На правах рукописи

РУДАКОВА ЕЛЕНА ВЛАДИМИРОВНА

О-ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ ЭТИЛТРИФТОРЛАКТАТЫ И

ГЕКСАФТОРИЗОПРОПАНОЛЫ КАК ИНГИБИТОРЫ СЕРИНОВЫХ

ЭСТЕРАЗ IN VITRO И IN VIVO

Специальность 02.00.10 – биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Черноголовка - 2014

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук (ИФАВ РАН)

Научный руководитель: Махаева Галина Файвелевна кандидат химических наук, заведующая лабораторией молекулярной токсикологии

ИФАВ РАН

Официальные оппоненты: Ротанова Татьяна Васильевна доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории химии протеолитических ферментов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук Козлов Владимир Андреевич доктор химических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории фосфорорганических соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института элементоорганических соединений им.

А.Н. Несмеянова Российской академии наук Федеральное государственное бюджетное

Ведущая организация:

учреждение науки Институт биохимии им.

А.Н. Баха Российской академии наук

Защита диссертации состоится « 7 » октября 2014 г. в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.102.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждения науки Институте физиологически активных веществ Российской академии наук по адресу: 142432, Московская обл., г. Черноголовка, Северный пр., д. 1.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте ИФАВ РАН (www.ipac.ac.ru).

Автореферат разослан «_» 2014 года.

Ученый секретарь диссертационного Светлана Васильевна Афанасьева совета, кандидат химических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. Органические производные пятивалентного фосфора (фосфорорганические соединения, ФОС) широко применяются в агрохимической практике и ветеринарии (инсектициды, акарициды, противопаразитные агенты), в промышленности (пластификаторы, компоненты смазочных материалов, антипирены), в качестве лекарственных средств лечения шистосомоза (метрифонат), глаукомы (экотиофат), рака (циклофосфамид), остеопороза (бисфосфонаты). Некоторые высокотоксичные ФОС являются химическими боевыми отравляющими веществами, огромные запасы которых, накопленные в мире (зарин, VX), как и проблемы, связанные с их транспортировкой, уничтожением и переработкой, представляют в настоящее время серьезную экологическую опасность.

Ряд ФОС помимо острого токсического действия, обусловленного ингибированием ацетилхолинэстеразы (АХЭ) нервных синапсов, может индуцировать синдром «отставленной нейротоксичности, вызываемой фосфорорганическими соединениями»

(ОНТФОС). Это дистальные нейропатии, проявляющиеся после 2-3 недельного латентного периода и характеризующиеся дегенерацией длинных аксонов периферической и центральной нервной системы. Высокая чувствительность человека к действию нейропатичных ФОС, наличие длительного скрытого периода между отравлением и клиническими проявлениями ОНТФОС, отсутствие специфических средств лечения и высокий уровень инвалидизации пострадавших делают чрезвычайно важной проблему оценки риска отставленного нейротоксического действия ФОС и ранней диагностики этого заболевания.

В связи с широким применением ФОС и необходимостью создания новых соединений и материалов, которые были бы безопасны для человека и теплокровных, весьма актуальной является задача выяснения механизмов формирования токсических эффектов данного класса соединений.

Фармакологическое применение антихолинэстеразных соединений и потребность в новых эффективных препаратах без опасных побочных эффектов обусловливают необходимость разработки методологии прогнозирования потенциальных биологических эффектов соединений на этапе синтеза и исследований in vitro.

Для характеристики эффективности взаимодействия антихолинэстеразных соединений с эстеразами-мишенями in vitro в нашей лаборатории предложена концепция «эстеразного профиля» – набора кинетических констант, описывающих ингибиторную активность соединения в отношении эстераз различной функциональной значимости:

ацетилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.7, АХЭ, острая токсичность, улучшение когнитивных функций); нейротоксичной эстеразы (КФ 3.1.1.5, НТЭ, отставленная нейротоксичность, ОНТФОС), бутирилхолинэстеразы (КФ 3.1.1.8, БХЭ, стехиометрический скэвенджер, улучшение когнитивных функций, модуляция метаболизма лекарств), карбоксилэстеразы (КФ 3.1.1.1, КЭ, стехиометрический скэвенджер, модуляция метаболизма лекарств).

Анализ эстеразного профиля позволяет получить более полную картину биологической активности соединения и оценить баланс между его терапевтическими свойствами и нейротоксичным потенциалом.

Эстеразы крови, с которыми взаимодействуют ФОС при попадании в организм, – АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и PON1 (КФ 3.1.8.1, гидролиз и детоксикация ФОС, каталитический скэвенджер) составляют «эстеразный статус» организма, который в значительной степени определяет видовую и индивидуальную чувствительность к антихолинэстеразным соединениям.

Новые методологии создания лекарственных средств с заданными свойствами ставят задачу постепенной замены тестов на животных для скрининговых исследований и оценки безопасности химических средств и продуктов, поик альтернативных моделей.

Ценность альтернативных (ферментных, клеточных, компьютерных и т.д.) моделей заключается не только или не столько в их способности заменить животных, сколько в получении максимально полной информации о потенциальных фармакологических и токсических свойствах соединений до их исследования на животных.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось исследование эстеразного профиля ряда О-фосфорилированных этилтрифторлактатов и некоторых представителей родственных соединений – О-фосфорилированных гексафторизопропанолов, и проверка в экспериментах на тканевом уровне (кровь, мозг) и на уровне целого организма прогнозов и выводов, сделанных на основании анализа эстеразного профиля соединений.

Для достижения цели работы были поставлены следующие задачи:

– оценка и анализ эстеразного профиля гомологичных O-фосфорилированных этилтрифторлактатов и выбор соединений для исследования на тканях и на целом организме;

– разработка методов определения АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови и сравнительное исследование «эстеразного статуса» человека и грызунов путем определения в крови активностей указанных ферментов;

– исследование НТЭ мозга и крови мышей как биомаркера воздействия нейропатичных ФОС;

– исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ на препаратах мозга и крови мышей in vitro;

– исследование ингибиторной активности фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ мозга и крови мышей на уровне целого организма при внутрибрюшинном (в/бр) введении;

Научная новизна работы. На примере фосфорорганических соединений впервые показано, что эстеразный профиль ингибиторов холинэстераз в значительной степени определяет их эффекты на тканевом уровне и на уровне целого организма.

Впервые подробно охарактеризован «эстеразный статус» человека и лабораторных животных (мыши и крысы).

Установлено, что НТЭ мозга и крови мышей являются биохимическими маркерами отравления нейропатичными ФОС. Разработана модель на мышах для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС.

Найден новый эффективный и селективный ингибитор карбоксилэстеразы плазмы крови мышей с низкой острой токсичностью.

Практическая значимость работы. Проведенное исследование показывает, что методология анализа эстеразного профиля антихолинэстеразных соединений, учитывающая конкурирующее взаимодействие соединения с несколькими мишенями, позволяет прогнозировать терапевтические и токсические эффекты соединения, и может быть использована в скрининговых исследованиях при создании новых эффективных и безопасных лекарственных средств.

Установлена возможность использования стандартных лабораторных животных (мышей) для биохимической оценки нейропатичного потенциала ФОС вместо дорогостоящих исследований, традиционно проводимых на курах.

Найденный в ходе работы эффективный и селективный ингибитор карбоксилэстеразы крови мышей, обладающий низкой острой токсичностью, может быть применен для стабилизации потенциальных фармакологических агентов, содержащих сложноэфирные или амидные группы, при проведении доклинических исследований на грызунах.

Полученные в настоящей работе данные по «эстеразному статусу» человека и грызунов важны при проведении исследований в области медицины и токсикологии, а также для более корректной экстраполяции экспериментальных результатов с животных на человека и в качестве базовых активностей при биомониторинге.

Личный вклад автора состоял в разработке условий и методов исследования, в планировании экспериментов, в подготовке образцов тканей животных и проведении экспериментальной работы, в обработке, обобщении и интерпретации полученных данных, анализе литературных источников. Автор принимал активное участие в подготовке к публикации полученных результатов и их апробации на российских и международных научных форумах.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: 11th SAC Seminar “New Trends In Chemical Toxicology”, 22-25 September 2008, Moscow; Society of Toxicology, Annual Meeting, 15-19 March 2009, Baltimore, USA;

12th Medical Chemical Defense Conference, 21-24 April 2009, Munich, Germany; 10th International Meeting on Cholinesterases, 20-25 September 2009, Sibenik, Croatia; VII Всероссийская конференция Химия и медицина «Орхимед-2009», 1-5 июля 2009, Уфа, Россия; 13th International CWD Conference, 24-27 May 2010, Prague, Czech Republic; VIII Всероссийская конференция с международным участием “Химия и медицина”, 6- апреля 2010, УФА, Россия; 14th International CWD Conference, 23-26 May 2011, Interlaken, Switzerland; XIX Mendeleev Congress on General and Applied Chemistry, 25-30 September 2011, Volgograd, Russia; 15th International CWD Conference, 21-25 May 2012, Glasgow, UK;

11th International Meeting on Cholinesterases, 4-9 June 2012, Kazan, Russia; 9-я Всероссийская конференции "Химия фтора", посвященная 100-летию со дня рождения академика А.В. Фокина, 22-26 октября 2012, Москва; Первая Российская конференция по медицинской химии (MedChem Russia-2013), 8-12 сентября 2013, Москва; 4th National Congress of Clinical Toxicology with International Participation and Annual Meeting of Bulgarian Toxicological Society, 7-8 November 2013, Sofia, Bulgaria.

Публикации. По материалам исследований опубликовано 38 работ, в том числе статей в международных и отечественных журналах, 3 статьи в материалах конференций, 7 глав в книгах, 18 тезисов докладов международных и российских конференций, получен 1 патент РФ на изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 255 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, обсуждения результатов в 5 главах, выводов и списка цитируемой литературы, включающего ссылок. Работа содержит 58 рисунков и 30 таблиц.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Фосфорорганические соединения, изученные в данной работе, были синтезированы и предоставлены сотрудниками лаборатории синтеза физиологически активных веществ ИФАВ РАН зав. лаб., к.х.н. Соколовым В.Б. и в.н.с., к.х.н. Аксиненко А.Ю.

Кинетические исследования проводили с использованием коммерческих препаратов ферментов: АХЭ эритроцитов человека, БХЭ сыворотки крови лошади, КЭ печени свиньи (Sigma-Aldrich, США) и стабильного лиофилизованного препарата НТЭ мозга кур (ЛиоНТЭ), полученного по методике, разработанной в нашей лаборатории. Ферменты инкубировали с исследуемыми соединениями в соответствующем рабочем буфере при 25°C для АХЭ, БХЭ, КЭ и при 37°C для НТЭ в течение различных интервалов времени в условиях [I]0>>[E]0. Остаточную активность АХЭ и БХЭ определяли методом Эллмана (pH 7.5, =412 нм, субстраты – ацетилтиохолин и бутирилтиохолин, соответственно);

активность КЭ определяли с использованием 4-нитрофенилацетата (pH 8.0, =405 нм), остаточную активность НТЭ определяли дифференциальным методом согласно Johnson M.K. (1977), используя фенилвалерат в качестве субстрата (рН 8.0, = 510 нм).

Измерения проводили на планшетном спектрофотометре BioRad Benchmark Рlus (France).

Кинетические константы ингибирования вычисляли методом линейной регрессии с использованием программы OriginPro 6.1 (OriginLab Corp., Northampton, MA).

Эстеразный профиль соединений анализировали классическим методом QSAR с построением моделей Хэнча.

Исследование ингибирования эстераз in vitro в препаратах крови мышей и человека (гемолизат крови 1:100) и в препаратах мозга мышей и кур (9S-фракция гомогената мозга) проводили при 20 минутной инкубации с ингибиторами в диапазоне концентраций от 10-11 до 10-3 М. Активность АХЭ и БХЭ определяли методом Эллмана, как указано выше (для крови =436 нм); измерение активности КЭ проводили c использованием 1нафтилацетата при 25oC (pH 8.0, =322 нм). Активность НТЭ в препаратах мозга определяли методом Johnson M.K., как указано выше; активность НТЭ в крови – аналогичным способом, но с электрохимической детекцией фенола с использованием тирозиназного биосенсора. Арилэстеразную активность PON1 в крови определяли согласно методу Kitchen B.I. (1973), при 25oC (pH 8.0, =270 нм, субстрат – фенилацетат).

Измерения проводили в трипликате на спектрофотометре Gilford-250 (England).

Результаты представлены в виде mean ± SEM, которые рассчитывали с использованием программы GraphPad Prism 3.02 (GraphPad Software, San Diego, CA).

В экспериментах in vivo использовали самцов белых аутбредных мышей линии CD весом 20-25 г в возрасте 1.5-2 месяцев. При исследовании дозозависимого ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ в крови и мозге мышей соединения растворяли в диметилсульфоксиде и вводили животным однократно в/бр 5-10 возрастающих доз в объеме ~ 0.1 мл. Активность ферментов определяли в 9S-фракции гомогената мозга и гемолизате крови (1:100), как описано выше.

Определение острой токсичности соединений выполняли на самцах мышей линии CD1 при в/бр введении: 5-7 доз для каждого соединения, 6-8 животных для каждой дозы, срок наблюдения – 24 часа. Величину LD50 вычисляли методом пробит-анализа с использованием программы BioStat 2006 Professional (AnalystSoft).

Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных Целью данного этапа работы являлось получение и анализ эстеразного профиля фосфорилированных этилтрифторлактатов, общей формулы (RO)2P(O)OCH(CF3)COOC2H5, где R = CH3, C2H5, i-C3H7, n-C3H7, i-C4H9, n-C4H9, n-C5H11.

Для получения эстеразного профиля TFL исследована кинетика ингибирования данными соединениями четырех сериновых эстераз – АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ.

Показано, что TFL необратимо ингибируют АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ с типичной для ФОС кинетикой ингибирования: зависимость степени ингибирования эстеразной активности от времени имеет псевдо-первый порядок, а наклоны прямых в полулогарифмических координатах lg(V0/Vt) = f (t) в случае АХЭ, БХЭ и КЭ пропорциональны концентрации ингибитора. При ингибировании НТЭ наблюдалось кинетическое проявление образования комплекса Михаэлиса, что позволило определить индивидуальные кинетические константы процесса ингибирования – константы Михаэлиса (Ka, M) и константы фосфорилирования (k+2, мин-1).

Тангенс угла наклона, близкий к 1, в зависимости lgKa(НТЭ) от гидрофобности алкильных радикалов (Рис. 1А) подтверждает экстракционный механизм взаимодействия НТЭ с фосфорорганическими ингибиторами. Наблюдается строгая корреляция между ингибиторной активностью TFL в отношении НТЭ (ki, М-1мин-1) и связыванием соединений в активном центре фермента (Ka, М): r = 0.998, n = 7, р < 0.0001 (Рис. 1Б).

Установлено, что константы фосфорилирования (k+2, мин-1) не зависят от структуры соединения и составляют в среднем (1.92±0.13)10-2 мин-1. Таким образом, ингибиторная активность TFL в отношении НТЭ определяется их эффективностью связывания с ферментом. Полученные величины бимолекулярных констант ингибирования всех исследуемых эстераз производными TFL, характеризующие эстеразный профиль соединений, приведены в Табл. 1.

Рис. 1. А - Зависимость константы Михаэлиса (Ka, М) для ингибирования НТЭ под действием TFL от гидрофобности алкильных радикалов; Б - корреляция между константами Михаэлиса (Ka, М) и бимолекулярными константами ингибирования (ki, М-1мин-1) для ингибирования НТЭ под действием TFL.

Таблица 1. Ингибиторная активность TFL (ki, М-1мин-1) в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ и их ингибиторная селективность в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ (RIP);

- аддитивная гидрофобность алкильных радикалов по Хэнчу (CH2=0.5).

На Рис. 2 представлена зависимость изменения эстеразного профиля TFL – их ингибиторной активности в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ с увеличением гидрофобности алкильных радикалов (R) в фосфорильной части молекулы.

Как следует из Табл. 1 и Рис. 2, ингибиторная способность TFL в отношении всех четырех сериновых гидролаз возрастает с увеличением гидрофобности алкильных радикалов. Стерические препятствия – наличие заместителя в -положении алкоксильного радикала - cнижают ингибиторную способность соединений. Эстеразыскэвенджеры - БХЭ и КЭ в большинстве случаев ингибируются более эффективно по сравнению с первичными мишенями АХЭ и НТЭ.

Для анализа эстеразного профиля ФОС использованы величины их ингибиторной активности в отношении 4-х эстераз (ki, М-1мин-1) и величины ингибиторных селективностей, рассчитанные как SX/Y = ki(EX)/ki(EY). В сумме это дает для моделирования 9 параметров, каждый из которых важен для определенных аспектов результирующего фармакологического профиля ФОС.

Отношения ki(БХЭ)/ki(АХЭ) и ki(КЭ)/ki(АХЭ) характеризуют селективность соединений в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, и, как мы полагаем, могут рассматриваться в качестве характеристики вкладов БХЭ и КЭ как вторичных мишенейскэвенджеров в формирование острой холинергической токсичности соединения.

Аналогично отношения ki(БХЭ)/ki(НТЭ) и ki(КЭ)/ki(НТЭ) характеризуют потенциальный вклад БХЭ и КЭ в формирование отставленной нейротоксичности.

Отношение ki(НТЭ)/ki(АХЭ) = RIP (Relative Inhibitor Potency) - относительная ингибиторная активность соединений в отношении ферментов-мишеней отставленной (НТЭ) и острой (АХЭ) нейротоксичности, коррелирует с отношением между LD50 и минимальной нейропатичной дозой. Для ФОС, которые в соответствии со своей структурой способны «стареть», RIP используется в качестве индекса, характеризующего нейропатичный потенциал соединения. Величина RIP > 1 указывает на то, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС данным соединением, будет меньше LD50, тогда как при RIP < 1 ОНТФОС может инициироваться при дозах, больших LD50.

Эстеразный профиль исследуемых соединений анализировали методом количественного анализа связи «структура-ингибиторная активность» и «структураингибиторная селективность» (QSAR) с построением моделей Хэнча. В качестве физикохимических дескрипторов использовали константы гидрофобности Хэнча (CH2 = 0.5) и стерические константы Чартона ( Ev ) для алкильных и алкоксильных заместителей.

Учитывая, что наилучшие уравнения получались в случае стерических констант Чартона для алкоксильных заместителей Ev (RO), общий вид полученных уравнений зависимости ингибиторной активности соединений в отношении фермента EX (Х = АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ) от гидрофобных и стерических свойств заместителей можно представить как lgki(EX) = A + B() + C()2 – D Ev (RO). Общее уравнение для ингибиторной селективности соединения по отношению к эстеразам EX и EY имеет вид:

lg SX/Y = A + B () + C ()2. Номера, коэффициенты A, B, C, D наилучших уравнений структура-ингибиторная активность/селективность и cтатистические характеристики моделей представлены в Табл. 2 (r – коэффициент множественной корреляции, s – стандартное отклонение, F – секвенциальный критерий Фишера и p – уровень значимости критерия Фишера).

Анализ зависимости структура–ингибиторная активность для TFL (уравнения 1-4, Табл. 2) показывает, что гидрофобные взаимодействия играют важную роль при ингибировании всех исследуемых эстераз, а стерические препятствия снижают ингибиторную способность соединений.

Таблица 2. Модели Хэнча структура-ингибиторная активность и структура-ингибиторная селективность и их статистические характеристики (количество соединений N=7).

lg ki(БХЭ) Рис. 3А демонстрирует рост ингибиторной селективности TFL в отношении эстеразскэвенджеров, БХЭ и особенно КЭ, при увеличении гидрофобности алкильных радикалов по сравнению с ингибиторной активностью в отношении мишени острой токсичности – АХЭ (уравнения 6 и 7 соответственно). Возрастание связывания TFL на токсикокинетической стадии c эстеразами-скэвенджерами с увеличением гидрофобности молекулы уменьшает количество соединения, достигающего мишени – АХЭ, снижая таким образом его острую токсичность. Это полностью согласуется с результатами экспериментов по определению острой токсичности (мыши, в/бр, 24 ч): более гидрофобный diBu-TFL вдвое менее токсичен, чем diEt-TFL: LD50 = 1560 (1350 1780) и 720 (623 817) мг/кг соответственно.

Селективность TFL в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с мишенью отставленной нейротоксичности (НТЭ) описывется уравнениями (8) и (9) соответственно. Из Рис. 3Б видно, что с ростом гидрофобности алкильных радикалов в фосфорильной части молекулы связывание TFL с БХЭ в сравнении с НТЭ существенно снижается, при этом линейно возрастает нейропатичный потенциал соединений (RIP) (уравнение 5). Это означает, что с ростом гидрофобности алкильных радикалов снижается защитная роль эстераз-скэвенджеров при формировании отставленной нейротоксичности, и соответственно возрастает опасность развития ОНТФОС.

Таким образом, анализ эстеразного профиля показывает различное влияние связывания TFL с неспецифическими эстеразами – КЭ и БХЭ – на формирование острой и отставленной нейротоксичности: с увеличением гидрофобности наблюдается повышение защитного эффекта в отношении острой холинэргической токсичности и снижение защитного эффекта в отношении способности соединения вызывать ОНТФОС. Согласно полученным данным, TFL с короткими алкильными радикалами (R = Me, Et) могут рассматриваться как потенциальные антихолинэстеразные терапевтические средства, у которых отсутствует такой опасный побочный эффект, как способность вызывать ОНТФОС.

Приведенные результаты показывают, что анализ эстеразного профиля ФОС позволяет получить более полную картину их биологических эффектов, тем самым оценить терапевтический потенциал и возможные побочные эффекты исследуемых соединений, а также позволяет получить информацию о механизмах формирования токсичности.

Рис. 3. А - зависимость анти-АХЭ активности TFL и их селективности (S) в отношении КЭ и БХЭ по сравнению с АХЭ от гидрофобности алкильных радикалов ( );

Б - зависимость нейропатичного потенциала TFL и их селективности (S) в отношении КЭ и БХЭ по сравнению с НТЭ от гидрофобности алкильных радикалов ( ).

Выбор соединений для исследований на тканях и на целом животном Мы полагаем, что эстеразный профиль антихолинэстеразного соединения в значительной степени определяет его эффекты на уровне тканей и целого организма.

Для проверки этой гипотезы было необходимо исследовать ингибиторную активность ФОС с разным эстеразным профилем в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ на препаратах тканей мышей (кровь и мозг) и на целом животном.

Ранее изученные O,O-диалкил-O-(1-трифторметил-2,2,2-трифторэтил) фосфаты (О-фосфорилированные гексафторизопропанолы, PFP) имеют близкую структуру с TFL и сходный характер зависимостей структура–активность/селективность

PFP TFL F

(R = CH3, C2H5, i-C3H7, n-C3H7, i-C4H9, n-C4H9, n-C5H11) Для исследования на тканях и на целом животном была выбрана пара соединений – (С2H5O)2P(O)OCH(CF3)2 (diEt-PFP) и (С4H9O)2P(O)OCH(CF3)2 (diBu-PFP), которая имеет бльшие различия в величине нейропатичного потенциала, селективности эстеразаскэвенджер/эстераза-мишень и острой токсичности для мышей по сравнению с аналогичной парой diEt-TFL – diBu-TFL. В качестве маркерного соединения использовали О,О-ди-n-пропил-О-дихлорвинилфосфат (C3H7O)2P(O)OCH=CCl2 (diPrDClVP) – известное нейропатичное соединение, ранее изученное в нашей лаборатории в экспериментах на курах и крысах.

Мы воспроизвели данные по эстеразному профилю ресинтезированных diEt-PFP и diBu-PFP, охарактеризовали эстеразный профиль diPr-DClVP (Табл. 3) и оценили острую токсичность всех соединений для мышей (в/бр, 24 ч). Величины ингибиторной селективности исследуемых ФОС в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ, рассчитанные как S(EX/EY) = ki(EX)/ki(EY), и величины LD50 приведены в Табл. 4.

Таблица 3. Ингибиторная активность in vitro (ki, M-1мин-1) diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ (эстеразный профиль соединений).

(1.80±0.11)103 (1.31±0.08)10 (4.50±0.19) diEt-PFP diBu-PFP diPr-DClVP Таблица 4. Ингибиторная селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ и острая токсичность соединений.

Как видно из Табл. 4, diEt-PFP имеет очень низкий нейропатичный потенциал (RIP = 0.07), умеренную острую токсичность (LD50 = 200 мг/кг) и проявляет высокую селективность в отношении эстераз-скэвенджеров, БХЭ и КЭ, по сравнению с НТЭ. В то же время гидрофобный diBu-PFP является потенциально опасным отставленным нейротоксикантом (RIP = 6.6), обладает очень низкой острой токсичностью (LD50> мг/кг) и проявляет высокую селективность в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ.

diPr-DClVP является наиболее активным ингибитором всех исследуемых эстераз, имеет высокий нейропатичный потенциал (RIP=3.5) и высокую острую токсичность (LD50= мг/кг). Для удобства сравнения с результатами экспериментов на препаратах мозга и крови мышей, величины констант ингибирования исследуемых соединений в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ (ki, M-1мин-1, Табл.3) были пересчитаны на величины IC50 (М) (Табл. 5). Для расчета использовали соотношение: IC50 = (ln2)/(kit), где t - фиксированное время инкубации с ингибиторами (20 мин).

Таблица 5. Ингибиторная активность исследуемых соединений в отношении ферментных препаратов АХЭ, НТЭ, БХЭ, КЭ, представленная величинами IC50 (эстеразный профиль соединений).

Соединение

АХЭ НТЭ БХЭ КЭ

diEt-PFP diBu-PFP diPr-DClVP Определение активностей эстераз проводили в цельной крови, поскольку именно цельная, а не фракционированная кровь является средой, более приближенной к условиям целого организма, т.к. в одной пробе локализованы все указанные ферменты в физиологическом соотношении. В связи с этим был отработан и стандартизован метод пробоподготовки, а также методики определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови. PON1 играет важную роль в детоксикации ФОС и, соответственно, влияет на видовую и индивидуальную чувствительность к этим соединениям.

Определены базовые активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в крови человека, крысы и мыши, т.е. охарактеризован «эстеразный статус» данных видов. Установлены существенные различия в «эстеразном статусе» человека и грызунов: у человека значимыми являются активности холинэстераз (АХЭ и БХЭ), активность КЭ незначительна. У грызунов наибольший вклад вносит КЭ, причем максимальная активность КЭ наблюдается у мышей. Во всех случаях была показана высокая арилэстеразная активность PON1 и низкая активность НТЭ (Рис. 4).

Активность эстераз крови Рис. 4. Активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови человека (N=6), мыши (N=24) и крысы (N=6) [мкмоль субстрата/(минмл крови)]. A) арилэстеразная активность PON1 включена, Б) арилэстеразная активность PON1 не включена.

Данные по «эстеразному статусу» человека и грызунов стали основой для проведения наших экспериментов по исследованию эффектов ФОС на тканях и целом организме.

Мыши как модель для биохимической оценки нейропатичного потенциала Эксперименты по исследованию поведения соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма мы проводили с использованием мышей линии CD1. Так как мыши являются нестандартным и малочувствительным объектом для изучения ОНТФОС в связи с отсутствием у них клинической картины – атаксии и параличей конечностей, следовало выяснить, насколько НТЭ мозга и крови мышей могут служить биохимическими маркерами воздействия нейропатичных ФОС, и показать принципиальную возможность использования мышей в качестве модели для биохимической оценки нейропатичной опасности соединений.

Для решения этой задачи проведено сравнительное изучение чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и мозга кур - стандартного объекта - к действию нескольких ФОС на препаратах мозга в опытах in vitro и на целом животном. Исследовали два известных нейропатичных соединения - мипафокс (MX) и diPr-DClVP, а также диэтильное и дибутильное производные О-фосфорилированных гесафторизопропанолов (diEt-PFP и diBu-PFP), обладающие по результатам анализа их эстеразного профиля различным нейропатичным потенциалом. diPr-DClVP, изученный ранее на курах и крысах в экспериментах in vitro и in vivo, использовали в качестве маркерного соединения.

Сравнительное исследование чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур к действию ФОС с различным эстеразным профилем в экспериментах in vitro. В опытах in vitro на препаратах мозга были определены бимолекулярные константы ингибирования АХЭ и НТЭ мозга мышей и мозга кур соединениями diEt-PFP, diBu-PFP, МХ и diPrDClVP (Табл. 6).

Таблица 6. Ингибиторная активность (ki, M-1мин-1) и ингибиторная селективность соединений в отношении АХЭ и НТЭ мозга мышей и кур in vitro.

Результаты показывают, что НТЭ мозга мышей имеет сходную с ферментом кур чувствительность к нейропатичным соединениям. Величины RIP, полученные на препаратах мозга кур и мышей, очень близки (Табл. 6) и отражают одинаковый ряд нейропатичной опасности соединений для обоих видов: diEt-PFP 2000 мг/кг). Следовательно, diBu-PFP, имеющий низкую острую токсичность, представляет опасность как отставленный нейротоксикант, способный вызывать ОНТФОС в дозах, не вызывающих признаков острого холинергического отравления.

Таким образом, эксперименты на целом животном подтверждают прогнозы in vitro:

diEt-PFP не представляет опасности как отставленный нейротоксикант, тогда как diPrDClVP и diBu-PFP являются нейропатичными соединениями. При этом наблюдается тот же ряд нейропатичной опасности соединений, который был получен в опытах in vitro:

Из Табл. 13 видно, что эффективность ингибирования эстераз крови мышей исследуемыми соединениями на уровне целого организма (величины ED50) располагается в ряду: diEt-PFP < diBu-PFP 8 и S(БХЭ/АХЭ) > 4 (Табл.13), что отражается на величине острой токсичности соединения (LD50 = 200 мг/кг), которая значительно выше, чем у более гидрофобного diBu-PFP (LD > 2000 мг/кг), несмотря на существенно более низкую собственную анти-АХЭ активность diEt-PFP в сравнении с diBu-PFP: ki=(1.80±0.11)103 и (8.44±0.34)104 M-1мин- соответственно (Табл. 3). Отсутствие ингибирования НТЭ in vivo характеризует diEt-PFP как безопасное соединение с точки зрения ОНТФОС. Это может быть связано как с довольно низкой собственной анти-НТЭ активностью diEt-PFP: ki = (1.31±0.08)102 Mмин-1 (Табл. 3), так и с высоким защитным эффектом эстераз-скэвенджеров, обусловленным высокой ингибиторной селективностью соединения in vitro:

S(КЭ/НТЭ)=779 и S(БХЭ/НТЭ)=34.6 (Табл. 4), а также с довольно высокой эффективностью связывания соединения с эстеразами-скэвенджерами in vivo: ED50(БХЭ) = 46.8 ± 1.5, ED50(КЭ)= 25.0 ± 1.0 (Табл. 13).

Таким образом, результаты эксперимента на целом животном полностью подтверждают высказанную нами гипотезу о различном вкладе эстераз-скэвенджеров – КЭ и БХЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности ФОС при увеличении гидрофобности соединения, сделанные на основании анализа эстеразного профиля. А именно: для более гидрофобного diBu-PFP наблюдается выраженный защитный эффект КЭ и БХЭ в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении развития ОНТФОС; в то время как для менее гидрофобного diEt-PFP наоборот: защитный эффект эстераз-скэвенджеров выше в отношении ОНТФОС по сравнению с острой токсичностью.

Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей. Известно, что КЭ гидролизует большинство терапевтических средств, содержащих сложноэфирную или амидную группировку. Грызунам свойственна высокая активность КЭ плазмы, в то время как у человека ее активность практически отсутствует, что осложняет экстраполяцию результатов токсикологических и фармакокинетических исследований с животных на человека. Это обусловливает потребность в селективных ингибиторах КЭ для проведения исследований на плазме мышей и на целом животном. В последнем случае ингибиторы должны обладать низкой острой токсичностью.

Анализ эстеразного профиля diEt-PFP и diBu-PFP (Табл. 3) показал выраженную ингибиторную селективность соединений в отношении КЭ по сравнению с АХЭ и БХЭ:

для diEt-PFP S(КЭ/АХЭ) = 56.6 и S(КЭ/БХЭ) = 22.7; для diBu-PFP S(КЭ/АХЭ) = 129 и S(КЭ/БХЭ) = 4.4. При этом diBu-PFP является в 100 раз более эффективным ингибитором КЭ по сравнению с diEt-PFP: константы ингибирования КЭ составляют (1.09±0.08)107 и (1.02±0.04)105 M-1min-1, соответственно.

Результаты экспериментов на препаратах крови мышей продемонстрировали выраженную селективность данных соединений в отношении КЭ крови (Табл. 11): для diEt-PFP S(КЭ/АХЭ) = 47.5 и S(КЭ/БХЭ) = 15; для diBu-PFP S(КЭ/АХЭ) = 65 и S(КЭ/БХЭ) = 7. При этом diBu-PFP в 80 раз более эффективно ингибирует КЭ крови по сравнению с diEt-PFP: величины IC50 составляют (2.4±0.13)10-8 и (1.89±0.11)10-6 М, соответственно (Табл. 10). Использование diBu-PFP в концентрации 110-7 М позволяет эффективно (более чем на 90%) и длительно (не менее 7 ч) ингибировать КЭ в препаратах крови мышей.

Анализ дозозависимостей ингибирования эстераз крови мышей при в/бр введении соединений показывает, что diEt-PFP (Рис. 6А) в дозе 45 мг/кг (0.22 LD50) эффективно (на 80%) ингибирует КЭ, снижает активность БХЭ на 50%, при этом не затрагивает активность АХЭ.

В случае diBu-PFP (Рис. 6 Б) полное ингибирование КЭ достигается в дозе 10 мг/кг