На правах рукописи

БУРДЕННЫЙ АЛЕКСЕЙ МИХАЙЛОВИЧ

РОЛЬ ГЕНЕТИЧЕСКИХ И ЭПИГЕНЕТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ В

РАЗВИТИИ РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ И

НЕМЕЛКОКЛЕТОЧНОГО РАКА ЛЁГКОГО.

03.01.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва – 2013 1

Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» (ФГУП «ГосНИИ генетика»)

Научный руководитель:

Кандидат биологических наук, ФГУП «ГосНИИ генетика», г. Москва Логинов Виталий Игоревич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, доцент ФГБУ «МГНЦ» РАМН Стрельников Владимир Викторович Кандидат биологических наук, доцент МБФ ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И.Пирогова Кулакова Ольга Георгиевна

Ведущая организация: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН

Защита состоится « » 2013 года в 14.00 часов на заседании Диссертационного совета при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545, Москва, 1й Дорожный проезд, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИ генетика».

Реферат разослан « » 2013 г.

Учный секретарь Диссертационного совета, Кандидат химических наук, доцент Т.Л. Воюшина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние десятилетия частота онкологических заболеваний неуклонно растет. Ежегодно более 10 млн. человек во всем мире заболевают раком и около 6 млн. человек умирают от рака ежегодно, что составляет 12% от умерших во всем мире. Только 5-10% случаев рака являются наследственными, а остальные случаи рака являются результатом генетических и эпигенетических повреждений, возникающих в течение жизни в соматических клетках. Повреждения могут происходить либо вследствие воздействия внешних факторов (курения, радиации, алкоголя), либо внутренних (гормоны, иммунная система).

В структуре онкологической заболеваемости на рак легкого, в том числе и немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ), приходится около 13% и показатели 5летней выживаемости очень плохие, даже в странах с высоким уровнем здравоохранения они составляют всего 15% (Jemal et al., 2010). В России ежегодно от НМРЛ погибает около 60000 человек, что составляет более 20% всех умерших от злокачественных опухолей. Считается, что причиной этих новообразований является курение (Имянитов, 2006).

В развитых странах рак молочной железы (РМЖ) выявляется у каждой десятой женщины, смертность при этом доходит до 40%. В отличие от рака легкого, для рака молочной железы не удалось убедительно выявить факторы риска окружающей среды. Предполагается, что в этом случае на первый план выходят факторы, участвующие в поддержании геномной стабильности (Imyanitov et al., 2004).

Согласно современным представлениям, важную роль в процессе канцерогенеза играют не только генетические факторы, определяющие индивидуальные различия ферментных систем (Ревазова и др, 2006), но и эпигенетические факторы – метилирование промоторных районов генов (Ходырев и др., 2011). Изменение статуса метилирования промоторных районов генов является характерной чертой опухолевых клеток, причем аномальное метилирование наблюдается уже на ранних этапах канцерогенеза. Изменения в уровне метилирования промоторных районов генов MGMT и RASSF1A показаны для рака молочной железы, легкого и опухолей других локализаций.

Генетические и эпигенетические факторы предрасположенности к развитию онкологических заболеваний связаны с несколькими уровнями системы клеточной защиты. К первому уровню можно отнести гены биотрансформации ксенобиотиков, главным образом, гены глутатион-S-трансфераз T1, M1, P1 (GSTT1, GSTM1, GSTP1) (Мартов и др., 2010; Корчагина и др., 2011). Следующий уровень клеточной защиты связан с механизмами прямой репарации повреждения ДНК и на этом уровне важным геном является О(6)-метилгуанин-ДНК-метилтрансфераза (MGMT) (Степанов и др., 2010; Пономарева и др., 2011). Третий уровень связан с генами, осуществляющими контроль за пролиферацией и дифференцировкой клеток, к ним относятся ген TP53 со своим регуляторным геном MDM2 (Желтухин и др., 2010), а также ген-супрессор опухолевого роста RASSF1A.

В данном исследовании сделана попытка объединить два аспекта в изучении проблемы повреждения генома человека - нарушение статуса метилирования генов RASSF1A и MGMT и генетический полиморфизм систем клеточного контроля и детоксикации ксенобиотиков, применительно к генам, кодирующим ключевые ферменты этих систем - GSTT1, GSTM1, GSTP1, TP53 и MDM2. При этом, чтобы подчеркнуть универсальность участия данных ферментов в онкологических процессах, были выбраны две принципиально различные по механизмам развития онкопатологии – немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы.

Цель исследования: Изучить вклад метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT, а также полиморфных маркеров генов GSTP1, GSTT1, GSTM1, TP53 и MDM2 в патогенез немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.

';

Задачи исследования:

1. Оценить распределение генотипов полиморфных маркеров генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1, GSTP1) и генов контроля пролиферации клеточного цикла и апоптоза (TP53, MDM2) у больных злокачественными новообразованиями разных локализаций (немелкоклеточный рак легкого и рак молочной железы).

2. Провести сравнительный анализ комбинаций генотипов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, TP53, MDM2 у всех обследованных больных и выявить специфичные сочетания, предрасполагающие к развитию немелкоклеточного рака легкого и рака молочной железы.

3. Определить профили метилирования промоторных областей генов RASSF1A, MGMT в эпителиальных опухолях молочной железы и легкого. Выявить возможные корреляции между уровнем метилирования этих генов и прогрессией опухоли.

4. Подобрать информативные системы маркеров, оптимальные для выявления данных видов опухолей.

Научная новизна: В настоящей работе впервые проведено комплексное исследование ассоциации генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, репарации ДНК и регуляции клеточного цикла и апоптоза с патогенезом онкологических заболеваний различных локализаций и выявлена связь неблагоприятных сочетаний генотипов с риском развития опухоли определенной локализации, ее клинико-гистологическими особенностями. Также впервые получены данные об уровне ассоциации комбинаций генотипов генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков и гена белка-онкосупрессора р53 с развитием злокачественных новообразований. Получены новые данные об ассоциации глутатион-S-трансфераз и генов ТР53 и MDM2 с патогенезом НМРЛ и РМЖ. Впервые выявлена ассоциация предрасполагающих генотипов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, ТР53 и MDM2 и их сочетания с гистологичесим типом опухоли. Впервые получены данные об ассоциации сочетанных предрасполагающих генотипов генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, ТР53, RASSF1A и MGMT с патогенезом РМЖ. Впервые обосновано, что суммарное влияние функционально неполноценных вариантов генов глутатион-Sтрансфераз Т1, М1, Р1 и предрасполагающих генотипов генов ТР53 и MDM превышает эффект индивидуальных генотипов. Проведен анализ молекулярногенетических нарушений, определяющих различия молекулярного патогенеза НМРЛ и РМЖ.

проведенного исследования данные фундаментального характера об ассоциации полиморфных маркеров генов, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков (GSTT1, GSTM1, GSTP1), и генов, участвующих в регуляции клеточного цикла и апоптоза (ТР53 и MDM2), а также анализ сочетанных предрасполагающих генотипов этих генов в эпителиальных опухолях, существенно расширяют имеющиеся представления о молекулярно-генетических механизмах возникновения и развития злокачественных новообразований.

Установление роли исследованных генов в развитии злокачественных опухолей обосновывает возможность рекомендовать определение этих показателей в качестве диагностических параметров для выявления групп повышенного онкологического риска. Результаты исследования могут быть положены в основу разработки новых патогенетически оправданных подходов к профилактике и ранней диагностике онкологических заболеваний, а также прогнозированию клинического течения злокачественных опухолей.

Апробация работы. Аппробация диссертационной работы состоялась на заседании Секции молекулярной биологии Учного совета ФГУП «ГосНИИгенетика»

22 мая 2013 года. Результаты настоящей работы были представлены на конференциях: «4th International Conference for Young Scientists 2011 “Molecular biology: advances and prospectives”» (Ukraine, Kiev, 2011), «Актуальные проблемы онкогенетики» (Москва, 2011), XV Российский онкологический конгресс (Москва, 2011), «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (Томск, 2012), «Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине» (Казань, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень рецензируемых научных журналов и изданий рекомендованных ВАК Минобрнауки для опубликования основных научных результатов диссертации, 7 материалов конференций и конгрессов, 1 статья в зарубежном сборнике.

Структура и объём диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы), описания результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего источников. Диссертация иллюстрирована 13 таблицами и 25 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Выборка образцов.

Образцы опухолевой и прилежащей гистологически нормальной ткани, а также крови собраны и клинически охарактеризованы в РОНЦ РАМН. Использовали кровь и ткани только тех больных, которые до операции не получали химио- или лучевую терапию. Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными заболеваниями, наследственными и психическими болезнями. Все случаи НМРЛ и РМЖ классифицированы клинически по системе TNM в соответствии с требованиями Международного противоракового общества (UICC, версия 7, 2009 г. (Sobin et al., 2009)) и типированы гистологически в отделе патоморфологии опухолей НИИ клинической онкологии ГУ РОНЦ РАМН.

Выборка парных тканевых образцов включала образцы немелкоклеточного рака легкого 49 случаев (в т.ч. плоскоклеточный рак легкого – 29 случаев и аденокарциному легкого – 20 случаев) и 58 образцов рака молочной железы (преимущественно «протоковой» гистологии, ипРМЖ). Выборка образцов ДНК, выделенная из периферической крови, включала образцы немелкоклеточного рака легкого – 88 случаев (плоскоклеточный рак –59 случаев, аденокарцинома – случаев) и образцы рака молочной железы – 140 случаев (в т.ч. инфильтративный протоковый – 105 случаев, инфильтративный дольковый – 35 случаев). В качестве популяционного контроля использовали сопоставимую по возрасту и полу выборку онкологически здоровых индивидов (n=240). Также были использованы 10 образцов ткани легкого и 10 образцов ткани молочной железы от постмортальных лиц без патологоанатомическом отделе НИИ Скорой Помощи им. Склифосовского. Далее постмортальные лица без онкопатологии в анамнезе будут обозначены как доноры.

Методы исследования Выделение геномной ДНК осуществляли по стандартному протоколу (Sambrook et al., 1989). Для анализа полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTM1, GSTP1, TP и MDM2 использовали метод ПЦР-ПДРФ. Анализ метилирования промоторных районов генов RASSF1A и MGMT проводили с помощью бисульфитной конверсии ДНК с последующей метил-специфичной ПЦР. Наличие участка метилирования определяли по присутствию на электрофореграмме участков, длиной 169 п.н. для гена RASSF1A и 81 п.н. для гена MGMT, контролем амплификации служило обязательное наличие на электрофореграмме фрагмента ДНК такой же длины, соответствующее неметилированной области гена.

Для статистической обработки данных использовался пакет программ STATISTICA® 6.0. Для сравнения частот метилирования нами использовался точный критерий Фишера. Достоверными считали различия при p0.05. При сравнении частот генотипов использовался стандартный критерий 2 Пирсона.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Ассоциация полиморфных маркеров генов биотрансформации с риском развития НМРЛ и РМЖ. Связь с клинико-гистологическими параметрами опухоли.

глутатион-S-трансферазы (GSTs). Наиболее значимыми генами в своих классах с точки зрения генетических и биомедицинских исследований являются гены GSTM1, GSTT1 и GSTP1 (Nebert and Vasiliou, 2004). У носителей “нулевых генотипов” (-/-) генов GSTM1 и GSTT1, синтез соответствующих ферментов полностью отсутствует (Rotunno et al., 2012). У носителей аллеля Val полиморфного маркера Ile105Val гена GSTP1 имеет место снижение концентрации фермента в клетках.

Частоты генотипов полиморфных маркеров генов GSTT1, GSTM1 и GSTР1 в обследованных группах больных НМРЛ и РМЖ представлены в табл. 1. Частота нулевого (–/–) генотипа гена GSTT1 в исследованных группах больных НМРЛ и его гистологических подтипах – АК и ПРЛ была достоверно выше, чем в контрольной группе в 2,5 (2 = 14,18), 3,2 (2 = 15,71) и 2,3 раза (2 = 9,65), соответственно (рис. 1А).

Полученные нами данные согласуются с данными других авторов (Timofeeva et al., 2010; Dzian et al., 2012). Для рака молочной железы и его инфильтративнопротоковой формы (ипРМЖ) было выявлено увеличение частоты нулевого генотипа гена GSTT1 в 1,5 раза (2 = 6,39 и 2 = 7,22, соответственно) по сравнению с аналогичным показателем у здоровых лиц (рис. 1А). В популяционных исследованиях зарубежных ученых отмечена ассоциация этого гена только с развитием рака молочной железы (Naushad et al., 2011, Ramalhinho et al., 2011).

Таким образом, проведенные нами исследования делеционного полиморфного маркера гена GSTT1 свидетельствуют, что наличие генотипа (–/–) гена GSTT является фактором риска рака для всех изученных нами опухолей.

Распределение частот генотипов полиморфных маркеров генов биотрансформации – GSTT1, GSTM1 и GSTP1, а также полиморфных маркеров генов апоптоза – TP53 и MDM2 среди больных НМРЛ и РМЖ, их гистологических