На правах рукописи

МОЛДОГАЗИЕВА Нурбубу Тентиевна

КОНФОРМАЦИОННАЯ ДИНАМИКА АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА, ЕГО

ПЕПТИДНЫХ ФРАГМЕНТОВ

И ИХ БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ

Специальность 03.01.02 – Биофизика

03.01.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена на кафедре биохимии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова»

Минздрава РФ.

Научный консультант:

Терентьев Александр Александрович, член-корр. РАМН, доктор медицинских наук, профессор, зав. кафедрой биохимии ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.Пирогова

Официальные оппоненты:

Крупянский Юрий Федорович, доктор физико-математических наук, профессор, заместитель директора по научной работе Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт химической физики имени Н.Н. Семенова Российской академии наук».

Сивожелезов Виктор Семенович, доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Федерального государственного учреждения науки «Институт биофизики клетки Российской академии наук».

Северин Сергей Евгеньевич, член-корр. РАМН, доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой биохимии Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова» Минздрава РФ.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии имени А.Н. Баха Российской академии наук», г. Москва.

Защита состоится «_»_20 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 по защите докторских и кандидатских диссертаций на базе ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет, Ауд. 389.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», г. Москва, Ломоносовский проспект, д. 27.

Автореферат разослан «_»_20 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук М.Г. Страховская

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Альфа-фетопротеин (АФП) – основной сывороточный белок эмбрионального периода развития всех млекопитающих, и, возможно, позвоночных. Он является наиболее известным опухолевым антигеном, специфичным для первичного рака печени и тератокарцином, признанный «золотым стандартом» в применении молекулярных биомаркеров в диагностике опухолей (Debruyne, 2008). Впервые АФП был обнаружен в 1956 году Берстрандом и Кзаром в сыворотке крови плода человека как белковая фракция, обладающая электрофоретической подвижностью -1-глобулинов (Berstrand and Czar, 1956), и был иммунохимически идентифицирован Мюралем и Руле в 1961 году (Muralt and Roulet, 1961). Открытие явления биосинтеза АФП в организме взрослых особей в процессе канцерогенеза в 1963 году Г.И. Абелевым у мышей с химически индуцированной гепатомой и Ю.С. Татариновым в сыворотке крови больных первичным раком печени положило начало интенсивным исследованиям этого белка (Abelev, 1963; Татаринов, 1963). За полвека, прошедшие с того времени, выделены, очищены разными способами и охарактеризованы физико-химически и иммунохимически альфафетопротеины человека, мыши, крысы, кролика, морской свинки.

АФП принадлежит к семейству белков – продуктов альбуминоидных генов, тандемно расположенных у человека в 4-ой хромосоме (4q11–q13) c характерной организацией экзонов и интронов, образуя совместно регулируемый мультигенный кластер. К белкам этого семейства относятся также сывороточный альбумин (СА), витамин Д-связывающий белок (ВДСБ) и афамин. Они обладают сходными физикохимическими свойствами и способны связывать низкомолекулярные гидрофобные лиганды и ионы металлов. Особый интерес представляет изучение эстрогенсвязывающей способности АФП, так как она определяет уровень циркулирующих в материнской сыворотке гормонов, способных оказывать фетотоксический эффект. Однако экспериментальными методами так и не удалось показать способность АФП человека (в отличие от АФП мыши и крысы) связывать свободные эстрогены. Ранее нами было показано, что АФП человека эффективно связывает иммобилизованные эстрогены. Однако строение эстрогенсвязывающего участка и механизмы их взаимодействия до сих пор оставались не изученными.

экспериментальных методов (таких как РСА и ЯМР-спектроскопия) также остается трудно разрешимой задачей. В связи с этим, компьютерное моделирование трехмерной (3D) структуры АФП в комплексе с эстрогенами с изучением структуры лигандсвязывающего участка, механизмов взаимодействия с лигандом и анализа конформационных изменений в молекуле АФП представляет собой актуальную научную проблему.

различных факторов, изучаются с 1980-х годов. Однако, взаимосвязь между конформационно-динамическими изменениями и биологической активностью АФП и его пептидов, и структурно-функциональные взаимоотношения в молекуле АФП, остаются неизученными.

В многочисленных экспериментальных моделях in vitro и in vivo показано, что АФП обладает несколькими видами биологической активности и, на этом основании сформировано представление о его полифункциональности и мультимодульностью строения, т.е. существованием в его молекуле множества функционально важных участков (Mizejewski, 1997, 2004, 2010; Zaretsky and Wreschner, 2008). В составе многих регуляторных белков обнаружены короткие линейные мотивы (3–10 а.о.), способные опосредовать белок-белковые взаимодействия, участвовать в передаче сигнала внутрь клеток, регуляции клеточного цикла и др. (Hunt, 1990; Liu and Hsu, 2005; Neduva and Russel, 2005; Saito et al., 2007; Diella et al., 2008). В 1997 году А.А.

Терентьевым было обнаружено наличие сходства между гептапептидным сегментом LDSYQCT, расположенным в N-концевой части полипептидной цепи АФП человека рецепторсвязывающего участка эпидермального фактора роста (ЭФР) с последовательностью LDKYACN у человека. Было сделано предположение о том, что этот сегмент представляет собой один из биологически активных участков АФП человека. Однако механизмы его функционирования и, особенно, роль отдельных аминокислотных остатков остаются до сих пор невыясненными.

Методы молекулярной динамики (МД), позволяющие получать детальные данные о структуре и механизмах внутри- и межмолекулярных взаимодействий на атомарном уровне, а также информацию о параметрах, которые трудно измерить с использованием экспериментальных методов, в настоящее время являются наиболее эффективным приемом для решения задач, описанных выше (Шайтан и соавт., 1999, 2002, 2003). Особую ценность представляет использование системного подхода в экспериментальных, так и компьютерных и вычислительных методов.

Цель исследования. Целью настоящей работы являлось исследование структурно-функциональных взаимосвязей в молекуле альфа-фетопротеина человека и его биологически активных пептидов путем изучения их конформационнодинамических свойств и анализа роли отдельных аминокислотных остатков в их биологической активности.

Задачи исследования.

1. Анализ структурно-функциональных и филогенетических взаимоотношений белков семейства альбуминоидных генов;

2. Построение компьютерной 3D модели АФП человека на основании гомологии с СА и ВДСБ, молекулярный докинг эстрогена (ДЭС) в построенную модель с изучением механизмов связывания гормона;

3. Структурно-функциональное картирование АФП, ЭФР и TGF- человека.

Поиск АФП14–20-подобных мотивов и их фрагментов в других физиологически активных белках, обнаруживаемых в компьютерных базах данных, и анализ аминокислотных замен в них;

4. Изучение методом молекулярной динамики конформационно-динамических свойств аминокислотных остатков в составе прямых и инвертированных АФП14–20–подобных мотивах и их фрагментов;

5. Выявление молекулярных механизмов, лежащих в основе изменения конформационной подвижности аминокислотных остатков в изученных пептидах;

6. Тестирование биологической активности АФП, его гептапептида АФП14–20, его тетра- и пентапептидных фрагментов, а также изучение влияния метода выделения на биологическую активность АФП;

7. Выявление взаимосвязи между биологической активностью изученных пептидов и их конформационно-динамическими свойствами.

Научная новизна. В настоящей работе впервые получена трехмерная модель АФП человека, построенная на основе гомологии сразу с двумя белками – сывороточным альбумином и витамин Д-связывающим белком, с последующей оптимизацией модели с применением метода МД. Валидация модели путем расчетов RMSD (root mean square deviation) и оценки конформационных и стереохимических параметров аминокислотных остатков продемонстрировала её высокое качество и надежность для осуществления последующего докинга лигандов.

Впервые осуществлен молекулярный докинг эстрогенов (ДЭС) в модель 3D структуры АФП и выявлены аминокислотные остатки, формирующие его эстрогенсвязывающий участок, а также сделаны предположения о возможных механизмах взаимодействия между АФП и ДЭС.

комбинированного изучения конформационно-динамических свойств его функционально важных пептидов, анализа роли аминокислотных замен в них и тестирования биологической активности полученных аналогов.

Впервые путем множественного глобального выравнивания первичных структур белков семейства альбумина у разных биологических видов выявлены диагностические для всего семейства аминокислотные остатки. В биологически важных участках АФП наблюдается наименьшая гомология с сывороточным альбумином, что может объяснять отсутствие у последнего специфических функций.

Выявлено пять функциональных классов белков, содержащих АФП14–20подобные мотивы, как в прямом, так и в инвертированном виде. Функциональная аннотация этих белков свидетельствует об их участии в регуляции пролиферации, апоптоза, миграции клеток, ответа на окислительный стресс во время эмбрио- и канцерогенеза. Прямые и инвертированные гептапептидные мотивы оказались связанными консенсусным октапептидным мотивом CXXGY/FXGX, образуя 22членный структурный модуль.

конформационной подвижности гептапептида LDSYQCT (АФП14–20), являющегося одним из функционально важных участков АФП человека, а также его аналогов и пента- и тетрапептидных фрагментов, обнаруживаемых в других белках, участвующих в регуляции пролиферации и апоптоза клеток во время эмбрио- и канцерогенеза (ЭФР, TGF-, PSG и CEA). Впервые выявлена взаимосвязь между гибкостью пептидного остова, оценка которой производилась по значениям характерного времени затухания и остаточной корреляции автокорреляционной функции, и биологической активностью изученных пептидов.

Практическая значимость работы. 3D модель пространственной структуры АФП человека, построенная в настоящей работе in silico на основе гомологии, создает возможности для ее использования с целью дизайна и экспериментального тестирования в условиях in vitro и in vivo новых низкомолекулярных лигандов.

Подтверждена перспективность использования МД методов для изучения и предсказания гибких (или жестких) участков полипептидной цепи, что может быть использовано для создания искусственных белков и пептидов.

Предложены направления для разработки структурных и конформационнодинамических критериев для отбора коротких пептидов, созданных на основе гептапептида LDSYQCT и пента- и тетрапептидных фрагментов, которые могут иметь важное значение для практической медицины.

Усовершенствован метод выделения и очистки альфа-фетопротеина человека с сочетанием экстракции п-бутанолом, высаливания, аффинной хроматографии и гельфильтрации для получения высокоочищенного (99% чистоты) препарата АФП, сохраняющего его нативную структуру и биологическую активность.

Новые лекарственные средства на основе изученных пептидов могут обладать потенциалом для коррекции иммунопатологических состояний, лечения инфекционно-аллергических, аутоиммунных заболеваний, а также могут найти применение в терапии эстрогенрезистентных опухолей. Более того, эти критерии могут способствовать созданию препаратов с противоположными биологическими эффектами.

Основные положения, выносимые на защиту.

Трехмерная (3D) структура АФП человека имеет U-образную форму, в которой выявляется полость, формируемая доменами I и III и содержащая участок связывания эстрогенов. Механизм образования комплекса АФП-ДЭС может включать водородные и гидрофобные взаимодействия.

С использованием системного подхода, комбинацией как экспериментальных, так и вычислительных и биоинформатических подходов изучены структурнофункциональные взаимоотношения и конформационная динамика АФП человека, его эстрогенсвязывающего участка и ЭФР-подобного пептида АФП14–20, а также его аналогов и фрагментов.

Биологическая активность изученных тетра-, пента- и гептапептидов из конформационно-динамических свойств аминокислотных остатков, что, в свою очередь, обусловлено внутримолекулярными взаимодействиями и порядком их чередования в полипептидной цепи.

практические рекомендации применяются в учебном процессе и научнопроизводственной деятельности на кафедре биохимии лечебного факультета ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский университет имени Н.И.Пирогова» Минздрава РФ.

Апробация работы. Результаты, полученные в настоящей работе, доложены и опубликованы в материалах и тезисах следующих Всероссийских и международных конференций: VIII Всероссийский научный форум имени академика В.И. Иоффе «Молекулярные основы иммунорегуляции, иммунодиагностики и иммунотерапии»

молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); Съезды общества биотехнологов России имени Ю.В. Овчинникова (Москва, 2005, 2006, 2008); IV Московский международный Биотехнологический конгресс (Москва, 2007); XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2006); конференции Российской Академии Естествознания (2005, 2006); IX международная научнопрактическая конференция «Достижения фундаментальных наук и возможности трансляционной медицины в решении актуальных проблем практического здравоохранения» (Астрахань, 2013); Annual meetings of International Society of OncoBioMarkers (ISOBM), (Helsinki (Finland), Rhodes (Greece), Pasadena (California, USA), Prague (Czech Republic), Tokio (Japan), Amsterdam (Netherlands), Munchen (Germany), 2004–2011); Moscow conference on computational molecular biology (MCCMB, 2005, 2009, 2011); 38-th Congress of Federation of European Biochemical Societies (FEBS) “Mechanisms in Biology”(Saint Petersburg, Russia, 2013).

Публикации. По результатам, изложенным в диссертации, опубликовано научная работа. Среди них 21 статья в рецензируемых ведущих Российских и международных научных журналах, включенных в перечень ВАК. А также 8 глав в сборниках и монографиях, включая 2 главы в монографиях, изданных в США (NOVA Publishers), и 62 работы в материалах и тезисах научных конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 398 страницах и состоит из следующих разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты собственных исследований и их обсуждение, Заключение, Список литературы, включающий 700 наименований, из них 51 в Российских и в зарубежных изданиях. Диссертация содержит 40 рисунков, 23 таблицы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

обнаружения коротких аминокислотных последовательностей, сходных с гептапептидом LDSYQCT (АФП14-20–подобных мотивов) в составе физиологически активных белков, как в прямом, так и в инвертированном виде. Для этой цели нами были применены алгоритмы GLFASTA (University of Virginia) и Blastp (NCBI) (Lipman and Pearson, 1985; Altschul et al., 1997).

Структурно-функциональную характеристику белков, в составе которых обнаруживались АФП14-20–подобные мотивы, осуществляли с помощью аннотированной базы данных UniprotKB/Swiss-Prot (NCBI). Для каждой позиции прямых и инвертированных АФП14–20–подобных гептапептидных мотивов подсчитывалось абсолютное количество остатков аминокислот. Относительное количество замен подсчитывалось для каждой позиции в % от общего числа (300) извлеченных с помощью алгоритма GLFASTA белков, содержащих АФП14–20– подобные мотивы по формуле (1): S = (n/ N) x 100%, где n – количество каждого типа а.о. в данной позиции, N – общее количество извлеченных белков.

выравнивания осуществляли использованием программы ClustalW2 (версия 2.1) (Larkin et al., 2007) с использованием матрицы Gonnet. Степень гомологии в каждой паре последовательностей оценивали путем определения степени идентичности и общего сходства с использованием следующих формул:

степень идентичности = (ni/ N) x 100% (2), общее сходство = (ni+nc)/N x 100% (3), где ni – количество идентичных а.о., nc – количество консервативных замен, N – длина выравниваемых последовательностей с учетом пробелов (гэпов).

Оценка доли аминокислотных различий (Р) производилась по формуле (4):

Р= (nn /N) x 100%, где nn – количество неидентичных а.о.

Так как в течение эволюционного времени в каждой позиции замены могли происходить неоднократно, для учета возможных множественных замен в каждой позиции, была проведена оценка доли аминокислотных различий на сайт по формуле (5): D(p) = –ln (1– P).

Моделирование трехмерной (3D) структуры альфа-фетопротеина человека на основании гомологии. Для построения 3D модели АФП в качестве шаблона были использованы трехмерные структуры СА и ВДСБ человека, экспериментально установленные с помощью рентгеноструктурного анализа с высоким разрешением:

2.6 и 2.15, соответственно. Они были извлечены из базы данных PDB (Protein Data Bank): шифры белков 1E78 для СА и 1KW2 для ВДСБ. Возможность использования этих двух белков в качестве шаблонов обеспечивается: 1) высокой степенью гомологии (40% идентичности между АФП и СА человека), 2) наличием сходных с АФП функций, 3) экспериментально установленное высокое сходство элементов вторичной структуры и 4) высокое разрешение 3D структур СА и ВДСБ, аминокислотных последовательностей АФП, СА и ВДСБ было проведено с использованием компьютерной программы ClustalW (версия 2.1) (Larkin et al., 2007).

Построение модели осуществляли с использованием программного пакета MODELLER 9v6 (Zhang and Skolnick, 2005; Eswar et al., 2006). Построенную модель сохраняли в виде выходного файла PDB, в дальнейшем визуализировали и анализировали с помощью программного пакета UCSF Chimera. Для оптимизации модели применяли метод молекулярной динамики с помощью программного пакета GROMACS (версия 3.3.1) при длине траектории 5 нс (Berendsen et al., 1995).

Оценку качества модели (валидацию) проводили двумя методами. Первый – расчеты значений среднеквадратичного отклонения (RMSD – root mean square deviation) для расстояний между соответствующими атомами построенной 3D модели АФП человека и той же модели в течение 5 нс МД. Второй метод основан на оценке конформационных и стереохимических параметров аминокислотных остатков модельного белка с использованием программного пакета PROCHECK (версия 3.5).

Метод молекулярного докинга. Докинг молекулы эстрогена (ДЭС) в построенную модель проводили с помощью программы Autodock (версия 4.0).

Использовали полугибкую разновидность докинга, где вся молекула белка оставалась жесткой, лишь а. о. Q428, M448, R452, V543 и T547 придавалась подвижность.

Протокол докинга: 10 независимых повторов для каждого лиганда с использованием исходной популяции из 100 случайно расположенных лигандов.

2,5x106 значений оценки энергии; максимальное значение итераций – 27 000.

Скорость (вероятность) изменений (mutation rate) была задана равной 0,02, а доля пар, обменивающихся информацией (crossover rate) – 0,80. Размер шага составлял 0, для перемещений (translations), 5,0° для кватернионов (quaternions) и 5,0° для двугранных углов. Допустимое отклонение для кластера (cluster tolerance) было задано равным 0,5, значение внешней энергии системы поддерживалась равным 1000 ккал с максимальным значением исходной энергии 0,0 ккал. Значение вероятности для произведения локального поиска каждого индивидуума в популяции составляло 0,06, с максимальным значением итераций для каждого поиска, равным 300. Выбор конформаций осуществлялся с использованием алгоритма Lamarckian Genetic Algorithm (LGA). 10 лучших конформаций кластеризовались в группы со значением RMSD ниже, чем 1,0. Кластеры упорядочивались по минимальному значению энергии отдельных конформеров в каждом кластере.

Расчеты с помощью метода молекулярной динамики. Модели молекул изучались в полноатомном приближении с применением потенциального поля Amber (Pearlman et al., 1991; Cornell et al., 1995). Параметры потенциального поля дополнялись экспериментальными данными, а также результатами квантовохимических расчетов с помощью программного комплекса GAMESS (Schmidt et al., 1993). Использовался ограниченный метод Хартри-Фока с базисным набором 6–31GF (Hinchliffe, 2000).

Расчеты МД осуществляли с использованием программного пакета Modyp (Шайтан, 1997a, 1997b) и следующего протокола: длина траектории 10 нс, температура Т=2000К (для достижения эргодичности траекторий (Шайтан и др.

1997а, 1997b, 1999; Вестерхофф и ван Дам, 1992) и ускорения сканирования конформационного пространства репрезентативной точкой). Для поддержания постоянства температуры использовали термостат Берендсена с постоянной времени изменения скорости =0,5 (Berendsen, et al., 1981, 1984) и столкновительный термостат с массой виртуальных частиц 18Да и частотой их столкновений с атомами изучаемой молекулы 55 пс-1 (Lemak and Balabaev, 1995, 1996) Диэлектрическая проницаемость среды была равна = 1, 10 или 80. Использовалась кубическая периодическая система с размерами ящика 100x100x100. Радиусы обрезания для: а) электростатических взаимодействий Rel=21, б) Ван-дер-Ваальсовых взаимодействий RVdW=16,8, в) водородных взаимодействий RHB=13,65. Шаг интегрирования: = фс, шаг записи в траекторный файл 0,1 пс. Для численного интегрирования использовался алгоритм Верле. Начальные скорости атомов определялись с помощью генератора случайных чисел с использованием распределения Максвелла.

Обработка траекторий, полученных методом МД. Анализ и оценка конформационных и динамических свойств молекул проводились с помощью двуD) и трехмерных (3D) карт уровней свободной энергии (сечений Паункаре), а также графиков автокорреляционных функций. Если 2D- и 3D-карты уровней свободной энергии позволяют выявлять вероятные конформации и их изменения, то значения остаточной корреляции и характерного времени затухания () автокорреляционных функций – оценивать подвижность аминокислотных остатков и гибкость пептидов.

2D и 3D распределения плотности вероятности реализации конформаций для всех сочетаний углов, и вычисляли по формуле (6):

где n,m – набор динамиче ских переменных, p(1,…,i,…N) – плотность вероятности обнаружить систему в заданной точке конфигурационного пространства.

Динамическое поведение индивидуальных конформационных степеней свободы молекулы оценивалось с помощью автокорреляционных функций двугранных углов специального вида. Нормированные автокорреляционные функции вычислялись согласно формуле (7):

где – значения торсионного угла в моменты времени t и t+. Необходимая информация содержится в зависимости действительной части автокорреляционной функции Re(Fxx) от времени. Автокорреляционные функции позволяют судить о характерных временах движения и типах динамики торсионных углов.

Для оценки степени различия (или сходства) между картами уровней свободной энергии или автокорреляционными функциями нами был использован кластерный анализ с построением кластерного дерева. В качестве меры различия между кластерами использовали эвклидово расстояние. Для построения кластерного дерева использовался алгоритм выбора минимальных расстояний. Степень сходства между двумерными картами уровней свободной энергии в координатах (, ) оценивалась согласно формуле (8):

где r и s соответствуют разным аминокислотным остаткам, а – параметр разбиения, p – плотность вероятности.

Для построения 2D и 3D карт уровней свободной энергии, а также графиков автокорреляционных функций и кластерных деревьев использовали программный полученных с помощью метода молекулярной динамики, осуществляли с помощью программного обеспечения VMD (Visual Molecular Dynamics).

Экстракция АФП из биологического материала. В качестве источника АФП человека использовали плацентарную кровь. Выделение АФП из биологического материала производилось путем высаливания сульфатом аммония с последующей экстракцией липидов 20% раствором п-бутанола. Белковую фракцию, содержащую АФП, вновь осаждали сульфатом аммония. Смесь центрифугировали, осадок отбирали, растворяли в буферном растворе и подвергали диализу.

хроматографии. Сорбент для проведения аффинной хроматографии был синтезирован на основе сефарозы CL-6B, к которому ковалентно был пришит ДЭС. Элюция связавшихся белков осуществлялась 7% раствором п-бутанола в буферном растворе.

Гель-фильтрация. Элюат подвергали хроматографии на КонА-сефарозе и получали препарат АФП-I, а в последующем – гель-хроматографии на сорбенте Сефакрил S200 в 10мМ растворе К-фосфатного буфера (pH=8,0), содержащем 2М KCl (препарат АФП-S) или 0,01% тритона-Х100 и 0,01% твина-80 (препарат АФП-T).

Диск-электрофорез. Степень чистоты полученных препаратов определяли методом аналитического диск-электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) в градиенте плотности акриламида (5–19%) в денатурирующих условиях (в присутствии 2% SDS).

дивинилбензола с 4-гидроксиметилфеноксиметильной якорной группой (смола Ванга). Полученные пептиды очищали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с обратной фазой.

периферической крови здоровых доноров и больных инфекционно-аллергическим миокардитом и атопической бюронхиальной астмой в стадии обострения без соответствующей терапии с использованием стероидных противовоспалительных и цитостатических препаратов. Лимфоциты выделяли в одноступенчатом градиенте плотности фикол/верографина в стерильных условиях по методу Boyum (1968).

Реакция бласттрансформации лимфоцитов. Биологическую активность АФП и пептидов, полученных методом твердофазного синтеза, изучали в реакции бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) для оценки их спонтанной или ФГАиндуцированной пролиферации у здоровых доноров.

Тест естественной цитотоксичности лимфоцитов. Клетки-мишени (линия эритромиелодных клеток K-562) смешивали с клетки-эффекторами в соотношении 50:1 и инкубировали в течение 60 мин. с 3Н-уридином (10 мкКи/кл.) в присутствии или без пептида. Радиоактивность подсчитывали на сцинцилляционном счетчике в импульсах в минуту. Подсчет лизиса клеток-мишеней (в %) проводили по формуле (9): N = (1 – (A – B)/(C – A) x 100, где A – радиоактивность в присутствии клетокэффекторов, B – общая радиоактивность (после обработки клеток-мишеней тритоном X-100), C – спонтанная радиоактивность (в отсутствии клеток-эффекторов).

Метод непрямой иммунофлюоресценции осуществляли с использованием меченых с помощью FITC (fluorescein isothiocyanate) моноклональных антител.

активированных Т-лимфоцитов у здоровых доноров и у больных иммунопатологиями (в сотрудничестве с кафедрой патофизиологии РНИМУ имени Н.И. Пирогова).

дифференцировки CD23, CD25, CD71, HLA-DR, CD95 и его лиганда CD95L вычисляли в процентах от общего их количества. Препарат микроскопировали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам И-3". В каждой лунке считали не менее 200 клеток, исключая клетки с соответствующие поверхностные маркеры.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Филогенетический анализ белков семейства альбуминоидных генов.

Попарное выравнивание полных (незрелых) аминокислотных последовательностей белков семейства альбуминоидных генов у разных биологических видов было произведено с использованием алгоритма ClustalW2 (версия 2.1) между парами белков, для которых были обнаружены полные первичные структуры в базе данных UniprotKB/Swiss-Prot. Подсчет степени сходства между парами белков показал, что у всех изученных биологических видов наблюдается одна и та же тенденция, а именно убывание степени идентичности в ряду: АФП-альбумин, АФП-афамин, альбуминафамин, альбумин-ВДСБ, АФП-ВДСБ и афамин-ВДСБ. При этом, наибольшая гомология у млекопитающих характерна для пары АФП-альбумин у человека – степень идентичности достигает 40,0%. Филогенетическое дерево, построенное на последовательностей белков семейства с применением метода объединения ближайших соседей (Neighbor-joining), представлено на Рис. 1. Длины ветвей дерева рассчитывались как количество аминокислотных замен на сайт.

Множественное выравнивание 29 белков семейства альбуминоидных генов у всех биологических видов было осуществлено с целью выявления консервативных а.о., а также обнаружения диагностических для данного семейства остатков аминокислот. Выяснилось, что для всех белков семейства характерно достаточно высокое сходство в участках связывания гидрофобных лигандов – жирных кислот, эстрогенов и билирубина, а также тяжелых металлов. Это подтверждается наличием общих функциональных свойств у белков данного семейства – связывание и транспорт различных гидрофобных лигандов и ионов тяжелых металлов, что было продемонстрировано экспериментально (Parmelee et al., 1978; Hsia et al., 1980; Aussel and Masseyeff, 1983; Aussel and Negrel, 1986; Iturralde et al., 1991; Peters, 1995; RuizGutierrez et al., 2001).

Рис. 1. Филогенетическое дерево семейства альбуминоидных генов, построенное с применением метода Neighbor-joining. Приведены шифры и кодовые названия белков в базе данных Swiss-ProtKB/UniProt. Через двоеточие даны расстояния от точки расхождения (длина ветви).

В то же время в специфических для АФП функционально важных участках, таких как иммуномодулирующий гептапептид LDSYQCT (АФП14–20), пептид, ингибирующий рост опухолей (GIP – growth inhibitory peptide, а.о. 464–497), сегмент главного комплекса гистосовместимости (а.о. 542–550) сходство с другими белками семейства не обнаруживается. Это подтверждается данными о том, что альбумин и ВДСБ не обладают теми видами активности, за которые ответственны вышеназванные участки.

Нами также выявлено четыре высококонсервативных аминокислотных остатка, обнаруживаемых в одной и той же позиции во всех (100%) из 29 выровненных аминокислотных последовательностей. Это следующие остатки: D261, R360, P440 и Интересно, что остаток аспарагиновой кислоты (D261) входит в состав L447.

интегринсвязывающего мотива LDV, а остаток лейцина (L447) располагается в предполагаемом высокоаффинном эстрогенсвязывающем участке. Эти аминокислотные остатки, наряду с характерно расположенными остатками цистеина и сдвоенных цистеинов, могут считаться диагностическими для всего семейства.

Построение трехмерной (3D) модели АФП человека в комплексе с ДЭС.

Высокая степень гомологии между АФП и ЧСА (40% идентичности и около 60% суммарного сходства с учетом консервативных замен (Рис. 2)), а также экспериментально установленное сходство элементов их вторичной структуры позволяет использовать их в качестве шаблона для построения 3D модели АФП человека.

Рис. 2. Результат попарного выравнивания аминокислотных последовательностей АФП и СА человека. Идентичные а.о. указаны между двумя последовательностями, + означает консервативные замены.

Этому способствует также высокое разрешение пространственных структур, установленных для ЧСА и ВДСБ методом рентгеноструктурного анализа и сходство их функций. При этом наибольшая степень идентичности между АФП и ЧСА (48%) наблюдается в домене III, в котором, во-первых, предположительно, располагается эстрогенсвязывающий участок АФП, а во-вторых, близко к значению (около 50% и выше), которое обеспечивает высокое качество моделирования на основании гомологии с белком-шаблоном (Chothia and Lesk, 1986).

Визуализация полученной модели с использованием программного пакета UCSF Chimera (Pettersen et al., 2005) позволила выявить U-образную 3D структуру АФП человека, в которой обнаруживается полость, формируемая доменами I и III (Рис. 3). Стенки этой полости образованы четырьмя -спиральными участками, которые включают а.о. 144–158, 442–460, 466–490 и 542–559. Таким образом, архитектура полученной нами модели соответствует данным, полученным экспериментально с помощью электронной микроскопии и кругового дихроизма, показавшими существование трех областей плотности масс: две по краям и одна на вершине (Luft and Loscheider, 1983; Peters, 1996). Эти области соответствуют трехдоменной структуре АФП.

Рис. 3. Трехмерная структура АФП человека, построенная с помощью программного пакета MODELLER9v6 на основе гомологии с ЧСА и ВДСБ с указанием элементов вторичной структуры. а) Остов полипептидной цепи: показаны -спиральные участки и неупорядоченные структуры. б) Поверхность модели. Слева N-конец, справа – С-конец полипептидной цепи. I, II и III – глобулярные домены.

Валидация построенной модели была произведена двумя способами: 1) путем оценки стереохимических параметров аминокислотных остатков и 2) расчетов среднеквадратичного отклонения (RMSD). Анализ карты Рамачандрана, построенной программного пакета PROCHECK (версия 3.5), показал, что комбинации значений двугранных и для всех аминокислотных остатков (т.е. конформация остова полипептидной цепи) соответствуют значениям, наблюдаемым в природных белках.

Расчет значений RMSD проводили в ходе 5 нс МД расчетов для расстояний между C-атомами части остова полипептидной цепи, представленной -спиралями, расположенными в полости, предположительно, содержащей эстрогенсвязывающий участок. График RMSD для четырех вышеуказанных -спиралей показан на Рис. 4, а.

На рисунке видно, что значения RMSD стабилизируется через 500 пс и варьируют в пределах 0,3–0,4 нм. Эти колебания объясняются внутренней динамикой белковой молекулы и низкочастотными флуктуациями -спиралей относительно друг друга в условиях растворителя в явно заданном виде. Оценка стереохимических параметров показала, что количество остатков с неправильной геометрией (R121, F202, Q291, K304, K384, C500, F533, T564 и E566) составляет всего 1,53% от общего количества а.о. в АФП. Элементы вторичной структуры, выявленные с помощью программы PROCHECK, соответствовали -спиралям (69%) с отсутствием -структур (Рис. 4, б), что согласуется с экспериментальными данными (до 67% -спиралей).

Рис. 4. а) Изменения со временем среднеквадратичных отклонений (RMSD), рассчитанных для четырех -спиралей, расположенных в полости модели 3D структуры АФП человека и включающих аминокислотные остатки 144–158, 442–460, 466–490, 542–559.

б) Карта Рамачандрана, построенная с помощью программы PROCHECK (версия 3.5). Карта показывает комбинации двугранных углов для аминокислотных остатков (показаны черными квадратиками) построенной модели АФП человека. Области наиболее предпочтительных конформаций показаны красным (обозначены A, B, L), разрешенных конформаций – желтым (обозначены a, b, l, p), допустимых – песочным (обозначены –a, -b, -l,-p).

конформационными свойствами), в структуре АФП обнаружено 540 а.о., из которых конформации 498 (92,2%) остатков располагаются в наиболее предпочтительных областях. Еще 41 остаток (7,6%) имеет разрешенную конформацию, и только один остаток (A39) имеет невыгодную конформацию. Количество остатков глицина оказалось равным 26, а остатков пролина – 21 (Рис. 5).

Стабильность структуры предположительного эстрогенсвязывающего участка, показанная с помощью расчетов RMSD, и хорошие стереохимические показатели его аминокислотных остатков позволяют осуществить докинг (посадку) лиганда в соответствующий участок построенной 3D модели АФП. Нами был использован полугибкий докинг, в котором структуры гормона и всего белка задавались жесткими, за исключением следующих аминокислотных остатков: Q428, M448, R452, V543 и T547, которым придавалась подвижность.

Рис. 5. Стереохимические параметры аминокислотных остатков в 3D модели АФП человека для остатков с 421 по 520 и с 521 по 605. На диаграммах красные столбцы соответствуют аминокислотным остаткам с неправильной геометрией (всего по всей длине полипептидной цепи 9 остатков или 1,53%). Показаны также элементы вторичной структуры (-спирали) и области, доступные для растворителя.

Обнаружено, что ДЭС садится на -спираль, формируемую остатками с 442 по 460 (Рис. 6, а) и локализуется между а.о. S445, R452 и E551, с которыми возможно образование водородной связи. Кроме того, ДЭС располагается близко к остаткам M448, A449 и V543, которые могут участвовать в образовании гидрофобных взаимодействий. Наименьшие расстояния наблюдались между центрами атомов кислорода (OG) остатка серина S445 и водорода первого гидроксила (HO1) ДЭС (1, ), а также между центрами атомов кислорода (OE1) остатка глутаминовой кислоты E551 и водорода второго гидроксила (HO2) молекулы гормона (1,69 ). Таким образом, результаты молекулярного докинга показывают, что взаимодействие с гормоном может осуществляться с участием субдоменов IIIA и IIIB АФП.

Термодинамическая характеристика связывания показала наименьшее значение свободной энергии (для лучшего комплекса АФП–ДЭС) равное –4,24 ккал/моль.

Полученный в результате докинга комплекс АФП–ДЭС с наименьшим значением свободной энергии далее был подвергнут релаксации с использованием метода молекулярной динамики с длиной траектории 5 нс. Визуализация комплекса АФП–ДЭС (Рис. 6, б) показала, что молекула гормона меняет свое положение в ходе расчетов молекулярной динамики и располагается между субдоменами IB, IIIA и IIIB.

Наименьшие расстояния наблюдались между центрами масс ароматических колец ДЭС и боковых радикалов остатков лейцина L138 и метионина M448 (около 0,5 нм).

Рис. 6. а) Докинг ДЭС в структуру 3D модели АФП человека; б) Аминокислотные остатки эстрогенсвязывающего участка АФП, выявленные методом молекулярные динамики.

Молекулярная динамика подтвердила возможное участие остатков S445, R и E551 в водородных взаимодействиях. Как видно на рис. 7,в и 7,г после 2 нс молекулярной динамики расстояния между атомами кислорода гидроксильных групп ДЭС и атомами кислорода боковых радикалов серина и глутаминовой кислоты (S и E551) проявляют тенденцию к снижению и достигают 0,4 нм, что свидетельствует о возможности водородных взаимодействий. Необходимо отметить, что расстояния оценивались между центрами тяжелых атомов (кислорода), т.е. с учетом Ван-дерВаальсовых радиусов атомов кислорода (1,35) и водорода (1,0), и также длины связи О–Н (0,96), эти расстояния могут быть достаточными для водородных связей.

Таким образом, можно сделать предположение о том, что связывание диэтистильбэстрола с АФП осуществляется благодаря двум типам взаимодействий.

Это 1) водородные с участием гидроксильных групп ДЭС и атомов кислорода боковых радикалов остатков S445, R452 и E551; 2) гидрофобные взаимодействия между ароматическими кольцами ДЭС и боковых радикалов остатков L138, M448 и M548 альфа-фетопротеина человека.

Рис. 7. Изменения расстояний между функциональными группами ДЭС и аминокислотных остатков АФП человека во времени в течение 5 нс МД. Графики а) и б) показывают возможность гидрофобных взаимодействий между центрами масс атомов, образующих ароматическое кольцо A гормона и боковых радикалов остатков лейцина L (а) и метионина M448 (б). Графики в) и г) показывают расстояния для водородных взаимодействий между центрами атомов кислорода OE1 остатка E551 и второй гидроксильной группы (OH2) ДЭС (в), а также атомов кислорода OG остатка S445 второго гидроксила (OH2) ДЭС (г).

Поиск АФП14–20-подобных мотивов. Нами составлена структурнофункциональная карта АФП человека, в которой были обобщены, дополнены и уточнены ранее полученные данные (Рис. 8). В составе АФП человека выявлено множество функционально важных участков, активность части из которых лишь предсказана, а другой части – подтверждена в различных экспериментальных моделях in vitro и in vivo. Среди них – гептапептид АФП14–20 (LDSYQCT), являющийся объектом наших исследований.

функционировании, мы провели поиск АФП14–20–подобных мотивов в использованием алгоритма GLFASTA нами было извлечено 300 белков, содержащих прямые АФП14–20–подобные мотивы, большинство из которых, так или иначе, принимают участие в процессах эмбрионального развития и опухолевого роста.

Белки, содержащие АФП14-20–подобные мотивы (Рис. 9), были отнесены к следующим функциональным классам: а) факторы транскрипции (22% от общего количества извлеченных белков); б) ферменты, преимущественно, оксидоредуктазы и ферменты, участвующие в биосинтезе белка и нуклеиновых кислот (40%); в) белки клеточной адгезии и их рецепторы (14%); в) факторы роста, их рецепторы и внутриклеточные эффекторы (10%); д) белки, участвующие в транспорте и внутриклеточной локализации других белков (9%); е) а также анти- и проапоптотические белки (5%).

Белки, содержащие АФП14-20-подобные мотивы Участники транспорта белков Анти- и проапоптотические белки Рис. 9. Диаграмма, показывающая соотношение (в %) белков, содержащих АФП 14-20 – подобные мотивы.

Анализ аминокислотных замен в составе выявленных АФП14-20–подобных мотивов показал, что наиболее консервативными являются остатки цистеина (C19), тирозина (Y17) и аспарагиновой кислоты (D15), которые очень редко или довольно редко подвергаются заменам. Так, в 99,0% из 300 извлеченных АФП14-20–подобных мотивов остаток цистеина сохраняется, он подвергается заменам только трижды (на S, T, Q). Остаток тирозина сохраняется в 78,3% мотивов и может заменяться, преимущественно, на остатки фенилаланина (около 6%) и серина (около 4%). Повидимому, в этом положении важно наличие как ароматического бензольного кольца, так и гидроксильной группы. Остаток аспарагиновой кислоты оказывается сохранным в 77,7% мотивов и наиболее часто заменяется на глутаминовую кислоту (7%), что свидетельствует о важной роли отрицательно заряженной функциональной группы в этом положении.

Остаток серина (S16) чаще всего заменяется на остатки треонина и лизина, а также на отрицательно заряженные а.о. и их амиды – D, E, N и Q. В целом, а.о., способные принимать участие в образовании водородных связей (S, T, Q, N, K, R и H) составляют 79% от общего количества а.о. этом в положении. Остаток глутамина (Q18) является достаточно вариабельным и довольно часто подвергается заменам, в основном, на гидрофильные и заряженные (как отрицательно, так и положительно) а.о. Однако, и в этом положении (Q18) также преимущественно (81%) располагаются а.о., способные участвовать в образовании водородных связей. Нами было сделано предположение о том, что в гептапептиде АФП14-20 остатки серина и глутамина могут быть задействованы в образовании внутримолекулярных водородных связей.

АФП14-20-подобные мотивы, но уже в инвертированном виде, обнаруживаются в составе ряда факторов роста семейства ЭФР и других физиологически активных белков, содержащих ЭФР-подобные модули. Например, последовательности RCEHADL (а.о. 40–46) в составе TGF-, RCERVDL (а.о. 40–46) в составе бетацеллюлина, PCRDKDL (а.о. 5–11) в составе NRG-3, а также RCQYRDL (а.о. 41– 47) в составе самого ЭФР человека (Рис. 10). При этом прямые и инвертированные мотивы оказываются связанными через октапептидный консенсусный мотив, общая формула которого для разных последовательностей определена как CXXGY/FXGX.

Таким образом, в составе ряда физиологически активных белков обнаруживается 22членный структурный мотив. Эти белки также оказались регуляторами эмбрио- и канцерогенеза. Как будет продемонстрировано ниже, прямые и инвертированные мотивы могут содержать а.о. необходимые для связывания с рецептором, т.е могут иметь важное функциональное значение.

Рис. 10. Первичная структура ЭФР человека с картированием линейных функционально важных участков. Показаны прямой и инвертированный АФП14-20-подобные мотивы, связаны октапептидом CVVGYIGE (мотивом CXXGY/FXGX). Нумерация а.о. дана для зрелой молекулы (в скобках указаны номера N- и C-концевого а.о. в полной молекуле). * – отмечены аминокислотные остатки, участвующие в связывании с рецептором. Остаток N представляет собой шарнирный участок.

В составе некоторых белков фетоплацентарного комплекса, принадлежащих к суперсемейству иммуноглобулинов, а именно трофобластспецифического бетаглобулина (ТБГ или PSG–pregnancy specific -1-glycoprotein) и раковоэмбрионального антигена (РЭА или CEA – carcinoembryonic antigen) (Brumm endorf and Rathjen, 1994;

Zebhauser et al., 2005; McLellan et al., 2005a), нами были обнаружены тетра- и пентапептидные мотивы, сходные с фрагментами гептапептида LDSYQCT (АФП14– Это четыре пентапептида в составе PSG человека (PYECE, PYQCE, LYVCS и 20).

LYACS) и один пентапептид SYKCE (а.о. 213–217) в CEA человека.

Конформационно-динамические свойства аминокислотных остатков в гептапептиде LDSYQCT, его аналогах и фрагментах. Для выяснения роли отдельных аминокислотных остатков в функционировании исследованных нами пептидов были изучены конформационно-динамические свойства гептапептида LDSYQCT, его аналогов, а также тетра- и пептапептидных фрагментов и их аналогов.

Были изучены также конформационно-динамические свойства гептапептидного фрагмента ЭФР, его 22-членного модуля, а также инвертированных АФП14–20– подобных мотивов ЭФР и других белков, содержащих ЭФР-подобные модули (всего 44 пептида, обозначенные P1–P44). Их свойства изучались в сравнении с гептапептидом LDSYQCT, обозначенном как исходный пептид P5.

Гибкость полипептидной цепи и изменения конформации белков и пептидов обуславливается вращениями вокруг валентных связей N–C, C–C C–C, или изменениями двугранных (торсионных) углов, и 1, соответственно (Gowariker et al., 1986). В настоящей работе оценку наборов вероятных конформаций в пептидах осуществляли путем анализа дву- и трехмерных (2D и 3D) карт уровней свободной энергии, или сечений Пуанкаре в координатах (,, и ). Эти карты, в отличие от карт уровней потенциальной энергии (Рамачандрана), учитывают вклад энтропийного фактора в стабилизацию конформаций. Динамические свойства а.о., т.е. их подвижность, и гибкость цепи оценивались с помощью значений остаточной корреляции и характерного времени затухания автокорреляционной функции. Для сравнительной оценки конформационно-динамических свойств а.о. в одном и том же положении в составе разных пептидом применялся кластерный анализ.

Влияние точечных замен консервативных аминокислотных остатков. В первой серии МД расчетов нами были изучены аналоги гептапептида АФП14–20, полученные с помощью замен наиболее консервативных а.о., выявленных локального выравнивания с применением алгоритма GLFASTA. Это остатки в положениях 15, и 19. На рис. 11 показаны 2D карты уровней свободной энергии для аминокислотных остатков гептапептида LDSYQCT (пептида Р5) и его аналогов (пептидов Р1–Р4 и Р6– Р12), полученных с помощью точечных замен остатков аспарагиновой кислоты, тирозина и цистеина. Более темные области соответствуют областям с минимумами свободной энергии с наибольшей плотностью вероятности реализации конформаций.

2D карты уровней свободной энергии для остатка аспарагиновой кислоты (D15) в составе исходного пептида Р5 имеет вытянутый контур с двумя локальными минимумами свободной энергии вокруг значений =–60, =–45 и =–120, =+150, соединенными перешейком при =–90, =+60. Первый минимум соответствует конформациям правых - и 310-спирали, а второй -структуры. Переход между этими двумя конформациями осуществляется через образование правой 2 7-спирали. 2D карты для остатков серина (S16), тирозина (Y17) и цистеина (С19) в составе пептида P5 имеют один глубокий энергетический минимум вокруг =–60, =–45 (правые и 310-спирали), связанный с дополнительным неглубоким минимумом при =+60, =–30, соответствующим левой 310-спирали.

Рис. 11. Двумерные (2D) карты (в координатах, ) уровней свободной энергии (сечения Пуанкаре) для аминокислотных остатков в пептиде LDSYQCT и его аналогах.

Изменения в конформационных свойствах аналогов гептапептида АФП 14– оценивались путем сравнения 2D и 3D карт аминокислотных остатков в одном и том же положении изучаемых пептидов. Пептиды Р1 и Р2, были получены путем точечных замен тирозина на фенилаланин или серин, т.е. Y17F и Y17S, соответственно (Табл. 1). Эти замены часто встречаются в природных белках, содержащих АФП14–20–подобные мотивы, демонстрируя важность как ароматического бензольного кольца, так и гидроксильной группы в этом положении, что подтверждается сходством конформационного поведения остатков Y, F и S в разных аналогах. Замены Y17F и Y17S существенно не изменяют картины распределения уровней свободной энергии для всех рассматриваемых остатков, кроме появления перешейков между минимумами свободной энергии на 2D карте цистеина (С19) в составе пептида Р1 вокруг =–120, =–120, а в случае пептида Р около =+120, =–45, которые связывают соседние минимумы вдоль угла.

Таблица 1. Изменения конформационно-динамических свойств аналогов гептапептида LDSYQCT – фрагмента альфа-фетопротеина человека (пептида АФП 14–20) Обозна- Точечная Аминокислотная Изменение физико- Изменение конформационной P P P Примечание: Нумерация а.о. дана для зрелой молекулы АФП человека. Полужирным шрифтом выделены замены а.о. Гидрофобность а.о. оценена согласно Kyte and Doolitle, 1982.

В пептиде P3 замена Q18E изменяет 2D карты для остатков серина (S16) и тирозина (Y17). На этих картах по сравнению с картами пептида Р5 минимум вокруг =–60, =–45 становится менее выраженным, но появляется новый глубокий локус при =–150, =+150, соответствующий образованию -структуры. Замена цистеина на аланин (Р4) не изменяет существенно 2D карт уровней свободной энергии всех остатков, однако конформационная подвижность у аланина больше, чем у цистеина.

2D карта остатка Y17 в составе пептида Р6, по сравнению с исходным пептидом Р5, содержит дополнительный минимум вокруг =–120, =–30, что лежит на границе между правыми - и -спиралями. Замена цистеина на серин (Р7) сопровождается небольшими, но заметным увеличением набора вероятных конформаций для всех остатков. Пептид Р8 был образован путем точечной замены S16V. Эта замена приводит к уменьшению набора вероятных конформаций а.о. в положениях 15 и 16. Заметные изменения 2D карт почти всех остатков наблюдается в пептиде Р10, который был получен путем замены отрицательно заряженной (D) на незаряженную (N) аминокислоту с тем размером боковой цепи.

Химическая модификация (P11) и образование дисульфидной связи (P12) увеличивают набор вероятных конформаций для остатка цистеина C19. При этом конформационная подвижность других а.о. практически не изменяется, за исключением Y17 в составе димерного пептида Р12 у которого увеличением набора вероятных конформаций. На рис. 12 представлены графики зависимости от времени действительной части автокорреляционных функций для торсионных углов, и.

На рисунке видно, что значение остаточной корреляции зависит от типа а.о. в том или ином положении и типа торсионного угла. Для остатка в положении 15 наибольшее значение остаточной корреляции наблюдается при вариации угла (Рис. 12, а). При этом во всех пептидах это значение близко к 0,4, за исключением Р10 (0,2), содержащего замену D15N. Во всех пептидах =10–20 пс. Значение остаточной корреляции для торсионного угла приближается к нулю в составе всех пептидов, за исключением Р8 со значением 0,2 (Рис. 12, б). Таким образом, замена S16V приводит к ограничению подвижности соседнего остатка D15. Наименьшее значение остаточная корреляция имеет в пептидах Р7 (C19S) и P10 (D15N). Подвижность N15 в пептиде P10 увеличивается по сравнению с D15 в пептиде Р5. Замена C19S в пептиде P7 также сопровождается увеличением подвижности D15.

Для остатков в положении 16 значение остаточной корреляции для торсионного угла во всех пептидах группируется около 0,2, за исключением Р (0,3). Это свидетельствует об ограниченности подвижности валина по сравнению с серином, находящимся в положении 16 у всех остальных пептидов. Характерное время затухания =20–40 пс. При вращении по углу наблюдается большой разброс значений остаточной корреляции – от нуля в Р3 до 0,5 в Р8 (Рис. 12, в). Это подтверждает ограниченность подвижности валина и увеличение подвижности серина в пептиде Р3, обусловленное заменой Q18E. Динамическое однообразие для всех пептидов демонстрируют автокорреляционные функции торсионного угла со значением остаточной корреляции, близким к нулю, и =3–5 пс. Исключение конформационного перехода для валина с =30 пс (Рис. 12, г).

Рис. 12. Зависимость от времени действительной части автокорреляционных функций двугранных углов (а), (б, в, д) и (г, е) для остатков в положениях 15 (а, б), 16 (в, г), (д) и 19 (е) в составе пептида P5 (LDSYQCT) и его аналогов. На рисунке видно, что значение остаточной корреляции зависит от типа а. о. в том или ином положении и типа торсионного угла.

Для автокорреляционной функции торсионного угла значения остаточной корреляции остатков в положении 17 во всех пептидах колеблются от 0,2 до 0,3 с минимальным значением 0,1 для пептида Р12. Для угла наблюдается динамическое однообразие во всех пептидах, за исключением E17 в пептиде Р3, и Q17 в пептидe Р10, содержащем замену D15N (Рис. 12, д), характеризующися наибольшей подвижностью. Графики автокорреляционных функций торсионных углов и остатков в положении 19 показывают особенность динамического поведения глицина и серина в этом положении (пептиды Р6 и Р7, соответственно), демонстрирующих наибольшую подвижность. Автокорреляционные функции торсионного угла показывает наибольшую подвижность (Рис. 12,е), наряду с глицином и серином, также и аланина в этом положении (в составе пептида Р4).

внутримолекулярных взаимодействий в изменении конформационно-динамических свойств гептапептида LDSYQCT были получены его аналоги (пептиды Р14–Р22, P24) с помощью следующих точечных замен а.о. (Табл. 2): а) лейцина в положении 14 – это L14H, L14P и L14T (пептиды P14, P22 и P24, соответственно); б) аспарагиновой кислоты в положении 15 – это D15G (пептид P21); в) серина в положении 16 – это S16A и S16K (пептиды P15 и P16); г) глутамина в положении 18, а именно, Q18A и Q18R (пептиды P17 и P20); а также д) треонина в положении 20 – это T20R (P18) и T20V (P19). Кроме того, были получены следующие пептиды: IMSYICS (P13) – участка домена II АФП человека (а.о. 266–272 в зрелой молекуле); PGSYQCT (P23), полученный путем двойной замены – L14P и D15G; а также LDKYACN (P25), представляющий собой часть (а.о. 26–32) рецепторсвязывающего участка эпидермального фактора роста (ЭФР). Конформационные и динамические параметры оценивались аналогично тому, как и в предыдущем подразделе.

На рис.13 представлены двумерные (2D) и трехмерные (3D) карты уровней свободной энергии для а.о. гептапептида LDSYQCT (пептида P5) и его аналогов (пептидов Р13–Р25), показывающие, что замены остатков серина (S16) и глутамина (Q18) приводят к увеличению конформационной подвижности всех а.о. по всей длине пептидов. В таблице 2 суммированы результаты этой серии МД расчетов.

Направление и длина полипептидной цепи. С целью оценки роли отдельных остатков в функционировании АФП14–20–подобных мотивов и влияния направления полипептидной цепи нами были изучены конформационно-динамические свойства аминокислотных остатков в одной и той же позиции прямых и инвертированных АФП14–20–подобных мотивов, которые были обнаружены нами в составе факторов роста семейства ЭФР и ЭФР-подобных модулей ряда физиологически активных белков. Конформационные и динамические параметры оценивались так же, как и ранее с помощью 2D- и 3D-карт уровней свободной энергии и автокорреляционных функций. Результаты суммированы в таблицах 3 и 4.

Рис. 13. А) Двумерные (2D) карты (в координатах, ) уровней свободной энергии (сечения Пуанкаре) для аминокислотных остатков: L14 (а, и), P14 (д), G15(к), S16 (б, е, л), A16 (ж), Q18 (в), А18 (з), T20 (г) и S20 (м) в гептапептиде АФП14–20 (Р5) (а–г) и его аналогах Р22 (д), Р14(е), Р15 (ж), Р17 (з), Р21 (и, к, л) и Р13 (м). Б) Трехмерные (3D) карты (в координатах, и 1) уровней свободной энергии (сечения Пуанкаре) для аминокислотных остатков: L (а, д), Р14 (и), S16 (б, е), K16 (k), Q18 (в), А18 (ж), I18 (л), T20 (г, з) и V20 (м) в гептапептиде Р5 (а–г) и его аналогах Р14 (д), Р22 (и), Р23 (е), Р24 (з), Р16 (к), Р18 (ж), Р13 (л) и Р19 (м).

Значения двугранных углов (, и 1) даны в градусах.

Таблица 2. Конформационно-динамические свойства аналогов пептида LDSYQCT – биологически активного участка альфа-фетопротеина человека (а.о. 14–20) Обозначе- Произведен- Аминокислотная Изменение физико-химических свойств Изменение P13* P P P P P P P P P P P P25** Анализ 2D и 3D карт уровней свободной энергии показывает, что одни и те же аминокислотные остатки, находящиеся в одном и том же положении, но в составе прямого или инвертированного пептидов реализуют, как видно из таблиц 3 и 4, разные наборы вероятных конформаций. Конформационные свойства а.о. в составе гептапептидного фрагмента мало отличаются от таковых в соответствующих участках полной молекулы ЭФР, содержащей 53 а.о., и ее 22-членного модуля.

Можно сделать заключение о том, что длина полипептидной цепи практически не влияют на конформационные свойства а.о. в молекулах пептидов и белков (повидимому, до достижения определенного числа контактов).

Таблица 3. Конформационно-динамические свойства прямых АФП14-20–подобных гептапептидных мотивов в составе ЭФР и TGF-1 человека Обозначение Тип пептида Аминокислотная Номера Типы реализуемых Изменения P P25f* P25m** P Примечания: 1) а.о. – аминокислотный остаток; 2) *зрелая молекула ЭФР человека; 3) **22-членный модуль ЭФР человека; 4) Остатки в пептидах P25f, P25m сравнивались с таковыми в пептиде P25, а в пептидах P25 и P37 – с таковыми в соответствующих положениях в пептиде P5.

Таблица 4. Конформационно-динамические свойства инвертированных АФП14-20–подобных мотивов эпидермального фактора роста (ЭФР) человека P P

LDKYACN

P P40f P40m Для сравнения степени сходства между конформационно-динамическими свойствами остатков в одном и том же положении у разных пептидов нами построением иерархично организованных древовидных диаграмм или кластерных различающиеся на величину dsr 0,004, относились к одной группе. Кластерный анализ 2D карт показал, что наблюдаются: 1) различия в конформационнодинамических свойствах аминокислотных остатков одного типа в одном и том же положении в прямых и инвертированных пептидах; 2) сходство конформационнодинамических свойств одних и тех же а.о. в полной молекуле ЭФР, ее 22-членного модуля и гептапептидного фрагмента; 3) сходство конформационно-динамических свойств у аминокислотных остатков в соответствующих положениях гептапептидов АФП и ЭФР (за исключением остатка лейцина).

Взаимосвязь между относительной гибкостью пептидного остова и биологической активностью пептидов. Для выявления взаимосвязи между биологической активностью и конформационно-динамическими свойствами нами были сконструированы семь пентапептидов и восемь тетрапептидов, часть из которых была изучена в тестах биологической активности. Все эти пептиды сходны с частью гептапептида LDSYQCT (АФП14-20), включающей а.о. 16–20 (SYQCT).

Рис. 14. Кластерные деревья для остатков в положениях 1(а), 3(б), 5(в) и 7(г) в изученных прямых и инвертированных пептидах ЭФР. По горизонтали откладываются номера объектов, а по вертикали – расстояния объединения (linkage distance).

Часть пептидов обнаруживается в составе других белков фетоплацентарного комплекса человека, в частности PSG и CEA. Результаты суммированы в таблице 5 и представлены на рис. 15. Все изученные пента и тетрапептиды по картине 2D и 3D карт и графиков автокорреляционных функций аминокислотных остатков в положениях 17, 18, 19 и 20 можно разделить на четыре группы. Первую группу составляют пептиды, содержащие остаток серина на С-конце цепи: P33 (YACS), P (YQCS) и P35 (YVCS), P41 (LYACS) и P42 (LYVCS). Вторую – пептиды, содержащие остаток глутаминовой кислоты на С-конце цепи: это P26 (PYQCE), P (YQCE), P32 (YACE), P36 (YVCE) и P43 (SYQCE). Пептиды P27 (PYECE) и P (YECE) по всем остаткам кластеризуются отдельно от других пептидов, образуя самостоятельный (третий) кластер. Четвертая группа состоит всего из одного пептида – гептапептида P5, который не кластеризуется ни с одним из пептидов, за исключением остатка Т20. Пептиды P28 (SYKCE), P29 (YQCT) и P44 (SYQCT), в основном, демонстрируют сходство между собой по конформационно-динамическим свойствам.

Рис. 15. А) 2D карты (в координатах, ) для остатков в положениях 17 (а, д, и), 18 (б, е, к), 19 (в, ж, л) и 20 (г, з) в пептидах P5 (а–г), P26 (и), P27 (д), P29 (е), P30 (ж), P31(к), P32 (з) и P33 (л), а также в положении 16 (м) в пептиде P28. Б) 3D карты для остатков в положениях 17 (а, д, и), 18 (б, е, к), 19 (в, ж, л) и 20 (г, з, м) в пептидах P5 (а–г), P27 (е), P29 (д), P30 (з), P31(и), P32 (л), P33 (ж, к), P34 (м). Значения двугранных углов (,, 1) даны в градусах.

Таблица 5. Изменение конформационно-динамических свойств остатков аминокислот в пента- и тетрапептидных фрагментах фетоплацентарных белков по сравнению с пептидом АФП14– Обозна- Произве- Аминокислотная Изменение физико-химических Изменение P P P P P P P P P P P P P P P Примечания: 1) АФП14–20 – фрагмент альфа-фетопротеина человека (а.о. 14–20), имеющий состав LDSYQCT (пептид P5); 2) а.о. – аминокислотный остаток; 3) нумерация а.о. дана для зрелой полипептидной цепи альфафетопротеина человека.

Таким образом, пептиды PYECE и YECE характеризуются наименьшей конформационной подвижностью аминокислотных остатков, что обусловлено наличием в их составе двух отрицательно заряженных остатков глутаминовой кислоты и зажатостью остатка цистеина, расположенного между ними. Также, в пептиде YVCE три из четырех а.о. (валина, цистеина и глутаминовой кислоты) характеризуются ограниченностью подвижности. Таким образом, можно утверждать, что вышеназванные пептиды облают относительной жесткостью пептидного остова.

Сохранность нативной конформации АФП при его выделении и очистке обуславливает его биологическую активность. Препараты АФП, полученные разными способами выделения и очистки различаются по биологической активности, что может быть связано с влиянием применяемых процедур на сохранность нативной конформации белка. Нами получено три препарата АФП человека: 1) АФП-I, представляющий собой промежуточный этап очистки АФП. При диск-электрофорезе в градиенте плотности ПААГ в присутствии SDS обнаруживались полосы, соответствующие альбумину, несколько полос в зоне молекулярных масс от 22 до кДа, а также - и -глобулинов. 2) АФП-S, полученный элюцией 2M KCl и 3) АФП-T – элюцией 0,01% тритона-Х100 и 0,01% твина-80 после гель-фильтрации (два последних – высокоочищенные, до 99% чистоты, препараты (Рис. 16)).

Эти препараты по-разному влияют на спонтанную и ФГА-индуцированную пролиферацию лимфоцитов здоровых доноров (РБТЛ). АФП-I повышает как спонтанную (на 134%), так и ФГА-индуцированную (на 24%) пролиферацию лимфоцитов, что может быть обусловлено присутствием примесных белков, обладающих активностью цитокинов. АФП-T характеризовался отсутствием как стимулирующего, так и ингибирующего влияния, что может быть связано с нарушением внутримолекулярных гидрофобных взаимодействий и потерей нативной