На правах рукописи

Ваел Шехта Метвалли Эльсайед Елазаб

НАНОЧАСТИЦЫ ХИТОЗАНА КАК НОСИТЕЛИ БИОЛОГИЧЕСКИ

АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Специальности: 02.00.06 – высокомолекулярные соединения

02.00.03 – органическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2012 www.sp-department.ru 2

Работа выполнена в Воронежском государственном университете на кафедре высокомолекулярных соединений и коллоидов

Научный руководитель: доктор химических наук, доцент Кузнецов Вячеслав Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Телешев Эдуард Никонорович доктор химических наук, профессор Борисова Елена Яковлевна

Ведущая организация: Воронежский государственный университет инженерных технологий

Защита состоится 1 марта 2012 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.120.04 при Московском государственном университете тонких химических технологий им. М.В. Ломоносова по адресу:

119571, г. Москва, пр. Вернадского,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета 119571, г.

Москва, пр. Вернадского,

Автореферат разослан «» 2012 года.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор химических наук, профессор Грицкова И.А.

www.sp-department.ru

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время значительное внимание многих исследователей приковано к проблеме выделения и химической модификации природных полимеров. Среди большого многообразия биополимеров особое место занимает хитозан. Уникальность хитозана обусловлена широким спектром проявляемых им свойств, среди которых следует особо выделить такие как биологическая активность, биосовместимость и нетоксичность. Это позволяет его использовать в химии, фармации, медицине, поэтому исследования, связанные с химией такого биополимера, как хитозан, является важной задачей полимерной химии. Учитывая его биологическую активность, биосовместимость и нетоксичность основным стратегическим направлением его использования является фармация и медицина, которая предъявляет определенные требования по величине молекулярной массы полимера. Задача получения низкомолекулярного хитозана, изучения механизма деструкции и управление процессом с целью синтеза продукта с необходимыми свойствами является актуальной как с теоретической, так и практической точек зрения.

Помимо этого, наличие в макромолекулах хитозана реакционноспособных групп обуславливает его способность к комплексообразованию, позволяющая осуществлять иммобилизацию биологически активных веществ. Учитывая его биосовместимость и нетоксичность возможно получение новых гидрофильных лекарственных форм на основе известных препаратов и веществ потенциально биологически активных с пролонгированным действием, что указывает на актуальность проведенных исследований.

Цель работы – синтез наночастиц хитозана с различной молекулярной массой и исследование их способности к комплексообразованию с биологически активными веществами для создания гидрофильных лекарственных форм.

www.sp-department.ru Научная новизна.

Изучена окислительная деструкция высокомолекулярного хитозана пероксидом водорода и получены его полимергомологи в широком диапазоне значений молекулярных масс. Установлена зависимость степени полимеризации хитозана от концентрации окислителя, температуры и продолжительности процесса. Найдено, что эффективным стоппером деструкции является водный раствор аммиака, не приводящий к понижению степени деацетилирования хитозана, как это происходит при использовании формалина.

Определены условия получения наночастиц низкомолекулярных хитозанов.с узким распределением по размерам. Показано, что размер частиц зависит от величины молекулярной массы хитозана, его концентрации и концентрации триполифосфата натрия, рН среды.

Впервые синтезирован и идентифицирован ряд прозводных 3замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

Получена водорастворимая форма известного противотуберкулезного препарата гидразона изоникотиновой кислоты - 1-изоникотинил-2-Dглюкозилгидразона дигидрата.

Показано, что низкомолекулярные гомологи хитозана образуют комплексы с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным, а также рядом производных пиридазина, на основе которых получены наноразмерные частицы с узким распределением по размерам.

Установлены закономерности образования наноразмерных частиц солей низкомолекулярного хитозана глутаминовой и янтарной кислот.

Практическая значимость работы.

Синтезированны полимерные комплексы хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным. Исследования в бактериостатической лаборатории Белгородского областного противотуберкулезwww.sp-department.ru ного диспансера ппоказали, что они перспективны для их применения в медицинской практике.

Получен ряд прозводных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

Личный вклад автора. Автор лично выполнил большинство этапов работ, включая постановку задач, проведение эксперимента, анализ и обсуждение результатов.

Автор защищает:

Усовершенствованный способ получения низкомолекулярных полимергомологов хитозана Синтез наночастиц на основе хитозана с различной молекулярной массой Способы получения ряда 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов и 1изоникотинил-2-D-глюкозилгидразона дигидрата Получение комплексов наночастиц хитозана с низкомолекулярными биологически активными веществами Апробация работы. Результаты работы докладавались на V Всероссийской Каргинской конференции «Полимеры-2010» (Москва, 2010г.), 7-ой СанктПетербургской конференция молодых ученых (Санкт-Петербург, 2011 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ: 4 патента, 1 статья, 2 тезисов докладов конференций различных уровней.

Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения полученных результатов, выводов и списка цитируемой литературы (189 наименований).

Диссертация изложена на 152 страницах машинописного текста, содержит таблицы, 25 рисунков.

Во Введении дано обоснование актуальности диссертационной работы и сформулирована ее цель.

Глава 1. В Литературном обзоре дан подробный анализ публикаций, связанных с получением хитозана, его полимергомологов и их взаимодействий с низкомолеклярными биологически активными веществами.

Глава 2. В Экспериментальной части описаны методики синтеза и аналитической оценки исходных веществ и продуктов их взаимодействия, методы исследования полимеров (вискозиметрия, ИК-спектроскопия, ЯМР Н, масс-спектрометрия, динамическое светорассеяние, потенциометрическое титрование, химические методы определения молекулярных масс) и другие, используемые в работе.

Глава 3. Обсуждение результатов 3.1. Деструкция высокомолекулярных хитозанов Изучено окислительное действие перекиси водорода на гликозидные центры, протекающей по схеме:

OH OH OH OH C

O O OH R C

Преимуществом использования пероксида водорода в качестве деструктирующего агента является экологичность, его доступность, а также минимизация побочных реакций окисления функциональных групп в мягких условиях осуществления процесса.

В связи с этим изучена деструкция высокомолекулярного хитозана H2O2, с целью получения полимергомологов со степенью полимеризации от 6 до 1000 аминоглюкозных единиц и сохранением СД более 90 %. Исследоwww.sp-department.ru вания проводились в 1-2 % водном растворе уксусной кислоты. Исследование влияния концентрации полимера показало, что оптимальной является масс. %. Увеличение концентрации полимера приводило к заметному росту вязкости, что осложняло осуществление процесса в связи диффузионным фактором и, как следствие, получению полимеров с большой степенью дисперсности.

Важнейшим параметром, определяющим степень деструкции высокомолекулярного хитозана, соответственно, и молекулярную массу конечного продукта, является концентрация H2O2 в реакционной среде. Исследования проводились при постоянной температуре 50 С. Установлено, что с увеличением концентрации пероксида водорода молекулярная масса снижается.

Однако, по мере повышения концентрации H2O2 происходит увеличение степени дисперсности целевого продукта, о чем свидетельствует расширение величин молекулярных масс полимеров в серии параллельно выполненных при одинаковых условиях опытов. Так, при концентрации H2O равной 2 масс. %, молекулярная масса изменялась в интервале 2,8-3,3 кДа, а при содержании 2,5 масс. % - 1,1-2,3 кДа. Это связано, по-видимому, с высокой интенсивностью процесса деструкции и сложностью конролирования и управления им. Дальнейшее повышение концентрации приводит к получению олигомеров.

Изучение влияния температуры на глубину протекания деструкцию исследовали в интервале 20-70 С. Установлено, что более перспективным параметром, позволяющим в большей степени регулировать молекулярную массу образующихся полимергомологов, является температура. С ростом температуры при постоянстве остальных параметров реакции, молекулярная масса снижается. Причем величина молекулярной массы полимеров, полученных в серии параллельных опытов, изменяется в пределах 5-10%, что соответствует ошибке эксперимента.

Реакцию окисления прерывали добавлением водного раствора аммиака.

Преимуществом данного метода в сравнение с применявшимся ранее форwww.sp-department.ru мальдегидом является то, что в результате реакции с аммиаком образуются безвредные молекулярный азот и вода и не снижается степень деацетилирования хитозана.

3.2. Получение наночастиц низкомолекулярного хитозана В последнее время значительный интерес проявляется к наноструктурированным полимерам. В силу большой удельной поверхности наночастицы проявляют отличные от обычных полимеров свойства и существенное увеличение характерных. Это открывает большие возможности использования их в различных отраслях науки и техники. В частности при создании лекарственных веществ. Такие структуры имеют большое сродство к мембране клетки и малые размеры позволяют легко проникать в ядро клетки.

Однако основной проблемой при получении наночастиц является их устойчивость. В силу высокой удельной поверхностной энергии таких частиц они проявляют чрезвычайно высокую склонность к агрегации. Важнейшей задачей при получении наночастиц является придания им свойства устойчивости к агрегации. Повышение устойчивости может быть достигнуто созданием условий, препятствующих агрегации. К числу таковых относят создание двойного электрического слоя, структурных барьеров и т.д. Наиболее перспективным является первый.

Исследовано влияние на размер наночастиц хитозана с молекулярной массой 10 кДа природы и концентрации электролита, рН среды. В качестве электролитов, стабилизирующих частицы хитозана в дисперсии изучены NH4OH и триполифосфат натрия (ТРР). Как установлено, в случае использования NH4OH образуются не стабильные наночастицы хитозана, которые с течением времени агрегируют до больших размеров (рис.1 ).

Рис.1 Зависимость размера частиц нанохитозана от времени (NH4OH, С(хитозана)=0,2 мг/мл) Использование ТРР приводит к образованию устойчивых во времени наночастиц хитозана. Установлено, что на размер частиц существенное влияние оказывает концентрация ТРР и хитозана. При концентрации хитозана менее 0,1 мг/мл получаются дисперсии с широким разбросом по размерам частиц. Наиболее стабильные результаты получены при концентрации хитозана 0,2 мг/мл, а в дальнейшем с ее увеличением размер частиц, сохраняя узкий интервал по размерам, растет.

Исследование влияния концентрации ТРР показало (рис.2), что с ее увеличением размер частиц снижается.

Рис. 2 Зависимость размера частиц хитозана (ММ=10 кДа) от концентрации ТРР (рН=4.0, С(хитозана)=2 мг/мл) Изучение влияния рН среды в процессе получения дисперсий хитозана показало, что зависимость носит не линейный характер (рис.3).

Рис.3 Зависимость размера частиц хитозана (ММ=10 кДа) от рН среды (С(хитозана)=2 мг/мл, С(ТРР)= 1,75 мг/мл) В области низких значений рН размер частиц с его ростом уменьшается, достигает минимального значения, а затем наблюдается их рост, связанный с уменьшением устойчивости частиц, на что указывает снижение снижение потенциала (рис.4).

Рис.4 Зависимость -потенциала от рН среды (С(хитозана)=2 мг/мл, С(ТРР)= 1,75 мг/мл) Изучение влияния молекулярной массы хитозана в интервале 5-30 кДа показало, что размер его наночастиц изменяются несущественно. Это связано, по-видимому, с тем, что макромолекулы хитозана чрезвычайно склонны к ассоциации и в образовании наночастиц участвуют ассоциаты макомолекул.

3.3. Синтез производных 3-замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов.

С целью исследования получения наночастиц полимерных комплексов с биологически активными веществами для получения их гидрофильных форм в качестве модельных соединений синтезирован ряд производных3замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов.

Исходный 3-гидразино-4,5-дифенил-1-пиразоло[3,4-b]пиридазин был получен путем обработки 3-циано-4,5-дифенилпиридазин-3(2Н)-он РОСl3 с образованием 2-хлор-3-циано-4,5-дифенилпиридазина и последующим взаимодействием с 85% гидразин гидратом по схеме:

Диазотированный арил амины, такие как анилин, о, м и р-толуидины, о-и ранизидина, о- и м-хлоранилин, п-нитроанилина, -нафтиламина и 3аминопиридина в сочетании с активными соединениями, таких как ацетилацетона натрия буферный раствор ацетата, чтобы дать азобензола ацетилацетона 2а-к с хорошими выходами (схема).

где Ar а С6Н5 2g, Ar = 2-ClC6H4 б, Ar = 2-MeC6H4 ч, Ar = 3-ClC6H4 с, Ar = 3-я MeC6H4, Ar = 4-NO2C6H4 г, Ar = 4-MeC6H4 у, Ar = 2-нафтил е, Ar = 2MeOC6H4 к, г = 3-пиридиле, Ar = 4-MeOC6H Спектральные данные для таких соединений указывают им иметь конфигурацию гидразона.

Полученные соединения, реагируя с азобензолацетонами в абсолютном этаноле при температуре кипения дают 3-[4-арилазо-3,5-диметилпиразол-1-ил]дифенил-1-пиразоло[3,4-b]пиридазин. по схеме:

где Ar = C6H5, 2-MeOC6H4, 3-ClC6H4, 2-MeC6H4, 4-MeOC6H4, 4-NO2C6H4, 3MeC6H4, 2-ClC6H4, 2-нафтил, 4-MeC6H Структура соединений была подтверждена с помощью ИК-, ЯМР 1H-, массспектрометрии и элементного анализа.

3.4. Синтез 1-изоникотинил-2-D-глюкозилгидразона Разработан способ получения 1-изоникотинил-2-D-глюкозилгидразона, предусматривающий конденсацию гидразида изоникотиновой кислоты с гидратом D-глюкозы по схеме:

Исходный гидразид изоникотиновой кислоты получен взаимодействием изоникотиновой кислоты с хлористым тионилом приводящим к образованию хлоргидрата изоникотиновой кислоты, последующим действием абсолютным этанолом получен хлоргидрат этилового эфира изоникотиновой кислоты изоникотиновой кислоты, который при взаимодействии с гидразин гидратом получен гидразид изоникотиновой кислоты в соответствии со схемой:

C2H5O Строение конечного 1-изоникотинил-2-D-глюкозилгидразона и промежуточных соединений подтверждено данными ИК-спектроскопии, элементного анализа температуры плавления и кипения.

3.5. Получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами Как известно, хитозан благодаря биосовместимости, нетоксичности, а также наличия реакционноспособных амино- и гидроксигрупп является перспективным носителем лекарственных веществ, снижая при этом их токсичность и повышающим гидрофильность. Получение наночастиц полимерных комплексов хитозана с лекарственными веществами позволяет создавать лекарственные формы, увеличивающие их возможность проникновения в клетки. В соответствии с этим получения наночастиц исследовано получение наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с 3-замещенными пиразоло[3,4-c]пиридазинами, являющимися потенциальными биологически активными веществами. Исследование проведено в присутствии ТРР.

Изучение влияния концентрации ТРР на степень связывания и размер частиц образующихся комплексов. Как установлено, с ростом концентрации ТРР степень связывания увеличивается достигая максимального значения 25 масс.% (рис.5 ), выходит на плато. Следует отметить, что средний размер частиц при этом снижается (рис.6).

ТРР.

Рис.6. Зависимость размера частиц комплекса хитозана с с 3замещенными пиразоло[3,4-c]пиридазинами от концентрации ТРР.

Для подтверждения образования комплексов хитозана с производными пиридазинов проведено ИК-спектральное исследование. В ИК-спектрах комплексов наблюдается смещение полос поглощения, соответствующих валентным колебаниям –С=N- связей конденсированных ароматических колец пиразолопиридазинов с 1586-1580 до 1570-1565 см-1.

Исследован процесс комплексообразования низкомолекулярных гомологов хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты (ГИНК) в присутствии ТРР. Для подтверждения образования комплексов ГИНК с хитозаном проведено их исследование с помощью ИК-спектроскопии. В ИК-спектрах комплексов наблюдается смещение характеристических полос поглощения в сравнении с исходными хитозаном и ГИНК. В частности, смещение полосы поглощения соответствующей валентным колебаниям гидразидной >С=О связи с 1654 см-1 в исходном ГИНК до 1663 см-1 свидетельствует об участии ее в образовании комплексов, вероятно с первичной или вторичной аминогруппой хитозана. На их участие указывает также смещение полосы поглощения в области 1616 см-1, отвечающей деформационным колебаниям первичной и вторичной аминогрупп в хитозане до 1631 см-1 в комплексе. Кроме этого в комплексообразовании согласно данным ИК-спектроскопии участвует «пиридиновый» атом азота ГИНК, на что указывает смещение полосы поглощения, соответствующей валентным колебаниям –С=N- ароматического цикла ГИНК с 1584 см-1 до 1560 см-1. Видимо, взаимодействие «пиридинового» атом азота ГИНК происходит со связями Р=О молекул ТРР.

С целью определения оптимальных условий взаимодействия хитозана с ГИНК, проведено исследование влияния их мольного соотношения на степень связывания. Изучение проведено в интервале 1.0-1.8 мольного избытка по отношению к хитозану. Установлено, что введение исходного мольного соотношения более 1.0, в изученном интервале, не приводит к увеличению массовой доли ГИНК в образующемся комплексе. Контроль содержания ГИНК в комплексе осуществляли по данным ИК-спектроскопии аналогично предыдущему.

Аналогичным образом получены наноразмерные комплексы низкомолекулярного хитозана с 1-изоникотинил-2-D-глюкозилгидразон дигидратом, глутаминовой и янтарной кислотами.

Структуру наночастиц комплексов низкомолекулярного хитозана с биологически активными веществами можно представить в общем виде следующим образом:

где Sub:

3-замещенные пиразоло[3,4-с]пиридазинов ГИНК: гидразид изоникотиновой кислоты 1-изоникотинил-2-D-глюкозилгидразона дигидрат Глутаминовая кислота Янтарная кислота ТРР: триполифосфат натрия

ВЫВОДЫ

1. Изучена окислительная деструкция высокомолекулярного хитозана пероксидом водорода и получены его полимергомологи в широком диапазоне значений молекулярных масс. Установлена зависимость степени полимеризации хитозана от концентрации окислителя, температуры и продолжительности процесса. Найдено, что эффективным стоппером деструкции является водный раствор аммиака, не приводящий к понижению степени деацетилирования хитозана, как это происходит при использовании формалина.

2. Определены условия получения наночастиц низкомолекулярных хитозанов в присутствии триполифосфата натрия с узким распределением по размерам. Показано, что размер частиц зависит от величины молекулярной массы хитозана, его концентрации и концентрации триполифосфата натрия, рН среды.

3. Впервые синтезирован и идентифицирован ряд прозводных 3замещенных пиразоло[3,4-с]пиридазинов, являющихся потенциальными биологически активными веществами.

4. Получена водорастворимая форма известного противотуберкулезного препарата гидразона изоникотиновой кислоты - 1-изоникотинил-2-Dглюкозилгидразона дигидрата.

5. Показано, что низкомолекулярные гомологи хитозана образуют комплексы с гидразидом изоникотиновой кислоты и его углеводным производным, а также рядом производных пиридазина, на основе которых получены наноразмерные частицы с узким распределением по размерам.

6. Установлены закономерности образования наноразмерных частиц солей низкомолекулярного хитозана глутаминовой и янтарной кислот.

Материалы диссертации полностью опубликованы и доложены на международных и всероссийских конференциях.

Основные публикации:

1. Deeb, A.Pyridazine derivatives and related compounds. 23*. Synthesis of 3-substituted pyrazolo[3,4-c]pyridazines and their application as disperse dyes / A.Deeb, F.Yassin, N. Ouf, W.Shehta. // Chemistry of Heterocyclic Compounds, Volume 46, Number 2, June 2010, pp. 212-222(11).

2. Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб. Синтез нанокомпозитов на основе хитозана и биологически активных веществ / Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб, В.А. Кузнецов // Полимеры-2010 : V Всерос. Каргинская конференция, Москва, 21-25 июня 2010 г. : программа конф. и сб. тез. пленарных, устных и приглашенных докл. — М., 2010. — 1 с. — 0,1 п.л.

3. Купреев Н.И. Патент № 2417088 (Россия) Способ получения низкомолекулярного хитозана / Н.И. Купреев, Д.В. Быковский, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

4. Купреев Н.И. Патент №: 2428432 (Россия) Способ получения наночастиц низкомолекулярного хитозана / Н.И. Купреев, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

5. Купреев Н.И. Положительное решение о выдаче патента № 2010148278/15(069722). Способ получения водорастворимого парааминосалицилата хитозана / Н.И. Купреев, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

6. Купреев Н.И. Положительное решение о выдаче патента № 2010119795/15(028178). Способ получения полимерного комплекса на основе изоглюкозила / Н.И. Купреев, В.А. Кузнецов, Ваел Шехта Матвалли Эльсайед Елазаб.

7. Панков И.В. Комплексообразование низкомолекулярного хитозана с гидразидом изоникотиновой кислоты / И.В. Панков, Ваел Шехта Метвали, В.А. Кузнецов // 7-ая Санкт-Петербургская конференция молодых ученых, Санкт-Петербург, ИВС РАН, 17-20 октября 2011 г. : программа и тез. Докл. – С-Пб., 2011. – С.101.