На правах рукописи

НЕХАЕВА

Татьяна Леонидовна

ОПТИМИЗАЦИЯ ТЕХНОЛОГИИ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ ПОЛУЧЕНИЯ

ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ ВАКЦИН НА ОСНОВЕ АУТОЛОГИЧНЫХ ДЕНДРИТНЫХ

КЛЕТОК

специальность – 14.01.12 – онкология – 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2014 г.

Работа выполнена в федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательском институте онкологии им. Н.Н. Петрова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Научный руководитель:

Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отдела терапевтической онкологии ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России Балдуева Ирина Александровна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник отделения биотерапии опухолей ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН Михайлова Ирина Николаевна Доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией общей иммунологии отдела иммунологии ФГБУ «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины»

Северо-западного отделения РАМН Назаров Петр Григорьевич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится « 24 » июня 2014 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 208.052.01 при ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России по адресу:

197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул. Ленинградская, 68; тел.: (812)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н.Петрова» Минздрава России по адресу: 197758, Санкт-Петербург, пос. Песочный, ул.

Ленинградская, 68 и на сайте http://www.niioncologii.ru/sites/default/files/files/20142104221008.pdf

Автореферат разослан «»_ 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного совета:

доктор медицинских наук Бахидзе Елена Вилльевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Поиск новых возможностей лечения больных с распространенным опухолевым процессом является актуальной задачей современной онкологии.

Высокий уровень смертности, недостаточная эффективность лекарственного лечения, прорыв в понимании молекулярно-генетических и иммунобиологических механизмов развития рака, становятся основополагающими факторами развития фундаментальной и клинической онкологии (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009).

На современном этапе развития науки не представляет сомнений факт участия дендритных клеток (ДК) в «высокопрофессиональной» презентации низкоиммуногенных опухолеассоциированных антигенов (ОАА) (Михайлова И.Н. и соавт., 2007; Murphy J.F., 2010;

Morel P.A., Turner M.S., 2010). ДК являются объектом широкого круга исследований, основная цель которых – создание клеточных вакцин, способных корректировать иммунный ответ у больных со злокачественными новообразованиями (Барышников А.Ю. и соавт., 2009; Кадагидзе З.Г. и соавт., 2011; Ridgway D., 2003; Mackiewicz J., Mackiewicz A., 2009; Palucka K. et al., 2010;

Castiello L. et al., 2011; Tuyaerts S., 2011). Разработка отечественных инновационных вакцин на основе аутологичных ДК (ДК-вакцина), обладающих эффективностью, безопасностью и надлежащим уровнем качества, отвечают задачам стратегической импортзамещающей программы Правительства РФ. Получение вакцинных ДК из миелоидных предшественников in vitro с использованием различных питательных сред, ростовых факторов и факторов дифференцировки различной активности, выбор которых для каждой лекарственной формы ДК (зрелые, незрелые) основан на оценке иммунобиологических и технологических характеристик, изучении их влияния на эффективность, безопасность и стабильность лекарственной формы, в ряде случаев препятствует получению стандартного клеточного продукта (Балдуева И.А., 2008; Toh H.C. et al., 2009; Koido S. et al., 2011; Ning J. et al., 2011).

Обеспечение качества отечественных аутологичных ДК-вакцин предполагает стандартизацию и контроль на основе использования рекомендованных методик, а также испытаний, отвечающих требованиям гармонизации и унификации. Сочетание новых мощных инструментов иммуномониторирования с усовершенствованием протоколов ДК вакцинации и рационально выстроенные фундаментальные научные исследования обеспечат больше доверия к противоопухолевой вакцинотерапии и откроют новые возможности лечения онкологических больных (Демидов Л.В., Харкевич Г.Ю., 2003).

Цель исследования - внедрение в клиническую практику стандартизированных методов получения вакцин на основе аутологичных костномозговых и периферических ДК для лечения больных меланомой кожи.

Задачи исследования 1. Апробировать и оптимизировать получение миелоидных предшественников ДК из лейкаферезного материала и периферической крови.

2. Стандартизировать условия дифференцировки, нагрузки и активации аутологичных ДК на основе изучения иммунофенотипа незрелых и зрелых ДК и уровня экспрессии раковотестикулярных антигенов (РТА) на опухолевых клеточных линиях, используемых для специфического созревания ДК.

3. Оценить стабильность иммунобиологических характеристик стандартизированных ДКвакцин на основе незрелых костномозговых и зрелых периферических ДК в процессе криоконсервации и хранения.

4. Изучить иммунологическую и клиническую эффективность стандартизированных ДКвакцин.

Научная новизна. В диссертационной работе впервые:

стандартизированы методы получения ДК-вакцин на основе аутологичных костномозговых и периферических предшественников;

проведена оценка поствакцинального клеточного и гуморального иммунного ответа у больных диссеминированной меланомой кожи;

разработана оригинальная методика активной специфической иммунотерапии «Способ иммунотерапии костномозговыми предшественниками дендритных клеток, сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками in vivo, больных диссеминированными солидными опухолями» (Патент на изобретение №237603, приоритет изобретения 17.04.2008 г., дата выдачи патента — 20.12.2009 г.).

Обоснована целесообразность использования стандартизированных ДК-вакцин для лечения больных меланомой кожи.

Снижена себестоимость получения ДК-вакцин в 5 раз за счет оптимизированного использования ростовых факторов GM-CSF и IL-4 как импортного, так и отечественного производства.

Адаптированы, оптимизированы и внедрены в клинико-лабораторную практику ELISpotанализ и клеточный ИФА.

Описаны стандартные операционные процедуры (СОП) для всех этапов получения ДК Внедрены в клиническую практику стандартизированные методы получения вакцин на основе аутологичных ДК (Медицинская технология ФС№2010/390 26.10. «Иммунотерапия костномозговыми предшественниками дендритных клеток, сенсибилизированных фотомодифицированными опухолевыми клетками in vivo, больных с диссеминированными солидными опухолями»).

1. В результате оптимизации процесса дифференцировки ДК in vitro установлено: применение ростового фактора GM-CSF (72 нг/мл) отечественного производства (Фармсинтез, Россия) и GM-CSF (72 нг/мл) импортного производства (CellGenix, Германия) обеспечивает получение сопоставимых результатов и приводит к снижению стоимости ДК-вакцин в 5 раз.

2. Оптимальная концентрация IL-4 для дифференцировки ДК находится в пределах от 5 до нг/мл, что снижает стоимость производства ДК-вакцин в 3-5 раз.

3. Для получения стандартизированных ДК-вакцин рекомендуется использовать оптимизированную панель моноклональных антител: CD14, CD1а, CD83, CD86, CD80, CCR7, HLA DR, метод проточной цитометрии или иммуноцитохимическое окрашивание, что позволит корректно определить степень зрелости ДК.

4. Критерием контроля качества вакцинных ДК является: жизнеспособность, иммунофенотип незрелых и зрелых опухолеспецифических ДК, высокая функциональная активность, отсутствие в вакцине ксеногенной сыворотки и инфекционных агентов на всех этапах дифференцировки, криоконсервации, размораживания и готовой лекарственной формы аутологичной ДК-вакцины.

Апробация материалов диссертации. Основные результаты работы обсуждены на научной конференции отделения химиотерапии и инновационных технологий ФГБУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова» Минздрава России совместно с кафедрой клинической лабораторной диагностики Северо-Западного государственного медицинского университета им.

И.И. Мечникова (2010). Результаты работы были представлены на конкурсе молодых ученых «У.М.Н.И.К.» (Санкт-Петербург, 2010), Х Всероссийской научной конференции с международным участием (Москва, 2011), IV Всероссийском научном Форуме с международным участием им. акад. В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт- Петербург, 2011), научном обществе онкологов Санкт-Петербурга и Ленинградской области (2012), конференции «Петровские чтения» (Санкт-Петербург, 2012), конференции «Дендритные клетки и их роль в норме и патологии» в рамках Объединенного иммунологического форума (Нижний Новгород, 2013), VIII Всероссийском съезде онкологов (Санкт- Петербург, 2013), 8 Съезде по меланоме (Гамбург, Германия, 2013), ASCO (Чикаго, США, 2012, 2013), ежегодном собрании Французского общества иммунологов (Париж, Франция, 2013).

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложений. Текст изложен на 173 страницах машинописного текста, содержит 28 таблиц и рисунков. Список литературы включает 21 источник отечественных и 164 источника зарубежных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования. Работа выполнена в ФГБУ «НИИ онкологии им.

Н.Н. Петрова» Минздрава России. Исследование проводилось в период с 2008 по 2013 г. В соответствии с задачами исследования работа была разделена на 2 части: лабораторная и клиническая.

В исследование включено 42 больных меланомой кожи (9 больных меланомой кожи III стадии и 33 больных – IV стадии). Объектами исследования согласно этапам получения ДКвакцин (рис. 1) были образцы биологического материала: 1) мононуклеары (МНК) периферической крови (146 образцов); 2) МНК лейкаферезного материала (18 образцов); 3) незрелые костномозговые ДК (134 образца); 4) незрелые ДК периферической крови ( образцов); 5) образцы аутологичной опухоли; 6) аллогенные клеточные линии меланомы кожи человека, Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel 520, полученные в лаборатории клеточных технологий НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова, депонированные во Всероссийской Коллекции клеточных культур позвоночных (НИИ цитологии РАН); 6) зрелые вакцинные ДК (226 образцов); 7) сыворотка и плазма периферической крови (96 образцов). Образцы МНК периферической крови доноров - контрольная группа (36 образцов).

Рис. 1. Схема получения вакцин на основе дендритных клеток.

Работу с ДК человека проводили в условиях стерильного модуля («Air Lock», США) с жестким режимом, использованием потолочных воздушных фильтров HEPA/ULPA (ультравысокая очистка), обладающих эффективностью 99,9995% по частицам размером 0, микрон. Рабочее место оснащено ламинарно-потоковым шкафом с вертикальным потоком воздуха, для создания в рабочей зоне стерильной среды (II класс биологической защиты).

Технология получения ДК-вакцин состоит из 5 основных этапов:

1) получение костномозговых или периферических предшественников ДК;

2) дифференцировка ДК из миелоидных предшественников in vitro;

3) приготовление РТА+ содержащего опухолевого лизата;

4) нагрузка и активация незрелых ДК лизатом РТА+;

5) криоконсервация и хранение вакцинных ДК.

Получение костномозговых и периферических предшественников ДК заключалось в использовании двух способов:

1) лейкаферез костномозговых предшественников периферической крови с помощью аппарата CobeSpectra (гемопоэтические стволовые клетки, ранние предшественники миеломоноцитопоэза, дендроцитопоэза, моноциты);

2) венопункция венозной крови.

Мононуклеарные клетки (МНК) выделяли стандартным методом (Boyum А., 1968) с использованием «Ficoll-Paque Premium» «GE Healthcare» (Великобритания).

Дифференцировку МНК в незрелые ДК проводили в бессывороточной среде «СellGro DС», питательных средах RPMI-1640 с добавлением ксеногенной или АВ сыворотки человека, ростовых факторов и факторов дифференцировки GM-CSF импортного и отечественного производства (72 нг/мл), при различных концентрациях IL-4 (от 0 до 45 нг/мл).

Методика приготовления стандартизированной вакцины на основе незрелых Дифференцировку МНК в незрелые ДК проводили в сбалансированной бессывороточной среде «СellGro DС», произведенной в условиях GMP и рекомендованной для культивирования ДК человека. Ростовые факторы и факторы дифференцировки – GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) вносили на 1-й и 3-й день культивирования. На 5-й день культивирования ДК собирали пастеровской пипеткой, незначительную часть прикрепившихся клеток снимали скрепером, отмывали двукратным центрифугированием в 10 мл 0,9% изотонического раствора NaCl, содержащего альбумин человека (конечная концентрация 2%), при 1000 об/мин в течение 10 мин.

Производили подсчет, оценку жизнеспособности, определяли иммунофенотип, уровень дифференцировки.

Методика приготовления стандартизированной вакцины на основе аутологичных ДК, Дифференцировку ДК из адгезионной моноцитарной фракции (CD14+) периферической крови больных злокачественными новообразованиями проводили в сбалансированной бессывороточной среде «Cell-Gro DC». Ростовые факторы и факторы дифференцировки – GM-CSF (72 нг/мл) и IL-4 (20 нг/мл) (СellGenix, Германия) вносили на 1-й, 3-й и 5-й дни культивирования.

лизированных охарактеризованных аутологичных и/или аллогенных опухолевых клеток Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel 520), экспрессирующих иммуногенные РТА+ (клеточные линии (NY-ESO-1+, MAGE+, HAGE+, GAGE+) в соотношении 1 ДК и 3 лизированные опухолевые клетки, ростовые факторы: GM-SCF (72 нг/мл), IL-4 (20 нг/мл) и TNF- (20 нг/мл) в ранее изученных концентрациях. Через 48 ч ДК собирали, осаждали центрифугированием, отмывали в 10 мл 0,9% раствора хлорида натрия, содержащего 10% альбумина человека, производили подсчет, оценку жизнеспособности, определяли иммунофенотип, уровень дифференцировки и функциональную активность.

Приготовление опухолевого лизата, содержащего РТА. Клеточные линии Mel 226, Mel 515, Mel 519, Mel 520, экспрессирующие РТА, смешивали в равных пропорциях и проводили последовательных циклов моментального замораживания/оттаивания в фосфатно-солевом буфере (качество лизиса клеток контролировали с помощью 0,1% трипанового синего и светового микроскопа), центрифугировали и фильтровали надосадочную фракцию через фильтр 0,2 мкм (Millipore, США). РТА+, содержащий опухолевый лизат, помещали в криопробирки и хранили при –20оС до использования (Балдуева И.А., 2008).

Криоконсервацию миелоидных предшественников и вакцинных ДК проводили с помощью программного замораживателя «Computer Freezer «Ice-Cube 14S» (Австрия). Для этого клетки помещали в бессывороточную криосреду (Биолот, Россия) и индивидуально маркированные криопробирки. Далее клетки переносили в индивидуальные контейнеры с жидким азотом (-196оС) и хранили в криобанке до использования.

Размораживание миелоидных предшественников и вакцинных ДК. Криопробирку с ДК помещали на 3 мин в водяную баню +42оС, далее ex tempore переносили в стерильную 15-мл пробирку и разбавляли не менее чем десятикратным избытком 0,9% изотонического раствора NaCl, содержащего альбумин человека (конечная концентрация 2%). Отмывали ДК двукратным центрифугированием (1000 об/мин в течение 10 мин) в 10 мл 0,9% изотонического раствора NaCl, производили подсчет и оценку жизнеспособности.

Иммунофенотипирование костномозговых и периферических незрелых и зрелых ДК проводили двумя методами:

1) иммуноцитохимического окрашивания по Oliver C., Jamur M.C. (2010).

2) проточной цитометрии BD FACSCalibur (BD Biosciense).

Использовали немеченные моноклональные антитела к дифференцировочным и линейноспецифическим антигенам: моноциты (CD14), незрелые ДК (CD1a), зрелые ДК (CD83), маркеры активации (CD80 и CD86), хемокиновый рецептор (CCR7), белки антигенов гистосовместимости II класса (HLA DR) и моноклональные антитела, меченные флуорохромами: CD83-PE-Cy5, CD1аPE, CD80-FITC, CD86-FITC, CD14-FITC, CCR7-FITC, CD209-FITC, HLA-DR PerCP-Cy5.5;

изотипический контроль (BD Biosciences, США) и программное обеспечение CellQuest Pro (tm).

Клиническую и иммунологическую оценку эффективности и безопасности двух видов ДК-вакцин (ДКВ* и ФДК**) провели у 42 больных с гистологически верифицированным диагнозом меланомы кожи после подписания ими информированного согласия. ДКВ получили больных (13 мужчин и 15 женщин в возрасте от 24 до 74 лет), ФДК – 14 пациентов (11 мужчин и 3 женщины в возрасте от 25 до 64 лет).

Для отбора больных использовали общепринятые в клинической практике критерии включения и исключения. Точкой отсчета наблюдения за больными принималась дата хирургического лечения. Объективную оценку клинического эффекта (стандартные клинические, лабораторные, рентгенологические и ультразвуковые) исследования проводили после каждого четного цикла вакцинотерапии. Больные получили от 2 до 12 циклов лечения. Пациенты были включены произвольным образом в когорты, получавшие один из изучаемых методов терапии.

Для оценки клинической эффективности вакцинотерапии использовали критерии RECIST v1.1.

Оценка нежелательных явлений (НЯ) проводилась по шкале токсичности CTC AE v.3.

Мониторинг специфического поствакцинального иммунного ответа изучали двумя методами:

1) ELISpot анализ;

2) клеточный иммуноферментный анализ (клеточный ИФА).

ELISpot анализ – исследование функциональной активности антиген-специфических клонов цитотоксических Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN- (интерферон-гамма) и гранзим Б. Использовали стандартные IFN- ELISpot тест-системы BD Biosciences (США), R&D Systems (Великобритания) и Millipore Corporation (США). Визуализацию результатов проводили с помощью автоматизированной системы ELISpot компании Carl Zeiss (Балдуева И.А., 2010;

Нехаева Т.Л., 2010).

_ *ДКВ - вакцина на основе зрелых периферических ДК.

**ФДК - вакцина на основе незрелых костномозговых ДК с фотодинамической терапией.

Клеточный ИФА – определение титра опухолеспецифических иммуноглобулинов класса G (IgG). В качестве антигена использовали аллогенные клеточные линии меланомы кожи Mel 226, Mel 519, Mel 520, Mel 515 и аутологичные опухолевые клетки. Регистрацию реакции антигенантитело проводили при длине волны 450 нм на фотометре «Multiskan EX» (Thermo Electron Corparation, США).

Полученные данные обрабатывали методами описательной статистики, корреляционного и регрессионного анализа. Для определения достоверности различий использовали критерии Стьюдента, Фишера и Вилкоксона, показатели выживаемости больных оценивали по методу Каплан-Мейера. Обработку результатов проводили с помощью прикладных статистических программ Statgraphics Plus и SPSS for Windows.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Стандартизация методов получения и криоконсервации миелоидных предшественников ДК из лейкаферезного материала и периферической крови Для получения ДК из моноцитов необходимо их предварительное прикрепление к твердому субстрату. Международные протоколы получения ДК из миелоидных предшественников методом адгезии на пластике не учитывают потерю неадгезированных моноцитов, что свидетельствует о недостаточно полном знании различий в субпопуляциях миелоидных предшественников, дифференцированных в вакцинные ДК in vitro.

В связи с этим нами изучено выделение концентрированного количества МНК в градиенте плотности Ficoll-Paque Premium и адгезия на пластике. В исследование включено 18 образцов лейкаферезного материала и 17 образцов МНК периферической крови больных меланомой кожи, и 9 образцов периферической крови здоровых лиц (доноры). Оценку качества материала проводили на гематологическом анализаторе крови «SysmexXT-2000i» (Sysmex, Япония), с помощью светового микроскопа «AxioImager.M1» (CarlZeiss, Германия) и проточного цитофлюориметра «FACSCalibur» с использованием специфических МкАт к CD45, CD14, CD34, CD33, CD13, HLA-DR, CD3, CD19 и изотипического контроля с учетом количества МНК в каждой пробе.

Анализ иммунофенотипа миелоидных предшественников ДК по уровню экспрессии CD34, CD33, CD14, CD11c, HLA-DR антигенов у больных меланомой кожи выявил различия в адгезионных свойствах и изменение субпопуляционного состава предшественников на фоне криоконсервации и криоконцентрации на градиенте плотности Ficoll-Paque (p0,05), что демонстрирует нецелесообразность концентрации моноцитов для повышения качества клеточного субпродукта после криоконцентрации.

2. Оптимизация и стандартизация условий дифференцировки вакцинных ДК Многочисленные экспериментальные исследования свидетельствуют, что незрелые CD1a+CD83- ДК периферической крови человека слабоиммуногенные и могут вызывать толерантность к антигенному стимулу (Kadowaki N. et al., 2000; Jin Y., et al., 2007).

опухолеспецифических Т-лимфоцитов, продуцирующих IFN- (Shevach E.M., 2004; Aerts-Toegaert C. et al., 2007). Таким образом, степень зрелости становится ключевой характеристикой ДК при получении ДК-вакцин. В этой связи важным является определение факторов, способствующих созреванию различных субпопуляций ДК.

иммунофенотипических маркеров зрелых ДК, дифференцированных в присутствии фиксированной концентрации ростового фактора GM-CSF1 импортного производства (контроль) и GM-CSF2 отечественного производства (опыт) в концентрации 72 нг/мл в сочетании с IL-4 ( нг/мл).

Таблица 1. Иммунофенотип зрелых ДК, дифференцированных в присутствии GM-CSF импортного Примечание: M – среднее значение экспрессии антигенов, m – ошибка среднего значения, – стандартное отклонение; концентрация GM-CSF (72 нг/мл), IL-4 (45 нг/мл).

Результаты этого анализа, представленные в табл. 1, демонстрируют отсутствие статистически значимых различий (р>0,05), что свидетельствует о сопоставимой активности ростовых факторов GM-CSF импортного и отечественного производства.

С целью снижения стоимости ДК вакцин и рационального использования IL-4, произведенного в условиях GMP (СellGenix, Германия), было изучено его влияние на экспрессию CD1a+, CD209+, CD40+, HLA-DR+, CD86+, CD80+ антигенов на незрелых и зрелых ДК.

Эффективность IL-4 оценивали в диапазоне концентраций от 0 (контрольный образец) до 45 нг/мл.

Для анализа экспрессии изучаемых маркеров на незрелых ДК были получены полиномиальные модели 2-го порядка на основе однофакторного регрессионного анализа, которые позволили установить, что для дифференцировки ДК in vitro оптимальная концентрация IL-4 находится в интервале от 5 до 20 нг/мл (рис. 2 А и Б). Дальнейшее увеличение концентрации не приводило к значимому повышению уровня экспрессии данных маркеров. Полученные данные позволили уменьшить расход IL-4 импортного производства от 3 до 5 раз.

Рис. 2 А. Экспрессия CD1a, CD83, CD209 и CD40 антигенов на незрелых ДК в диапазоне Рис. 2 Б. Экспрессия CD1a, HLA-DR, CD80 и CD86 антигенов на незрелых ДК в диапазоне С целью повышения эффективности бюджетных расходов на лечение больных меланомой кожи и снижения стоимости ДК-вакцин нами было проведено сравнительное исследование (табл.

2) влияния на созревание ДК интерферона-альфа (INF-), который в последнее время рассматривается как фактор, способствующий ускоренному созреванию ДК в сочетании с GMCSF (Korthals M. et al., 2007).

При сравнительном анализе результатов иммунофенотипирования популяций незрелых ДК, дифференцированных из миелоидных предшественников, ДК1 (GM-CSF + IL-4) и ДК2 (GM-CSF + IFN-) на 7-й день культивирования было установлено, что популяция ДК2 содержала клетки с экспрессией моноцитарного компонента CD14 по сравнению с отсутствием подобных клеток в популяции ДК1, дифференцированных в присутствии IL-4 (табл.2).

Таблица 2. Иммунофенотип незрелых ДК, дифференцированных в присутствии GM-CSF + IL-