На правах рукописи
КОБОЛЕВ ЕВГЕНИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ
ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
ЭПИЛЕПТИЧЕСКОГО СИНДРОМА
14.03.03- патологическая физиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук
Москва - 2011 2
Работа выполнена в Одесском национальном медицинском университете МЗ Украины и патологической физиологии ГОУ ВПО « Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор Годлевский Леонид Семенович Заслуженный деятель науки РФ, Доктор медицинских наук,профессор Дроздова Галина Александровна
Официальные оппоненты: Доктор медицинских наук, профессор Радыш Иван Васильевич Доктор мелдицинских наук, профессор Решетняк Виталий Кузьмич Доктор медицинских наук, профессор Зилов Вадим Георгиевич
Ведущая организация : Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова
Защита диссертации состоится «09» ноября 2011_ году в 13 часов на заседании диссертационного совета Д.212.203.06 при ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ по адресу: 117198, г.
Москва, ул. Миклухо- Маклая, д.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» Минобрнауки РФ по адресу :
117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.
Автореферат разослан «»2011_ года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор Г.А. Дроздова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Несмотря на применение современных антиэпилептических препаратов (АЭП) в 20-30% всех случаев заболевание характеризуется фармакологической резистентностью [Regesta G; Tanganelli P., 1999 N'guyen The Tich S; Pereon Y., 2004]. Соответственно, если иметь в виду, что в развитых странах не 1% населения страдает эпилепсией, исследование патогенеза фармакологически резистентной эпилепсии и разработка патогенетически обоснованного лечения представляют собой важную в научно- практическом отношении проблему [Вайнтруб М.Я., 2000;
Дзяк Л.А и соавт., 2001; Карлов В.А. и соавт., 2006; Крыжановский Г.Н., 1980-2009; Гехт А.Б. и соавт., 2005; Тодорив И.В. и соавт., 2007;
Mtodzikowska-Albrecht J. et al., 2007; 2011].
Механизмы развития эпилепcии в пocледнее время раccматривалаcь преимущеcтвеннo c тoчки зрения дефицита тoрмoзных механизмoв мoзга [Kрыжанoвcкий Г.Н., 1980- 2006; Reynolds R.., 1985]. Однако, следует oтметить, чтo предcтавления oб уcтoйчивoм характере нарушений co cтoрoны oтдельных нейрoтранcмиттерных cиcтем - дефиците ГАМК и избытке вoзбуждающих аминoкиcлoт мoгут cоставлять фрагмент пoлифункциoнальных нарушений, которые находятся в основе хронического эпилептогенеза [Раевcкий К.С., 1990; Meldrum B.R., 1990Schmidt D., Morselli P.L., 1986, Loscher W., Schmidt, D. 1988, 1993].
Сегодня, в контексте проблемы фармакологической резистентности эпилепсии указанные нейромедиаторные нарушения рассматриваются в комплексе с иными расстройствами, которые связаны с развитием нейромодуляторных нарушений, в том числе детерминируемых генетическим аппаратом нейрона. Так, показано, что факторы иммунной природы обеспечивают местные нейропатофизиологические механизмы многих нейропатологических синдромов и могут принимать участие в развитии фармакологической резистентности эпилептического синдрома к противоэпилептическим препаратам [Aarli J.A., 2000; 2003 Balosso S. et al., 2005 Bernardino L et al., 2005 Dube C et al., 2005; Janeway CA et al., 1999;
Yamamoto M, Akira S., 2005;. Young D, During MJ., 2004].
В последнее время установлено наличие взаимосвязи между системами контроля функции нейронов и иммунологической системой - как лимфоцитарным звеном, так и факторами гуморальной природы [Абрамов В.В.. 1991; Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2004; Карпова М.Н., 2005, 2008] Определена важная роль медиаторов воспаления в контроле возбудимости нейронов, формировании нейродегенеративных изменений, а также в развитии компенсаторно- приспособительных реакций [Годлевский Л.С., Ненова О.Н., 2006; Вастьянов Р.С. и соавт., 2006; Шандра А.А. и соавт., 2010;
Vezzani A., 2005; 2010]. Так, в частности, определена патогенетическая роль провоспалительных цитокинов- фактора некроза опухолей- альфа (ФНОальфа), интерелейкина-1-бета (ИЛ-1-бета) в развитии эпилептогенного возбуждения, активировании гипоталамо- гипофизарно- надпочечниковой оси [Spangello B.L., Gorospe W.C., 1995 Watkins L.R. et al., 1995 Licinio J., 1997 Kronfol Z., Remick D.G., 2000], развитии тяжелых нейропатологических синдромов- депрессии, болезни Альцгеймера, болезни Паркинсона.
Разнooбразные эффекты нейрoиммуномодуляторов oбеcпечивают cущеcтвенные cиcтемные механизмы нарушений в oрганизме при развитии хрoничеcкoгo эпилептoгенеза и, в частности, модели киндллинга, рассматриваемой в качестве фармакологически резистентной формы эпилептического синдрома [Shandra A.A. et al., 1996; 2009; Schmidt D., Morselli P.L., 1986, Loscher W., Schmidt, D. 1988, 1993]. Однако, не исследовано патогенетическое значение иммуно - зависимых механизмов развития киндлинга, не определено значение данных механизмов в формировании фармакологической резистентности киндлинговых эпилептиформных проявлений.
Поэтому анализ механизмов резистентности к действию АЭП представляет собой проблему, решение которой может в существенной степени находиться в плоскости определения патогенетической роли иммунокомпетентной системы организма и, в частности, нейроиммунных взаимодействий. Рассмотрению фармакорезистентности с данных позиций, а также взаимоотношений с существующими теориями ее генеза посвящено данное исследование.
Связь работы с научными планами, программами, темами.
Диссертационная работа является фрагментом плановой научноисследовательской работы кафедры биофизики, информатики и медицинской аппаратуры Одесского национального медицинского университета, утвержденной МЗ Украины «Исследовать влияние физических факторов на головной мозг лабораторных животных» (№ госрегистрации 0198U007842).
Диссертант был соисполнителем указанной темы.
Цель работы заключалась в определении особенностей патогенеза экспериментального эпилептического синдрома резистентного к действию антиэпилептических факторов с позиций изучения нейроиммунных взаимоотношений.
Задания исследования. В соответствие с поставленной целью планируется решить следующие задачи:
1. Исследовать особенности действия антиэпилептических препаратов, применяемых как самостоятельно, так и в комбинации с пентоксифиллином (ПТФ) в отдаленном периоде коразолового киндлинга, в том числе на модели каинат-провоцированного судорожного синдрома.
2. Исследовать поведенческие, электрографические особенности применения интерферона 2-альфа (ИФН-2-альфа) на модели киндлингового эпилептогенеза, а также особенности эффектов в условиях применения ПТФ.
3. Изучить электрографические судорожные проявления, особенности двигательной активности, у животных в условиях применения ЛПС на модели резистентного эпилептического синдрома; изучить особенности противосудорожного эффекта ЛПС в условиях применения диазепама;
4. Исследовать показатели функционального состояния тиолдисульфидной и аскорбатной систем крови в механизмах корригирующего действия ПТФ в отношении резистентного к лечению эпилептического синдрома;
5. Исследовать особенности синдрома толерантности, как модели резистентности к действию АЭП, формирование киндлинга у толерантных к диазепаму животных, а также состояние системы провоспалительных цитокинов в этих условиях;
6. Изучить особенности активации антиэпилептической системыпалеоцеребелярной коры в отношении киндлинговых эпилептиформных проявлений, очаговой ЭпА, а также особенностей эффектов диазепама в условиях ЭС мозжечка;
7. Изучить системные показатели со стороны обмена коллагена при моделировании резистентной формы эпилептического синдрома, а также особенности данных проявлений в условиях экспериментальной терапии;
8. Провести клиническую апробацию сочетанного применения АЭП и ПТФ у детей с резистентными формами эпилепсии, изучить клинические проявления, показатели ПОЛ и характер обмена липопротеинов.
Объект исследования– патогенез резистентного к фармакотерапии эпилептического синдрома.
Предмет исследования – патогенетические механизмы развития и прекращения эпилептического синдрома, которые осуществляются в условиях развития фармакологической резистентности.
Методы исследования – нейропатофизиологические – моделирование эпилептического синдрома, наблюдение поведенческих реакций животных, запись и анализ ЭЭГ. Иммунологические – определение бластогенной активности мононуклеарных клеток, определение уровня провоспалительных цитокинов твердофазным иммуноферментным методом. Биофизические – амперотитрометрическое определение тиол-дисульфидных групп и состояния окислительно- восстановительной аскорбатной системы крови, нейрофармакологические – внутрижелудочковое и внутримозговое введение нейротоксинов. Весь массив полученных данных обработан статистически с применением адекватных критериев оценки различий между группами.
Научная новизна полученных результатов. Впервые установлено, что в условиях воспроизведения модели резистентной к терапии формы эпилептического синдрома отмечается снижение противоэпилептической эффективности карбамазепина, вальпроата натрия, а также МК-801 в отношении судорог, провоцированных у киндлинговых крыс применением каиновой кислоты. Установлено потенцирование действия карбамазепина под влиянием МК-801, а также усиление противоэпилептической эффективности препаратов под влиянием пентоксифиллина. Показана эффективность ПТФ в отношении нарушенной активности мононуклеарных клеток у киндлинговых животных, а также состояния тиол-дисульфидной системы крови. Установлено повышение эпилептогенного действия интерферона-2-альфа (ИФН-2-альфа) в отношении киндлинговых судорог, показано значение ретикулярной части черного вещества и вентральнобазальных отделов миндалины в формировании данных эффектов. Показано, что противосудорожное действие ЛПС на модели резистентного эпилептического синдрома при коразоловом и ЭС-амигдалярном киндлинге развивается в связи с угнетением активности таламо-кортикальной синхронизирующей системы и потенцируется применением диазепама.
Диазепам также потенцирует противосудорожное действие ЛПС в отношении каинат - провоцированных генерализованных судорожных реакций у резистентных к терапии киндлинговых животных. Впервые установлено, что моделирование киндлингового синдрома у толерантных к диазепаму крыс сопровождается значительным увеличением уровня ФНОальфа и ИЛ-1-бета в ткани мозга животных, а также показано блокирование толерантности под влиянием сочетанного применения ПТФ и никотинамида.
Впервые установлено развитие остеопатии, в основе которой лежит подавление синтеза коллагена у крыс с хроническим киндлинговым эпилептическим синдромом, а также подавление данных нарушений под влиянием никотинамида и витамина Е. Впервые показано нарушение полового поведения у киндлинговых животных, коррекция данного состояния липоевой кислотой. Установлена эффективность ЭС палеоцеребеллярной коры в отношении подавления киндлингиндуцированных судорожных реакций, а также проэпилептические эффекты ЭС в отдаленной фазе киндлинга. Показано усиление антиэпилептического действия диазепама под влиянием предварительных ЭС палеоцеребеллярной коры, а также снижение уровня малонового деальдегида в ткани мозга. В условиях клинической апробации на резистентных к терапии формах эпилепсии у детей установлено усиление эффективности антиэпилептической терапии под влиянием ПТФ, показано снижение выраженности перекисного окисления липидов, увеличение антиоксидантного потенциала тканей, а также повышение содержания в крови фракции 2 липопротеидов высокой плотности и аполипопротеина.
Научная новизна защищена патентами Украины на изобретения (№36594, №36595, №36596, №64298, №64301,).
Практическое значение полученных результатов. Полученные результаты позволяют обосновать условия эффективного применения антиэпилептических препаратов у пациентов, которые страдают резистентными к терапии формами эпилепсии с учетом состояния иммунологической реактивности. Приведены принципы модуляции иммунной системы пациентов, с целью повышения эффективности антиэпилептической терапии.
Обоснованы методы активирования структур антиэпилептической системы, в частности, палеоцеребеллярной коры в условиях формирования резистентной эпилептической активности.
Доказана перспективность исследований закономерностей формирования противоэпилептического эффекта ЛПС, на основе которых возможным является создание новых комплесных методов лечения, а также создания противоэпилептических средств.
Результаты исследования внедрены в практическую деятельность Одесского областного психо-неврологического диспансера, в работу кафедр Донецкого государственного медицинского университета им. М.Горького МОЗ Украины, Тернопольской государственной медицинской академии им.
И.Я.Горбачевского МОЗ Украины, Одесского государственного медицинского университета МОЗ Украины, медицинского факультета международного казахско- турецкого университета им. Х.А.Ясави (МОЗ Республики Казахстан), а также в работу международного научно- учебного центра информационных технологий и технических систем НАН Украины (Киев).
Личный вклад соискателя. Автором самостоятельно проведен патентно-информационный поиск, анализ научной литературы, определены цель и задачи исследования, отработаны экспериментальные модели и проведены экспериментальные исследования, осуществлена статистическая обработка полученных результатов, их оформление в виде таблиц и рисунков, проанализированы результаты исследований, написаны научные работы, опубликованы основные положения диссертации.
Апробация результатов диссертации. Основные положения диссертации докладывались на следующих конференциях: научнопрактической конференции с международным участием посвященном 175летнему юбилею И.М.Сеченова «И.М.Сеченов и Одесская школа физиологов» (Одесса, 2004); научно- практической конференции «Компъютерная медицина 2005 (Харьков, 2005); второй международной конференции «Гомеостаз: физиология, патофизиология, фармакология и клиника» (сентябрь 2005, Одесса); конференции Украинского общества нейронаук (с международным участием), посвященной 75-летию Донецкого государственного медицинского университета (Донецк, 2005); на четвертом международном конгрессе по качеству жизни пациентов страдающих эпилепсией, деменцией, рассеянным склерозом и периферической невропатией (Одесса, январь 2006), пятом международном конгрессе по патофизиологии (июнь-июль, 2006, Пекин, Китай), X конференции Украинской противоэпилептической лиги (УПЕЛ) (Киев, май, 2006);
международной научно-практической конференции молодых ученых «Ученые будущего» (октябрь, 2004, 2006, 2007, 2008, Одесса), научной конференции «чтения им. В.В. Подвысоцкого» (Одесса, 2004, 2005, 2006, 2007, 2008, 2009), научно- практической конференции «Биофизические стандарты и инфоромационные технологии в медицине» (Одесса, 2004, 2005, 2006, 2007, 2010); IV-й конференции Украинского общества нейронаук (с международным участием), посвященной 100-летию со дня рождения академика НАН Украины Ф.Н.Серкова (Донецк, 2008), Международный конгресс по неврологии (Куба, Гавана, 2010 ), на XVIII съезде Украинского физиологического общества (Одесса, 2010):
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 научных работ: 3 монографии, 16 статей в журналах, входящих в перечень, утверждённый ВАК РФ. Результаты исследований докладывались на научных и научно - практических конференциях, в том числе с международным участием.
Структура и объем диссертации. Содержание работы изложено на 287 страницах машинописного текста и состоит из введения, 8 глав, выводов и списка использованных источников литературы, иллюстрирована рисунками и 36 таблицами. Библиографический указатель содержит источников, из которых 57 изложены кириллицей.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материал и методы исследований. Иccледoвания прoвoдилиcь в ycлoвиях ocтрoгo и хрoничеcкoгo экcперимента на 1427 белых крыcахcамцах линии Виcтар маccoй oт 170 дo 320 г, кoтрые находились в обычных условиях содержания и кормления. В работе также исследовали наследственную формы абсансной эпилепсии на крысах линии WAG/Rij ( животных).
Фармакологический киндлинг воспроизводили с помощью повторных введений коразола (25,0- 30,0 мг/кг, в/бр) [Крыжановский Г.Н.и соавт., 1986;
Шандра А.А. и соавт., 1999]. Кроме того, применяли также ЭСиндуцированную форму киндлинга, вызываемую ЭС вентрально- базальных отделов миндалины (AP= -2,8; L= 4,5; H= 8,2) [М.Я.Волошин, 1987;
А.Д.Ноздрачев и др., 1987; Я.Бyреш и др., 1991].
Очаги эпилептогенеза моделировали путем применения растворов натриевой соли бензилпенициллина (10.000 МЕ/мл), каиновой кислоты (Sigma - Aldrich Со, США) (2,0 мг/мл) и азотнокислого стрихнина (30, мг/мл), которые вводили внутригиппокампально и внутриамигдалярно по координатам стеротексического атласа в объеме 2,0 мкл.
Острые генерализованные судороги моделировали путем применения раствора натриевой соли бензилпенициллина (3,0 млн МЕ/кг, в/бр) [Mrangoz C., Bagrici F., 2003], а также с помощью в/жел применения раствора каиновой кислоты и NMDA (в дозах 0,6 мкг и 10 мкг/ животное), вызывавшие типичные клонические судорогии, а также тоническую экстензию передних конечностей [White H.S. et al., 1992]. Кроме того, применяли системное введение эпилептогенов- пикротоксина (1,0 мг/кг, бикукуллина – 4,0 мг/кг и азотнокислого стрихнина- 1,5 мг/кг).
Для воспроизведения толерантности к диазепаму животным повторно применяли препарат («Гедеон Рихтер», Венгрия), который вводили внутрибрюшинно из расчета 0,5 мг/кг в течение четырех недель. Подобная длительность применения препарата позволяет сформировать выраженную толерантность к его действию [Clark M., Massenburg G.S., 1994; Pratt J.A., Brett R.R., 1998; Weiss S.R., Clark M., 1995].
Оценку двигательной активности осуществляли методов открытого поля [Лазаренко К.С. и др., 1982; Александрова Н.Г. и др., 1984], а также метода прямой актометрии [Крыжановский Г.Н., 1980]. Кроме того, исследовали агрессивность путем определения порога электрического тока вызывавшего драки в парах животных на электродном полу, болевую чувствительность, а также послеприступную депрессию по Myslobodsky M., (1980). Поведение спаривания животных исследовали по методике Буреш Я., (1990).
Животным имплантировали нихромовые электроды в структуры мозга под нембуталовым наркозом (40,0 мг/кг, в/бр) и животных использовали в исследовании через 7-14 суток с момента операции.
Для оценки ЭЭГ использовалась частота опроса 256 имп/с с помощью АЦП (DX-Системы, Харьков)- данные визуализировали на экране и записывали на жесткий диск для последующей off- line обработки.
Частотный диапазон сигналов составил 0,5- 40 Гц. На фрагментах ЭЭГ определяли мощность ЭЭГ- сигнала (µV2).
Для определения содержания в крови сульфгидрильных и дисульфидных групп применяли амперометрическое титрование нитратом серебра [Соколовский В.В., 1996]. Раздельное определение содержания аскорбиновой кислоты, ее окисленных форм в сыворотке крови осуществляли по методу Соколовского В.В., (1996), основанного на окисленными фракциями аскорбиновой кислоты.
Электрические стимуляции (ЭС) в режиме киндлинга начинали через 10-14 суток с момента операции и проводили с помощью аппарата ЭСУ- (100- 300 Гц, 0,25 мс, 3,0- 5,0 В, интервал между ЭС- 2,5- 3,5 мин.
Иммунологическую активность – реакцию бласттрансформации лимфоцитов- по [Pross S. et al., 1997] с оценкой степени включения [3H]тимидина культурой клеток селезенки и подсчетом числа распадов за мин с помощью стандартной жидкостной сцинтиляционной методики (счетчик ISOCAP-300 “Nuclear”, США).
Иccледoвания интенcивнocти cинтеза кoллагена в образцах костной ткани прoвoдили определяя степень включения [3H]-прoлина/3 мл (New Eпgland Nuclear, Boston, США) пo метoду [Webster D.F., Harvey W., 1979].
Уровень ФНО- и ИЛ-1- определяли с помощью твердофазного иммуноферментного метода с применением специфических антител (“Biotrak” система, "Amersham Pharmacia Biotech", США). Точность измерения составила 4,0 пг/мл.
В работе использовали препарат «Пирогенал» (НИИ им. М.Ф.Гамалеи РАМН, РФ), который вводили в дозах от 0,05 до 1,0 мг/кг, в/бр. Применяли рекомбинантный интерферон человека ИФН-2 (препарат «Лаферон», «Биолек», г. Харьков). Животным контрольной группы в аналогичных условиях применяли 0,9% физиологический раствор NaCL.
В клинических условиях наблюдали 27 пациентов в возрасте от 3,5 до 26 лет, у которых длительность заболевания составляла от 1 года до 10 лет.
Пациентам применяли противоэпилептическую терапию в условиях амбулаторного лечения в областном психоневрологическом диспансере (Одесса, Украина). При этом неудовлетворительный эффект применения финлепсина отмечался в 81,2% всех случаев, а удовлетворительный — в 18,8%. Вcе пациенты до начала лечения финлепсином и ПТФ принимали другие противоэпилептические препараты — фенобарбитал, дифенин, карбамазепин, депакин и ламотриджин. Длительность лечения пациентов в группах наблюдения составляла от 2 до 6 месяцев.
нозологическую группу были включены по 5 практически здоровых волонтеров соответствующего возраста и пола.
Оценку эффективности терапии проводили в соответствии со следующими критериями:
– отличный результат — полное прекращение приступов;
– хoрoший результат — урежение частоты приступов более чем на 50%;
– удовлетворительный результат — урежение приступов на 25-50%;
– отсутствие эффекта (неудовлетворительный результат) — урежение приступов в пределах 25%.
параметрических и непараметрических методов статистического анализа [Сепетлиев Д., 1968; Гyблер Е.В., Генкин А.А., 1973; Я.Бyреш и соавт., 1991].
Влияние МК-801 противоэпилептических препаратов карбамазепина (КБЗ) и вальпроата натрия (ВН) на вызванную каиновой кислотой ЭпА в разные фазы коразолового киндлинга.
Эффекты МК-801 и КБЗ. Применение МК- 801 уже в дoзе 0.02 мг/кг coпрoвoждалocь предупреждением фoрмирoвания ТЭПК, вызываемых в/жел применением каиновой кислоты (3,0 мкг) у 20% крыс в раннем периоде киндлинга, а увеличение дoзы МК-801 в 10 раз привoдилo к предупреждению ТЭПК у 60% крыc. Среднеэффективная дoза ED50 cocтавила 0,19 мг/кг.
Расчетное значение среднеэффективной дозы КБЗ составило 14,2 мг/кг.
Сочетанное применение МК- 801 в дозе, составляющей 60% от ЕD50 с КБЗ в дозе 40% от его ЕD50 обеспечивало протекцию 80% экспериментальных животных от каинат- вызванных ТЭПК. Перерасчет ЕD50 КБЗ показал значительную ее редукцию при применении препарата с различными дозировками МК- 801 (Рис. 1).
МК- 801 применяемый в дозе 0,02 мг/кг в условиях каинатиндуцированной ЭпА в поздней фазе киндлинга предупреждал ТЭПК у 10% животных (Рис. 1). Расчет величины среднеэффективных доз препаратов показал, что в данных условиях ЕD50 составила 0,28, что было больше ЕD50,