На правах рукописи

ПИМЕНОВ Николай Васильевич

Разработка средств и совершенствование методов

лечения и профилактики сальмонеллеза птиц

03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии),

06.02.02 – ветеринарная микробиология, вирусология,

эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва, 2012

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И.Скрябина» (ФГБОУ ВПО МГАВМиБ).

Научный консультант: доктор ветеринарных наук, профессор Субботин Владимир Викторович

Официальные оппоненты:

Бессарабов Борис Филиппович – доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, профессор кафедры птицеводства и болезней птиц;

Золотухин Сергей Николаевич – доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия имени П.А.Столыпина», профессор кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы, заведующий лабораторией прикладной микробиологии и бактериофагии Научно-исследовательского инновационного центра микробиологии и биотехнологии;

Ирза Виктор Николаевич – доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», заведующий лабораторией эпизоотологии и мониторинга.

Ведущая организация: Государственное научное учреждение «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт биологической промышленности».

Защита состоится « 24 » декабря 2012 г. в_1400 _часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 при ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23;

тел. (495) 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, 23).

Автореферат разослан «04»_октября2012 г. и размещен на сайте http://www.vak.ed.gov.ru.

Ученый секретарь диссертационного совета, профессор Грязнева Т.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. По заключению экспертов Всемирной организации здравоохранения сальмонеллез, как зоонозная инфекция, не имеет себе равных по сложности эпизоотологии, эпидемиологии и трудностям борьбы с ним. Хозяйства, сталкиваясь с проблемой сальмонеллеза, несут большие потери из-за смертности молодняка, снижения продуктивности, качества продукции и наложения ограничительных мероприятий на выпуск продукции. Обсемененные сальмонеллами яйца и мясо птиц являются основными причинами пищевых токсикоинфекций у людей.

Эффективность проводимых мероприятий против сальмонеллеза птиц недостаточна. Антибиотикообработки не позволяют избавить птицу от сальмоносительства, не способны профилактировать и ликвидировать инфекцию, а предотвращают лишь массовое клиническое проявление заболевания (Ленев С.В., Малахов Ю.А., 1995; Куриленко А.Н. 2003; Данилевская Н.В., 2007; WHO,1991; Bole-Hribovsek V., 1998).

Требует совершенствования специфическая профилактика сальмонеллеза птиц с использованием средств активной иммунизации. Не разработана эффективная система специфических мероприятий по борьбе с сальмонеллезом в условиях непромышленного, мелкофермерского, частного птицеводства разных направлений и голубеводства.

Цель и задачи исследований. Целью настоящих исследований являлись разработка средств и методов лечения и профилактики сальмонеллеза птиц, совершенствование системы противоэпизоотических мероприятий, направленных на борьбу с сальмонеллезом птиц.

Для достижения поставленной цели были определены задачи:

1. Выяснить этиологическую структуру сальмонеллеза птиц разных видов, изучить биологические свойства и антибиотикорезистентность возбудителя.

2. Определить вирулентные и иммуногенные изоляты возбудителя со свойствами производственных и контрольных штаммов, провести их депонирование.

3. Определить технологические параметры изготовления и эффективность применения инактивированной вакцины против сальмонеллеза голубей.

4. Выделить и провести селекцию, изучение морфологической структуры и биологических свойств бактериофагов со свойствами производственных штаммов.

5. Сконструировать препараты бактериофагов против сальмонеллеза птиц, оценить их терапевтическую эффективность.

6. Разработать метод для лечения сальмонеллеза птиц с использованием препаратов бактериофагов и пробиотика.

7. Сконструировать и определить оптимальную иммунизирующую дозу ассоциированной вакцины против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц.

8. Разработать технологическую схему производства вакцины ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц.

9. Провести доклинические и клинические испытания предложенной вакцины с целью ее регистрации и сертификации на территории РФ.

10. Усовершенствовать систему противоэпизоотических мероприятий по борьбе с сальмонеллезом птиц разных видов путем введения в нее разработанных средств и методов лечения и профилактики болезни.

Научная новизна. Изучена современная эпизоотическая ситуация по сальмонеллезу у птиц разных видов и направлений содержания.

Впервые проведен анализ свойств большого числа изолятов возбудителей сальмонеллеза голубей и декоративных птиц. Производственные и производственно-контрольные штаммы сальмонелл, выделенные автором, депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ и впервые использованы для создания средств специфической профилактики. Впервые разработана и апробирована вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей.

Выделены бактериофаги с высокими литическими свойствами, адсорбционными свойствами, специфичностью действия, изучена их морфологическая структура, антигенное родство. Производственные штаммы бактериофагов, выделенные под руководством и с участием автора, депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ и впервые использованы для создания лечебно-профилактических препаратов против сальмонеллеза птиц.

Впервые разработан препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей. Усовершенствованы лечебные средства против сальмонеллеза птиц. Впервые разработан метод селективной деконтаминации для лечения сальмонеллеза птиц с использованием предложенных препаратов бактериофагов и пробиотика лактобифадол.

Разработана и внедрена в производство и ветеринарную медицину вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц – новый эффективный биопрепарат, не имеющий аналогов в Российской Федерации.

Изучены биологические свойства нового вируса болезни Ньюкасла, выделенного автором, обладающего свойствами производственного штамма.

Усовершенствована система лечебно-профилактических мероприятий при сальмонеллезе птиц с использованием новых средств и методов, разработанных автором или под руководством автора.

Научная новизна работы подтверждена патентами: «Вакцина инактивированная против сальмонеллеза голубей и способ ее применения», «Препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей», «Способ лечения птиц при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhimurium».

Практическая значимость. По результатам исследований разработаны «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур» и «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

Вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц сертифицирована, зарегистрирована на территории Российской Федерации и внедрена в практику ветеринарной медицины.

Разработанные в ходе работы Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей, Бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц, вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей рекомендованы для применения в качестве средств лечения и профилактики сальмонеллеза. Предложенные новые средства, а также способы их применения и метод селективной деконтаминации позволяют совершенствовать борьбу с сальмонеллезом птиц.

Материалы работы включены в «Методические рекомендации по недопущению распространения гриппа птиц и болезни Ньюкасла голубей в частных подворьях, птицеводческих хозяйствах и голубятнях», утвержденные Учебно-методическим советом ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (пр.

№11 от 25.10.11).

Личный вклад соискателя. Автору принадлежат непосредственное осуществление исследований этиологического профиля сальмонеллеза птиц, выделение и изучение биологических свойств изолятов сальмонелл, определение и депонирование производственных штаммов, создание вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей, создание и внедрение вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц, создание бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц.

Автору принадлежат организация и проведение работ по выделению бактериофагов, совместно с аспирантом Чирковой И.В. изучение их биологических свойств и депонирование производственных штаммов, разработка и испытание препарата Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей.

Автор принимал непосредственное участие во всех доклинических, клинических регистрационных испытаниях новых, предложенных им, средств и методов лечения и профилактики сальмонеллеза птиц.

Автору принадлежат анализ и обобщение полученных результатов, концепция совершенствования системы лечебно-профилактических мероприятий против сальмонеллеза птиц с использованием новых средств и методов.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены на XI Московском международном ветеринарном конгрессе (2003), Межрегиональной научно-практической конференции молодых ученых «Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки» (Воронеж, 2005), на Международной школе-конференции молодых ученых «Проблемы рационального природопользования техногенного региона» (Кемерово, 2005), II Открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Молодежь и наука XXI века» (Ульяновск, 2007), V Международном симпозиуме «ЕС-Россия: сотрудничество в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи»

(Пущино, 2008), Междунар. научно-практической конференции «Вопросы ветеринарии и биотехнологий» (Москва, 2009), VII Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству (Москва, 2010), Международной научно-практической конференции «Молодость, талант, знания – ветеринарной медицине и животноводству» (Троицк, 2010), IV Международной научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные тенденции развития Российской науки» (Красноярск, 2011), Международной научно-практической конференции «Молодежь и инновации – 2011» (Горки, Беларусь, 2011), Международной российско-чешской научнопрактической конференции молодых ученых и специалистов «Актуальные вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии» (Москва, 2012) и других.

Результаты исследований также доложены на международных, всероссийских и академических школах молодых ученых, научно-практических семинарах, методических совещаниях факультета ветеринарной медицины и факультета повышения квалификации, кафедральном и межкафедральных заседаниях ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Публикации. По теме диссертации и материалам исследований опубликованы 48 научных работ, в т.ч. 20 статей в научных журналах, из которых 18 – в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, в т.ч. 3 патента, а также монография, 3 рекомендации, 24 статьи в сборниках научных трудов.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 307 листах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, сведения о практическом использовании результатов исследований, рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (301 источник, в т.ч. 153 – иностранных авторов). Диссертационная работа содержит 42 таблицы, 19 рисунков, 114 листов приложений.

На защиту выносятся следующие положения и результаты:

1. Этиологическая структура сальмонеллеза птиц разных видов в сравнительном аспекте.

2. Технология производства вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей, ее свойства и эффективность применения.

3. Морфологическая характеристика, биологические, адсорбционные свойства и антигенное родство бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium.

4. Технология производства и эффективность применения Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей и бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц.

5. Биологические свойства вируса ньюкаслской болезни «PN-T».

6. Технология производства и протективная эффективность вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц.

7. Усовершенствованная система противоэпизоотических мероприятий против сальмонеллеза птиц разных видов, включающая метод селективной деконтаминации и способы профилактики сальмонеллеза птиц с использованием разработанных препаратов бактериофагов и вакцин.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2002-2012 гг. на базе ФГБОУ ВПО МГАВМиБ.

Изучение эпизоотической ситуации, диагностические исследования, взятие материала и испытания препаратов проводили на голубятнях, в зоопарках и птицеводческих хозяйствах г. Москвы, Московской, Тульской, Владимирской, Калужской, Тверской областей, Краснодарского края, а также на базе ФГУ «Центральная научно-методическая ветеринарная лаборатория». Выделение и изучение биологических свойств изолятов сальмонелл и бактериофагов проводили на базе МГАВМиБ, ФГУ «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ), НПФ «Бионит».

Электронно-микроскопические исследования проводили на базе ГУ «Научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И.Ивановского РАМН». Молекулярно-генетические исследования проводили на базе ФГУ ВГНКИ. Испытания разработанных препаратов проводили на базе ФГБОУ ВПО МГАВМиБ и ООО «Торговый дом БиАгро».

В работе использованы 71 музейный штамм бактерий, 4 производственных штамма и 129 полевых изолятов сальмонелл, 42 бактериофага, диагностические сыворотки, питательные среды, реактивы, лабораторная посуда и оборудование, животные: 2820 белых мышей, 9 кроликов, голубей, 15655 кур и цыплят, 103 утки, 95 гусей, 60 фазанов и другие птицы, СПФ куриные эмбрионы в количестве 3300, а также эпизоотологические, бактериологические, серологические, вирусологические, статистические методы исследований, методы молекулярной диагностики, электронной микроскопии и другие.

Бактериологическое исследование проводили согласно методическим указаниям по лабораторной диагностике сальмонеллезов животных и человека, утвержденным Департаментом ветеринарии МСХ РФ и Госкомсанэпиднадзором Минздрава РФ 18.06.96. Для выделения бактериофагов использовали метод обогащения, описанный Адамсом, активность фагов определяли методами Аппельмана и Грациа, адсорбционные свойства – по Адамсу, изучение морфологии вирионов фагов проводили по методике А.С. Тихоненко, определение способности бактериофагов к образованию литического фермента проводили по методу В.А. Зуева и В.В. Желтовой в модификации Л.Б. Борисова.

Контроль препаратов на стерильность, безвредность, определение токсичности биомассы и остаточной вирулентности проводили в соответствии с ГОСТами на препараты биологические. Определение антигенной активности проводили в РТГА, РНГА и РА, иммуногенной активности – путем инфицирования тест-объектов контрольными штаммами сальмонелл в дозах 5 LD50.

Результаты исследований обрабатывали методами корреляционного, вариационного и факторного статистического анализа с использованием пакета компьютерных программ «Biostat» и «Statistica 6,0» и анализом результатов по Ашмарину И.П. и Воробьеву А.А.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Этиологический профиль сальмонеллеза птиц При изучении эпизоотической ситуации и этиологической структуры сальмонеллеза птиц S. typhimurium выделяли в 189 из 194 случаев сальмонеллеза у голубей в 2003 г., что составило 97,4 %, 228 (93,1 %) из 245 в 2004 г., 198 (98,5 %) из 201 в 2005 г., 111 (97,4 %) из 114 в 2006 г., (99,2 %) из 129 в 2007 г. и 133 из 146 случаев в 2008 году, что составило 91,2 %. Т.о. доля сероварианта S. typhimurium в этиопатогенезе сальмонеллеза голубей за 6 лет наблюдений составила в среднем 96,1 %. Доля сероварианта S. enteritidis составила за 6 лет 28 случаев из 1029 – 2,7 %.

Остальные сероварианты встречались единично и эпизоотического значения не имели.

Доля S. typhimurium от общего количества положительных исследований на сальмонеллез водоплавающих птиц составила 97,7 %. Доля других серовариантов не превышает 1 % (S. enteritidis – 0,8 % в среднем за 6 лет наблюдений). Анализ результатов исследований патологического материала от попугаев, фазанов, ворон, журавлей, страусов, индеек, перепелов и других диких, экзотических и вольерных птиц, показал также доминирующую роль S. typhimurium – 87,5 %.

Доля S. typhimurium в этиологии сальмонеллеза кур составляла 9,5 % в 2002 г.; 15,4 % в 2003 г.; 10,8 % в 2004 г.; 18,2 % в 2005 г. и 17,7 % в году. Доля S. enteritidis в этиологии сальмонеллеза кур – превалирующая (31,2 % - 51,2 %).

Культуры сальмонелл, выделенные от птицы, обладали характерными морфологическими, тинкториальными, культуральными, биохимическими свойствами для своего рода и сероварианта. Все изоляты обладали патогенностью и широкой антибиотикорезистентностью. Спектр определения составлял по большинству изолятов не менее 25 антибактериальных препаратов различных фармакологических групп. Высокую или среднюю чувствительность среди 28 исследованных изолятов S. typhimurium отмечали только к имипенему, у половины культур – к клафорану, левомицетину, байтрилу, фурагину. К мономицину, ципрофлоксацину, азитромицину, клотримазолу, доксициклину, метронидазолу, карбенициллину, колистину, стрептомицину, белкоспире, рифампицину, канамицину, тетрациклину, линкомицину, неомицину, эритромицину большинство выделенных изолятов сальмонелл обладали резистентностью или низкой чувствительностью.

Исследованиями на белых мышах выявили наиболее вирулентные и иммуногенные штаммы сальмонелл, что в дальнейшем подтвердили и на голубях (табл. 1).

Таблица 1. Показатели LD50 и ImD50 производственных штаммов сальмонелл для белых мышей и голубей (k=0-1,57) Штаммы S. typhimurium М-2ф t, S. typhimurium М-5в t, S. typhimurium Д-1в t, S. enteritidis 25 Яв e были депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных и производственно-контрольных.

Изготовление вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей, контроль вакцины Необходимость создания эффективной инактивированной вакцины против сальмонеллеза голубей была продиктована отсутствием сертифицированного аналогового препарата в нашей стране и насущной востребованностью со стороны голубеводов и ветеринарной службы.

Операционная схема изготовления вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против салмонеллеза голубей включала следующие этапы (рис. 1):

1. Исследование свойств штаммов, контроль заявленных свойств штаммов S. typhimurium М-5в t -ДЕП, S. typhimurium Д-1в t -ДЕП, S.

enteritidis 25 Яв e –ДЕП, используемых в качестве производственных.

2. Для накопления бактериальной массы посев лиофильно высушенной культуры производственных штаммов осуществляли внесением стерильного физраствора во вскрытые ампулы и переносом в пробирки с бульоном Хоттингера. Через 24 часа инкубации при 37С проводили пересев, а на третий день – высев во флаконы с бульоном Хоттингера в соотношении 1:10.

3. Культивирование штаммов в 6-литровых бутылях с добавлением через 4 часа 40 %-ного раствора глюкозы до 0,5 %-ной концентрации. Дальнейшее культивирование 18-24 часов с периодическим контролем чистоты роста.

4. Инактивация бульонных культур формалином из расчета 0,3 % к общему объему в течение 19-21 суток при 200С.

6. Концентрирование и декантация антигенов в приведенных ниже оптимальных условиях.

7. Определение концентрации бактериальной массы.

8. Составление серии вакцины.

9. Фасовка вакцины.

10. Упаковка и маркировка (этикетирование) вакцины.

11. Контроль вакцины на стерильность.

12. Контроль вакцины на безвредность.

13. Контроль вакцины на активность.

Опытные образцы препарата – вакцины инактивированной против сальмонеллеза голубей готовили в нескольких вариантах. Всего было изготовлено 9 опытных серий: 3 из них (серии № 1, № 2, № 3) изготовили, используя в качестве средства концентрирования антигена 50 % полиэтиленгликоль-6000 (ПЭГ-6000); серии № 4, № 5, № 6 с использованием геля гидрата окиси алюминия; серии № 7, № 8, № 9 были эмульгированными с использованием масляного адъюванта на основе масла «Markol-52» и эмульгатора №134 (Франция).

Рис.1. Операционная схема изготовления вакцины инактивир ованной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей Через 18-24 часов культивирования производственных штаммов определяли концентрацию биомассы и инактивировали бульонные культуры формалином, внося его до концентрации в биомассе 0,3 %. Инактивацию проводили, выдерживая бутыли в темном месте при комнатной температуре и перемешивая их содержимое ежедневно.

Осаждение бактериальных клеток проводили внесением растворов ПЭГ-6000 или геля гидрата окиси алюминия в объеме 18-20 % к объему среды. Через 72 часа проводили декантацию надосадочной жидкости в количестве 75-80 % от первоначального объема, а оставшуюся в виде осадка бактериальную массу ресуспендировали в стерильном изотоническом растворе хлорида натрия до концентрации каждого штамма 6 млрд.

мкр. кл. в 1 см3 в образцах № 2 и № 5, в образцах № 1 и № 4 – 3 млрд. мкр.

кл., в образцах № 3 и № 6 – 9 млрд. мкр. кл.

Для получения экспериментальных образцов № 7, № 8, № 9 бактериальную суспензию центрифугировали в течение 30 минут при 4000 тыс.

об./мин. Надосадочную жидкость полностью удаляли, а осадок ресуспендировали в физиологическом фосфатно-буферном растворе с рН 7,2. Бактериальную массу разводили с тем расчетом, чтобы в последующем при добавлении минерального масла в качестве эмульгатора концентрация в готовом препарате также составила 6 млрд. мкр. кл. в 1 см3 вакцины (№ 8), 3 млрд. мкр. кл. (№ 7) и 9 млрд. мкр. кл. (№ 9).

Для проверки безвредности препарата использовали беспородных взрослых голубей, которым образцы вакцины вводили в удвоенной дозе.

При этом образцы № 1-6 вводили внутримышечно, образцы масляной вакцины № 7-9 вводили подкожно.

Наблюдения показали, что после введения голубям образцов № 1-3 у птицы не было отмечено системных реакций. При индивидуальном осмотре местных негативных признаков реакции организма на введение препарата не выявлено.

Введение голубям экспериментальных образцов № 4-6 также не провоцировало каких либо системных реакций. Однако, при индивидуальном осмотре вакцинированной птицы, у отдельных голубей на месте введения вакцины выявляли болезненные уплотнения диаметром 0,8-1,6 см. Их пальпация доставляла птице четко выраженное беспокойство. В течение последующего после вакцинации месяца у таких птиц наблюдалось отсутствие стремления к полету.

Введение образцов № 7-9 голубям в двукратной дозе подкожно в области средней трети шеи было отмечено образованием быстро развивающихся асептических абсцедирующих припуханий. При этом появившееся образование быстро смещалось в область спины, голуби становились вялыми, адинамичными. У отдельных особей отмечали искривление шеи и прогрессирующее исхудание. В последующем на месте введения отмечали фиброзные образования. Таким образом, проведенные исследования показали, что оптимальным средством концентрирования антигенов для вакцины инактивированной против сальмонеллеза голубей является полиэтиленгликоль-6000. Его использование не вызывало негативных воздействий на организм птиц.

Для определения оптимальной концентрации бактериальной массы в одной вакцинальной дозе, способной вызвать формирование напряженного иммунитета, проводили вакцинацию голубей препаратом с разной плотностью бактерийного антигена. Были сделаны опытные образцы полиэтиленгликолевой вакцины с содержанием 9х109; 7,5х109; 6х109;

4,5х109; 3х109 мкр. кл. в 1 см3.

Вакцинировали голубей беспородных массой 280-320 г внутримышечно двукратно в дозе 0,5 см3 с интервалом 30 дней. Через 18 дней после повторной вакцинации у иммунизированных голубей брали кровь, которую исследовали в ККРА с эритроцитарными антигенами. После этого птицу инфицировали внутримышечно контрольными штаммами S. typhimurium Д-1в t в дозе 11,5 млн. мкр. кл. (5 LD50) и S. enteritidis 25 Яв е в дозе 247, млн. мкр. кл. (5 LD50). В качестве контрольной группы использовали 8 невакцинированных голубей, по 4 на каждый штамм. Результаты опыта отражены в таблице 2.

Таблица 2. Определение оптимальной концентрации микробных клеток сальмонелл в вакцинальной дозе Заражающая культура Контроль 1 группа 2 группа 3 группа 4 группа 5 группа S. typhimurium Д-1в t S. enteritidis 25 Яв е В соответствии с данными, отраженными в таблице 2, оптимальной иммунизирующей дозой является 4,5 и 6,0 млрд. мкр. кл. в 1 см3 вакцины.

Однако в течение 3-7 дней после заражения у голубей 4 группы отмечали признаки подострого заболевания: незначительное угнетение, вялость, снижение аппетита, усиленную жажду, иногда разжиженную консистенцию помета. Признаки самопроизвольно заканчивались в течение 1 недели. Т.о., в качестве иммунизирующей дозы мы определили 6,0 млрд. мкр.

кл. инактивированных сальмонелл. При введении вакцины в дозе, содержащей данное количество клеток, у птиц вырабатывался иммунитет, способный предохранить от гибели 100 % голубей в лабораторных условиях.

На всех этапах работы по получению экспериментальных серий вакцины проводили проверки стерильности и безвредности препарата.

Лабораторное испытание вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей (контроль иммуногенности) проводили на 20 голубях, беспородных, массой 250-280 г. Голубей опытной группы прививали вакциной в дозе 0,5 см3, голубям контрольной группы вводили стерильный изотонический раствор хлорида натрия в той же дозе. Через 21 день после инъекции проводили инфицирование голубей обеих групп внутримышечно штаммом S. typhimurium М-2ф t в дозе 5 млн.

мкр. кл (2,5 LD50). В течение 14 дней наблюдения отмечали сохранность в опытной группе – 90 % при 80 %-ной летальности в контроле.

Определение эффективности вакцины осуществляли на голубятне с поголовьем 160 птиц, в т.ч. молодняка до года – 104. В течение предшествующего исследованию года у птиц периодически отмечали случаи болезни с отказом от корма, угнетением, расстройством дефекации, появлением зеленой окраски фекальных масс. У взрослых голубей болезнь носила хронический характер, проявляясь поражением суставов ног и крыльев, у молодняка в возрасте до 3-4 месяцев – явлениями в виде дрожи, судорожных подергиваний головы, нарушения естествен-ного положения головы, опистотонуса.

Для оздоровления данной голубятни наряду с комплексом ветеринарно-санитарных мероприятий проводили вакцинацию птицы вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей двукратно с интервалом 40 дней в дозе 0,5 см3. Больных и подозрительных по заболеванию голубей лечили цефалексином в течение 10 дней согласно результатам исследований чувствительности возбудителя к антибиотикам. В качестве контроля нами были оставлены 20 взрослых голубей без вакцинации, имевших до лечения признаки, характерные для сальмонеллеза. После лечения эти голуби были помечены и оставлены в общем помещении с основным вакцинированным поголовьем. Наблюдение вели в течение 12 месяцев. Среди контрольных птиц периодически наблюдали признаки заболевания в виде угнетения, отказа от корма, появления артритов и т.д. Первые клинические явления отмечали через 4,5 месяца после начала эксперимента. При проведении бактериологического исследования фекалий и содержимого внутрисуставных абсцессов от заболевших голубей выделяли S. typhimurium – всего от 6 птиц. При этом два голубя были вынужденно убиты. При бактериологическом исследовании из печени, селезенки, красного костного мозга выделена S. typhimurium от обоих голубей.

Среди вакцинированных птиц не было выявлено голубей с поражением суставов и другими признаками, характерными для сальмонеллеза. Случаев заболевания сальмонеллезом среди моло-дняка голубей также не выявили. Сальмонелл не выделяли.

Селекция и изучение биологических свойств высокоактивных Для выделения бактериофагов к S. typhimurium были отобраны и исследованы по методу обогащения пробы пометных вод и фекалий из голубятен и птицеферм Московской области, Москвы, Тулы и Тульской области в общем количестве 116. Выделены 39 бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium, 16 из которых по методу Аппельмана обладали активностью 10-8-10-10, еще 2 бактериофага – 10-5-10-7.

Отобранные фаги обладали широким спектром действия в отношении сальмонелл специфичного сероварианта, лизируя не менее 81 % полевых изолятов и музейных штаммов S. typhimurium, а преимущественно 90- % культур сальмонеллы тифимуриум (15 из 18 фагов).

Высокие результаты литической активности у исследованных бактериофагов отмечены и к другим серовариантам сальмонеллы, этиопатогенным для птиц: к S. enteritidis лизис культур на уровне 73-93 % отмечен у 16 фагов, еще 2 бактериофага – Ph. S. typhimurium №14 ПП и №17Ф2М лизировали все 15 тестовых культур. Лизис штаммов S. gallinarumpullorum фагами отмечен на уровне 5-6 из 7 (71-85 %), S. dublin – преимущественно 3 из 4, S. newlands – 1-2 из 3. В то же время проведенные исследования не выявили ни одного случая литической активности у исследованных изолятов фагов к бактериям других родов семейства Enterobacteriaceae – Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Yersinia pseudotuberculesis, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis и к бактериям других семейств – Pasteurella multocida, Bordetella bronchiseptica, Listeria monocytogenes, Streptococcus pyogenes, Staphilococcus aureus. Результаты данных исследований констатируют специфичность литического действия отобранных фагов вариантами вида Salmonella enterica.

Выделенные бактериофаги характеризовались проявлением роста в виде негативных колоний преимущественно типа «А». При электронномикроскопическом исследовании мы получали ультрафотографии фагов с инструментальным увеличением в 53018 раз и фотографическом увеличении – в 1,8-4,9 раз. По морфологии структурных элементов бактериофаги отнесены к семейству Siphoviridae и четвертой морфологической группе по А.С. Тихоненко.

При исследовании адсорбционных свойств фагов на депонированных штаммах сальмонелл, выявлены выраженные свойства адсорбции на клетках хозяев. При этом наибольшие показатели скорости адсорбции – (4,96±0,05)х10-9 см3мин-1 и количества адсорбировавшихся фаговых частиц –91,7±0,25 %, отмечены у бактериофага Ph. S. typhimurium №8 МЕ, который также наиболее интенсивно формировал литический фермент.

При проведении опытов одиночного цикла развития фага Ph. S.

typhimurium №5 ТЗ среднее число негативных колоний в разведении 1: составляло 30-32 на протяжении 22 минут, с 26 минуты отмечался выраженный рост, на 28 минуте появлялись негативные колонии в чашках, засеянных из разведения 1:100, и на 30 минуте проявляется полный лизис колоний в посевах из второго разведения (1:40). Таким образом, конец латентного периода начинает проявляться на 24-25 минутах и стабилизируется за 8 минут. Среднее число негативных колоний, полученных из разведения фага 1:100 – 132, т.е. по окончании лизиса бактерий количество фаговых частиц составило 13200 в 0,1 мл материала. Средний выход фага рассчитывали отношением количества выхода бактериофага к исходному количеству в латентный период. Для Ph. S. typhimurium №5 ТЗ он составил 426. Штаммы Ph. S. typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ аналогично обладали выраженной интенсивностью формирования литического фермента, минимальным латентным периодом внутриклеточного развития, высокой урожайностью, периодом стабилизации лизиса 6-8 минут, скоростью адсорбции 4,0-4,96 х 10-9 см3мин-1. Полученные результаты свидетельствует о том, что данные штаммы могут быть использованы в качестве производственных, в связи с этим они были депонированы в коллекции ФГУ ВГНКИ.

Полученные гипериммунные сыворотки на производственные штаммы бактериофагов проявляли нейтрализующую активность в разведениях 1:5Константы скорости нейтрализации фагов с гомологичными антисыворотками были 240,21-270,26 мин-1, с гетерологичными антисыворотками – 124,42-163,67 мин-1. Т.о. штаммы Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, Ph. S.

typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ являются родственными и обладают выраженной иммуногенностью.

Создание фагового препарата против сальмонеллеза голубей Работа по разработке и созданию препарата выполнялась совместно с Чирковой И.В. Препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей готовили, производя высев в разные емкости с предварительно нагретым до 37°С и разведенным 1:5 МПБ суспензий 6-часовой культуры S. typhimurium М-2ф t и фильтрата каждого из депонированных бактериофагов.

Культивирование фагов на молодых культурах сальмонелл проводили 18 часов, после чего осуществляли очистку культуральной жидкости от биомассы сальмонелл, остатков клеток и компонентов питательной среды.

Следующим этапом осуществляли центрифугирование при 6000 об./мин. в течение 30 минут, фильтрацию через системы бактериальных фильтров Шамберленда и приготовление концентрированной суспензии бактериофагов. Контролем служили отсутствие роста при посеве суспензии бактериофагов в разведенный МПБ и рост сальмонеллы без фагов по выраженной мутности питательной среды.

В качестве консерванта приготовленной суспензии фагов применяли раствор хинозола до его конечной концентрации в фаголизате – 0,01 %.

Готовый препарат формировали смешиванием консервированных суспензий бактериофагов Ph. S. typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЕ и Ph. S. typhimurium №9 ММ в соотношении 1:1:1. Контроль на стерильность осуществляли высевом на МПА и в МПБ по отсутствию роста после 18-20-часовой инкубации при температуре 37°С. Контроль на активность осуществляли на белых мышах массой 14-16 г, для чего 10 мышам подкожно вводили S. typhimurium M-2ф t в дозе 10 тыс. мкр. кл. (5 LD50).

Спустя 20 минут мышам подкожно вводили Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см3, что соответствует 104 фаговых частиц. Контрольной группе – 10 голов белых мышей, вводили только культуру сальмонеллы в аналогичной дозе. За лабораторными животными наблюдали 8-10 дней, павших мышей вскрывали, проводили бактериологический анализ.

Контроль осуществляли для каждой экспериментальной серии приготовленного препарата (всего более 24). При контроле активности сохранность белых мышей в опытных группах составляла 100 %, в контрольных группах отмечали гибель 90-100 % мышей, из патологического материала которых была выделена S. typhimurium.

Создание бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц Для создания бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц были использованы фаги к S. enteritidis, выделенные нами при исследовании по методу обогащения 52 проб сточных вод из цехов содержания молодняка и маточного поголовья птицефабрик и депонированные ранее в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных.

Бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц готовили по аналогичной схеме, смешивая в конечный препарат консервированные суспензии 3 фагов тифимуриум и 3 фагов энтеритидис в равных соотношениях (рис. 2).

Исследования на активность бивалентного бактериофага осуществляли на белых мышах массой 14-16 г. Для этого формировали 3 опытные и контрольные группы мышей по 10 голов. В первых группах инфицирование перед фагообработкой проводили S. typhimurium M-2ф t в дозе 10 тыс.

мкр. кл. (5 LD50), во вторых – S. enteritidis 25 Яв e в дозе 70 тыс. мкр. кл. ( LD50), в третьих – обоими штаммами в дозах по 2,5 LD50.

В опытных группах, где вслед за летальной дозой культуры возбудителя вводили бивалентный бактериофаг, сохранность составила 90-100%.

При этом, по окончании периода наблюдения – 14 дней и бактериологическом исследовании всех мышей опытных групп, бактерий рода Salmonella не выделяли. В контрольных группах, инфицированных как монокультурами, так и (в третьей группе) смесью штаммов обоих серовариантов, гибель мышей была максимальной, составила 90-100 %.

Аналогичные исследования провели с голубями.

Рис. 2. Схема изготовления бивалентного бактериофага против Сохранность голубей в опытных группах стабильно составляла 90- % при сохранности в контрольных группах без фагообработки – 0-10 %.

Летальные случаи в опытных группах могли быть спровоцированы сальмонеллезными токсинами, т.к. гибель птицы отмечали в первые (2 опытная группа) и вторые (3 опытная группа) сутки после начала эксперимента, что не характеризует развитие инфекционного процесса.

Проведенные исследования бактериологическими методами материала от птицы в опытных группах спустя 14 дней после начала эксперимента не выявили культуры сальмонелл ни у павших, ни у выживших голубей, тогда как у всех птиц в контрольных группах были выделены изоляты рода Salmonella серовариантов соответственных инфицированию. Причем в третьей опытной группе, где заражение проводилось культурами двух серовариантов, в 60% была выделена S.typhimurium, не смотря на меньшее количество введенных микробов. Гибель голубей в контрольных группах проходила, начиная с 3-4 до 10-12 суток эксперимента, как правило, после развития клиники угнетения, одышки, отказа от корма, быстрой потери массы, диареи серо-зеленого цвета, потери координации движений, развития опистотонуса или нехарактерных колебательных движений головой.

Эффективность метода селективной деконтаминации для лечения сальмонеллеза птиц с использованием бактериофагов и Для эффективного оздоровления хозяйств от сальмонеллеза нами разработан метод селективной деконтаминации, основанный на санировании организма птиц разных видов с одновременным использованием препаратов бактериофагов против сальмонеллеза и пробиотика лактобифадол.

Лактобифадол содержит живые микробные клетки бифидобактерий вида Bifidobacterium adolescentis и живые микробные клетки лактобактерий Lactobacillus acidophilum. Штаммы отличаются выраженными антагонистическими свойствами к патогенным бактериям, имеют выраженные адгезивные свойства, устойчивы к широкому диапазону рН, устойчивы к желчи, фенолу, повышенной концентрации хлорида натрия, имеют выраженную кислотообразующую, антагонистическую, биохимическую и ферментативную активность, образуют органические кислоты, витамины, ферменты, повышающие продуктивность и конверсию корма у животных и птиц. Сочетание конкурентного действия на патогенную микрофлору лактобифадола со специфическим литическим действием Бактериофага тифимуриум или бивалентного бактериофага обеспечивает выраженный лечебный и профилактический эффект против сальмонеллеза птиц.

Метод селективной деконтаминации был апробирован при пероральном применении птице Бактериофага тифимуриум и лактобифадола.

Испытание метода в остром опыте проводили на 30 цыплятах 14дневного возраста, для чего были созданы 3 группы по 10 голов – 2 опытные и контрольная. Птицу в группах кормили и содержали по принципу аналогов. Инфицирование цыплят проводили смесью из свежих культур штаммов S. typhimurium Д-1в t и S. typhimurium М-2ф t орально в дозе млрд. мкр. кл.

После появления клинических признаков заболевания, проявлявшихся в потере аппетита, одышке, взъерошенности оперения, иногда – диарее, цыплятам первой опытной группы орально вводили Бактериофаг тифимуриум из расчета 0,5 см3, что соответствует 104-105 фаговых частиц, индивидуально при помощи автоматической пипетки-дозатора. Обработку проводили трижды с интервалом 12 часов, а затем еще дважды с интервалом 48 часов. За три часа до выпойки препарата цыплят выдерживали без поения. Лактобифадол вводили в корм из расчета 1,0 г на всех цыплят опытной группы ежедневно в течение 10 дней в виде формы препарата на отрубях. Цыплятам второй опытной группы использовали метод лечения с применением энрофлоксацина – энрофлон 10 %-ный раствор в дозе 0,5 см на 1 л воды 5 дней согласно «Наставлению по применению энрофлона % раствора для орального применения», утвержденному Департаментом ветеринарии Минсельхозпрода России 14.07.98 г. Цыплят контрольной группы препаратами не обрабатывали.

За птицей наблюдали 15 дней, после чего проводили убой. Исследования показали, что в контрольной группе цыплят летальность составила 90%. Павшие цыплята имели характерные патологоанатомические изменения. При бактериологическом исследовании у всех 10 цыплят контрольной группы была выделена S. typhimurium (табл. 3).

Таблица 3. Эффективность применения Бактериофага тифимуриум и лактобифадола в лабораторных условиях Опытная 1 (Бактериофаг тифимуриум + лактобифадол) Испытание метода селективной деконтаминации в «полевых» условиях проводили на неблагополучных по сальмонеллезу голубятнях Подольского и Домодедовского районов Московской области. Диагноз был подтвержден бактериологически – выделена культура S. typhimurium, и методом молекулярной диагностики – положительные результаты ПЦР с пометом и смывами из клоаки у клинически больных и здоровых птиц.

В голубятне Домодедово отмечали полную заболеваемость среди молодняка 2-3-месячного возраста, полученного от основных самок. Общая заболеваемость по птицепоголовью голубятни составила 80 % (120 из голубей). Летальность составила 65 % (пали 78 из 120 заболевших голубей). До начала терапевтических мероприятий методом селективной деконтаминации владельцем голубятни принимались попытки по лечению птицы в виде выпоек энрофлона и бактисубтила, что ослабило развитие эпизоотического процесса, но не остановило инфекцию и появление новых случаев болезни.

Выпойку Бактериофага тифимуриум в неблагополучной голубятне проводили согласно разработанной и использованной в лабораторном эксперименте схеме. Лактобифадол в виде мучной формы давали с кормом из расчета 0,4 г на 1 кг массы птицы в течение первых 10 дней лечения, далее – в дозе 0,2 г на 1 кг массы птицы еще в течение 20 суток.

Случаи гибели птицы прекратились со вторых суток применения предложенного способа лечения. В течение 4 суток состояние птицы нормализовалось. При бакисследованиях смывов из клоаки от 50 голубей через 30 дней бактерий рода Salmonella не выявляли.

В двух голубятнях Подольского района на поголовье в 175 голубей пород пермские, свердловские, гривуны и синие выявили заболеваемость 14,3 %. Ежедневный отход составлял до 3 голубей (1,7 %). При этом вспышка была отмечена на фоне применения владельцем байтрила. С третьих суток после начала лечения Бактериофагом тифимуриум против сальмонеллеза голубей и лактобифадолом состояние больных голубей стабилизировалось, появилась активность, восстановился аппетит, дефекациия нормализовалась. Через 14 дней при исследовании 47 проб (27, %) фекалий от голубей бактерий рода Salmonella не выделяли. Через дней после проведения терапевтических мероприятий в ПЦР с 20 пробами материала от излеченных голубей и со сборными пробами помета положительных результатов на сальмонеллез не регистрировали.

Пример терапевтической эффективности применения Бактериофага тифимуриум и пробиотика лактобифадол отмечали на птице разных видов вольерного содержания передвижного частного зоопарка «Ташир». У фазанов 4-5-месячного возраста проявлялся жидкий помет зеленого цвета, птицы отставали в росте и развитии. Взрослая птица имела матовое взъерошенное оперение. Из 28 фазанов разных пород у 6 (21 %) отмечали картину острого заболевания – повышение температуры тела до 43,0 °С, угнетение, снижение аппетита, взъерошенность оперения, одышку, диарею. фазана 3-месячного возраста пали. В 25-40-дневном возрасте среди утят отмечали развитие угнетения, анорексию, диарею серо-желтого цвета с примесью крови. Летальность молодняка составила 62,5 %. Из патологического материала выделена S. typhimurium.

Выпойку Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза осуществляли групповым способом всей птице зоопарка «Ташир» из расчета: перепелам – по 0,5 см3 препарата, фазанам, уткам – по 1,0 см3, селезням, павлинам – по 3,0 см3, гусям и лебедям – по 5,0 см3 трижды с интервалом часов, затем четвертую и пятую выпойки – через 48 часов. Препарат растворяли в воде из расчета 1:20. Лактобифадол давали ежедневно всей птице в формах, сорбированных на муке и на отрубях, по схеме.

Констатировали улучшение состояния птицы на 3 сутки, температура тела стабилизировалась в пределах физиологических норм, восстановился аппетит, помет оформился и приобрел характерную серо-коричневую окраску. Заболеваемость и гибель птицы больше не отмечали в течение 5месячного периода наблюдения.

Создание вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц Создание ассоциированной инактивированной вакцины против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц обосновано удобством применения и контроля иммунизации, возможностью точного дозирования, что является основополагающим фактором при профилактической противоэпизоотической работе с малыми поголовьями и ценной птицей. Такая вакцина обеспечивает напряженный иммунитет на длительный период против двух основных инфекционных болезней птиц, протекающих нередко совместно, снижение трудоемкости и повышение экономической эффективности ветеринарных мероприятий, снижение вероятности поствакцинальных осложнений, реактогенности и развития суперинфекции при иммунизации по инфицированному фону. При применении инактивированной вакцины исключается циркуляция живых вакцинных штаммов, провоцирующих положительные результаты контрольных, надзорных и мониторинговых исследований с наложением ограничений на хозяйство (ферму, вольер), а также провоцирующих снижение воспроизводительных качеств декоративных птиц.

Схема технологического процесса производства вакцины ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц представлена на рисунке 3. Производственный процесс включал следующие этапы:

1. Приготовление питательной среды для культивирования штаммов сальмонелл – бульона Хоттингера или триптон-соевого бульона.

2. Приготовление посевного материала. Производственные штаммы высевали в МПБ, а через 2-3 часа пересевали во флаконы с бульоном Хоттингера или триптон-соевым бульоном. Затем проводили посевы второй и третьей генерации до получения максимальной концентрации сальмонелл. Одновременно делали контрольные посевы на МПБ, МПА, МППБ под вазелиновым маслом, среду Сабуро.

3. Инактивация микробных клеток сальмонелл. Полученную в результате культивирования бактериальную массу сальмонелл перекачивали в стерильные ёмкости разного объема, добавляли 0,3 % формалина (с содержанием формальдегида не менее 37 %) по объёму и тщательно перемешивали. Инактивацию бактериальной массы проводили в течение дня при температуре 20-22С с ежедневным перемешиванием. Контроль полноты инактивации проверяли путем посевов бактериальной массы на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро, а также путем инокуляции полученной взвеси белым мышам подкожно в объеме 0, см3. Белые мыши при этом оставались живыми и клинически здоровыми в течение 10 суток наблюдения. При выявлении нарушений стерильности объем полученного антигена забраковывали.

4. Концентрирование, очистку и стандартизацию сальмонеллезных антигенов проводили путем осаждения микробных клеток 50 %-ным раствором ПЭГ-6000 в течение 48-72 часов и декантирования надосадочной жидкости, удаляя 80-85 % объёма. В полученной массе устанавливали концентрацию микробных клеток (для каждого штамма отдельно) и разводили стерильным фосфатно-буферным раствором до конечной концентрации 6х109 мкр. кл. в 1,0 см3.

5. Исследование токсичности биомассы. Для этого бактериальную суспензию сальмонелл, осажденную полиэтиленгликолем, ресуспендировали до концентрации 12х109 мкр. кл. в 1 см3 0,85 %-ного раствора хлорида натрия. Токсичность инактивированной бактериальной массы определяли на 30 белых мышах массой 16-18 г в трех группах путем подкожной инъекции суспензии в объеме 0,5 см3 с концентрацией 3х109 мкр. кл./см3, 6х109 мкр. кл./см3, 12х109 мкр. кл./см3. Также токсичность определяли на 10 голубях 3-4-месячного возраста породы тульские синие массой 160- г путем подкожной инъекции суспензии в аналогичных концентрациях.

Все мыши и голуби оставались живы и клинически здоровы в течение дней наблюдения.

Штамм вируса ньюИнактивирование «Н» или «PN-T»

каслской олезни 6. Получение вируссодержащей эмбриональной жидкости. Для изготовления опытных образцов вакцины использовали штамм вируса ньюкаслской болезни «Н» или его аналог – авторский штамм, названный «PNT». Вирус болезни Ньюкасла (голубиный вариант) PN-T выделен нами из трупа голубя в 2003 году, активен в РН, РТГА, патогенен для СПФ куриных эмбрионов, реактогенен для цыплят моложе 2-х месяцев. В качестве оптимальной защитной среды для вируса PN-T нами экспериментально определено обезжиренное молоко, сохраняющее титр после сушки инфекционности вируса 7 ЭЛД50/ см3 и титр в РГА 6,0 log2.

При сравнении нуклеотидных последовательностей в области F0 гена и сопоставлении аминокислотных последовательностей фрагмента F предшественника выявлено, что штамм PN-T имеет сайт, характерный для вирулентных штаммов 112-RRQKRF-117. Уровень гомологии проанализированного нуклеотидного фрагмента штамма PN-T с аналогичными областями производственных вакцинных штаммов вируса ньюкаслской болезни колеблется от 80 % до 87 %, что является показателем высокой степени отличий авторского штамма PN-T.

Для получения вируссодержащего материала в аллантоисную полость заражали 9-10-тисуточные куриные эмбрионы, которые затем помещали в термостат с температурой 37,0±0,5°С и относительной влажностью 60- % на 47-48 часов. Овоскопирование проводили 2 раза в сутки. Эмбрионы, павшие в течение 24 часов, утилизировали.

Перед сбором вируссодержащего материала эмбрионы охлаждали при температуре 4-6°С в течение 12 часов. Экстраэмбриональную вируссодержащую жидкость собирали во флаконы в стерильных условиях. Исследовали титр вируса. Для дальнейшей работы и инактивации допускали вируссодержащий материал с исходным титром в пределах от 8,5 lоg2 до 9,0 lоg2 вируса «Н» и от 7,5 до 9,0 lоg2 вируса «PN-T».

Из полученного вируссодержащего материала отбирали пробы для проведения контролей, а оставшуюся часть инактивировали путем добавления в нее 0,1 %-ного раствора формалина с содержанием активного формальдегида не менее 37 %. Контроль на наличие контаминации проводили посевами на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом, тиогликолевую среду, среду Эдвардса, среду Сабуро. Параллельно проводили проверку гемагглютинирующей активности экстраэмбриональной жидкости.

Для изготовления вакцины допускали вируссодержащий материал с гемагглютинирующим титром не ниже 6,0 log2.

7. Контроль качества готового препарата осуществляли исследованиями стерильности, безвредности, антигенности и иммуногенности.

8. Изготовление серии вакцины. Для изготовления серии вакцины проводили объединение суспензии сальмонелл (при концентрации 6х109 мкр.

кл. и соотношении штаммов 1:1:1) и вируссодержащей эмбриональной жидкости до получения в готовом препарате 90 % суспензии бактериальных клеток и 10 % эмбриональной жидкости по объему.

9. Фасовка. Полученную серию вакцины расфасовывали в стерильных условиях на базе биопредприятия ООО «Торговый дом «БиАгро» в стерильные стеклянные флаконы по 10,0 и 20,0 см3 (20 и 40 доз соответственно) по ТУ 9467-003-05749470-94 или в ампулы соответствующей вместимости. При регистрации в ФГУ ВГНКИ вакцине определено название «Вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц».

Исследования по безопасности рекомендуемой прививочной дозы, при передозировке и повторном введении вакцины проводили при подкожном введении препарата 10-и белым мышам весом 18-20 г в объёме 0,3 см3, 0, см3 по 5 голов на каждую дозу, взрослым беспородным голубям массой 250-350 г, 3-4-месячным голубям породы синий массой 120-150 г путем внутримышечного введения вакцины в объеме 0,5 см3; 1,0 см3; 2,0 см3. Использовали по 5 голубей в каждой группе. Учет результатов проводили на 1, 2, 10 сутки. Все лабораторные объекты оставались живы и здоровы. При убое в месте инъекции вакцины не отмечали никаких морфологических изменений. Исследования подтвердили безвредность вакцины и при повторном введении в рекомендуемой и удвоенной дозах.

Изучение антигенных и иммуногенных свойств Для изучения антигенных и иммуногенных свойств вакцины «Виросальм» формировали по принципу аналогов 2 группы голубей, беспородных, 3-8-месячного возраста, массой 220-350 г. Опытной группе (10 голов) вводили внутримышечно вакцину «Виросальм» в рекомендованной дозе с последующей ревакцинацией через 30 дней. Контрольной группе (5 голубей) инъецировали стерильный физиологический раствор. До инъекции и на 14, 30, 60, 90, 150, 210, 270 сутки после повторного введения у голубей из подкрыльцовой вены брали кровь для серологических исследований.

Исследования в РТГА к вирусу ньюкаслской болезни показали, что средний титр антител в опытной группе составил на 14 сутки – 6,4±0, log2, 30 сутки – 6,5±0,17 log2, 60 сутки – 5,8±0,20 log2, 90 сутки – 5,5±0, log2, 150 сутки – 4,3±0,15 log2, 210 сутки – 3,5±0,17 log2, 270 сутки – 2,6±0,31 log2. В контрольной группе титры были нулевыми весь период наблюдения. Данные исследования были проведены на птице других видов и подтвердили выраженные антигенные свойства вакцины «Виросальм». Максимальные титры отмечали у перепелов и цыплят, в течение всего периода наблюдения они превышали 5 log2. Уровень антигенной напряженности у остальных птиц плавно снижался от 7-9 log2 в первый месяц после вакцинации до 2-5 log2 к одиннадцатому месяцу.

Антигенную активность вакцины «Виросальм» по сальмонеллезным компонентам оценивали при постановке РА. Положительной оценкой считали наличие титра антител не менее чем на два креста. На 14, 30, 60, 90, 150, 210 и 270 сутки после повторного введения вакцины у голубей опытной группы отмечали положительные результаты в РА с антигенами S.

typhimurium и S. enteritidis, оцененные на ++++ и +++. В сыворотке крови голубей контрольной группы при аналогичных исследованиях отмечали отрицательные и сомнительные результаты в РА.

При определении иммуногенной активности вакцину в дозе 0,5 см вводили 20 интактным голубям опытных групп внутримышечно двукратно с интервалом 35 дней. В качестве контрольных использовали 10 невакцинированных голубей, которым вводили стерильный физраствор в той же дозе и содержали в аналогичных опытной группе условиях. Через 12суток после повторной иммунизации голубей инфицировали контрольно-производственны-ми штаммами в дозах 5 LD50. В опытных группах получена сохранность 90-100 % при полной гибели птицы в контрольных группах. При бактериологическом исследовании из патматериала от трупов голубей были выделены в соответствующих группах культуры S.

typhimurium и S. enteritidis. Опыт был проведен в аналоговых условиях еще дважды, полученные результаты были аналогичными, что свидетельствует о высоких иммуногенных свойствах вакцины «Виросальм».

При использовании вакцины «Виросальм», хранившейся согласно инструкции по применению при 4°С в течение 6, 12, 18, 24 месяцев, не выявлено достоверных изменений значений антигенных и иммуногенных свойств, что характеризует стабильность вакцины при хранении.

Эффективность применения вакцины «Виросальм»

В КФХ «Барбасов» Наро-Фоминского района Московской области вакцинации подвергли 76 голубей породы типлеры разных возрастных групп, 52 молодки и курицы кросса Ломан-браун, 23 утки породы пекинские, гусей породы горьковские и индеек породы белые широкогрудые (легкий кросс). Вакцину «Виросальм» вводили дважды с интервалом дней по одной вакцинной дозе 0,5 см3 голубям, курам и уткам, 43 гусятам в возрасте 3-4 мес., 19 индюшатам в возрасте 62 дней; по 1,0 см3 взрослой птице массой более 4 кг – 14 гусям и 7 индейкам. Наблюдение за птицей вели в течение 8 месяцев, фиксировали случаи заболеваемости. Перед применением вакцины и на 30, 100, 150 и 200-е сутки после повторной вакцинации у голубей и кур (по 4 пробы) исследовали кровь в РТГА, определяли титры антител к вирусу ньюкаслской болезни и к парамиксовирусу типа 2. Результаты исследований приведены в таблице 4.

Таблица 4. Антигенная активность вакцины «Виросальм» к вирусу ньюкаслской болезни в условиях КФХ «Барбасов»

Вид Средние титры антител в РТГА к вирусу болезни Ньюкасла птицы Как видно из таблицы 4, титры антител к вирусу болезни Ньюкасла в период исследований находились на высоком уровне. Титры антител к парамиксовирусу типа 2 не менялись и оставались в пределах 0-2 log2.

До вакцинации у птицы КФК «Барбасов» отмечали отход молодняка с признаками расстройства пищеварения, «вертячки» у голубей, одышки, угнетения. После вакцинации в период наблюдения 8 месяцев не отмечено ни одного случая заболевания кур, голубей, уток, гусей и индеек ньюкаслской болезнью и сальмонеллезом, в т.ч. – у полученного в период наблюдения молодняка.

Сохранность птиц составила: цыплят и кур – 100 % (к 93,4 % в период предыдущих 9 месяцев), голубей – 100 % (к 61,8 %), уток – 100 % (к 96, %), гусей – 98,2 % (1 случай гибели гусенка по причинам травматического характера) к 81,6 % в аналогичный период, индеек 100 %. Контрольные исследования на сальмонеллез со сборными пробами помета на 30, 100, 150 и 200 сутки после повторной вакцинации в ПЦР и бактериологическими методами были отрицательными.

В условиях ОАО «Птицефабрика «Тульская» вакцину применяли на группе 15500 цыплят кросса Ломан-браун 20-суточного возраста внутримышечно дважды с интервалом 30 дней в дозе 0,5 см3. Предварительно у 40 произвольно выбранных цыплят из группы были отобраны пробы крови для получения сыворотки и исследования на наличие остаточных антител к вирусу болезни Ньюкасла. Цыплят с титрами антител 2 и более log до вакцинации из группы исследуемых исключали. 10 цыплят были сформированы в качестве контрольной группы, их не вакцинировали. Сыворотку крови исследовали в РНГА на наличие антител к вирусу ньюкаслской болезни на 14, 30, 60 и 100-е сутки после проведения вакцинации.

Результаты исследований представлены в таблице 5.

Титры цыплят контрольной группы, содержавшихся совместно со всей птицей, показывают, что в цехе отсутствует циркуляция вируса болезни Ньюкасла и рост титров антител в опытной группе не спровоцирован эпизоотическим процессом. При применении вакцины «Виросальм» в производственных условиях птицефабрики не отмечали признаков реактогенности, любого рода изменений физиологического статуса птицы и местных морфологических изменений в области инъекции препарата.

Таблица 5. Антигенная активность вакцины «Виросальм» к вирусу ньюкаслской болезни в условиях ОАО «Птицефабрика «Тульская»

Группа Средние титры антител в РНГА к вирусу болезни Ньюкасла Опытная, 30 цыплят Контрольная, 10 цыплят Под контролем специалистов СББЖ ЗАО г. Москвы были проведены испытания вакцины «Виросальм» в условиях неблагополучных голубятен.

Вакцину вводили клинически здоровым голубям в дозе 0,5 см3 двукратно с интервалом 28 дней. Исследования титров антител проводили через 14, 60, 90, 150 и 210 дней после повторной вакцинации (по 10 проб сыворотки крови голубей). Динамика изменений титров антител к S. enteritidis и S.

typhimurium представлена в таблице 6.

Таблица 6. Антигенная активность вакцины «Виросальм» к S. typhimurium и S. enteritidis в условиях голубятен ЗАО г. Москвы 1. Средний кова, log 2. Средний ченко, log Условные обозначения: S.t. – Salmonella typhimurium, S.e. - Salmonella enteritidis В течении 10 месяцев наблюдения заболеваемости и гибели голубей не отмечали. По окончании срока наблюдения 6 вакцинированных и 6 невакцинированных голубей контрольной группы инфицировали штаммом S.

typhimurium М-5в t в дозе 4 млн. мкр. кл. (2,5 LD50). В течение последующих 10 дней в опытной группе пал 1 голубь с клинической картиной энтероколита. 5 голубей опытной группы не заболели, сохранность составила 83,3 %. В контрольной группе, напротив, – заболели и пали 5 голубей, сохранность составила 16,7 %.

В условиях индивидуальных подсобных хозяйств и частных подворий деревни Мошок Гусевского района Владимирской области были провакцинированы 24 индоутки, 44 утки, 22 гуся, 19 цесарок, 36 индеек в возрасте 25-35 дней. Отмечены безвредность, ареактогенность вакцины «Виросальм» при применении, высокие антигенные свойства (табл. 7).

Таблица 7. Титры антител в РТГА к вирусу ньюкаслской болезни при применении вакцины «Виросальм» в условиях индивидуальных подсобных хозяйств и частных подворий Вид пти- Титры анСредние титры антител в РТГА цы, колна день исследования после вакцинации, log Индоутки, Утки, 44 0,07± 0,04 6,98±0,09 6,77±0,14 6,05±0,15 4,71±0, Гуси, 22 0± 0,0 6,90±0,13 5,82±0,22 5,32±0,23 4,27±0, Цесарки, Индейки, 0,28± 0,12 6,94±0,11 7,97±0,12 7,39±0,16 6,41±0, Применение вакцины «Виросальм» вызывало образование защитных антител на уровне, достаточном для предотвращения возникновения инфекции. До иммунизации у невакцинированных птиц в РТГА титр антител против болезни Ньюкасла и сальмонеллеза был на уровне менее 1 log2, после вакцинации уровень антител вырос в несколько раз и в среднем по поголовью колебался в диапазоне от 6 до 7 log2. Индекс нейтрализации у птиц, участвовавших в эксперименте, до вакцинации составил 0,2-0,42, после ревакцинации – 4,4-7,2. Уровень антител был стабильно высоким через 3 и 6 мес. после применения вакцины «Виросальм».

Схема лечебно-профилактических мероприятий, направленных против сальмонеллеза птиц Согласно представленным данным комплекс эффективных мероприятий по профилактике сальмонеллеза птиц был дополнен специфической иммунизацией вакциной «Виросальм» инактивированной ассоциированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц. Осуществление вакцинации необходимо проводить по санированному фону, для чего рекомендуется применение бактериофага против сальмонеллеза (бивалентного или моновалентного в зависимости от вида птиц и эпизоотической ситуации в районе).

Апробированная схема специфической профилактики сальмонеллеза голубей, а также водоплавающих птиц, где доминирующим возбудителем является серовариант S. typhimurium, состоит из выпойки Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см3 двукратно с интервалом 72 часа и последующей иммунизацией вакциной инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей или вакциной «Виросальм» двукратно с интервалом 28-30 дней внутримышечно в дозе 0,5 см3.

Схема специфической профилактики сальмонеллеза кур и других птиц (индеек, индоуток, фазанов, перепелов, страусов, попугаев и т.д.) в условиях частных подворий, мелких ферм, вольеров, зоопарков, квартирноклеточного содержания включает выпойку бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц двукратно в дозе 0,5 см3 с интервалом 72 часа и последующей двукратной иммунизацией вакциной «Виросальм» с 20дневного возраста с интервалом 28-30 дней.

Предложенная комплексная схема лечения и профилактики сальмонеллеза птиц успешно апробирована в условиях зоопарка ООО «Парк живой природы «До-До» Анапского района Краснодарского края, где была зафиксирована заболеваемость сальмонеллезом водоплавающих и фазаньих птиц. Болезнь отмечали в острой клинической форме у 2 фазанов охотничьих (Phasianus venaticus) трехмесячного возраста, у уток-мандаринок (Aix galericulata), пеганок (Tadorna tadorna) и каролинок (Aix sponsa) – всего 24 голов. 2 утенка 44-дневного возраста и 1 фазан 27-дневного возраста пали. При патологоанатомическом вскрытии выявлена картина катарально-геморрагического энтероколита, дистрофии печени с очагами некроза, зернистой дистрофии селезенки и почек, острой застойной гиперемии и отека легких, инъекции сосудов в головном мозге и отека мозговых оболочек. При лабораторной диагностике выделена S. typhimurium. Кроме того, из помета журавлей-красавок (Anthropoides virgo) была выделена S.

enteritidis.

Для борьбы с сальмонеллезной инфекцией были организованы и проведены общие санитарные мероприятия: дезинфекция вольеров, кормушек, предметов ухода и смотровых зон 1 %-ным раствором виркона. Для лечения и профилактики сальмонеллеза применен метод селективной деконтаминации с использованием бивалентного бактериофага и пробиотика лактобифадола. Препараты использовали всем птицам зоопарка: больным и клинически здоровым.

Проведенные мероприятия оказали выраженный терапевтический эффект. Заболеваемость птицы прекратилась уже после первичной выпойки бактериофага. Выздоровление больной птицы отмечали в течение 6-8 суток. Через 20 дней после проведения лечения были взяты контрольные анализы, культуры рода Salmonella из помета и смывов не выделяли.

Спустя 3 недели была осуществлена иммунизация клинически здоровых птиц вакциной «Виросальм» внутримышечно: уток-мандаринок – 7 голов, уток-каролинок – 4, пеганок – 2 головы в дозе по 0,5 см3; аистов белых (Ciconia ciconia) – 2 гол., журавлей: стерхов (Grus leucogeranus) – 2, серого (G. grus) – 1, японского (G. japonensis) – 1, красавок (Anthropoides virgo) – 3, черношейных (G. nigricollis) – 2; пеликанов розовых (Pelecanus onocrotalus) – 2 гол., больших гокко (кракс, Pauxi rubra) – 2 в дозе 1,0 см3;

фазанов: серебряных (Phasianus nycthemera) – 2, кавказских (P. colchicus) – 4, желто-золотых (Р. flavus) – 5 голов в дозе 0,5 см3; майн: обыкновенных (Acridotheres tristis) – 2, священных (Gracula religiosa) – 5; розовых скорцов (Sturnus roseus) – 4; турако: перса (Tauraco persa) – 2, фиолетовочубых (T.

porphyreolophus) – 2 в дозе 0,5 см3; попугаев: зеленокрылых ара (Ara chloroptera) – 4, сине-желтых ара (A. ararauna) – 4, венесуэльских амазонов (Amazona amazonica) – 2, веерных (Deroptyus accipitrinus) – 5, бразильских черноухих (Pionus menstruus) – 2 голов в дозе 0,5 см3; африканских страусов (Struthio camelus) – 3 в дозе 5,0 см3; кур (Gallus gallus) декоративных:

шамо – 17, сибрайт – 7, китайских шелковых – 12, орпингтон – 11 голов в дозе 0,5 см3. Повторную вакцинацию проводили согласно временному наставлению через 30 дней. Ревакцинации проводили каждые 11 мес. Полученных птенцов вакцинировали с 20-дневного возраста по аналогичной схеме в половинных дозах. Перед вакцинациями птице групповым способом выпаивали бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц дважды с интервалом 72 часа и задавали с кормом лактобифадол 10 дней.

Случаев заболеваемости и падежа птицы в зоопарке ООО «Парк живой природы «До-До» с начала наблюдения и в течение 3 лет не отмечали.

При контрольных исследованиях на сальмонеллез и сальмонеллоносительство, проводимых ежеквартально бактериологическими методами и в ПЦР с пометом птицы разных видов из всех вольеров, положительных результатов не отмечали, культуры сальмонелл не выделяли.

ВЫВОДЫ

1. Для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц научно обоснованы и клинически подтверждены метод селективной деконтаминации и последующая вакцинация, эффективность которых доказана полным оздоровлением неблагополучных по сальмонеллезу пунктов с формированием у птиц стойкого иммунитета.

2. Преобладающим этиотропным серовариантом возбудителя сальмонеллеза (87,5-97,7 %) у голубей, уток, мускусных уток, гусей, фазанов, перепелов, декоративных птиц является Salmonella typhimurium. Роль S.

typhimurium в возникновении сальмонеллеза кур является основной после S. enteritidis и S. gallinarum-pullorum. Выделенные изоляты сальмонелл обладают широкой антибиотикорезистентностью.

3. Культуры штаммов S. typhimurium М-2ф t, S. typhimurium М-5в t, S. typhimurium Д-1в t, S. enteritidis 25 Яв e обладают типичными биологическими, высокими вирулентными и иммуногенными свойствами для белых мышей и голубей, отвечают требованиям, предъявляемым к производственным и контрольно-производственным штаммам.

4. На основе штаммов S. typhimurium М-5в t -ДЕП, S. typhimurium Дв t -ДЕП, S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП создана вакцина инактивированная полиэтиленгликолевая против сальмонеллеза голубей. Определены биотехнологические параметры изготовления вакцины и оптимальное средство концентрирования антигенов – полиэтиленгликоль-6000. Готовый вакцинный препарат с оптимальной иммунизирующей дозой 6,0 млрд. мкр.

кл. в 1 см3 является безвредным и ареактогенным для голубей, обладает выраженной иммуногенностью и протективной активностью в течение месяцев.

5. Выделенные бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium № ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium №9 ММ обладают свойствами производственных штаммов: высокой литической активностью, специфичностью в отношении вида Salmonella enterica, широким диапазоном литической активности, минимальным латентным периодом внутриклеточного развития, высокой урожайностью, периодом стабилизации лизиса в течение 6-8 минут, скоростью адсорбции 4,0-4,96 х 10- см3мин-1. По своей структурной организации они относятся к семейству Siphoviridae, B1 морфотипу и четвертой морфологической группе по А.С. Тихоненко.

6. Полученные гипериммунные сыворотки на производственные штаммы бактериофагов проявляли нейтрализующую активность в разведениях 1:5-1:400. Константы скорости нейтрализации фагов с гомологичными антисыворотками составили 240,21-270,26 мин-1, с гетерологичными антисыворотками – 124,42-163,67 мин-1. Штаммы Ph. S.

typhimurium №5 ТЗ, Ph. S. typhimurium №8 МЕ, Ph. S. typhimurium № ММ являются родственными и обладают выраженной иммуногенностью.

7. На основе производственных штаммов Ph. S. typhimurium создан препарат Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей, обладающий выраженной активностью на модельных объектах (белых мышах): сохранность в опытных группах составила 100 % при 90-100 % гибели в контроле.

8. На основе производственных штаммов фагов тифимуриум и энтеритидис сконструирован бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц, определены технологические параметры его производства и контроля. Эффективность препарата при инфицировании контрольными штаммами S. typhimurium и S. enteritidis в дозах 5 LD50 характеризовалась 90-100 %-ной сохранностью лабораторных объектов (белых мышей, голубей) в опытных группах при 90-100 %-ной гибели в контроле.

9. Разработан метод селективной деконтаминации поголовья птиц, основанный на применении Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей или бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц с водой и пробиотика лактобифадол с кормом. Использование данного метода обеспечило высокий терапевтический эффект при сальмонеллезе птиц разных видов в условиях лаборатории, голубятен, вольеров зоопарка «Ташир».

10. Выделенный вирус болезни Ньюкасла «PN-T» относится к мезогенным парамиксовирусам типа 1, имеет высокую степень отличий от штаммов «Н», «ГАМ-61», «В1», «La Sota», «Бор-74 ВГНКИ» и обладает высокой иммуногенностью. Оптимальной защитной средой для штамма является обезжиренное молоко.

11. На основе штаммов сальмонелл S. typhimurium М-5в t -ДЕП, S.

typhimurium Д-1в t -ДЕП, S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП и вируса болезни Ньюкасла штамма «Н» или «PN-T» сконструирована вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц. Разработаны технология ее производства, методы контроля и способ применения.

12. У голубей, иммунизированных вакциной «Виросальм», титры антител к вирусу ньюкаслской болезни составили 6,4-2,05 log2 в течение 320 суток наблюдения, у уток, фазанов, мускусных уток, гусей, индеек, цесарок 7,7-3,5 log2, у цыплят, перепелов – 9,6-5,15 log2. Антигенная активность по сальмонеллезным компонентам характеризовалась выраженной агглютинацией антигенов S. typhimurium и S. enteritidis с сыворотками крови вакцинированных птиц. Сохранность иммунизированных голубей при инфицировании в летальных дозах 5 LD50 составила 90-100 % при полной гибели птицы в контроле.

13. Доказана эффективность применения вакцины «Виросальм» на птице разных видов в условиях ОАО «Птицефабрика «Тульская», птицеферм, голубятен и индивидуальных подсобных хозяйств. Антигенная активность вакцины «Виросальм» к S. typhimurium и S. enteritidis на голубях в «полевых» условиях составила 8-5 log2 в РНГА в течение 210 дней наблюдения.

14. Усовершенствована система противоэпизоотических мероприятий для борьбы с сальмонеллезом птиц разных видов, родов и семейств.

Помимо неспецифических ветеринарно-санитарных мероприятий система предусматривает использование препаратов бактериофагов и пробиотика лактобифадол для лечения больных птиц и ликвидации сальмонеллоносительства с последующей иммунизацией вакциной «Виросальм». В условиях зоопарка ООО «Парк живой природы «До-До» Краснодарского края разработанная система позволила со 100 %-ной эффективностью ликвидировать сальмонеллез и сальмонеллоносительство у птиц, обеспечить профилактику болезни в течение трехлетнего периода наблюдения.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Результаты, полученные в ходе исследований, включены в «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (№13-3-6/1965 от 04.11.2002).

2. Штаммы сальмонелл Salmonella typhimurium М-2ф t -ДЕП, S.

typhimurium М-5в t -ДЕП, S. typhimurium Д-1в t -ДЕП, Salmonella enteritidis 25 Яв e -ДЕП паспортизированы и депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных, контрольно-производственных и использованы для изготовления биопрепаратов.

3. Способы изготовления и применения вакцины инактивированной полиэтиленгликолевой против сальмонеллеза голубей запатентованы, патент №2377015 от 27.12.09.

4. Бактериофаги Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ -ДЕП, Ph. S.

typhimurium №8 МЕ -ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 ММ -ДЕП, Ph. S.

enteritidis A-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН- -ДЕП паспортизированы, депонированы в ФГУ ВГНКИ в качестве производственных и использованы для изготовления биопрепаратов.

5. Полученные дополнительно 15 бактериофагов с высокой литической активностью к S. typhimurium сохранены в качестве резервных, из них с исследованной морфологией структурных элементов паспортизированы.

6. Способы изготовления и применения Бактериофага тифимуриум против сальмонеллеза голубей запатентованы, патент №2366456 от 10.09.09.

7. Разработаны инструкции по применению и другая научнотехническая документация на Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей и бивалентный бактериофаг против сальмонеллеза птиц.

8. Метод селективной деконтамицации для лечения сальмонеллеза птиц с использованием Бактериофага тифимуриум и пробиотика лактобифадол запатентован, патент №2375075 от 10.12.09.

9. Результаты, полученные в ходе исследований, включены в «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации (№25-25/162 от 11.04.2008).

10. Вирус болезни Ньюкасла «PN-T» (парамиксовирус типа 1 голубиный вариант) паспортизирован и использован для изготовления экспериментальных серий инактивированной вакцины против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц.

11. Способы изготовления, производства и применения вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц использованы для составления отчета о доклинических исследованиях и научно-технической документации для регистрации и сертификации препарата.

12. Вакцина «Виросальм» ассоциированная инактивированная против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц сертифицирована и зарегистрирована на территории Российской Федерации.

13. Результаты, полученные в ходе исследований, включены в «Методические рекомендации по недопущению распространения гриппа птиц и болезни Ньюкасла голубей в частных подворьях, птицеводческих хозяйствах и голубятнях», утвержденные учебно-методическим советом ФГБОУ ВПО МГАВМиБ (протокол №11 от 25.10.2011).

14. Результаты, полученные при исследовании иммунобиологических и протективных свойств новых методов и средств против сальмонеллеза и ньюкаслской болезни, внедрены в ветеринарную практику голубеводства и птицеводства.

15. Материалы научных исследований, представленные в диссертационной работе, используются в учебном процессе во ФГБОУ ВПО МГАВМиБ по дисциплинам: «Эпизоотология и ифекционные болезни животных», «Болезни птиц», «Фармакология», «Болезни молодняка сельскохозяйственных животных», «Болезни лабораторных животных», «Болезни экзотических животных».

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Ветеринарным специалистам, заводчикам голубей, владельцам ферм, вольеров, частных индивидуальных хозяйств и мест содержания птицы рекомендуется проводить мониторинг сальмонеллезной инфекции бактериологическими методами и совершенствовать лечебнопрофилактические мероприятия, направленные против сальмонеллеза птиц, с применением новых средств и методов, предложенных в данной работе.

2. Штаммы Salmonella typhimurium М-2ф t -ДЕП, S. typhimurium Мв t -ДЕП, S. typhimurium Д-1в t -ДЕП, S. enteritidis 25 Яв e -ДЕП рекомендуется использовать в качестве производственных и контрольнопроизводственных для создания ветеринарных препаратов.

3. Для профилактики сальмонеллеза голубей рекомендуется использовать вакцину инактивированную полиэтиленгликолевую против сальмонеллеза голубей в дозе 0,5 см3 с 20-30-дневного возраста двукратно с интервалом 30-40 дней.

4. Для профилактики сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц рекомендуется применение вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла голубей и декоративных птиц с 20-дневного возраста двукратно с интервалом 30 дней.

5. Специалистам биотехнологических предприятий рекомендуется использовать производственный регламент вакцины «Виросальм».

6. Штаммы бактериофагов Phagum Salmonella typhimurium №5 ТЗ ДЕП, Ph. S. typhimurium №8 МЕ -ДЕП, Ph. S. typhimurium №9 ММ -ДЕП, Ph. S. enteritidis A-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-1 -ДЕП, Ph. S. enteritidis ЮН-2 -ДЕП рекомендуется использовать в качестве производственных для создания ветеринарных препаратов.

7. Для лечения и профилактики сальмонеллеза голубей рекомендуется использовать Бактериофаг тифимуриум против сальмонеллеза голубей орально индивидуально или с водой групповым способом в дозе 0,5 см3 на голову при концентрации фага 108 и в дозе 0,25 см3 голубятам до 14дневного возраста с первых дней жизни. Для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц рекомендуется использовать бивалентный бактериофаг согласно инструкции по применению.

8. Для лечения и профилактики сальмонеллеза птиц рекомендуется использовать метод селективной деконтаминации, включающий применение Бактериофага тифимуриум или бивалентного бактериофага против сальмонеллеза птиц и пробиотика лактобифадол.

9. Штамм вируса ньюкаслской болезни «PN-T» рекомендуется депонировать в ФГБУ ВГНКИ и использовать в качестве производственного.

Данные по свойствам вакцины «Виросальм» в новом варианте с включением антигена инактивированного штамма «PN-T» рекомендуется использовать для дальнейшего совершенствования средств специфической профилактики болезни Ньюкасла птиц.

10. При организации противоэпизоотической борьбы с сальмонеллезом птиц необходимо использовать «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур» и «Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей», одобренные Департаментом ветеринарии Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В., Толпыгин М.А. Специфическая профилактика сальмонеллеза кур // Ветеринарная медицина. – 2002. – № 2. – С. 29-30.

2. Пименов Н.В., Бубнова Л.В. Бактерии рода Salmonella – этиологический фактор острых кишечных расстройств у серых ворон // Ветеринарная медицина. – 2002. – № 2. – С. 29.

3. Куриленко А.Н., Пименов Н.В., Ленев С.В., Малахов Ю.А., Яковлев С.С. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза кур. – М.: МСХ-МГАВМиБ. – 2002. – 34 с.

4. Пименов Н.В., Ленев С.В., Куриленко А.Н. Протективная активность бивалентного сальмофага против сальмонеллеза энтеритидис и пуллороза-тифа кур // Сб. науч. трудов ВГНКИ. – М.: ФГУ ВГНКИ, 2003. – Т.

64. – С. 178-182.

5. Пименов Н.В., Ленев С.В., Малахов Ю.А., Куриленко А.Н. Новый этап в совершенствовании профилактики и лечения сальмонеллеза кур // Мат-лы XI Московского международного вет. конгресса. – М.: Асс. практ.

вет. врачей, 2003. – С. 228-229.

6. Пименов Н.В., Капустин А.В. Смешанная инфекция – сальмонеллез и болезнь Нью-Касла голубей // Ветеринарная медицина. – 2004. – № 4. – С. 23-24.

*7. Данилевская Н.В., Пименов Н.В. Проблема антибиотикорезистентности на примере лечения сальмонеллеза у домашних голубей // Российский ветеринарный журнал. – 2005. – № 4. – С. 21-24.

8. Пименов Н.В. Основные направления борьбы с сальмонеллезом голубей // Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки: Матлы межрег. науч.-практ. конф. мол. уч. – Воронеж: ФГОУ ВПО «ВГАУ им.

К.Д. Глинки», 2005. – Ч. 2. – С. 144-147.

*9. Пименов Н.В., Данилевская Н.В. Антибиотикорезистентность сальмонелл, выделенных у домашних голубей // Ветеринария. – 2006. – № 9. – С. 20-24.

10. Пименов Н.В. Эпизоотологические особенности сальмонеллеза голубей // Мат-лы XIII Московского международного конгресса по бол.

мелк. дом. жив. – М.: Асс. практ. вет. врачей, 2005. – С. 153-155.

11. Пименов Н.В. Сальмонеллез синантропных птиц – проблема токсикоинфекций человека // Проблемы рационального природопользования техногенного региона: Сб. науч. тр. Междунар. шк.-конф. – Кемерово:

ФГОУ ВПО КГСХИ, 2006. – С. 206-210.

12. Данилевская Н.В., Пименов Н.В. Новое в антибиотикотерапии: антибиотикорезистентность – угроза реальна // Новейшие разработки в ветеринарии. Клеточная терапия: Мат-лы совм. конф. – М.: ГУ РОНЦ им. Н.Н.

Блохина РАМН, 2006. – С. 16-22.

13. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Биологические свойства бактериофагов Salmonella typhimurium и их терапевтическая эффективность против сальмонеллеза голубей // Молодежь и наука XXI века: Мат-лы II Открытой Всеросс. науч.-практ. конф. мол. уч. – Ульяновск: ФГОУ ВПО УГСХА, 2007. – Ч. 1. – С. 336-340.

14. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Специфическая профилактика сальмонеллеза голубей // Голубеводство.–2007.–№ 12.–С.29; 2008.– №1.– С.29.

*15. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Фаговыделение, профилактика и терапия сальмонеллеза голубей // Ветеринария. – 2007. – № 10. – С. 24-28.

*16. Пименов Н.В. Создание и необходимость применения инактивированной вакцины против сальмонеллеза и болезни Нью-Касла голубей // Ветеринарная медицина. – 2008. – № 2-3. – С. 11-12.

17. Пименов Н.В., Куриленко А.Н., Чиркова И.В., Яковлев С.С. Рекомендации по диагностике, профилактике и ликвидации сальмонеллеза голубей. – М.: МСХ; «МегАрт» – 2008. – 43 с.

*18. Чиркова И.В., Пименов Н.В. Биологические свойства бактериофагов против сальмонелл тифимуриум и их использование в борьбе с сальмонеллезом птиц // Ветеринария и кормление.– 2008.– № 3. – С.32-34.

*19. Пименов Н.В. Перспективы применения бактериофагов в ветеринарии // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 5. – С. 34-35.

20. Желудева Е.В., Пименов Н.В. Человек и природа: «биологическое»

и «социальное» // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009. – Вып. 5. – С. 206-210.

21. Пименов Н.В., Бурико Б.Ю. Основные методы борьбы с ньюкаслской болезнью в голубеводстве // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009. – Вып. 5. – С. 132-138.

*22. Пименов Н.В., Чиркова И.В. Препарат против сальмонеллеза голубей и способ лечения сальмонеллеза голубей: Патент на изобретение №2366456 // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности. – 2009. – № 25.

23. Пименов Н.В. Вирус для изготовления инактивированной полиэтиленгликолевой вакцины против сальмонеллеза и болезни Нью-Касла голубей // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр.

мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2009. – Вып. 5. – С. 138-141.

*24. Пименов Н.В. Распространенность инфекционных болезней в голубеводстве // Ветеринария и кормление. – 2009. – № 6. – С. 69-70.

*25. Пименов Н.В., Чиркова И.В., Субботин В.В., Данилевская Н.В.

Способ лечения птиц при сальмонеллезе, вызванном Salmonella typhimurium: Патент на изобретение №2375075 // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности.– 2009. – №34.

*26. Пименов Н.В. Вакцина инактивированная против сальмонеллеза голубей и способ ее применения: Патент на изобретение №2377015 // Официальный бюллетень Федеральной службы по интеллектуальной собственности. – 2009. – № 36.

27. Пименов Н.В. Антигенные и иммуногенные свойства вакцины «Виросальм» инактивированной ассоциированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц // Мат-лы междунар. науч.-практ. конф. «Молодость, талант, знания – ветеринарной медицине и животноводству». – М.Троицк: ФГОУ ВПО УГАВМ, 2010. – Т. 3. – С. 107-112.

28. Пименов Н.В. Молодые предлагают новые методы и препараты // Информационный бюллетень Минсельхоза России.– 2010.– № 4.– С.50-52.

*29. Пименов Н.В. Сальмонеллез птиц: перспективные направления в лечебно-оздоровительных мероприятиях // Ветеринария и кормление. – 2010. – № 3. – С. 24-25.

30. Пименов Н.В. Диагностика, профилактика и меры борьбы с основными инфекциями в голубеводстве. – М.: Колос, 2010. – 96 с.

31. Желудева Е.В., Пименов Н.В. Проблемы экологии: способность мыслить в общепланетарном масштабе // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 275-277.

32. Пименов Н.В. Инновационный метод профилактики сальмонеллеза и ньюкаслской болезни птиц в условиях мелких и средних хозяйств // Актуальные проблемы развития АПК в научных исследованиях молодых ученых: Труды Всерос. совета мол. уч. и спец-тов аграрных образовательных и научных учреждений. – М.: МСХ РФ, 2011. – С. 146-149.

33. Пименов Н.В., Зотова З.В. Иммунобиологические свойства вакцины «Виросальм» в сравнении с живыми вакцинами против ньюкаслской болезни у голубей // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб.

науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011.– Вып.7.– С. 164-178.

34. Желудева Е.В., Пименов Н.В. Социальная экология: аксиологическая переориентация сциентизированного мышления // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 278-280.

*35. Зотова З.В., Пименов Н.В. Проблема ньюкаслской болезни голубей и пути ее решения // Ветеринария и кормление.– 2011.– № 5.– С.35-36.

36. Пименов Н.В. Бивалентный сальмофаг против сальмонеллеза птиц // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч. – М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 168-174.

37. Пименов Н.В. Вакцина «Виросальм» – новый биопрепарат для специфической профилактики сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц // Инновационные тенденции развития Российской науки: Мат-лы IV Междунар. науч.-практ. конф. мол. уч. – Красноярск: ФГОУ ВПО «Красноярский ГАУ», 2011. – Ч. 1. – С. 139-142.

38. Зотова З.В., Пименов Н.В. Факторы риска распространения эпизоотии ортомиксвирусной и парамиксвирусной инфекций птиц в Московской области // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч.

тр. мол. уч.– М.: ФГОУ ВПО МГАВМиБ, 2011. – Вып. 7. – С. 145-151.

39. Пименов Н.В. Специфическая эффективность вакцины «Виросальм» ассоциированной инактивированной против сальмонеллеза и болезни Ньюкасла птиц // Молодежь и инновации – 2011: Мат-лы Междунар.

науч.-пр. конф. – Горки: Белорусская ГСХА, 2011. – Ч. 1. – С.309-312.

*40. Пименов Н.В. Новые пути решения медико-социальной проблемы сальмонеллеза птиц // Жизнь без опасностей.– 2011.– № 2.– Т. 6.– С. 56-60.

*41. Пименов Н.В., Зотова З.В. Конструирование вакцины «Виросальм» на основе парамиксовируса типа 1 голубиного варианта штамма «PN-T» // Ветеринарный врач. – 2011. – № 4. – С. 2-4.

42. Пименов Н.В., Зотова З.В. Методические рекомендации по недопущению распространения гриппа птиц и болезни Ньюкасла голубей в частных подворьях, птицеводческих хозяйствах и голубятнях. – М.:

ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. – 2011. – 56 с.

43. Пименов Н.В. Новые методы и средства в борьбе с сальмонеллезом птиц // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол.

уч. – М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2012. – Вып. 8. – С. 138-143.

*44. Пименов Н.В. Эффективность оздоровительных мероприятий против сальмонеллеза птиц в условиях зоопарка // Российский ветеринарный журнал. – 2012. – № 3. – С. 22-24.

*45. Пименов Н.В. Вакцинопрофилактика сальмонеллеза голубей и декоративных птиц // Ветеринария. – 2012. – № 8. – С. 20-22.

*46. Пименов Н.В. Совершенствование средств и методов борьбы с сальмонеллезом птиц // Ветеринария и кормление. – 2012. – № 4.– С.32-33.

47. Пименов Н.В. Эффективность метода селективной деконтаминации в условиях пунктов содержания птицы, неблагополучных по сальмонеллезу // Вопросы ветеринарии и ветеринарной биологии: Сб. науч. тр. мол. уч.

– М.: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, 2012. – Вып. 8. – С. 143-147.

*48. Пименов Н.В. Совершенствование системы противоэпизоотической борьбы с сальмонеллезом птиц // Ветеринарная медицина. – 2012. – № 3. – С. 38-40.

* - издания, рекомендованные ВАК РФ