На правах рукописи

Неганова Маргарита Евгеньевна

ПРОИЗВОДНЫЕ АЛКАЛОИДА СЕКУРИНИНА И

ИЗОАЛАНТОЛАКТОНОВ В КАЧЕСТВЕ ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ

НЕЙРОПРОТЕКТОРОВ

Специальность 02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Черноголовка 2012

Работа выполнена в лаборатории нейрохимии ФАВ Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ Российской академии наук.

Научный руководитель: кандидат химических наук ШЕВЦОВА Елена Феофановна

Официальные оппоненты: доктор химических наук МИЛАЕВА Елена Рудольфовна кандидат химических наук БОБРОВ Михаил Юрьевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н.Баха РАН

Защита диссертации состоится «28» февраля 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.102.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук по адресу:

142432, Московская обл., г.Черноголовка, ул. Северный проезд, д. 1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института физиологически активных веществ Российской академии наук.

Автореферат разослан «24» января 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Афанасьева        

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Общее увеличение продолжительности жизни, связанное с успехами медицины в лечении сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний все в большей степени выводит на верхние строчки в статистике смертности нейродегенеративные заболевания. В основе своей нейродегенерация представляет прогрессивно нарастающий процесс гибели анатомически обособленной группы нервных клеток головного мозга, функциональное предназначение которой определяет клинические проявления соответствующего конкретного заболевания. Таким образом, основой патогенеза таких широко распространенных заболеваний как болезни Альцгеймера и Паркинсона, а также целого ряда менее известных расстройств является нейродегенеративный процесс, локализованный в том или ином отделе центральной нервной системы.

Исследование как общих механизмов нейродегенерации, так и специфических механизмов развития различных нейродегенеративных заболеваний имеет огромное значение для поиска путей их фармакологической коррекции. Существуют многочисленные данные, свидетельствующие о роли митохондрий и окислительного стресса в развитии нейродегенерации. Более того, эти два явления, первоначально считавшиеся независимыми и относящимися к разным уровням организации живой клетки, оказались глубоко взаимосвязанными и, в известной мере, взаимно порождают друг друга. Данный вывод поставил в практическую плоскость решение задачи о целенаправленном фармакологическом воздействии на вышеуказанные элементы ранних стадий нейродегенерации, что послужило фундаментальной предпосылкой для постановки настоящей работы.

Современная индустрия лекарственных средств имеет в качестве научной базы многоуровневую систему биологических исследований.

(тестирование) химических соединений на биологическую активность. На основании полученных данных делаются предварительные выводы о возможных механизмах биологического действия новых химических веществ, намечаются пути их дальнейшей направленной химической модификации с целью оптимизации биологической активности.

Полученные таким образом химические структуры вновь проходят стадию первичного скрининга на простых лабораторных экспресс-моделях биологической активности. Затем по результатам этих анализов отбираются так называемые вещества-лидеры, обладающие оптимальными полезными свойствами. В дальнейшем отобранные вещества проходят ряд дополнительных этапов скрининга на последовательно усложняющихся биологических моделях.

Одним из плодотворных подходов к поиску лекарственных средств является химическая модификация природных соединений с последующей проверкой их биологической активности. В ИФАВ РАН в лаборатории природных соединений был синтезирован ряд новых производных на основе природного алкалоида секуринина и изоалантолактонов.  Цель и задачи исследования. Целью данной работы был поиск потенциальных нейропротекторов в ряду новых синтетических производных алкалоида секуринина и изоалантолактонов.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать антиоксидантные свойства в ряду производных алкалоида секуринина и изоалантолактонов на модели перекисного окисления липидов гомогената мозга крыс.

2. Определить механизмы антиоксидантного действия, изучаемых 3. Исследовать влияние производных природного алкалоида секуринина и изоалантолактонов на функциональные характеристики митохондрий.

4. Исследовать нейропротекторную активность веществ-лидеров на различных клеточных моделях нейротоксичности.

5. Провести первичную оценку веществ-лидеров в экспериментах in vivo.

Научная новизна работы. Впервые был проанализирован ряд новых производных природного алкалоида секуринина и изоалантолактонов и изучена их биологическая активность. Найдены соединения, которые проявляют антиоксидантные свойства - активно ингибируют ПОЛ в гомогенате мозга крыс и этот эффект связан как с хелатированием ионов железа, так и с радикалсвязывающими свойствами полученных аддуктов.

При изучении влияния веществ на функциональные характеристики митохондрий и выживаемость клеток в условиях клеточной токсичности выявлено вещество – лидер алломаргаритарин (АМ), проявляющее мито- и цитопротекторные свойства.

Практическая значимость работы. Результаты работы могут быть использованы для:

-Анализа взаимосвязи структура-активность при планировании работ по химическому синтезу новых химических структур на основе природных соединений с нейропротекторной активностью -Выбора наиболее перспективных соединений из ряда исследуемых аддуктов для последующего углубленного изучения и оптимизации структуры для создания эффективных нейропротекторых препаратов.

Апробация результатов исследования. Результаты работы были представлены на Всероссийской конференция молодых ученых и III школе им. Академика Н.М. Эмануэля (Москва, 2008), на 4-м международном симпозиуме по достижениям в области молекулярных механизмов нейродегенеративных заболеваний (the 4th European Society for Neurochemistry Conference on Advances in Molecular Mechanisms of Neurological Disorders, Ляйпциг, Германия, 2009), на 5-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии»

(Судак, Крым, Украина, 2009), на 6-й Всероссийской конференции «Химия и технология растительных веществ» (Санкт-Петербург, 2010), на международном симпозиуме по патофизиологии, активным формам кислорода и азота (“International Symposium on the Pathophysiology of Reactive Oxygen and Nitrogen Species ”. Саламанка, Испания, 2010), на 21 Съезде физиологического общества имени И.П.Павлова (Москва – Калуга, 2010), на 3-м Всероссийском, с международным участием, конгрессе студентов и аспирантов «Симбиоз-Россия 2010» (Нижний Новгород, 2010), на 6-м международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (устный доклад, Судак, Крым, Украина, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 печатных работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, соответствующих Перечню ВАК, и 15 работ в сборнике материалов докладов научных конференций.

Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, методов и материалов, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 125 страницах и включает 31 рисунок и 6 таблиц. Список цитируемой литературы содержит источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные. Для экспериментов in vitro использовались самцы нелинейных беспородных крыс, весом 200-220 г. В опытах in vivo – самцы мышей линии CD1, весом 20-25 г. Животные содержались в условиях стандартного вивария с 12-ти часовым световым режимом и свободным доступом к воде и пище (в случае выделения митохондрий печени у крыс изымался корм за 24 часа до эксперимента). Все манипуляции с животными проводились в соответствии с решениями комиссии по Биоэтике ИФАВ РАН.

Приготовление гомогената мозга крыс. Декапитацию заранее наркотизированных СО2 животных проводили с помощью гильотины. Мозг гомогенизировали в ледяном растворе 120 mМ KCl/ 20mМ HEPES. Для получения субклеточной фракции гомогенат мозга центрифугировали при 1500g и далее работали с супернатантом.

Выделение митохондрий. Митохондрии мозга крыс получали центрифугированием в градиенте плотности Перколла по методу Sims N.R.

Определение белка в препаратах митохондрий и гомогенате мозга крыс проводили микробиуретовым методом. Стандартная митохондриальная фракция содержала 8-10мг белка на мозг. Митохондрии хранили при 4оС.

Функциональная активность митохондрий мозга крыс сохранялась в течение 2,5-4 часов.

Оценка антиоксидантной активности. Антиоксидантную активность исследовали на модели перекисного окисления липидов (ПОЛ) гомогената мозга крыс. Уровень ПОЛ определяли по модифицированному для проведения в плашечном формате ТБК-тесту.

Определение Fe2+ - хелатирующей активности. Fe2+-хелатирующую активность определяли по модифицированной методике Gulcin. Метод основан на конкуренции исследуемого вещества с известным хелатором железа феррозином, образующим окрашенный комплекс с Fe2+ с пиком поглощения 562нм.

Определение антирадикальной активности. Антирадикальную активность оценивали: 1) по уровню восстановления стабильного свободного радикала дифенилпикрилгидразила (ДФПГ) 2) по методу CUPRAC, основанному на оценке восстанавливающей активности исследуемого вещества в отношении комплекса неокупроина с Cu2+. В качестве референтного соединения использовали известный антиоксидант – тролокс, данные рассчитывали в относительных его единицах и выражали в тролокс-эквивалентах (ТЭ).

Определение степени ингибирования липоксигеназы. Определение степени ингибирования фермента липоксигеназы проводили спектрофотометрически по образованию продукта окисления линолевой кислоты при max 234 нм.

Изучение скачка митохондриальной проницаемости (СМП). СМП исследовали, измеряя спектрофотометрически уменьшение оптической плотности суспензии митохондрий при 540 нм. Проба содержала 0,2 мг белка/мл изолированных митохондрий мозга крыс. Инициаторами СМП служили хлористый кальций или синтетический пептид -амилоид 25- (А) фирмы Bachem. Каждый эксперимент проводился в трех повторностях.

Скорость набухания оценивали по тангенсу угла наклона наиболее крутого участка кривой зависимости A540 от времени и представляли в процентах от контроля.

Измерение мембранного потенциала митохондрий. Мембранный потенциал митохондрий измеряли спектрофотометрически с использованием потенциал-зависимого индикатора сафранина А в кювете спектрофотометра Beckman DU 640 при 25оС и постоянном перемешивании.

Оценка кальциевой емкости митохондрий. Кальциевую ёмкость митохондрий определяли путем измерения концентрации внешнего кальция в суспензии митохондрий (0,2 мг белка в мл) с помощью металлохромного индикатора арсеназо III (50 мкМ) при дробном добавлении к митохондриям низких подпороговых концентраций кальция.

Клеточные модели нейротоксичности. Нейроны получали из коры мозга новорожденных крыс (1-2 сут) способом трипсинизации с последующим пипетированием. Эксперименты проводились на 8-10 суточных культурах.

Неротоксичность индуцировали добавляя к культуре клеток Fe3+, глутамат (Глу) или А. Выживаемость нейронов определяли с помощью МТТ теста по методике Niks и Otto.

Методы, использованные для первичной in vivo характеристики веществлидеров (оценка токсичности, влияние на развитие судорог в различных моделях эпилепсии и т.д.) подробно описаны в разделе материалы и методы диссертационной работы.

Анализ и статистическую обработку всех полученных данных проводили с помощью программ Origin 7.5, Microsoft Excel 2010 и Statistica 5.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Исследуемые соединения. Для химической модификации были выбраны алкалоид секуринин (СКР), выделяемый из секуринеги ветвецветной (Securinega suffruticosa (Pall.) Rehd), и сесквитерпеновые лактоны – изоалантoлактон (ИАЛ) и эпоксиизоаланталактон (эИАЛ), выделяемые из биологической активности указанных соединений, включая разнообразные направленной химической модификации могут быть созданы новые высокоэффективные соединения, обладающие нейропротектрными свойствами.

Исходные соединения содержат активированную двойную связь, по которой легко присоединяются N-нуклеофилы (реакция Михаэля). В качестве аддентов использовали амины (например, 4-(4-метоксифенил)пиперазин) и природные алкалоиды, содержащие первичную или вторичную аминогруппу, – триптамин, эфедрин, анабазин, сальсолин и др. Реакции лактонов с Nнуклеофилами протекают в мягких условиях и отличаются высокой стереоселективностью. В случае СКР для образования только одного стереоизомера требуется катализ кислотой Льюиса. На основе СКР были синтезированы аддукты 4-5, на основе ИАЛ – 6-18, на основе эИАЛ – 19- (табл.1.).

изоалантолактонов. Антиоксидантные свойства исследуемых веществ оценивали по уровню ингибирования инициированного ПОЛ гомогената мозга крыс. В качестве инициаторов ПОЛ использовали Fe3+ и третбутилгидропероксид (т-БГП). Установлено, что исходные соединения не проявляют антиоксидантной активности либо усиливают интенсивность Fe3+индуцированного ПОЛ, проявляя прооксидантные свойства. В то же время, большинство синтетических аддуктов, полученных на основе исходных соединений, эффективно подавляют Fe3+-индуцированное ПОЛ (табл.1). При этом наибольшей активностью обладают аддукты на основе триптамина (табл.1, соединения СКР-5272 (4), ИАЛ-5272 (6), эИАЛ-5272 (19)). При инициировании ПОЛ т-БГП исследуемые соединения так же проявили антиоксидантную активность, но в меньшей степени. Данное обстоятельство косвенно свидетельствовало о том, что антиоксидантная активность данных соединений может быть связана с их железохелатирующей способностью.

Для более углубленного изучения механизма, лежащего в основе антиоксидантного действия исследуемых веществ, мы произвели оценку их железохелатирующей и антирадикальной активности в модельных химических системах. Большинство изученных соединений (14 из 19) проявили выраженную -хелатирующую активность. Меньшее количество соединений проявили антирадикальную активность: 9 из 19 по ДФПГ-тесту; 3 из 19 по CUPRAC-тесту (табл.1). Это согласуется с предположением о том, что антиоксидантная активность большинства из изученных соединений связана с их железохелатирующей способностью.

В пользу указанного вывода свидетельствуют также результаты анализа хелатирующей способностью, которая оказалась напрямую связанной с наличием вторичного атома азота. Включение указанного атома в циклическую структуру с переходом в третичное состояние приводит к исчезновению хелатирующего эффекта у соответствующих соединений (табл. 1, соединения СКР-154 (5), ИАЛ-290 (14), ИАЛ-292 (17), эИАЛ- (20), эИАЛ-290 (21)).

Таблица 1. Антиоксидантные свойства производных секуринина и сесквитерпеновых лактонов.

СКР-аддукы ИАЛ-аддукы эИАЛ-аддукты Таким образом, соединения, обладающие металлхелатирующими свойствами, эффективно снижают ПОЛ, индуцированное Fe3+, блокируя процесс на стадии инициирования реакции Фентона.

Вместе с тем, нельзя исключать вклад антирадикального механизма в антиоксидантное действие некоторых из исследуемых веществ. Об этом свидетельствует как эффект ингибирования ПОЛ, индуцированного т-БГП, так и небольшая антирадикальная активность в ДФПГ- и CUPRAC тестах.

Как видно из рисунка 1, только аддукты с триптамином проявили активность сравнимую с тролоксом в тесте CUPRAC. При этом одно из соединений, аддукт секуринина и триптамина алломаргаритарин (АМ) был в 1,67 раза активнее эталона.

Рисунок 1. Восстановительная способность производных алкалоида секуринина и сесквитерпеновых лактонов в тесте CUPRAC.

Дополнительным вкладом в антиоксидантную активность аддуктов с триптамином может служить обнаруженная нами их способность к ингибированию активности липоксигеназы, фермента запускающего процесс ферментативного ПОЛ (табл.2).

Таблица 2. Способность триптаминовых производных секуринина и лактонов ингибированть активность липоксигеназы.

Вещество % ингибирования активности липоксигеназы в IC50, мкМ Таким образом, в основе обнаруженной нами антиоксидантной активности изученных производных секуринина и изоалантолактонов могут лежать различные молекулярные механизмы, включающие как выраженную железохелатирующую способность большинства данных веществ, так и прямое антирадикальное действие для ряда триптаминовых аддуктов. С учетом всей совокупности полученных нами экспериментальных данных мы выделили группу триптаминсодержащих аддуктов в качестве наиболее перспективных соединений для дальнейших исследований (СКР-5272 (4), ИАЛ-5272 (6), эИАЛ-5272 (19)).

Известно, что окислительный стресс и накопление концентрации свободного железа являются важными факторами в развитии возрастзависимых нейродегенеративных заболеваний. Поэтому обнаруженная у исследованных соединений как антиоксидантная активность в целом, так и их железохелатирующая способность могут рассматриваться в качестве перспективных атрибутов потенциальных нейропротекторов.

Изучение влияния исследуемых веществ на функциональные характеристики митохондрий. Митохондрии, в частности СМП, играют ключевую роль в каскадах клеточной гибели, в регуляции кальциевого гомеостаза и в обеспечении энергетической достаточности клеток, что особенно важно для клеток мозга. Ранее было показано, что как окислительный стресс, так и целый ряд известных нейротоксинов, в том числе и А, потенцируют СМП, а применяемые в практике нейроактивные лекарственные препараты с нейропротекторным эффектом способны повысить устойчивость митохондрий к индукции СМП.

функциональные характеристики митохондрий, включая СМП, может рассматриваться в качестве важной тестовой методики для отбора потенциальных нейропротекторов.

Влияние производных секуринина и изоалантолактонов на митохондрии анализировали по трём основным параметрам:

1. Влияние на кальций-индуцированное «набухание» митохондрий, индукции СМП.

2. Влияние на мембранный потенциал митохондрий.

3. Влияние на кальциевую ёмкость митохондрий.

Второй из указанных параметров является наиболее критичным с точки зрения потенциальной цитотоксичности исследуемых веществ. По этой причине вещества, существенно влияющие на мембранный потенциал митохондрий, исключались из дальнейших исследований. Оставшиеся соединения были протестированы по влиянию на устойчивость митохондрий к Са2+-индуцированному СМП. Среди изученных веществ наибольший интерес представлял триптаминовый аддукт секуринина (СКР -5272a (АМ)), который ранее уже был включен нами в группу наиболее активных антиоксидантов.

Как видно из рисунка 2 АМ: 1) не оказывает влияния на трансмембранный потенциал митохондрий в присутствии субстратов дыхательной цепи (рис.2В), 2) дозозависимо ингибирует Ca2+-вызванное «набухание» митохондрий мозга крыс (рис.2А-Б), 3) увеличивает кальциевую емкость митохондрий (рис.2Г).

Рисунок 2. Влияние СКР и АМ на функциональные характеристики митохондрий (А, В, Г)-типичные графики кинетики, соответственно: Са2+-индуцированного набухания митохондрий, трансмембранного потенциала и кальциевой ёмкости митохондрий; (Б) нормированные значения скорости набухания митохондрий.

Как было показано ранее, А потенцирует Са2+-индуцируемое СМП в изолированных митохондриях печени и мозга крыс. Преинкубация изолированных митохондрий мозга крыс с АМ приводит к эффективному подавлению А-(Са2+)-вызванной индукции СМП (рис.3) Рисунок 3. Влияние АМ на А-(Са2+)-индуцируемое набухание митохондрий.

По результатам первичного отбора, из широкого ряда синтетических производных природного алкалоида секуринина и сесквитерпеновых лактонов было выделено соединение алломаргаритарин, обладающее как митопротектокторным действием. С учетом того, что данные свойства алломаргаритарина могут обеспечить целенаправленное фармакологическое воздействие на базовые элементы ранних стадий нейродегенерации:

окислительный стресс и дисфункцию митохондрий, от этого соединения можно было ожидать высокой нейропротекторной активности.

клеточных моделях нейротоксичности. Нейропротекторная активность АМ изучалась на первичной культуре нейронов коры головного мозга крыс при различных видах клеточной токсичности (глутаматная токсичность, железо-индуцированная токсичность и А-индуцированная токсичность).

Гибель нейронов под действием глутамата (эксайтотоксичность), является одним из основных путей гибели клеток головного мозга при нейродегенерации. Механизмы эксайтотоксической гибели клеток экспериментальные данные, подтверждающие значительную роль окислительного стресса, митохондрий и, в частности, СМП в этом процессе.

В условиях нашего эксперимента инкубация клеток коры мозга крыс с 0,025 мМ АМ после токсического воздействия глутамата значительно увеличивает процент выживших клеток, в отличие от СКР (рис.4).

Для ряда нейродегенеративных заболеваний показано накопление в мозге свободных форм железа, с токсическим воздействием которого также может быть связан нейродегенеративный процесс.

В мозге больных болезнью Альцгеймера увеличение аккумуляции свободных ионов железа наблюдается как вне- так и внутриклеточно, что, в частности, обусловливает свободнорадикальные повреждения клеток, нарушение функций митохондрий, и может быть причиной гибели нейронов.

Инкубация клеток коры мозга крыс с 0,1мМ Fe3+ вызывает снижение выживаемости клеток на 47%. АМ, в отличие от СКР, достоверно защищает нейроны в культуре клеток коры головного мозга крыс от токсического действия Fe3+ (рис.4).

Как было показано ранее, АМ, но не СКР, эффективно предотвращает А-вызванную индукцию процесса СМП, а СКР, в соответствии с имеющимися данными предотвращает А токсичность in vivo. При инкубации первичной культуры нейронов коры мозга с 25 мкМ А выживаемость клеток снижается на 26%. СКР не вызывает очевидного увеличения выживаемости нейронов в присутствии А. В присутствии АМ токсический эффект А снижается (рис.4). Этот эффект может быть связан как с антиоксидантным эффектом АМ, так и его способностью увеличивать устойчивость митохондрий к индукции СМП.

Рисунок 4. Влияние СКР и АМ на выживаемость нейронов при различных моделях