосомной дезоксирибонуклеазы II (DNAse II) и лиганда циклофилина, модулирующего кальциевый ответ (CAMLG), способны влиять на экспрессию этих генов.

Впервые установлено, что инсерционно-делеционный полиморфизм AluYa5-повтора в гене ангиотензинпревращающего фермента коррелирует с развитием дисциркуляционной энцефалопатии у ликвидаторов чернобыльской аварии и уровнем свободных аминокислот в сыворотке крови больных с дисплазиями соединительной ткани.

Запатентован способ выявления предрасположенности к длительной физической работе.

Патент на изобретение № 2194982.

В геноме широко распространенного паразита человека лентеца широкого (Diphyllobothrium latum) открыт повторяющийся элемент, который был назван DL1.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Alu-повторы являются важными функционально значимыми элементами генома человека, а не «эгоистической ДНК», как это было принято считать ранее.

2. Alu-повторы способны регулировать экспрессию белок-кодирующих генов.

3. Alu-повторы за счет модуляции экспрессии генов и Alu-опосредованной экзонизации интронов вносят существенный вклад в генетическую гетерогенность популяции.

4. Инсерционно-делеционные полиморфизмы Alu-повторов ассоциированы с предрасположенностью к различным мультифакториальным заболеваниям 5. Alu-повторы могут служить вспомогательными сигналами при формировании факультативного гетерохроматина.

Теоретическая и практическая значимость. Работа вносит существенный вклад в разрешение проблемы «парадокса генома эукариот». Приводятся теоретические обоснования участия Alu-повторов в регуляции экспрессии белок-кодирующих генов. Факт влияния Aluповторов на уровень экспрессии некоторых генов человека показан экспериментально.

Обсуждается возможная роль Alu-повторов в Polycomb-зависимом глушении богатых генами сегментов в ходе инактивации Х-хромосомы.

Большая часть работы посвящена изучению инсерционно-делеционного полиморфизма (ИДП) Alu-повторов в интронах генов АСЕ, ТРА, apoAI и FMR1. Особо значимые результаты получены при изучении ИДП в гене АСЕ. Установлено, что этот ИДП коррелирует с высшими достижениями в различных спортивных дисциплинах, развитием дисциркуляционной энцефалопатии у ликвидаторов чернобыльской аварии и уровнем свободных аминокислот в сыворотке крови больных с дисплазиями соединительной ткани. Эти работы имеют большое значение для практической и спортивной медицины.

На основании наших исследований можно дать практические рекомендации по лечению больных с дисциркуляционной энцефалопатией. Полученные данные следует учитывать при проведении заместительной диетотерапии больных с дисплазиями соединительной ткани, наследственными аминоацидопатиями, такими как фенилкетонурия, лейциноз и треонинемия, при индивидуальном подборе препаратов, содержащих лейцин, изолейцин и фенилаланин.

Установлено, что ИДП AluYa5-повтора в гене АСЕ также необходимо учитывать при выборе индивидуальных нагрузок и специализации в спорте высших достижений.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на первой (ПереяславльЗалесский 1990), второй (Переяславль-Залесский 1991) всесоюзных и третьей (Черноголовка 1993) всероссийской конференции по программе «Геном человека», первой европейской конференции «Организация генома человека» (Гейдельберг 1990), восьмой конференции Международного общества дифференцировки (ISD) (Хиросима 1994), четвертом европейском конгрессе по биологии клетки (Прага 1994), всероссийской конференции «Актуальные вопросы неврологии, нейрохирургии и медицинской генетики» (Уфа 1998), втором съезде ВОГиС (Санкт-Петербург 2000), втором Всероссийском съезде медицинских генетиков (Курск 2000), пятом Европейском конгрессе науки о спорте (Ювяскюля, Финляндия 2000), втором международном совещании «Ретропозоны и эволюция генома» (Сочи 2003), Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы клиники и лечения в многопрофильном лечебном учреждении", посвященной 300-летию Санкт-Петербурга и 205летию Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург 2003, пленарный доклад), Международной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск 2007), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино 2007), Международной конференции «II съезд Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН» (Санкт-Петербург 2007), на курсах «Достижения медицины плода» Общества медицины плода (Лондон 2013). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии Института цитологии РАН и на совместном семинаре лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии, лаборатории радиационной цитологии, лаборатории регуляции экспрессии генов и лаборатории клеточной патологии Института цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Программы ГКНТ «Геном человека», Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 94-04а, 97-04-48764, 00-04-04003, 01-04-49486, 02-04-49631, 05-04-48403, 05-04-48815, 07-04- 00311), гранта по поддержке ведущих научных школ НШ-1647.2003.4, INTAS Genomics grant 05-1000004-7755, International Science Foundation grants R5U000 and R5U300, U.S. Civilian Research & Development Foundation for the Independet States of Former SovietUnion (CRDF), Award № ST-012-0, DeutscheForschungs gemeinschaft grants 436 RUS 113/126/1-113/126/0, Office of Science (BER) U.S. Department of Energy grant DE-FG03-01ER63070.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 22 статьи (из них 17 в отечественных, 5 в зарубежных научных журналах), 23 тезиса, глава в сборнике и 4 учебно-методических пособия (из них 2 с грифом УМО), получен 1 патент. Всего автором опубликовано 60 научных трудов.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы.

Материалы и методы. Методы, использованные в работе, материалы и оборудование, объекты исследования подробно описаны в соответствующих разделах диссертации и опубликованных по теме диссертации статьях (см. список).

ВВЕДЕНИЕ

Cтроение Alu-повторов. В составе большинства Alu-повторов имеется сайт рестрикции (AGCT) для эндонуклеазы рестрикции AluI. Этот сайт расположен приблизительно в 170 н.п. от начала повтора. Благодаря этому Alu-повторы получили свое название. Эндонуклеаза рестрикции была названа так, потому что впервые была выделена из Arthrobacter luteus (Roberts et al., 1976) Длина консенсусной последовательности Alu-повторов составляет 282 н.п.

Отдельные представители семейства могут иметь различную длину за счет вариабельных областей и вариаций длины, входящих в состав повтора полиадениновых участков. Собственно, Alu-повтор представляет собой димер, состоящий из двух прямых повторов длиной 130 н.п., разделенных богатой аденином вставкой. Правый мономер длиннее левого на 31 п.н. Богатая аденином последовательность имеется и на 3'-конце второго мономера. Оба мономера Aluповтора гомологичны друг другу на 80%. В составе всего повтора можно выделить консервативные и 2 вариабельные области. Каждый Alu-повтор фланкирован прямыми повторами длиной от 7 до 20 н.п.

Левый мономер Alu-повтора содержит функционально активный внутренний промотор для РНК-полимеразы III, состоящий из двух элементов, называемых Box-A и Box-B. Box-A располагается на участке +4/+37 и представляет собой последовательность 5'-RRYNNRRYGG-3'.

Box-B находится в области +70/+86, его последовательность 5'-GWTCRANNC-3'. Box-B является необходимым и достаточным для относительно точной, хотя и неэффективной инициации транскрипции Alu in vitro, наличие Box-A значительно увеличивает эффективность транскрипции. Таким образом, внутренний промотор для РНК-полимеразы III сходен с промоторами генов тРНК (Perez-Stable et al., 1984).

Распределение Alu-повторов в геноме человека. Огромное количество Alu-повторов распределено в геноме человека более или менее равномерно. Значительная их часть соседствует с уникальными функционально значимыми последовательностями. Alu-повторы часто фланкируют структурные гены, присутствуют в интронах, экзонах и промоторах. В геноме человека встречаются и довольно протяженные кластеры Alu-повторов, причем инвертированными по отношению друг к другу. В работах 90-х гг. распределение Alu-повторов в индивидуальных хромосомах выясняли методом гибридизации in situ. После завершения работ по секвенированию генома человека для этих целей стал широко применяться компьютерный анализ. Так, удалось установить, что значительное количество Alu-повторов инвертировано, один Alu-повтор в среднем встречается на протяжении трех килобаз. Alu-повторы эволюционно древних подсемейств имеют тенденцию образовывать кластеры, в то время как молодые Aluповторы преимущественно расположены одиночно и не локализованы рядом с древними повторами (Jurka et al., 2003). Alu-повторы в целом «предпочитают» GC-богатые участки генома. Однако повторы, принадлежащие к молодым подсемействам, могут быть распространены и в AT-богатых районах. Размер хромосомы никак не коррелирует с количеством локализованных в ней Alu-повторов. По такому показателю, как отношение общей длины всех копий повтора в данной хромосоме к длине этой хромосомы, лидирует 19-я хромосома (26,3 %), минимальное значение показано для Y хромосомы (7,5 %). Частота встречаемости Alu-повторов в генах выше, чем в межгенных промежутках для всех хромосом, за исключением 22-й и 19-й хромосом (Grover et al., 2004). Установлена сильная корреляция