«НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ МОДИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ ДЛЯ ЖИРОВЫХ ПРОДУКТОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ СВОЙСТВАМИ ...»

На правах рукописи

Шеламова Светлана Алексеевна

НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ТЕХНОЛОГИИ

МОДИФИКАЦИИ РАСТИТЕЛЬНЫХ МАСЕЛ

ДЛЯ ЖИРОВЫХ ПРОДУКТОВ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМИ

СВОЙСТВАМИ

Специальность 05.18.06 – Технология жиров, эфирных масел

и парфюмерно-косметических продуктов

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора технических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный консультант: доктор технических наук, профессор Тырсин Юрий Александрович

Официальные оппоненты: Кривова Анна Юрьевна, доктор технических наук, профессор, Научный Центр ОАО «Свобода», зав. лабораторией Бутова Светлана Николаевна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств», зав. кафедрой «Технология продуктов биоорганического синтеза»

Султанович Юрий Аврамович, доктор химических наук, профессор, ООО УК «Солнечные продукты», советник генерального директора

Ведущая организация: ОАО «ГосНИИсинтезбелок»

Защита состоится «25» декабря 2012 года, в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 212.122.05 при ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления им. К. Г. Разумовского», по адресу:

109029, г. Москва, ул. Талалихина, дом 31, ауд. 13 (первый этаж).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет технологий и управления им. К. Г. Разумовского»

Автореферат разослан: « » ноября 2012 г.

С авторефератом диссертации можно ознакомиться на сайтах ВАК РФ Министерства образования и науки РФ http://vak2.ed.gov.ru/catalogue и ФГБОУ ВПО МГУТУ им. К.Г. Разумовского http://mgutm.ru/graduates-and-doctors/

Ученый секретарь диссертационного совета Козярина Г. И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В перспективах развития масложирового комплекса России важное место отводится вопросам повышения качества и безопасности продукции, что соответствует положениям Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации; государственной политике в области здорового питания населения на период до 2020 года, в число основных задач которой включено развитие производства продуктов функционального назначения, внедрение био- и нанотехнологий. К таким инновационным технологиям относится энзимная переэтерификация природных масел для получения специализированных жиров. Этот способ одновременно ограничивает использование химических реагентов в производственных процессах, загрязнение окружающей среды и обеспечивает удовлетворение готовых продуктов требованиям здорового питания по содержанию насыщенных триацилглицеролов и трансизомеров жирных кислот.

В последние годы специализированные жиры занимают значительный объем масложировой отрасли как рецептурные ингредиенты для молочной, кондитерской, хлебопекарной промышленности; углубляется дифференциация жиров под конкретные продукты. Высокая специфичность липолитических ферментов к строению жирнокислотного остатка и его положению в молекулах триацилглицеролов (ТАГ) дает возможность получать широкий спектр жировых продуктов как в отношении технологической функциональности, так и соответствия научным принципам нутрициологии о роли различных жирных кислот в питании и значении их распределения в ТАГ.

Большой вклад в формирование и развитие современных тенденций технологии специальных жиров внесли А. П. Нечаев, Ю. А. Султанович, И. В. Павлова, А. А. Кочеткова и другие ученые. Фундаментальные и прикладные исследования ферментативной модификации ТАГ представлены в работах Ю. А.

Тырсина, Л. В. Зайцевой, В. В. Мельникова, A. K. Macrae, S. Bloomer, C. E. Martinez, Y. Schimada, D. Zhou, T. Oba & B. Witholt и др.

Практика внедрения ферментативной технологии при переработке масел и жиров показала, что липолитические ферментные препараты должны иметь высокую трансферазную активность, стабильность в производственном процессе, устойчивость к технологическим факторам.

Липолитические ферменты широко распространены в организмах различного уровня биологической организации, но решить технологические задачи возможно только с помощью их микробного синтеза. Работы по скринингу продуцентов, получению активных генетически модифицированных штаммов микроорганизмов, изучению свойств липаз, их иммобилизации активно проводятся учеными различных стран. Исследования отечественных авторов (Е. Л.

Рубан, Л. О. Северина, Г. Б. Ксандопуло, К. Д. Давранов, Ю. А. Свириденко, И.

М. Арендс, Ж. Х. Диеров, А. Ю. Кривова и др.) проводились с целью использования липаз для гидролиза масел и жиров. Количество работ, посвященных изучению липолитических ферментов в процессах синтеза в микроводных условиях крайне ограничено (Ю. А. Тырсин, К. Д. Давранов). В крупномасштабном производстве специализированных жиров в России используются ферментные препараты липаз зарубежных фирм. В связи с перспективами данных технологий получение отечественных препаратов липаз со свойствами, необходимыми для эффективного осуществления биомодификации жиров, – важная и насущная проблема.

Диссертационная работа направлена на решение важной народнохозяйственной задачи – разработку научно обоснованных технологических решений биомодификации растительных масел, реализация которых отвечает современным тенденциям развития науки и технологий, ориентированных на создание экологически чистых производств, в частности, масложировых продуктов функционального назначения.

Работа проводилась в соответствии с планом НИР ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий» по теме «Биосинтез микроорганизмами биологически активных веществ и исследование их физикохимических свойств» (номер гос. регистрации 01930004491), в рамках проблемы «Модификация сорбентов путем иммобилизации ферментов и других физиологически активных веществ», утвержденной Координационным планом Научного Совета РАН, выполняемой в ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет»; на кафедре органической и пищевой и биохимии ФГБОУ ВПО «МГУПП».

Цель и задачи исследований. Цель настоящего исследования заключалась в научном обосновании и практической реализации разработанной технологии модификации растительных масел на основе ферментативного гидролиза и переэтерификации ТАГ для получения функциональных жировых продуктов с определенными технологическими и физиологическими свойствами.

Поставленная цель достигалась решением следующих задач:

- скрининг активного продуцента микробных липаз, удовлетворяющих требованиям направленной конверсии жиров и масел, и микробных продуцентов внеклеточных липоксигненаз;

- изучение особенностей регуляции биосинтеза изоферментов внеклеточного липолитического комплекса выбранного продуцента;

- разработка технологии получения препаратов липаз с различной степенью очистки и исследование физико-химических и каталитических свойств выделенных изоферментов липазы;

- идентификация функциональных групп активного центра липаз;

- разработка приемов иммобилизации липазы на различных носителях и изучение свойств иммобилизованных препаратов;

- исследование кинетических параметров реакций гидролиза и трансэтерификации в водной и органической средах, катализируемых иммобилизованной липазой;

- разработка технологии получения жировых продуктов с функциональными свойствами на основе ферментативных процессов этерификации, глицеролиза, ацидолиза;

- разработка технологии хлебобулочных изделий с использованием модифицированных жиров;

- проведение производственных испытаний разработанных технологий на предприятиях масложировой и хлебопекарной промышленности.

Научная концепция. Научная концепция состоит в разработке научнопрактических аспектов технологии модификации растительных масел на основе ферментативного гидролиза и переэтерификации для получения функциональных жировых продуктов посредством использования ферментов липаз и липоксигеназ, включающего выбор липолитического фермента с высокой гидролитической и трансацилирующей активностью, получение ферментных препаратов липазы и липоксигеназы, изучение каталитических свойств липазы, иммобилизацию липазы, выявление закономерностей ферментативных процессов гидролиза и трансэтерификации ацилглицеролов в водной среде и в системах с органическими растворителями, оценку факторов, определяющих соотношение продуктов трансэтерификации, обоснование использования жиров, модифицированных липазой и липоксигеназой, в технологии пищевых производств.

Основные положения, выносимые на защиту.

На защиту выносятся следующие положения:

- методологический подход к оценке эффективности использования липолитических ферментов для модификации растительных масел на основе совокупности экспериментальных исследований каталитических свойств липаз;

- особенности биосинтеза липаз и липоксигеназ микроорганизмами;

- представление механизма действия липаз;

- специфичность действия липаз (позиционная, к жирным кислотам) при гидролизе и этерификации в микроводных условиях и в системах с органическими растворителями;

- кинетические и термодинамические характеристики адсорбции липазы при иммобилизации;

- кинетические параметры ферментативного гидролиза и трансэтерификации;

- технологические решения по использованию липазы и липоксигеназы в хлебопечении;

- оценка эффективности использования липазы для получения жировых продуктов с функциональными свойствами.

Научная новизна. Научно обоснован выбор ферментов липаз и липоксигеназ с целью модификации растительных масел для получения функциональных жировых продуктов и имеющих перспективы использования в технологии пищевых производств.

С целью интенсификации процессов гидролиза и переэтерификации растительных масел, совершенствования технологии хлебобулочных изделий и повышения их качества экспериментальным путем выявлены штаммы микромицетов с высоким уровнем синтеза внеклеточных липазы (Rhizopus oryzae 1403), липоксигеназы (Rh. oryzae 605) и комплекса этих ферментов (Rh. microsporus var. chinensis 1062).

На основе анализа факторов, влияющих на биосинтез липаз при культивировании микромицета Rh. оryzae 1403, установлено, что им синтезируется комплекс липолитических ферментов.

Впервые получены в гомогенном виде изоформы Липаза I и Липаза II, охарактеризованы их биохимические, физико-химические и каталитические свойства. Определение кинетических параметров реакций гидролиза и трансэтерификации триацилглицеролов и ингибиторный анализ позволили выявить функциональные группы активного центра ферментов. На основании собственных экспериментальных и данных литературы предложена модель механизма действия липаз.

Впервые установлена специфичность изоформ липаз Rh. оryzae 1403 к строению ацильного остатка и его положению в триацилглицеролах как при гидролизе, так и при этерификации.

Установлены особенности иммобилизации липазы на различных носителях. Определены кинетические и термодинамические характеристики адсорбции фермента на гидрофобном сорбенте – стиросорбе, которые показали высокое аффинное сродство липазы к сорбенту.

Проведен комплексный анализ кинетических параметров реакций гидролиза, этерификации, глицеролиза, ацидолиза иммобилизованным препаратом липазы в водной и органической средах; установлены общие закономерности проведения ферментативной конверсии ацилглицеролов.

В рамках обоснования целесообразности использования жиров и масел, частично гидролизованных липазой, при изготовлении хлебобулочных изделий, выявлены особенности их влияния на свойства клейковины, крахмала, жизнедеятельность дрожжей; на технологические параметры и качество готовых изделий.

Впервые определены факторы, влияющие на соотношение и выход продуктов в процессах этерификации, глицеролиза и ацидолиза, катализируемых липазой Rh. оryzae 1403, в водной и органических средах.

Новизна исследований защищена 1 авторским свидетельством и 3 патентами.

Практическая значимость. Полученный экспериментальный материал позволил сформировать рекомендации по практическому приложению микробных липаз и липоксигеназ; определить рациональные условия проведения ферментативных процессов гидролиза и трансэтерификации триацилглицеролов для модификации жиров и масел и области практического использования получаемых продуктов конверсии.

Разработана технология культивирования продуцента липазы Rhizopus oryzae 1403 и технология ферментного препарата липазы с высоким выходом –62, % и активностью 27,5 ед./мг. Способ биосинтеза липазы запатентован (Патент 2397247 РФ).

Получен иммобилизованный препарат липазы, отличающийся высокой трансферазной активностью – 385 ед./г и стабильностью в органических растворителях. Высокая активность препарата, позиционная специфичность и широкий спектр сродства к жирным кислотам позволили рекомендовать его для получения разнообразных продуктов путем энзимной переэтерификации.

Установлены режимы проведения гидролиза жировых продуктов, позволяющие получить жиры с функциональными свойствами для технологии хлебопечения. Разработаны технологии хлебобулочных изделий на основе ферментированных жиров и сдобных изделий с использованием липазы и растительной липоксигеназы (А.С. 1405130). Производственные испытания этих технологий на хлебозаводах (г. Воронеж) булочно-кондитерском комбинате (г.

Санкт-Петербург) подтвердили получаемый положительный эффект. Получен диплом 4-й Международной выставки «Современное хлебопечение. Сладкоежка–2000», г. Воронеж.

Получен препарат липоксигеназы, отличающийся высокой активностью и низким уровнем окисления -каротина (Патент 2233324 РФ); комплексный препарат липазы и липоксигеназы с высокой активностью обоих ферментов (Патент 2233325 РФ). Эти препараты рекомендованы для использования в хлебопекарной промышленности.

Показана перспективность использования иммобилизованной липазы Rhizopus oryzae 1403 для получения жиров с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов (МАГ и ДАГ) путем этерификации или глицеролиза растительных масел.

Доказана возможность получения низкокалорийных жиров с помощью ацидолиза растительных масел. Оптимизирован процесс ацидолиза подсолнечного масла с каприновой кислотой, что позволило увеличить включение кислоты до 91,8 % от максимального возможного и сократить длительность процесса в 2–3 раза.

Предлагаемые технологии модификации растительных масел успешно апробированы в производственных условиях на предприятии ЗАО «ГК Маслопродукт» (г. Воронеж).

Личный вклад соискателя. Личное участие автора являлось основополагающим на всех стадиях работы и состояло в формировании научных направлений, постановке задач и целей исследований, организации эксперимента, анализе и обработке результатов, подготовке материалов к опубликованию, проведении производственных испытаний.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были доложены на 35-ти научных конференциях, в том числе: на симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, 2004); на Всероссийском конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, 2009); на международных и всесоюзных конференциях: «Техника и технология пищевых производств»

(Могилев, 1998, 2005), «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья» (Москва, 2002), «Пищевые технологии и биотехнологии»

(Казань, 2009, 2010), «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, 2009), «Управление торговлей: теория, практика, инновации» (Москва, 2009), «Аналитические методы измерений и приборы в пищевой промышленности. Экспертиза, оценка качества, подлинности и безопасности пищевых продуктов» (Москва, 2009), «Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасности наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах»

(Москва, 2009), «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров»

(Орел, 2010), «Актуальные проблемы потребительского рынка товаров и услуг»

(Киров, 2009, 2011), «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров» (Орел, 2011), «Новости научной мысли» (Прага, 2011), «Наука и технологии: шаг в будущее» (Прага, 2012).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 72 работы, в том числе 16 статей в журналах, рекомендованных ВАК; 2 монографии; получено 1 авторское свидетельство и 3 патента РФ на изобретения.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, экспериментальную часть, выводы, список использованной литературы и приложения. Содержание работы изложено на 318 страницах основного текста, включающего 45 таблиц и 91 рисунок, и 8 приложений. Список литературы включает 663 источника, в том числе 451 иностранных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность решаемой проблемы, доказана необходимость проведения исследований в направлении скрининга липолитических ферментов с соответствующими свойствами для биоконверсии природных триацилглицеролов с получением жировых продуктов с функциональными свойствами.

Глава 1. Состояние проблемы и постановка задач исследования В представленном обзоре научной и технической литературы по теме диссертации обобщены достижения, накопленные к настоящему времени в области энзимной переэтерификации ТАГ для получения специализированных жиров;

изучения липолитических ферментов микроорганизмов.

Энзимная переэтерификация не только исключает образование токсичных трансизомеров жирных кислот, но имеет ряд преимуществ со стороны технологической оценки готовых жировых продуктов. За счет высокой пластичности, способности кристаллизоваться в устойчивой -форме они могут быть использованы в качестве жировой основы маргаринов, заменителей молочного жира, начинок для различных кондитерских изделий. Становится решаемой проблема получения заменителей какао-масла. Использование переэтерифицированных масел в технологии пшеничного хлеба позволяет улучшить реологические свойства теста, физико-химические и органолептические показатели хлеба по сравнению с применением растительных масел и традиционных маргаринов.

Ферментативная переэтерификация незаменима для получения диетических жировых продуктов. Согласно современным представлениям науки о питании переваривание и метаболизм жиров определяется как распределением жирных кислот в молекуле ТАГ, так и соотношением молекулярных масс его компонентов. Так называемые симметричные триацилглицеролы АВА типа, где А – жирная кислота со средней цепью, а B – длинноцепочечная ненасыщенная жирная кислота, важны для больных с нарушениями пищеварения. Они чрезвычайно редки, и их трудно получить химическим синтезом. ТАГ, содержащие смешанные жирные кислоты, имеют потенциальное применение в развитии новых клинических продуктов для парентерального или тонкокишечного питания хирургических, сильно травмированных, обожженных или септических больных. Большое внимание уделяется низкокалорийным жирам. Главный подход в этой технологии – это определенное распределение стеариновой кислоты и низкомолекулярных жирных кислот.

Известно создание диетических продуктов на основе ферментативного гидролиза – образующиеся диацилглицеролы (ДАГ) уменьшают факторы атеросклероза кровеносных сосудов, подавляют различные дегенеративные болезни. Метаболизм диацилглицеринов отличается тем, что они быстрее «сгорают»

вместо осаждения в жировой ткани. Технологические свойства ДАГ характеризуются эмульгирующими свойствами, что необходимо в процессе приготовления майонеза, молочных продуктов, в хлебопечении.

Однако множество проблем связано с использованием липаз в микроводных и органических средах. Во-первых, это солюбилизация фермента в масле.

Во-вторых, липазы показывают более низкую скорость переэтерификации (в сотни и тысячи раз) по сравнению с гидролизом; органические растворители могут оказывать на них отрицательное действие. Остро в этом случае стоит проблема длительного использования фермента или его восстановления. Поэтому предпочтение отдается иммобилизованным препаратам. Иммобилизация липаз проводится различными способами, но преимущество имеет адсорбция как наиболее простой и экономичный. Основным недостатком энзимной переэтерификации является длительность процесса. Отечественными препаратами масложировая промышленность не располагает.

Таким образом, необходимо получение липолитических ферментов с высокой трансацилирующией активностью, стабильностью, что позволит сократить длительность процессов энзимной переэтерификации жиров и улучшить экономические показатели производства. Это требует комплексной оценки ферментативных процессов и решения ряда технологических задач:

- направленный выбор продуцентов ферментов;

- определение условий получения препаратов в растворимой и иммобилизованной формах;

- исследование физико-химических свойств липаз, стабильности, специфичности;

- разработка направлений использования полученных препаратов.

В рамках проведения комплексной оценки эффективности ферментативной модификации растительных масел были проведены серии экспериментов для установления рациональных режимов проведения различных процессов гидролиза и трансэтерификации и разработке технологических решений по их применению.

Общая структура исследований представлена на рис. 1.

Глава 2. Материалы и методы исследований Объектами исследования служили микромицеты различных родов, ферменты липаза и липоксигеназа, продуцируемые этими микроорганизмами. В работе использованы различные общепринятые и специальные методы исследования – микробиологические, физические, физико-химические, Скрининг активных продуцентов липаз и липоксигеназ Токсикологическая Очистка и изучение фракционного состава Исследование биохимических и физико-химических свойств биохимические, в том числе хроматография липидов (тонкослойная, газовая, высокоэффективная жидкостная), хроматография белков (гелевая и ионообменная), спектрофотометрия, электрофорез, фотоколориметрия, а также методы оценки качества полуфабрикатов и готовых продуктов, принятые в хлебопекарной промышленности. Исследования проводили не менее чем в 3-х кратной повторности, обработку экспериментальных данных осуществляли методами математической статистики. Для оптимизации процессов применены методы математического планирования эксперимента.

Глава 3. Выбор активного продуцента липазы. Исследование особенностей биосинтеза липолитического комплекса из Rhizopus oryzae Опыт исследования липолитических ферментов микроорганизмов показывает, что штаммы одного и того же вида могут различаться как по уровню биосинтеза, так и по свойствам фермента.

С целью получения активного продуцента липазы нами было проверено штаммов микроскопических грибов из родов Aspergillus, Rhizopus, Mucor и др.

в условиях глубинного культивирования. Чистые культуры микроорганизмов были получены из Всероссийской коллекции микроорганизмов и из коллекции почвенных микромицетов кафедры биологии растений и животных ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный педагогический университет».

Одновременно с липазной (ЛА) проверялась липоксигеназная активность (ЛО) с целью выявления продуцентов ферментных препаратов целевого назначения – для хлебопечения. Положительная роль ферментов липазы и липоксигеназы в приготовлении теста из пшеничной муки известна. В связи с этим перспективна биоконверсия жировых рецептурных составляющих при совместном действии этих ферментов.

Высокая активность липазы была обнаружена у Rhizopus oryzae 1403 (49, ед./см3), липоксигеназы – у Rh. oryzae 605 (105,6 ед./см3) (Пат. 2233324 РФ); Rh.

microsporus var. chinensis 1062 синтезировал оба фермента на достаточно высоком уровне (ЛА=33,7 ед./см3; ЛО=70,4 ед./см3) (Пат. 2233325 РФ).

Дальнейшие исследования посвящены продуценту липазы Rhizopus oryzae 1403. Установлено, что он образует липоксигеназу с активностью 26,1 ед./см3 и является продуцентом главным образом экзоформ ферментов, так как внутримицелиальные ЛА и ЛО составили 3,0 и 8,5 % соответственно от внеклеточной активности.

Глубинный способ культивирования продуцента был намного эффективнее, чем поверхностный, при котором ЛА в расчете на 1 г СВ экстракта по сравнению с фильтратом культуральной жидкости была в 55 раз меньше.

Исследования физиологических особенностей Rhizopus oryzae 1403 показали, что оптимальными условиями для роста и биосинтеза липазы являются температура 30 С и рНнач 7,0. Продуцент нуждался в восстановленной форме азота. Углеводы – моно-, олиго-, и полисахариды; многоатомные спирты подавляли биосинтез липазы. Добавление в питательную среду органических источников азота (пептона, казеина и БВК), а также продуктов животного происхождения (кровяной, мясо-костной и рыбной муки) значительно интенсифицировало рост Rh. oryzae 1403 и его биосинтетическую активность. Лучшие результаты получены на средах с соевой мукой, которая может быть заменена на соевый жмых; и с рыбной мукой. На фоне среды с соевым жмыхом уровень ЛА повышали на 13–16 % некоторые соли (MgSO4, Na2HPO4), а из факторов роста – кукурузный экстракт.

Биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 индуцировался как субстратами – триацилглицеролами, так и продуктами их гидролиза – жирными кислотами и их производными – твинами. Активность по сравнению с пептонно-солевой средой увеличивалась в 2,3–4,0 раза (табл. 1).

Таблица 1 – Влияние индукторов на биосинтез липазы Rh. oryzae На биосинтез липаз микроорганизмами могут оказывать влияние поверхностно-активные вещества. Однако эти сведения весьма противоречивы. Исследование влияния различных ПАВ на биосинтез липазы Rh. oryzae 1403 проводились на фоне среды с соевым жмыхом (2 %), кукурузным экстрактом (1, %), (NH4)2HPO4 (0,5 %) и подсолнечным маслом (0,5 %). Результаты, представленные в табл. 2, показывают, что поливиниловый спирт и фосфатидный концентрат оказывали слабое влияние на биосинтез липазы микромищетом. Отрицательное действие проявлял бридж. Тритоны сильно отличались по эффекту.

При добавлении тритона Х-305 удалось повысить активность фермента в 3, раза.

Таблица 2 – Влияние ПАВ на биосинтез липазы Rh. oryzae Фосфатидный Для некоторых продуцентов липаз установлено наличие нескольких изоформ этого фермента. Они отличаются структурой, молекулярной массой, каталитическими свойствами, стабильностью. Множественность изоформ липаз может быть обусловлена изменениями в экспрессии генов, различным количеством ковалентно связанных углеводов, частичным протеолизом и другими трансляционными модификациями.

Исследования состава липолитического комплекса Rh. oryzae 1403 при культивировании на средах с добавлением различных индукторов и без них показали, что на пептонно-солевой среде и с твином 20 образовывалась одна форма липазы. При введении в питательную среду оливкового масла, олеиновой кислоты и других твинов синтезировалась еще одна форма липазы. Таким образом, с большой достоверностью можно утверждать, что микромицет Rh. oryzae 1403 способен синтезировать два липолитических фермента. По всей видимости, в данном случае происходит контроль на уровне экспрессии генов липазы.

На основании проведенных исследований установлено, что высокая липолитическая активность Rh. oryzae 1403 наблюдалась на среде с соевым жмыхом, подсолнечным маслом, кукурузным экстрактом, (NH4)2HPO4 и тритоном Х-305.

Оптимизация состава питательной среды с помощью математических методов планирования позволила увеличить активность комплексного препарата до 352 ед./см3, что в 7 раз выше по сравнению с исходной средой. Максимум ЛА в культуральной жидкости наблюдался к 60 ч выращивания.

Глава 4. Получение препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403 и исследование их физико-химических и биохимических свойств Разработка технологий получения препаратов липазы. Препараты липазы Г3Х и Г10Х были получены на основе ультрафильтрации и осаждения органическими растворителями.

При ультрафильтрации потери активности составили около 2 %, степень очистки – 2,2.

Токсикологическая экспертиза этого препарата установила, что он не обладал токсическим действием.

Исследования по осаждению липазы органическими растворителями показали, что на полноту выделения значительное влияние оказывает рН. Оптимальная зона находилась в пределах рН 5,5-6,0; кроме того, при подкислении фильтрата культуральной жидкости до рН 5,5 часть балластных белков выпадала в осадок и удельная активность увеличивалась в 1,08-1,1 раза. Всеми органическими растворителями липаза Rh. oryzae 1403 осаждалась монотонно с последовательным увеличением их концентрации, соответственно, выход фермента возрастал до определенного предела, а удельная активность снижалась (рис. 2). Анализ полученных результатов показал, что лучшим осадителем для липазы Rh. oryzae 1403 является ацетон – при концентрации его в смеси 70 % выход липазы составил 62,3 %, степень очистки – 1,88.

Значительное влияние на выход препаратов оказывала сушка. Распылительная сушка при температурных режимах tвх 190–195 С и tвых 85–90 С давала потери до 25 %. Поэтому температура была максимально снижена на входе до 140–145 и 70–75 С на выходе. При этом потери активности удалось довести до 11–12 % (табл. 3).

Рисунок 2 – Влияние концентрации растворителей на осаждение липазы:

() ацетон; () изопропанол; () этанол; светлые значки – ЛА в осадке, темные значки – удельная ЛА Таблица 3 – Получение препаратов липазы путем осаждения органическими растворителями Определены оптимальные параметры процесса вакуум-сублимационной сушки: температура замораживания – минус 12 – минус 15 С, скорость охлаждения – 0,01 С/мин, температура на стадии сублимации – 30–35 С.

Активность препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403 Г10Х, полученных в результате осаждения фермента из ультрафильтрата культуральной жидкости ацетоном, составила 24,9 ед./мг при распылительной сушке и 27,5 ед./мг – при сублимационной. Препарат содержал незначительные примеси липоксигеназы –50 ед./г, протеазы – 7,1 ед./г и целлюлазы – 5,0 ед./г; амилазная, глюкоамилазная активность не были обнаружены.

Технологическая схема получения препаратов липазы представлена на рис. 3.

Получение высокоочищенных препаратов липазы. Ферментный препарат, полученный в результате ультрафильтрации и последующего осаждения, подвергали гель-фильтрации на Sephadex G-150. Липаза элюировалась одним пиком; при электрофоретическом анализе в нем обнаруживалось две белковые фракции с липолитической активностью. Разделение липаз Rhizopus oryzae проводили с помощью ионообменной хроматографии на DEAE Сellulose 52.

Компоненты срепродуцента липазы ды, пар, стериль- стерилизация, охлаждение, Отработанный посевного материала ды, пар, стерильстерилизация, охлаждение, ный воздух Отработанный Осадок (биомасса, остатки среды) на утилизацию Ультрафильтрат на утилизацию Липаза Г3Х Вакуум-сублимационная Водно-спиртовая, водно-ацетоновая Рисунок 3 – Схема получения препаратов липазы Rh. oryzae Для элюции был применен ступенчатый градиент концентрации NaCl от 0,1 до 0, М, так как в ряде случаев он оказывался более эффективным, чем линейный.

Кроме того, в элюирующий буфер был добавлен тритон Х-305 0,1 %. Таким способом удалось разделить две изоформы фермента. Одна из них элюировалась раствором NaCl с концентрацией 0,1 М (фракция I), а другая – 0,7 М (фракция II). Повторная гель-фильтрация через Sephadex G-100 позволила повысить кратность очистки до 42,0 и 25,0 с выходом по активности5,8 и 8.8 % для I и II фракции соответственно (табл. 4). Далее они были названы как Липаза I и Липаза II.

Таблица 4 – Характеристика этапов очистки липаз Rh. oryzae Фильтрат жидкости Осаждение ацетоном (1:2,5) Гель-фильтрация G- фильтрация G- Молекулярная масса Липаз I и II, определенная гель-фильтрацией на Sephadex G-150 и методом электрофореза в присутствии SDS, была практически одинаковой и равнялась 44±2 кДа.

Изоэлектрические исследования изоформ липазы Rh. oryzae 1403 показали, что pI Липазы I равна 3,0, а Липазы II – 4,2. Между изоформами наблюдалось большое соответствие в аминокислотном составе за исключением аминокислот с положительно и отрицательно заряженными радикалами – отношение (Glx + Asx) к (Lys + Arg) для Липазы I составило 3,2, для Липазы II – 2,2, что согласуется с их изоэлектрическими точками.

Оптимальные условия действия изоферментов были следующими: температура 35 С и значение рН для Липазы I – 6,5; для Липазы II – 6,0.

Определение функциональных групп липаз и расшифровка механизма их действия. Известны многочисленные исследования по расшифровке строения активного центра микробных липаз, особенностей механизма их действия, поверхностной активации. Для этого используются методы химической модификации, сайт-направленного мутагенеза, молекулярного моделирования. Установлено, что большинство липолитических ферментов действуют как сериновые гидролазы с триадой Ser-Gis-Asp в активном центре. Кислотный остаток аспарагиновой кислоты триады в гидролитических ферментах, катализирующих расщепление сложных эфиров, может быть заменен глутаминовым, как показано при определении структуры липаз Geotrichum candidum, Candida rugosa. Однако липаза Burkholderia sp. является тиоловым ферментом, имеющим в активном центре цистеин. Наряду с этим обнаружена липаза из Mucor hiemalis f. hiemalis, каталитическая активность которой остается неизменной при воздействии как модификаторов серина, так и цистеина.

Для идентификации остатков аминокислот липаз Rhizopus oryzae 1403, участвующих в катализе, была проведена модификация ферментов специфичными реагентами с привлечением кинетического анализа ингибирования.

Липаза I исследовалась в реакции гидролиза, в качестве субстрата был взят трибутирин. Начальная скорость определялась по накоплению свободных жирных кислот в первые 7–10 мин.

Зависимость начальной стационарной скорости процесса от концентрации субстрата имеет вид уравнения Михаэлиса где k2 – эффективная константа; КМ – константа Михаэлиса; СS,0 и СЕ,0 – начальная концентрация субстрата и фермента соответственно.

Зависимость (lg 1/k2, pH) позволила установить рК ионизирующихся групп фермента – рК1=5,2 и рК2=6,9. Первое значение близко к карбоксильной группе, второе – к гистидину. рК гистидина подтвердилась в эксперименте с фотоокислением Липазы I, проведенного при рН 5,5–7,5 и температурах 25, 30, 40 С:

были получены значения рК=6,51, и теплоты ионизации Н=29,1 кДж/моль.

Однако инактивация ферментов в процессе фотоокисления в зависимости от температуры и рН может происходить как вследствие разрушения остатков гистидина, так и нарушения общей молекулярной структуры белка. Поэтому для выяснения роли остатков имидазола гистидина в функционировании Липазы I её модифицировали диэтилпирокарбонатом (DEP), который может реагировать в белках с имидазолом гистидина и с ОН-группами тирозина. Для Липазы I установлено увеличение светопоглощения при 242 нм, что указывает на взаимодействие DEP с гистидином; при длине волны 278 нм, характерной для тирозина, уменьшение поглощения было крайне незначительным. Расчеты констант инактивации фермента при различных концентрациях ингибитора и преобразование значений в полулогарифмических координатах позволило установить, что порядок реакции, определенный по тангенсу угла наклона прямой (tg ) равен 1,05, что указывает на участие в реакции не более одного остатка гистидина (рис. 4).

Подтверждение участия карбоксильных групп в каталитическом действии Липазы I проведено с помощью 1-этил-3(3-диэтил-аминопропил)карбодиимид гидрохлорида (EDC) в присутствии этилового эфира глицина. Известно, что карбодиимиды способны реагировать с другими аминокислотными остатками.

Аминогруппу лизина можно исключить из-за ее высокого рК, который будет препятствовать реакции в условиях данного эксперимента.

D 0, Рисунок 4 – (а) Спектры поглощения липазы, модифицированной DEP (2,5·10-3М); (б) определение порядка реакции С тирозином и гистидином карбодиимиды образуют устойчивые к кислотному гидролизу соединения. Но аминокислотный анализ модифицированного фермента показал, что количество этих остатков не изменяется. Установлено, что уменьшение скорости гидролиза трибутирина сильно зависело от концентрации водородных ионов (рис. 5), значение рК группы равнялось 5,0.

Рисунок 5 – (а) Зависимость скорости гидролиза трибутирина Липазой I, модифицированной EDC при различных значениях рН: () 6,4; () 6,0; () 5,4;

() 4,6; (б) определение рК модифицированной группы Если карбодиимиды реагируют с серином, как в случае с химотрипсином, то активность полностью восстанавливается гидроксиламином. Добавление к инактивированной Липазе I NH2OH не дало такого эффекта. Таким образом, полученные результаты позволяют утверждать, что за инактивацию Липазы I EDC отвечают именно карбоксильные группы. Отсутствие инактивации без эфира в реакционной среде и экранирование фермента субстратом свидетельствовало об отсутствии внутримолекулярных взаимодействий, которые может вызывать EDC. При практически полной потере активности в данном ферменте модифицировалось 11 карбоксильных групп (рис. 6). При условии псевдопервого порядка реакции получили, что для проявления активности необходимо не менее трех групп.

Рисунок 6 – Ингибирование Липазы I карбодиимидом и включение глицина в молекулу фермента Для выяснения механизма действия EDC на липазу были определены кинетические параметры гидролиза трибутирина и триолеина. Vmax мало отличались на обоих субстратах; KM на трибутирине увеличилось в 1,47, а на триолеине – в 1,18 раз. Соответственно в большей степени на трибутирине уменьшилась каталитическая эффективность – в 2,8 раз против 2,15 на триолеине. Это приводит к выводу, что карбоксильные группы отвечают за создание активной конформации фермента при связывании с определенным субстратом.

Анализ кинетических параметров гидролиза трибутирина Липазой I, модифицированной различными ингибиторами, показал, что DEP вызывал уменьшение Vmax, n-хлормеркурибензоат (n-ХМБ) – реагент на сульфгидрильные группы – увеличение КМ; фенилметансульфонилфторид (PMSF) – специфический ингибитор сериновых ферментов, и EDC приводили к изменению обеих констант Михаэлиса (табл. 5).

Таблица 5 – Изменения кинетических параметров реакции гидролиза трибутирина Липазой I в присутствии различных модификаторов Это говорит о том, что в соединении фермента с субстратом участвует сразу несколько областей молекулы фермента, каждая из которых имеет ключевые аминокислотные остатки и поэтому блокирование одной из групп может привести к искажениям конформации, что делает ее менее благоприятной для связывания с субстратом и для диссоциации фермент-субстратного комплекса.

Для исследования роли остатка серина в катализе была проведена модификация липазы ингибиторами, которые являются аналогами субстратов – nгексил-этил-хлорофосфонатом и додецилсульфонатом и проведен кинетический анализ ингибирования (рис. 7).

Рисунок 7 – Кинетические зависимости ингибирования Липазы I (а) nгексил-этил-хлорофосфонатом и (б) додецилсульфонатом в двойных обратных координатах; () нативный фермент; (), () с ингибиторами Исходя из трехстадийного механизма ферментативной реакции гидролиза были рассчитаны индивидуальные константы k2 и k3 из соотношений Для фосфоната они были равны: k2=4,2 с-1 и k3=7,6, то есть в данном случае ингибировалась стадия ацилирования. Для сульфоната соотношение между константами было обратным – k2=18,5 с-1 и k3=3,2, что свидетельствует о подавлении стадии деацилирования.

При исследовании изоформ липаз в реакциях гидролиза триолеина и этерификации олеиновой кислоты и глицерина обнаружены близкие потери активности под действием специфических ингибиторов (табл. 6). Поэтому можно утверждать, гидролиз и трансэтерификация являются обращением одного и того же механизма.

Таблица 6 – Влияние ингибиторов на активность изоформ липаз Rh. oryzae 1403 в реакциях гидролиза и этерификации Реакция

DEP EDC PMSF

Представленные данные по идентификации остатков аминокислот Липазы I и ингибированию обеих изоформ липаз согласуются с известным механизмом, который предполагает, что нуклеофильная атака на карбонильный углерод эфирной связи осуществляется остатком серина, активизированным через сеть водородных связей гистидином и аспарагиновой кислотой. Сложноэфирная связь разрывается и образуется промежуточный интермедиат – ацил-фермент.

Деацилирование происходит в результате нуклеофильной атаки молекул воды через формирование второго тетраэдрального промежуточного соединения. Когда липаза действует в среде с пониженной активностью воды, другие нуклеофильные группы являются конечными акцепторами ацила (в трансферазных реакциях).

Исследование субстратной специфичности липолитического комплекса Rhizopus oryzae 1403. Позиционную специфичность липаз оценивали по PSI (positional specifity index), вычисляемого по соотношению диацилглицеролов (DG, %), образующихся за 1 ч гидролиза триолеина:

Полученные данные (табл. 7) позволяют отнести обе изоформы липаз Rhizopus oryzae 1403 к позиционно специфичным, так как согласно данной методике cтрого 1,3-специфичные липазы имеют PSI +100, у неспецифичных липаз значения PSI находятся в пределах от +30 до –20, к третьей группе относят несовершенные 1,3-специфичные липазы (т. е. скорее специфичные, чем неспецифичные) с PSI от +80 до +70.

Таблица 7 – Определение позиционной специфичности липаз Rhizopus oryzae Для определения специфичности липаз к строению жирнокислотного остатка использован метод, предусматривающий гидролиз метиловых эфиров жирных кислот, полученных из натуральных жиров, и расчет коэффициента K(FA):

где [FA]P и [FA]S – концентрации жирных кислот во фракциях свободных жирных кислот и их метиловых эфиров соответственно.

В качестве исходных субстратов были выбраны молочный и рыбий жир, льняное, горчичное и касторовое масла, имеющие характерный жирнокислотный состав. Анализ полученных данных показал, что обе формы липазы Rhizopus oryzae 1403 проявляют предпочтительность к жирным кислотам со средней длиной цепи. Такая тенденция наблюдалась на всех маслах. В пределах длины углеводородной цепи 14–18 явно была выражена специфичность к ненасыщенным жирным кислотам с одной и двумя двойными связями (рис. 8).

K(FA) Рисунок 8 – K(FA) для жирных кислот при гидролизе метиловых эфиров, полученных из молочного жира (а) и рыбьего жира (б) Липазой I () и Липазой II () Линоленовая кислота являлась менее предпочтительной, так же как и рицинолевая. Это говорит о том, что наличие большого количества (больше двух) двойных связей и оксигруппы может создавать стерические помехи при соединении фермента с субстратом. Отмечено, что Липаза I имеет более выраженную специфичность.

Различия в скорости высвобождения олеиновой и масляной кислот составили у Липазы I – 4–5 раз, у Липазы II – 1,3–1,8 раза; олеиновой и докозагексаеновой кислот – 21,1 и 4,7 раз соответственно. Такие различия в специфичности изоформ продуцента объясняют тот факт, что препарат липазы Г10Х способен к гидролизу широкого спектра природных жиров и масел.

Иммобилизация липазы и физико-химические свойства иммобилизованного фермента. Для расширения возможностей биоконверсии липидов необходима иммобилизация липолитических ферментов, так как она не только позволяет многократно их использовать, но и увеличивает их стабильность в системах с органическими растворителями. Для иммобилизации липазы Rhizopus oryzae 1403 были выбраны носители, используемые в пищевой технологии – стиросорб МЭР 100(ЦГ) и анионит АВ-17-2П. Установлено, что перспективным носителем для фермента является стиросорб, так как эффективность связывания липазы с ним составила 57,3 %, с анионитом она не превышала 23 %.

Исследования адсорбции фермента на стиросорбе показали, что равновесие устанавливается к 40 мин для белка и к 60 мин для активности. Таким образом, липаза со временем вытесняет другие белки с поверхности носителя; адсорбционный коэффициент составил 1,25. Установлена оптимальная температура адсорбции – 30 С. Адсорбционные константы, полученные при различных рН, мало отличались. Это дало основание предположить, что определяющую роль в связывании липазы со стиросорбом играют гидрофобные взаимодействия.

Кинетика связывания липазы с носителем изучалась с помощью смешанного уравнения Колмогорова, Ерофеева, Казеева, Аврами и Мампеля (КЕКАМ) где – степень преобразования ([А]/[А]max, в единицах активности); k – константа скорости адсорбции; n – специфический кинетический параметр.

Применение модели КЕКАМ позволило нам получить прямолинейные зависимости (рис. 9).

Рисунок 9 – Кинетические зависимости в координатах уравнения КЕКАМ для адсорбции липазы при различных температурах: (1) 30 С; (2) 23 С; (3) 4 С Значения констант для различных температур и энергии активации приведены в табл. 8. Параметр n рассматривается как критерий, определяющий ход гетерогенных реакций. Значения n для белка были 0,91–0,97, а для липазы – больше единицы, что говорит о том, что скорость адсорбции фермента лимитируется взаимодействием с поверхностью сорбента. При различных температурах значения n мало отличались, что свидетельствует о незначительном влиянии ее на механизм связывания.

Таблица 8 – Значения кинетических параметров и энергии активации для адсорбции липазы Rh. oryzae 1403 на стиросорбе Температура, С Низкая энергия активации говорит о высоком аффинном сродстве липазы Rh. oryzae 1403 к стиросорбу.

Таким образом, проведенные исследования показали, что для достижения максимальной сорбции липазы на стиросорбе ее нужно проводить при температуре 30 С и рН 6,5 в течение 60 мин.

Гидролитическая активность иммобилизованного фермента составила ед./г носителя, активность переэтерификации – 385 ед./г. Исследования влияния рН и температуры на каталитическую активность препарата показали, что оптимумы его действия не отличаются от растворимой формы фермента – это рН 6,5 и 35 С.

Иммобилизованный препарат отличался более высокой устойчивостью в органических средах. Полярные растворители (этанол, ацетон, изопропанол) вызывали инактивацию растворимой липазы при 35 С за 0,5–2 ч, с то время как у иммобилизованной формы остаточная активность после 10 сут инкубации составляла 17–43 %. В неполярных растворителях (изооктан, гептан, гексан) она оставалась на уровне 98–95 % за тот же период (рис. 10).

Испытания препаратов липазы, лиофилизированных или иммобилизованных из буферных растворов с различными значениями рН, показали, что оптимум их действия в органических растворителях остается неизменным и составляет 6,5. Таким образом, растворители не вносят искажений в состояние ионизации фермента при катализе.

Иммобилизованный препарат показал более высокую термостабильность.

Время потери 50 % активности у растворимой липазы составило при 40 С 72 ч, 50 С – 4 ч. У иммобилизованной липазы период «полужизни» увеличился вдвое. Особенно высокая термостабильность иммобилизованного препарата отмечена в реакциях этерификации в органической среде. Так, в реакции этерификации в гексане при 50 С степень конверсии за 8 ч была выше на 10 % по сравнению с 35 С, длительность процесса сокращалась на 2 ч. В среде без растворителя степень конверсии при 50 С не превышала 40 % к 2 ч, а затем снижалась в связи с тепловой денатурацией фермента (рис. 11).

Рисунок 10 – Стабильность (а) растворимой и (б) иммобилизованной липазы при инкубации в органических растворителях при 35 С: () метанол, () этанол, () ацетон, () хлороформ, ( ) изопропанол; () бутанол, () гексан, (+) гептан, (*) изооктан Рисунок 11 – Влияние температуры на этерификацию глицерина и олеиновой кислоты: () 35 С; () 50 С ; () 60 С ; (, ) система без растворителя;

(,, ) в гексане.

Высокая активность и стабильность иммобилизованной липазы позволяет рекомендовать ее для биоконверсии жировых продуктов.

Глава 5. Исследование кинетических параметров реакций гидролиза и трансэтерификации ацилглицеролов, катализируемых липазой в водной и органической средах Различные типы превращений – как гидролиз, так и трансэтерификация триацилглицеролов под действием иммобилизованного препарата липазы Rh.

oryzae 1403 исследованы в водной среде и в системах с органическими растворителями. Несмотря на то, что общие правила управления ферментативным катализом в таких нетрадиционных средах существуют, параметры для каждого фермента нельзя точно предсказать, поэтому они должны быть определены экспериментально.

Кинетические параметры гидролиза гомогенных триацилглицеролов Vmax и KM были определены с помощью метода двойных обратных координат Лайнуивера и Берка. Начальная скорость определялась по накоплению свободных жирных кислот. Полученные значения представлены в табл. 9.

Триацилглицеролы с высокой температурой плавления и находящиеся в твердом состоянии при оптимальной температуре действия липазы Rh. oryzae 1403, не подвергались превращениям. Поэтому их гидролиз был проведен в системе с растворителями с различной полярностью – гексаном (log P 3,5) и бутаноном (log P 0,28).

Таблица 9 – Кинетические характеристики гидролиза триацилглицеролов иммобилизованной липазой Rh. oryzae С увеличением длины цепи жирной кислоты в составе ТАГ скорость гидролиза возрастала вне зависимости от системы реакции. Характер изменения KM определялся полярностью среды реакции: в воде и бутаноне значения KM уменьшались с длиной цепи, а в гексане – увеличивались. Таким образом, в неполярном растворителе требуется преодолеть более высокий энергетический барьер для связывания субстрата с ферментом. Судя по константам скорости второго порядка – Vmax /KM, специфичность к кислотам с большой длиной цепи проявлялась в воде и полярном растворителе; в неполярном растворителе наблюдалось обращение специфичности к длине цепи жирной кислоты. Эффективность гидролиза в бутаноне была ниже в 2,8–3,6 раз по сравнению с водной средой, что объясняется значительным снижением скорости реакции. Уменьшение эффективности гидролиза триацилглицеролов в гексане главным образом связано с возрастанием константы Михаэлиса в 1,4–3,7 раз.

Исследования динамики гидролиза растительных масел липолитическим комплексом Rh. oryzae 1403 показали, что она отличается от таковой у позиционно специфичных липаз. В последнем случае при достижении 40 % гидролиза происходит выделение глицерина и его количество монотонно увеличивается.

Количество моноацилглицеролов в реакционной смеси при этом начинает уменьшаться. Как видно из рис. 12, глубина расщепления масла для препарата липазы Rh. oryzae 1403 не превышала 37 %, глицерин образовывался в следовых количествах, что можно объяснить миграцией ацила в sn-2-положение ацилглицерина.

Рисунок 12 – Характер гидролиза растительных масел липазой Rh. oryzae 1403: () ТАГ; () ДАГ; () МАГ; () СЖК; (*) глицерин В рассматриваемой реакции создающееся равновесие связано с особенными свойствами данного ферментного препарата, а именно, с высокой трансацилирующей активностью.

Основным фактором, определяющим положение равновесия в рассматриваемой реакции, является содержание воды в реакционной смеси. Изучение систем без растворителей показало, что при увеличении количества воды скорость гидролиза ТАГ монотонно возрастает, а для этерификации существует некоторый предел, выше которого скорость реакции снижается (рис. 13). При проведении процессов в среде с органическими растворителями вода в реакционной системе распределяется между ферментом, носителем, растворителем, субстратами и продуктами реакции. Поэтому количество воды становится некорректным параметром. По этой причине в экспериментах по исследованию влияния растворителей на ход реакций трансэтерификации использовался показатель активности воды aw.

Рисунок 13 – Влияние количества добавленной воды на ход реакций гидролиза триолеина (а) и этерификации глицерина и олеиновой кислоты (б), катализируемых иммобилизованным препаратом липазы Rh. oryzae Были испытаны растворители смешивающиеся и несмешивающиеся с водой, с различной гидрофобностью, характеризуемой коэффициентом распределения log P: бутанон (0,28), дипропиловый эфир (1,9), бензол (2,0), гексан (3,5).

Зависимость скорости реакции этерификации от aw была подобна со всеми выбранными растворителями; максимальные ее значения наблюдались в диапазоне aw 0,5–0,8 (рис. 14).

Рисунок 14 – Скорость этерификации глицерина и олеиновой кислоты, осуществляемой липазой, как функция аw в системах с органическими растворителями: () гексан; () без растворителя; () бензол; () бутанон; (*) бутанон Снижение скорости реакции при дальнейшем увеличении aw происходит прежде всего из-за конкуренции между гидролизом и алкоголизом промежуточного соединения – ацил-фермента.

При любой активности воды на скорость трансэтерификации оказывал влияние вид растворителя: в гексане она была выше по сравнению с реакционной системой без растворителя, а более полярные растворители приводили к ее снижению.

Осуществляемые липазой реакции биоконверсии ацилглицеролов, рассматриваемые в настоящей работе, и различия косубстратных систем показаны в табл. 10. Они включают две полуреакции, в которых образуется тетраэдрический интермедиат.

Таблица 10 – Различия в косубстратных системах при биоконверсии ацилглицеролов Как можно ожидать, скорости этих реакций будут различными из-за различий в природе донора ацильной группы и нуклеофила.

Проведены сравнительные исследования реакций этерификации и глицеролиза в средах с полярным и неполярным растворителями при aw 0,83. В качестве доноров ацила использовали олеиновую кислоту и триолеин соответственно. На рис. 15 показаны зависимости начальной скорости этерификации от концентрации олеиновой кислоты и глицерина.

Характер графиков в двойных обратных координатах (1/v0-1/[A]) свидетельствует о пинг-понговом би-би-механизме реакции с конкурентным ингибированием одним из субстратов – акцептором ацила – глицерином. Ингибирования реакции этерификации олеиновой кислотой не было обнаружено. В этом случае механизм этерификации представляется следующей схемой:

Рисунок 15 – Влияние концентрации олеиновой кислоты (а) и глицерина (б) на скорость реакции этерификации в гексане: () 1 мМ; () 2,5 мМ; () мМ; () 10 мМ; (*) 20 мМ; () 50 мМ; (+) 100 мМ; (в) зависимость в двойных обратных координатах Согласно этому механизму начальная скорость может быть описана уравнением где А и В – субстраты, донор и акцептор ацила соответственно; K M и K M кинетические константы Михаэлиса при насыщении В и А; KiB – константа ингибирования для глицерина.

Установлено, что кинетическая модель реакций не зависела ни от типа донора ацила, ни от вида растворителя.

Кинетические параметры, определенные согласно уравнению (9), представлены в табл. 11. Значения Vmax в бутаноне составили 44–52 % от Vmax в гексане, что может быть связано с непосредственным влиянием полярного растворителя на фермент. В бутаноне было затруднено связывание с глицерином как ацил-фермента ( K M ), так и свободного фермента ( KiB ). В гексане связывание свободного фермента с олеиновой кислотой ( K M ) и глицерином ( KiB ) было соA поставимо, а с триолеином – менее сильным.

Таблица 11 – Кинетические константы этерификации и глицеролиза, катализируемых иммобилизованной липазой Rh. oryzae 1403 в бутаноне и гексане Бутанон Гексан Скорость реакции этерификации олеиновой кислоты и глицерина была ниже в 1,9–2,3 раза, чем трансэтерификации между глицерином и триолеином и в гексане, и в бутаноне. Отмечено изменение в субстратной специфичности, оцениваемой как отношение (Vmax /КМ ТАГ)/(Vmax /КМ С18:1) от гексана к бутанону в 5,3 раза. Каталитическая эффективность по отношению к глицерину была значительно выше в гексане, чем в бутаноне.

Кинетика реакции ацидолиза в гексане исследована с точки зрения обращения реакции гидролиза триолеина. Скорость реакции гидролиза в этом случае определялась по убыванию субстрата, а скорость ацидолиза по его образованию в реакции между диолеином и олеиновой кислотой. Определение кинетических констант проведено согласно уравнению скорости для пинг-понгового би-би-механизма без ингибирования субстратом, так как оно не наблюдалось.

Это уравнение имеет вид Кинетические константы гидролиза триолеина и синтеза диолеина и олеата приведены в табл. 12. Анализ полученных данных показал, что максимальная скорость гидролиза триолеина в 3,3 раза меньше, чем обратной реакции, но каталитическая эффективность обеих реакций сравнимы, то есть для липазы Rh.

oryzae 1403 при выбранных условиях гидролиз не является скорость лимитирующей стадией при ацидолизе.

Таблица 12 – Кинетические константы гидролиза и ацидолиза Таким образом, установлено, что кинетические параметры реакций трансэтерификации зависят от природы как донора ацила, так и его акцептора, а также от присутствия растворителя и его полярности. Самая высокая каталитическая эффективность для иммобилизованной липазы Rh. oryzae 1403 отмечена в реакции ацидолиза, а наиболее предпочтительным растворителем является неполярный растворитель – гексан.

Глава 6. Практическое использование ферментативной конверсии природных триацилглицеролов 6.1. Гидролизованные жировые продукты и их функциональные свойства в технологии хлебопечения.

Продукты гидролиза жиров липазой Rh. oryzae 1403 – моно- и диацилглицеролы, жирные кислоты обладают поверхностно-активными свойствами. Проведенные исследования показали, что жиры, модифицированные ферментативным гидролизом, являются достаточно эффективными улучшителями качества хлебобулочных изделий. Увеличивался удельный объем, пористость, эластичность мякиша, замедлялось черствение изделий. По органолептическим показателям опытные образцы соответствовали требованиям нормативной документации. Сокращалась длительность брожения теста в 1,4–1,5 раза.

С целью научного обоснования применения гидролизованного масла в технологии хлебопечения исследовано его влияние на жизнедеятельность дрожжевых клеток, свойства клейковины пшеничного теста и пшеничного крахмала при различной степени гидролиза и массовой доле масла.

При культивировании дрожжей на модельной синтетической среде установлено, что в присутствии гидролизованного масла в сравнении с нативным ускоряется потребление глюкозы дрожжевыми клетками (рис. 16). Подобный эффект получен с жирными кислотами – олеиновой и линолевой. Это может быть связано с повышением проницаемости мембран клеток и снижением затормаживающего действия нативного масла на проникновение в них углеводов.

Гидролизованное масло способствовало повышению сопротивляемости клейковины нагрузке сжатия (рис. 17).

Решающую роль в получении такого эффекта играют жирные кислоты.

Они являются поверхностно-активными веществами с дифильным строением.

Адсорбируясь на межфазовой поверхности, такие соединения снижают поверхностное натяжение, что эквивалентно образованию новой поверхности.

Для моделирования состояния крахмальной фракции муки в готовых хлебобулочных изделиях изучено влияние гидролизованного масла на процесс формирования крахмального студня по изменению его пластической прочности (рис. 18).

Рисунок 16 – Динамика потребления глюкозы дрожжевыми клетками в присутствии 5 % масла: гидролизованное масло (- - -) со степенью расщепления, (%): () 6,8; () 9,6; () 12,5; () нативное масло; () контроль – без масла Рисунок 17 – Влияние 5 % нативного масла и гидролизованного со степенью расщепления () 6,8 %; () 9,6 %; () 12,5 % на свойства клейковины в процессе брожения; () нативное масло; () контроль Прочность крахмального студня была максимальной без масла и снижалась по мере увеличения его концентрации. Очевидно, масло в этом случае выполняет роль пластификатора, уменьшая энергию связи частиц и затрудняя стабилизацию структуры. Гидролизованное масло приводило к повышению прочности крахмального студня. Вероятно, большая прочность создается за счет создания комплексов амилозы и амилопектина с моно- и диацилглицеролами, которые, как известно, вызывают флокуляцию крахмальных зерен и увеличивают таким образом степень полимеризации студня. Таким образом, изменение свойств клейковины и крахмала под влиянием гидролизованного масла позволяет стабилизировать физические свойства теста. Установлена рациональная степень гидролиза масел и жиров – 10–13 %.

Рисунок 18 – Влияние 5 % нативного масла и гидролизованного со степенью расщепления () 6,8 %; () 9,6 %; () 12,5 % на формирование крахмального студня (б); () нативное масло; () контроль Установлено, что при хранении крахмальных студней в течение трех суток их пластическая прочность возрастала, но в образцах с гидролизованным маслом этот процесс протекал медленнее. Это объясняет замедление черствение хлебобулочных изделий.

Более ощутимый эффект улучшения качества теста и хлеба получен при использовании совместного действия липазы и липоксигеназы. Это может быть достигнуто обработкой масла ферментными препаратами, полученными из разных продуцентов (Rhizopus oryzae 1403 и Rh. oryzae 605), либо комплексным препаратом из Rh. microsporus var. chinensis 1062 (табл. 13).

Таблица 13 – Показатели качества хлеба Кислотность мякиша, Удельный объем, Формоустойчивость, Аппаратурная и технологическая схемы приготовления теста с использованием модифицированного масла представлены на рис. 19, 20.

Рисунок 19 – Аппаратурная схема приготовления теста безопарным способом с использованием масла, гидролизованного препаратом липазы: 1 – гомогенизатор; 2 – водомерный бачок; 3 – сепаратор; 4 – дозировочная станция; 5 – тестомесильная машина; 6 – нагнетатель теста; 7 – бункер для брожения теста;

8 – тестоделительная машина Рисунок 20 – Схема приготовления теста безопарным способом 6.2 Получение жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов с помощью этерификации и глицеролиза.

Проведение этерификации глицерина и олеиновой кислоты при соотношении 1:1 в среде без растворителя показало, что моно- и диацилглицеролы образовывались почти в эквимолекулярных количествах. Формирование триолеина происходило очень медленно (рис. 21). Это можно объяснить позиционной специфичностью липазы, что подтвердилось результатами тонкослойной хроматографии продуктов этерификации: в начале процесса проявлялись 1(3) моноолеин и 1,3-диолеин. К 6 ч идентифицировались 1,2(2,3) диолеин, к 8 ч – 2моноолеин, что связано со спонтанной миграцией ацила из первого положения молекулы глицерина во второе. За счет этого образовывался и триолеин.

Рисунок 21 – Изменение состава продуктов этерификации глицерина и олеиновой кислоты: () олеиновая кислота; () моноолеин; () диолеин; () триолеин Эффективность синтеза сильно зависела от количества воды в реакционной смеси. Лучший результат получен при содержании воды 2,5-3,0 %, при дальнейшем его увеличении степень конверсии снижалась, соотношение продуктов при этом не изменялось. Для получения высоких концентраций продуктов в равновесии необходим избыток глицерина – лучший результат дало молярное отношение олеиновой кислоты и глицерина 1:3,1.

Исследован процесс глицеролиза различных масел и жиров в средах с органическим растворителем и в его отсутствие. В качестве растворителя был выбран 2-метил-2-пропанол. Факторы, влияющие на характер процесса, изучены на примере глицеролиза подсолнечного масла.

Процесс глицеролиза в системе без растворителя показан на рис. 22.

К 3 ч 74,3 % триацилглицеролов масла конвертировалось в моно- и диацилглицеролы. Наблюдалось почти равное распределение между 1,3 и 1,2(2,3)диацилглицеролами. При более длительной инкубации – 8 ч – трансформировалось до 97 мол. % триацилглицеролов; моноацилглицеролы накапливались в количестве 68,7 мол. %. Диацилглицеролы составляли в сумме 26,1 мол. %.

Жирные кислоты появлялись в реакционной смеси начиная с 4 ч, в равновесном состоянии их количество находилось в пределах 2 %.

Рисунок 22 – Глицеролиз подсолнечного масла в среде без растворителя:

() СЖК; () МАГ; () 1,2(2,3) ДАГ; () 1,3 ДАГ; () ТАГ Проведение глицеролиза в среде с растворителем при концентрации масла 20 % и глицерина 10 % показало, что процесс конверсии триацилглицеролов идет несколько медленнее, что, по всей вероятности, связано с влиянием растворителя на активность фермента. Равновесное состояние отличалось составом продуктов от системы без растворителя: больше образовывалось моноацилглицеролов – до 85,8 мол. % и, соответственно, меньше диацилглицеролов – 7,2 мол. % (рис. 23).

Рисунок 23 – Глицеролиз подсолнечного масла в среде с 2-метил-2пропанолом: () СЖК; () МАГ; () 1,2(2,3) ДАГ; () 1,3 ДАГ; () ТАГ На выход и состав конечных продуктов при глицеролизе сильно влияло соотношение субстратов – глицерина и масла. Причем наблюдалась различная картина в водной среде и в 2-метил-2-пропаноле (рис. 24, 25). Для получения максимального количества моноацилглицеролов в системе без растворителя оптимальное соотношение глицерина (как добавленного, так и в составе масла) и ацильных групп триацилглицеролов масла составило 1,6:1, дальнейшее его повышение не приводило к изменению равновесного состояния в реакционной смеси. В 2-метил-2-пропаноле выход моноацилглицеролов повышался до избытка глицерина в 2,7 раза к ацильным группам. Количество диацилглицеролов при этом соответственно снижалось.

Рисунок 24 – Влияние количества глицерина на выход продуктов при глицеролизе подсолнечного масла в среде без растворителя: () СЖК; () МАГ;

()ДАГ Рисунок 25 – Влияние количества глицерина на выход продуктов при глицеролизе подсолнечного масла в 2-метил-2-пропаноле: () СЖК; () МАГ;

()ДАГ Максимальный выход диацилглицеролов мог быть получен при низкой концентрации глицерина с соотношением (0,65–0,7):1 как в среде с растворителем, так и без него.

Исследование влияния концентрации масла в органическом растворителе в пределах 10–50 % при постоянном количестве глицерина – 15 % показало, что лучший результат (по выходу моноацилглицеролов) в мол. % достигался при концентрации масла 15 %. По всей вероятности, это связано с более благоприятным соотношением глицерина и ацильных групп (3,5:1). Технологическая схема производства жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов приведена на рис. 26.

6.3 Получение низкокалорийных жиров путем ацидолиза.

Иммобилизованный комплексный препарат липазы Rh. oryzae 1403 является перспективным для проведения ацидолиза. Установлено, что жирные кислоты со средней молекулярной массой могут быть успешно включены в триацилглицеролы растительных масел как в среде с растворителем, так и без него (рис. 27).

При дозировке препарата 10 % к массе субстратов и соотношении кислот к маслу 2:1 моль/моль равновесие устанавливалось к 12 ч и количество включенных кислот от максимально возможного (66,6 %) для каприловой кислоты составило 54,7 и 59,6 и каприновой – 70,4 и 81,5 % соответственно в среде без растворителя и в гексане. Система с растворителем была несколько предпочтительней. Однако в промышленности имеют преимущество технологии без растворителей, так как их добавление усложняет процесс, повышает его стоимость; выход продукта на единицу объема реакционной смеси значительно снижается.

Рисунок 27 – Ацидолиз подсолнечного масла иммобилизованной липазой с кислотами: () каприновой; () каприловой; светлые значки – без растворителя;

темные значки – в органической среде В связи с этим был исследован ацидолиз различных растительных масел с каприновой кислотой в среде без растворителя. С целью достижения максиРастительное Глицерин, 14 % Иммобилизованный ферментный препарат Rh. oryzae Рисунок 26 – Технологическая схема процесса производства жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов на основе ферментативного катализа мального включения этой кислоты в триацилглицеролы масла была проведена оптимизация ацидолиза с использованием центрального ком-позиционного униформ-рототабельного планирова ния эксперимента. На основании предварительной оценки в качестве факторов, оказывающих влияние на выход процесса, были выбраны: дозировка ферментного препарата к массе субстратов (Е, %), соотношение масла и кислоты (С10:0:ТАГ, моль/моль), содержание воды в реакционной смеси (W, %) и длительность (). Реализация плана эксперимента и результаты расчетов эффектов факторов показали, что основную роль играет соотношение субстратов и содержание воды. Оптимальные параметры проведения ацидолиза – Е= 11,3 %; W=3,5 %; кислота:масло (моль:моль) = 6,8 и время 5 ч позволили повысить включение С10:0 до 60,6 мол. %, т. е. до 91,8 % от теоретически возможного. Сокращение длительности процесса в 2–3 раза по сравнению с известными технологиями дает увеличение прибыли в среднем в 3,3 раза и рентабельности продукции на 44,4 %. Газовая хроматография состава жирных кислот триацилглицеролов после ацидолиза показала, что с увеличением включения каприновой кислоты почти эквивалентно в них уменьшается количество других кислот (рис. 28).

Рисунок 28 – Изменение жирнокислотного состава подсолнечного масла при ацидолизе с каприновой кислотой: () С10:0; () С18:1; () С18:2; (*) С16: Позиционная специфичность липазы Rh. oryzae 1403 сохранилась, о чем свидетельствовали данные жирнокислотных композиций в 1(3) и 2-положениях триацилглицеролов масла: во 2-ом положении она не изменилась после ацидолиза, то есть каприновая кислота обменивалась с жирными кислотами только в 1-м и 3-м положениях ацилглицеролов (табл. 14).

Растительные масла оказались различными по эффективности процесса ацидолиза. Для соевого, хлопкового масел получены результаты, близкие к подсолнечному при установленных оптимальных режимах. В аналогичных условиях каприновая кислота с трудом включалась в ТАГ касторового масла и особенно, горчичного. Это согласуется со специфичностью липазы Таблица 14 – Изменение состава жирных кислот в 1(3)- и 2-положениях триацилглицеролов в подсолнечном масле при ацидолизе Жирные кислоты Rh. oryzae 1403 к жирным кислотам, определенной в реакциях гидролиза – обмен на рицинолевую и эруковую кислоты проходил медленно.

Таким образом, проведенными исследованиями показана перспективность использования липаз с высокой трансацилирующей активностью для модификации жировых продуктов путем этерификации, глицеролиза или ацидолиза. Доказана высокая эффективность получения жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов, низкокалорийных жиров. Обоснован положительный эффект масла, подвергнутого конверсии липазой и липоксигеназой, в производстве хлебобулочных изделий.

ВЫВОДЫ

1. Выполнено комплексное научное исследование, позволившее научно обосновать и разработать практические решения по модификации растительных масел на основе ферментативного гидролиза и переэтерификации ТАГ для получения функциональных жировых продуктов с определенными технологическими и физиологическими свойствами.

2. Научно обоснована необходимость скрининга ферментов микробного происхождения для конверсии растительных масел. Экспериментальным путем выявлены активные продуценты внеклеточных ферментов липазы и липоксигеназы: (1) Rhizopus oryzae 1403, синтезирующий липазу, которая обладает позиционной специфичностью и высокой трансферазной активностью, необходимыми для эффективной модификации жиров и масел; (2) Rh. oryzae 605, превосходящий по уровню активности липоксигеназы известные микробные источники; (3) Rh. microsporus var. chinensis 1062, рекомендованный для получения комплексного препарата липазы и липоксигеназы.

3. Определены факторы, регулирующие биосинтез липазы Rhizopus oryzae 1403. Показана индуцибельность фермента и его синтез в виде двух изоформ в зависимости от вида индуктора. Оптимизация условий культивирования продуцента позволила повысить (в 7 раз) липолитическую активность – до 352 ед/см3, что сравнимо с известными в настоящее время продуцентами.

4. Получены две изоформы липазы (I и II), определены их физикохимические, биохимические и каталитические характеристики. Посредством анализа кинетических параметров реакций установлена принадлежность липаз I и II к сериновым гидролазам, содержащим каталитическую триаду Asp(Glu)-Ser-His;

доказано участие в реакциях гидролиза и этерификации одного и того же активного центра.

5 Установлены кинетические закономерности гидролиза и трансэтерификации в процессе конверсии триацилглицеролов в водной и органической средах для липазы Rh. oryzae 1403. Доказано, что этерификация и глицеролиз подчиняются пинг-понговому би-би-механизму с ингибированием акцептором ацила – глицерином. Ацидолиз не ингибируется субстратом и гидролиз не является скорость лимитирующей стадией.

6. Доказана специфичность изоформ (I и II) липазы Rhizopus oryzae 1403 к sn-1(3)-положениям триацилглицеролов как при гидролизе, так и при трансэтерификации. Установлена специфичность липаз к строению ацильного остатка в триацилглицеролах масел, а именно, предпочтительность к жирным кислотам со средней длиной цепи (C12-C18), содержащим не более двух двойных связей.

7. Разработаны технологии получения ферментных препаратов липазы Rhizopus oryzae 1403 различной степени очистки на основе ультрафильтрации, осаждения органическими растворителями и сублимационной сушки: (1) препарата липазы Г10Х с выходом – 62,3 % и активностью 27,5 ед./мг при гидролизе и трансэтерификации – 385 ед./г; (2) высокоочищенных препаратов Липазы I и Липазы II с удельной активностью 3600 и 2150 ед./мг белка и степенью очистки 42,0 и 25,0 соответственно.

8. Получен иммобилизованный препарат липазы на стиросорбе, обладающий высокой устойчивостью к органическим растворителям при повышенных температурах. Изучена кинетика адсорбции, установлено высокое сродство липазы к сорбенту, обеспеченное преобладанием гидрофобных взаимодействий.

9. Обоснована целесообразность использования продуктов ферментного (липазой, а также в комплексе с липоксигеназой) гидролиза масел в хлебопечении, обусловленная вследствие интенсификацией потребления глюкозы дрожжами, повышением качества клейковины и прочности крахмального студня.

Установлена рациональная степень гидролиза масел и жиров - 10-13%, при которой длительность брожения сокращается в 1,4–1,5 раза, улучшаются реологические свойства теста и качество хлеба (удельный объем на 8,6-12,5 %; формоустойчивость - на 5,4-13,5%; пористость мякиша – на 5-11%); замедляется черствение изделий.

10. Показана перспективность использования иммобилизованного препарата липазы Rhizopus oryzae 1403 для получения жировых продуктов с повышенным содержанием моно- и диацилглицеролов путем этерификации или глицеролиза; найдены рациональные режимы этерификации; установлена возможность регуляции соотношения моно- и диацилглицеролов при глицеролизе изменением баланса «глицерин-ацильные группы» и полярности среды реакции.

11. Разработан способ получения низкокалорийных жиров с помощью ацидолиза растительных масел с каприловой и каприновой кислотами липазой Rhizopus oryzae 1403 в средах без растворителя и в гексане. Оптимизация параметров, влияющих на эффективность ацидолиза в системе без растворителя, позволила повысить включение каприновой кислоты до 60,6 мол. %, то есть до 91, % от теоретически возможного.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации 1. Шеламова, С.А. Биотехнологические основы конверсии триацилглицеролов [Текст] / С.А. Шеламова. – Воронеж: Научная книга, 2008. – 145 с.

2. Шеламова, С. А. Механизмы гидролиза, синтеза и переэтерификации в пищевой биотехнологии [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова. – Изд.полиграф. центр «Научная книга», 2012. – 125 с.

3. Шеламова, С. А. О позиционной специфичности некоторых микробных липаз [Текст] / Г.Д. Федорова, И.М. Арендс, В.В. Дорохов, М.Е. Кончаловская, И. А. Соколова, С. А. Шеламова, Ж. Д. Лебедева, И. М. Волкова // Прикладная биохимия и микробиология. – 1986. – Т. 22, № 5.– С. 630– 4. Шеламова, С. А. Оптимизация процесса ферментативного гидролиза жиров [Текст] / Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Л. П. Пащенко, Ю. С. Сербулов // Биотехнология. – 1988. – Т. 4, № 5. – С. 627– 5. Шеламова, С. А. Биоконверсия животных жиров для целей хлебопекарного производства [Текст] / Л. П. Пащенко, С. А. Шеламова // Хранение и переработка сельхозсырья. – 1998. –№ 4. – С. 24– 6. Шеламова, С. А. Ферментативный гидролиз растительных масел в технологии производства диетических сортов хлеба [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Н. А. Жеребцов // Хлебопечение России. – 1999. – № 3. – С. 26– 7. Шеламова, С. А. Иммобилизация липазы Rh. japonicus 1403 путем ковалентного связывания [Текст] / С. А. Шеламова, Т. А. Ковалева, В. Ф. Селеменев, О. Д. Трофимова, Н. В. Бондарева // Биотехнология, 2001. – № 5. – С. 32– 8. Шеламова, С. А. Исследование особенностей строения активного центра липазы Rh. japonicus [Текст] / Т. А. Ковалева, С. А. Шеламова, О. Д. Трофимова, Н. В. Бондарева // Вестник ВГУ. – 2001. – № 2. – С. 114– 9. Шеламова, С. А. Иммобилизация липазы Rhizopus japonicus на анионите АВ-17-2П модифицированным глутаральдегидным методом [Текст] / Т. А.

Ковалева, С. А. Шеламова, О. Д. Трофимова, Н. В. Бондарева, В. Ф. Селеменев // Сорбционные и хроматографические процессы, 2001. – Т. 1. – Вып. 1. – С.

107– 10. Шеламова, С. А. Технология получения ферментного препарата липазы [Текст] / И. Т. Кретов, С. В. Шахов, С. А. Шеламова, А. Н. Рязанов, Н. В.

Янышева // Вестник Российской академии сельхознаук. – 2002. – № 4. – С. 76– 11. Шеламова, С. А. Исследование влияния модифицированного растительного масла на свойства клейковины [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева, Н. М. Дерканосова, Т. А. Ковалева, О. Д. Трофимова // Вестник Российской академии сельхознаук. – 2002. – № 5. – С. 82– 12. Шеламова, С. А. Выделение экстрацеллюлярной бактериальной инулиназы Bacillus polymyxa 722 и изучение ее физико-химических свойств[Текст] / Н. А. Жеребцов, И. Н. Абрамова, С. А. Шеламова // Биотехнология. – 2002.– № 3. – С. 13– 13. Шеламова, С. А. Биосинтез инулиназ бактериями рода Bacillus [Текст] / Н. А. Жеребцов, И. Н. Абрамова, С. А. Шеламова // Прикладная биохимия и микробиология. - 2002. - Т. 38. - № 6. - С.634– 14. Шеламова, С. А. О целесообразности использования гидролизованного растительного масла в технологии хлебопечения [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Л. П. Бондарева, Н. В. Янышева // Хранение и переработка сельхозсырья.- 2005. – № 6. – С. – 46– 15. Шеламова, С. А. Адсорбция липазы на гидрофобном носителе [Текст] / С. А. Шеламова, В. Ф. Селеменев, И. А. Крылов, Н. В. Янышева, А. И. Ситников // Биотехнология. – 2007. – № 3. – С. 52– 16. Шеламова, С. А. Идентификация гистидина в активном центре Липазы I Rhizopus oryzae 1403 [Текст] / Ю.А.Тырсин, С. А. Шеламова // Вестник Государственного Оренбургского университета. – 2009. – № 6. – С. 374– 17. Шеламова, С. А. Некоторые каталитические свойства Липазы I Rhizopus oryzae 1403 [Текст] / С. А. Шеламова, Ю. А. Тырсин // Вестник Государственного Оренбургского университета. – 2009. – № 6. – С. 434– 18. Шеламова, С. А. Определение положения включения кислоты в триацилглицеролы при ферментативном ацидолизе [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А.

Шеламова, Н. М. Дерканосова // Товаровед продовольственных товаров. – 2010.

– № 2. – C. 24– 19. Шеламова, С. А. Использование жировых гидролизатов для сдобных изделий [Текст] / Л. П. Пащенко, Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Т. В. Санина, В. В. Носовец, Г. Ф. Иванова // Известия вузов. Пищевая технология. – 1986.

– № 5 (Деп. в АгроНИИТЭИПП, № 1346-пщ) 20. Шеламова, С. А. Выделение и очистка липазы Rh. japonicus [Текст] / С. А. Шеламова, И. М. Арендс, Э. А. Шишкова // Материалы III Всесоюзн. конф. «Биосинтез ферментов микроорганизмов». – Кобулети, 1986. – С. 21. Шеламова, С. А. Способ приготовления теста для сдобных изделий [Текст] / С. А. Шеламова, Л. П. Пащенко, Н. А. Жеребцов, Е. Ю. Малютина // Деп. в ЦНИИТЭИхлебопродуктов, 1987. – № 742-хб 22. Шеламова, С. А. Модификация жидкой окислительной фазы в технологии приготовления сдобных изделий [Текст] / Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Л. П. Пащенко, В. Ф. Каримова // ВИНИТИ. – 1987. – № 10 (Деп. в ЦНИИТЭИМинхлебопродуктов, № 800-хб87) 23. Шеламова, С. А. Исследование условий применения препарата липазы из гриба Rh. oryzae в меховой промышленности [Текст] / В. Ю. Пружанская, Л.

А. Комисарова, Т. П. Назарова, Е. Г. Стрельникова, С. А. Шеламова, Е. Н.

Орешкин // ВИНИТИ, 1987. – № 6 (Деп. в ВНИИ меховой пром-сти, № 1939лп87) 24. Шеламова, С. А. Изучение свойств липазы из Rh. oryzae [Текст] / В.

Ю. Пружанская, И. М. Грачева, С. А. Шеламова // Тез. докл. Всесоюзн. науч.

конф. «Разработка и совершенствование технологических процессов, машин и оборудования для производства, хранения и транспортировки продуктов питания», г. Москва, 26–28 мая 1987. – М., 1987. – С. 25. Шеламова, С. А. Использование мультиэнзимных композиций в хлебопечении [Текст] / С. А. Шеламова, В. С. Григоров // Межвузовский сборник научных трудов (ДСП). – М.: МТИПП, 1987. – С. 26. Шеламова, С. А. Использование гидролизованного жира при производстве хлебобулочных изделий [Текст] / Л. П. Пащенко, Н. А. Жеребцов, С. А.

Шеламова, В. В. Носовец, Г. Ф. Иванова // Информ. сборник «Передовой и производственный опыт и науч.-техн. достижения, рекомендуемые для внедрения. – М., 1989.- Вып. 3. – С. 35– 27. Шеламова, С. А. Очистка и свойства липазы из Rh. japonicus [Текст] / Н. А. Жеребцов, С. А. Шеламова, Э. А. Шишкова, И. А. Новикова, И.

М. Арендс, В. Ю. Пружанская // Сб. статей «Ферменты микроорганизмов».- М.:

ВНИИСЭНТИ, 1989. – Ч. 1.- С. 120–128.

28. Шеламова, С. А. Жировые гидролизаты как факторы интенсификации процесса брожения и улучшения физических свойств теста при производстве сдобных изделий [Текст] / С. А. Шеламова, Н. А. Жеребцов, Л. П. Пащенко, Ю.

И. Попрыгина // ВИНИТИ, 1989. – № 2 (Деп. в ЦНИИТЭИхлебопродуктов, № 966-хб88) 29. Шеламова, С. А. Практическое использование липазы [Текст] / С. А.

Шеламова, Н. А. Жеребцов, В. С. Григоров, Л. П. Пащенко // Материалы Всесоюзн. науч.-практ. конф. «Ферменты – народному хозяйству». – Черновцы, 1990. – С. 30. Шеламова, С. А. О субстратной специфичности липазы Rh. japonicus 1403 [Текст] / С. А. Шеламова, Н. А. Жеребцов // Деп. в НПО Медбиоэкономика. – 1991. – № 549-мб 31. Шеламова, С. А. Применение биохимической обработки дополнительного сырья в производстве сдобных изделий [Текст] / С. А. Шеламова, Н.

А. Жеребцов, В. С. Григоров, Л. Ф. Забелина // Деп. в АгроНИИТЭИПП. – 1991.

– № 32. Шеламова, С. А. Гидролиз подсолнечного масла [Текст] / С. А. Шеламова, Л. В. Спивакова, Л. Г. Кириллова // Материалы Первой конф. СевероКавказского региона «Современные достижения в биотехнологии». – Ставрополь, 1995. –С. 72– 33. Шеламова, С. А. Ингибиторы и активаторы липазы Rh. japonicus [Текст] / С. А. Шеламова // Вестник ВГТА. – 1998. – Вып. 2. – С. 32– 34. Шеламова, С. А. Действие ферментированного растительного масла на адгезионные свойства теста [Текст] / С. А. Шеламова, В. А. Дятлов, Н. М.

Дерканосова, А. Н. Рязанов // Сб. науч. трудов «Модернизация существующего и разработка новых видов оборудования для пищевой промышленности». – Воронеж, 1998. – Вып. 8. – С. 75– 35. Шеламова, С. А. Влияние различных видов гидролизованных масел на качество полуфабрикатов и готовых изделий [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М.

Дерканосова // Деп. в ВИНИТИ. – 1998. – № 3298-В 36. Shelamova, S. А. Hydrolytic enzymes of typical chernozem microscopic fungi [Техт] / S. А. Shelamova, I. D. Svistova, T. I. Agutova // Ecological Congress.

– 1999. –V. 3, № 1. – P. 51– 37. Шеламова, С. А. Ультрафильтрация в процессе получения ферментного препарата липоксигеназы [Текст] / С. А. Шеламова, А. Н. Рязанов, Н. Н. Козырева, Н. В. Бондарева // Сб. науч. трудов «Модернизация существующего и разработка новых видов оборудования для пищевой промышленности». – Воронеж, 1999. – Вып. 9. – С. 51– 38. Шеламова, С. А. Совершенствование технологии приготовления хлеба с добавлением растительного масла [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова // Тез. докл. межрегион. науч. конф. «Продовольственная безопасность России. Качество продуктов питания-99». – Воронеж, 1999. – С. 127– 39. Шеламова, С. А. Биоконверсия растительных масел в производстве массовых и диетических сортов хлеба [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Н. В. Бондарева // Тез. докл. Междунар. науч. конф. «Прогрессивные пищевые технологии – третьему тысячелетию», Краснодар, 19-22 сент. 2000 г., Краснодар.- 2000.- С. 40. Шеламова, С. А. Исследование физико-химических и кинетических характеристик свободной и иммобилизованной липазы из Rh. japonicus [Текст] / Т. А. Ковалева, С. А. Шеламова, О. Д. Трофимова, Н. В. Бондарева // Труды IY междунар. симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и пути их использования», Москва-Пущино, 20-24 июня 2001 г., М.: Изд-во Росс. ун-та дружбы народов, 2001.- Т. 3.-С. 493- 41. Шеламова, С. А. К вопросу о влиянии липидов на жизнедеятельность дрожжей [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Н. В. Янышева // Материалы междунар. науч. конф. «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий», Саранск, 12-15 сент. 2001 г.- Саранск, 2001. – С. 42. Шеламова, С. А. Ферментативная модификация жировых продуктов и ее практическое использование [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева, Т. А.

Ковалева, О. Д. Трофимова // Тез. докл. междунар. конф. мол. ученых «От фундаментальной науки – к новым технологиям», Москва-Тверь, 25-28 сент. г.- Тверь, 2001. – С. 43. Шеламова, С. А. Исследование физико-химических и кинетических характеристик реакции гидролиза триацилглицеролов свободной и иммобилизованной липазой [Текст] / Т. А. Ковалева, С. А. Шеламова, О. Д. Трофимова, Н. В. Бондарева // ХYIII Съезд физиологического общества им. И.П. Павлова:

Тез. докл.- Казань, 2001.- С. 44. Шеламова, С. А. Функциональность жировых продуктов в хлебопечении [Текст] / С. А. Шеламова, Т. А. Ковалева, Н. В. Янышева, О. Д. Трофимова // Материалы междунар. науч.-практ. конф. «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров и услуг», Орел, 18-21 дек. 2001. – Орел, 2001.- Т. 1. – С.

45. Шеламова, С. А. Масла как регуляторы свойств клейковины [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Т. А. Ковалева, Н. В. Янышева, О. Д. Трофимова // Сборник докладов юбил. науч.-практ. конф. «Пищевые продукты ХХI века». – М., 2001. – Т. 1.- С. 46. Шеламова, С. А. Хроматографический анализ свободных жирных кислот при гидролизе масла [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева, В. Ф. Селеменев, Т. А. Ковалева, О. Д. Трофимова // Сб. тез. Всерос. симп. «Современные проблемы хроматографии». – М., 2002. – С. 47. Шеламова, С. А. К вопросу о роли биомодификации масла в технологии хлебопечения [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Н. В. Янышева // Материалы 2-ой Всеросс. науч.-техн. конф. «Современные достижения биотехнологии», Ставрополь, 12-13 сент. 2002.- Ставрополь, 2002.- Т. 2.- С. 175– 48. Шеламова, С. А. Биоконверсия растительных масел в технологии приготовления диетических сортов хлеба [Текст] / С. А. Шеламова, Н. М. Дерканосова, Н. В. Янышева // Сб. докл. 6-ой Междунар. науч. конф. памяти В.М. Горбатова «Биотехнологические процессы переработки сельскохозяйственного сырья», М., 5–6 дек. 2002 г. – М., 2002. – С. 60– 49. Шеламова, С. А. Влияние гидролизованных масел на некоторые функции дрожжевых клеток [Текст] / Н. М. Дерканосова, С. А. Шеламова, Н. В.

Янышева // Сб. науч. трудов «Производство продуктов питания из растительного сырья: свершения и надежды». – Воронеж, 2002. – С. 50. Шеламова, С. А. Управление процессом вакуум-сублимационного обезвоживания во вспененном состоянии ферментного препарата липазы Rh.

japonicus 1403 [Текст] / А. А. Шевцов, С. А. Шеламова, А. Н. Рязанов, А. В. Санин // Там же. – С. 51. Шеламова, С. А. Модификация глутаральдегидного метода при иммобилизации липазы из Rhizopus japonicus 1403 на ионообменных смолах [Текст] / Т. А. Ковалева, В. Г. Артюхов, О. Д. Трофимова, С. А. Шеламова, Н. В. Янышева // Международный форум «Аналитика и аналитики»: Каталог рефератов и статей, Т. II, Воронеж, Россия, 2–6 июня 2003 г. – С. 52. Шеламова, С. А. Непрерывный ферментативный гидролиз растительного масла [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева // Материалы II Междунар.

науч.-техн. конф., посв. 100-летию засл. деят. науки техники РСФСР, проф. Попова В.И. «Прогрессивные технологии и оборудование для пищевой промышленности», Воронеж,22-24 сентября 2004 г.- Воронеж, 2004.- Ч. I.- С. 237– 53. Шеламова, С. А. Ковалентная и адсорбционная иммобилизация липазы Rhizopus japonicus 1403 [Текст] / С. А. Шеламова, В. Ф. Селеменев, Н. В.

Янышева // Всеросс. симпозиум «Биотехнология микробов». – М.: МАКС Пресс, 2004. – С. 54. Шеламова, С. А. Влияние низких температур на активность ферментного препарата липазы [Текст] / Н. В. Янышева, С. А. Шеламова, А. Н. Рязанов // Материалы V Науч.-практ. конф. «Совершенствование техники, технологии и методов управления на предприятий пищ. и перераб. пром-сти», Воронеж, 26– 27 апреля 2005. – Воронеж. – 2005. – С. 23– 55. Шеламова, С.А. Технология модификации растительного масла для хлебопечения [Текст] /С.А. Шеламова, Н.В. Янышева // Всеросс. науч.-практ.

конф. с междунар. участием «Пищ. пром-сть: интеграция науки, образования и производства», Краснодар, 26–28 мая 2005 г.- Краснодар.- 2005.- С. 56. Шеламова, С. А. Липолитический фермент для хлебопекарной и кондитерской промышленности [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева, Н. М.

Дерканосова // Тезисы докл. V Междунар. науч.-техн. конф. «Техника и технология пищевых производств», Могилев, 18–20 мая 2005 г.,.- Минск: Издат.

центр БГУ. – 2005. – С. 57. Шеламова, С. А. Специфичность Липазы I Rhizopus oryzae 1403 к жирным кислотам [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева, Н. М. Дерканосова // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран содружества», Минск – Нарочь, Республика Беларусь, 25-28 мая 2005 г.- Минск:

РИВШ.- 2005.- С. 58. Шеламова, С. А. Роль гистидина в действии Липазы I Rhizopus oryzae 1403 [Текст] / С. А. Шеламова, Н. В. Янышева, Т. И. Хоменко // Сборник тез.

докл. Общеросс. конф. мол. ученых с междунар. участием «Пищ. технологии», Казанский гос. технол. ун-т, 30 мая 2006 г. – Казань. – 2006. – С. 59. Шеламова, С. А. Эффективность ферментативного ацидолиза различных растительных масел [Текст] / С. А. Шеламова, Ю. А. Тырсин // Материалы III Междунар. науч.-техн. конф. «Инновационные технологии и оборудование для пищ. промышленности (приоритеты развития)», посвящ. 80-летию ГОУВПО «Воронеж. гос. технол. академия», Воронеж, 22-24 сент. 2009 г. – Воронеж, 2009. – Т. 2. – С. 60. Шеламова, С. А. Ферментативный способ улучшения качества хлебобулочных изделий [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова // Сб. материалов первой междунар. науч.-практ. конф. «Идентификация фальсифицированных пищевых продуктов. Контроль содержания и безопасности наночастиц в продукции сельского хозяйства и пищевых продуктах», Москва, 28-29 октября 2009 г. – М.: МГУПП-МЕДИА, 2009. – С. 146- 61. Шеламова, С. А. Липазы и липоксигеназы в хлебопекарной промышленности [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова // Материалы XI Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, ноября-2 декабря 2009 г. – М., 2009. – С. 62. Шеламова, С.А. Регулируемая энзиматическая трансэтерификация жиров для пищевой промышленности [Текст] /Ю.А. Тырсин, С.А. Шеламова //Материалы XI Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 30 ноября-2 декабря 2009 г. – М., 2009. – С. 63. Шеламова, С. А. Ферментативный способ получения низкокалорийных жиров [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова // Материалы XI Всероссийского конгресса диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье», Москва, 30 ноября-2 декабря 2009 г. – М., 2009. – С. 64. Шеламова, С. А. Методы определения позиционной специфичности липазы [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова // Материалы межрегион.

науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы потребительского рынка товаров и услуг», Киров, 25 декабря 2009 г. – Киров, 2009. – С. 65. Шеламова, С. А. Анализ продуктов ферментативного гидролиза и синтеза триацилглицеролов [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова, Н. М.

Дерканосова // Материалы V междунар. науч.-практ. конф. «Потребительский рынок: качество и безопасность товаров», Орел, 2010 г. – Орел, 2010. – С. 66. Шеламова, С. А. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии в исследовании ферментативной трансэтерификации ацилглицеринов [Текст] / С. А. Шеламова, Ю. А. Тырсин, Н.А. Шеламова // Материалы Всеросс.

науч.-практ. конф. с междунар. участием «Актуальные проблемы потребительского рынка товаров и услуг», Киров, 18 февраля 2011 г. – Киров, 2011. – С. 67. Шеламова, С. А. Кинетика ферментативного гидролиза триацилглицеролов [Текст] / Ю. А. Тырсин, С. А. Шеламова // Mezinrodn vdecko-practic konference «Zprvy vdek ideje-2011» Praha, 27.10–5.11. 2011 г. – Praha: