На правах рукописи
Ларин Андрей Александрович
ОСОБЕННОСТИ ОПРЕДЕЛЕНИЯ И ОЦЕНКА НАКОПЛЕНИЯ
УГЛЕВОДОРОДОВ В ГИДРОБИОНТАХ АЗОВСКОГО МОРЯ
Специальность 03.02.08 – экология (химические наук
и)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук Краснодар 2010 г.
Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном предприятии «Азовский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства» (ФГУП «АзНИИРХ»)
Научный руководитель: доктор биологических наук Корпакова Ирина Григорьевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Елецкий Борис Дмитриевич доктор химических наук, профессор Александрова Эльвира Александровна
Ведущая организация: ГУ «Гидрохимический институт»
(г. Ростов-на-Дону)
Защита состоится 29 июня 2010 г. в ауд. 231 в 1400 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.101.16 в Кубанском государственном университете по адресу: 350040, г. Краснодар, ул. Ставропольская,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного университета по адресу: 350040, г. Краснодар, ул.
Ставропольская,
Автореферат разослан 27 мая 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Н.В. Киселева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. К числу приоритетных загрязняющих веществ по критериям экологической опасности (токсичности, генотоксичности, канцерогенности и распространенности, частоте встречаемости), обнаруженных в воде и донных отложениях Азовского моря, относятся нефтепродукты (НП), пестициды, соединения ряда металлов. Наиболее распространенным видом антропогенного воздействия на биоресурсы моря и экосистему в целом является нефтяное загрязнение.
С эколого-токсикологических позиций нефть и нефтепродукты рассматриваются как групповой токсикант неспецифического действия.
Компоненты нефти и нефтепродуктов активно воздействуют в той или иной мере на все группы живых организмов в морской среде, вызывая изменение в структуре сообществ, уменьшение их биомассы и продукции. Известно большое количество работ, описывающих токсическое действие углеводородов (УВ) нефти, распределенных в водной толще, на различные гидробионты. Однако остается невыясненным влияние сорбированных донными отложениями УВ на формирование и развитие донных сообществ.
Донные отложения являются местом обитания бентосных организмов, которые относятся к важнейшим компонентам водной экосистемы, участвующим в круговороте веществ. За счет высокой фильтрационной активности бентосные организмы обладают повышенной способностью к накоплению токсикантов. Ряд авторов отмечают положительную корреляцию между содержанием УВ в бентосных организмах и местах их обитания донных осадках. Поэтому довольно часто предлагается использовать различные бентосные организмы (в частности двустворчатые моллюски) в качестве тест-объектов при мониторинге загрязнения морской среды.
Литературные данные о степени накопления нефтяных компонентов в бентосных организмах весьма отрывочны, а по корреляции между уровнем накопления в моллюсках и загрязнением среды их обитания практически отсутствуют. Нерешенным остается также вопрос корректного аналитического определения углеводородов одновременно во всех элементах водных экосистем - воде, донных отложениях и гидробионтах. Разные методы имеют неодинаковую чувствительность и специфичность к определяемым веществам. При анализе воды, донных отложений и гидробионтов несоответствие результатов, получаемых разными методами, становится более ощутимым.
Диссертационная работа выполнена в рамках государственных контрактов с Госкомитетом РФ по рыболовству и Федерального агентства по рыболовству (Росрыболовство) по ФЦП «Мировой океан» в рамках темы «Комплексные исследования процессов, характеристик и ресурсов Черного и Азовского морей» и госзаказа на выполнение научно-исследовательских работ по направлению «Комплексное изучение водных биологических ресурсов и среды их обитания в промысловых районах Мирового океана в целях рыболовства, сохранения водных биологических ресурсов и среды их обитания».
Цель настоящей работы разработка унифицированного подхода к оценке содержания углеводородов в элементах водных экосистем и исследование зависимости накопления углеводородов в двустворчатых моллюсках Азовского моря от условий их обитания.
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:
- разработать методику определения углеводородов в гидробионтах;
- исследовать уровень накопления углеводородов различных классов в двустворчатых моллюсках Азовского моря и среде их обитания;
- изучить взаимосвязь содержания углеводородов в двустворчатых моллюсках от уровня загрязненности среды их обитания;
- провести моделирование динамики накопления углеводородов различных классов в двустворчатых моллюсках.
Научная новизна.
Изучены особенности анализа и разработана методика определения УВ в гидробионтах с учетом состава и свойств аналита.
По результатам наблюдений, проведенных в 2004-2009 гг., исследована зависимость степени накопления УВ в двустворчатых моллюсках Азовского моря от уровня нефтяного загрязнения среды их обитания.
Личный вклад автора: непосредственное участие автора в 15 морских экспедициях, лабораторных экспериментах, обработке и анализе собранного материала. По результатам исследований автором написаны научноисследовательские отчеты и статьи, в которых проанализированы полученные данные по уровням накопления УВ в моллюсках и среде их обитания. При личном участии автора проведена разработка, усовершенствование и метрологическая аттестация методики определения УВ в гидробионтах.
Практическая значимость.
Разработана и аттестована методика определения УВ в биологических пробах, которая внедрена в АзНИИРХ при проведении экологических исследований.
Результаты исследований используются при проведении анализов гидробионтов в процессе эколого-рыбохозяйственного мониторинга элементов водных экосистем Азово-Черноморского бассейна.
Положения, выносимые на защиту:
1. Экспериментальные и теоретические материалы по особенностям определения углеводородов в гидробионтах.
2. Результаты определения углеводородов в двустворчатых моллюсках Азовского моря в различные сезоны 2004-2009 гг. с использованием предложенной методики.
3. Результаты исследований по установлению взаимосвязи накопления углеводородов в двустворчатых моллюсках и уровнем углеводородного загрязнения среды их обитания.
4. Материалы по метрологической аттестации методики определения УВ в гидробионтах.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 3 статьи в научных журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007); II Всероссийской конференции по аналитической химии с международным участием (Краснодар, 2007); VII Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «ЭКОАНАЛИТИКА - 2009» (Йошкар-Ола, 2009); V и VI Международной научно-практической конференции молодых ученых по проблемам водных экосистем «Pontus Euxinus – 2007» и «Pontus Euxinus – 2009» (Севастополь, 2007, 2009).
Структура и объем работы. Диссертация изложена на 132 стр., состоит из введения, пяти глав и выводов, включает 36 рис., 20 табл., список литературы, содержащий 186 источников, в том числе 68 иностранных.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Особенности определения УВ в биологических пробах Большинство известных методик определения УВ в гидробионтах включает 3 стадии анализа: выделение из анализируемых проб, очистку экстрактов от мешающих веществ и количественное определение выделенных УВ. Для выделения УВ из анализируемых проб, как правило, используются различные органические растворители или смеси из двух растворителей.
Наиболее распространенные способы очистки экстрактов включают щелочной гидролиз, который обычно проводится водными или спиртовыми растворами едкого калия или натрия при различных температурах и времени обработки, и последующей экстракции органическими растворителями. Недостатком методик, предусматривающих проведение гидролиза, является необходимость наличия довольно значительной массы исследуемых биологических образцов, что не всегда доступно. К немаловажному фактору, особенно при выполнении рутинных анализов, относится высокая трудоёмкость и существенный расход реактивов. Реже используются методики, основанные на прямой экстракции УВ различными органическими растворителями и последующем отделении от мешающих соединений различными хроматографическими методами – колоночной, тонкослойной, гель-проникающей хроматографией.
Количественное определение выделенных УВ чаще других проводится методами газовой, газожидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Используются также оптические методы – УФ- и флуоресцентной спектрометрии.
Анализ литературных данных позволяет утверждать, что при выполнении рутинных анализов, требующих совмещения корректности результатов с минимизацией трудовых и материальных затрат, наиболее интересны методики определения УВ, основанные на измерении интегральных оптических характеристик. Несмотря на множество существующих в настоящее время методик определения УВ в гидробионтах, эта проблема остается недостаточно решенной. Практически отсутствуют работы, посвященные разработке методик, обеспечивающих одновременно корректный анализ всех элементов водных экосистем - вод, донных отложений и гидробионтов. Разные методы анализа имеют неодинаковую чувствительность и специфичность к определяемым веществам, по-разному проявляется и влияние матрицы на аналитические сигналы определяемых соединений. При анализе проб воды, донных отложений и гидробионтов сложного состава несоответствие результатов, получаемых разными методами, становится наиболее ощутимым.
Анализ литературных и наших экспериментальных данных по степени накопления УВ гидробионтами, опубликованных в период 1990-2009 гг., показал, что содержание алифатических УВ в двустворчатых моллюсках может варьировать от следовых количеств (1.6 мг/кг) до аномально высоких величин – 6800 мг/кг сырой массы. Такой же широкий разброс данных приведен и для полициклических ароматических углеводородов – от 0.01 до >100 мг/кг сырой массы. Максимальное накопление углеводородов в моллюсках отмечается после аварийных ситуаций и в хронически загрязненных районах с высоким уровнем загрязнения. Сведения по составу и содержанию УВ в морских организмах довольно отрывочны, касаются лишь отдельных классов соединений, отдельных акваторий, выполнены авторами с применением различных методов исследования. Противоречивость полученных данных с одной стороны связана со сложностью и зависимостью от многих условий процессов трансформации УВ, а с другой стороны – трудностями методического характера, обусловленными многочисленностью УВ, имеющих различное строение и свойства, которые могли бы быть положены в основу их определения.
Следует также отметить, что моллюски легко аккумулируют, но сравнительно медленно выводят УВ из организма в связи с отсутствием или, по крайней мере, слабым развитием углеводородгидроксилазной детоксицирующей системы. Такая особенность их поведения позволяет рассматривать их как потенциальные тест-объекты для контроля загрязнения водных экосистем. Предпосылкой к этому является широкое распространение моллюсков в морской среде, особенно в прибрежной зоне, легкодоступный пробоотбор, прикрепленный образ жизни и высокая фильтрационная активность, а также низкий процент биотрансформации УВ, приводящий к аккумулированию органических загрязнителей. Однако изучению взаимосвязи между уровнем накопления УВ в моллюсках и содержанием УВ в среде их обитания посвящено недостаточное количество исследований, которые могли бы ответить на вопрос: могут ли моллюски служить индикаторами загрязнения при экологическом мониторинге водных экосистем.
При определении УВ в биологических объектах возникают две основные проблемы, связанные со сложностью и непостоянством их состава, с одной стороны, и наличием липидных фракций – с другой. Из-за сложности и непостоянства состава нефтей и нефтепродуктов, в том числе и их углеводородных фракций, возникает проблема выбора характеристик для количественного определения, как суммарного содержания нефтяных компонентов, так и углеводородов. Вторая проблема связана с тем, что какие бы методики не были взяты для количественного определения УВ, в том числе хроматографические и оптические, одновременно будут регистрироваться и компоненты липидных фракций.
В отличие от других токсикантов (пестициды, ПХБ, тяжелые металлы) нефть и нефтепродукты представляют собой очень сложную смесь углеводородов и их производных, содержащих серу, азот и кислород.
Содержание отдельных компонентов в различных сортах нефти и нефтепродуктов варьирует в очень широких пределах. Попадающие в водную среду нефть и нефтепродукты практически сразу же перестают существовать в исходном состоянии. В результате сложнейших физико-химических и биохимических превращений состав и свойства компонентов нефтяного загрязнения с течением времени существенно изменяются, что создает дополнительные трудности их аналитического определения.
Благодаря липофильным свойствам, УВ в наибольшей степени накапливаются в жизненно важных органах с высоким содержанием липидов, таких как мозг, печень и гонады. При экстракции УВ из анализируемых проб полученный липидный экстракт включает собственно УВ, жиры (триацилглицерины), а также содержащиеся в меньших количествах липиды других классов (фосфолипиды, стероиды, каротиноиды, жирорастворимые витамины и др.).
Оптимизация условий анализа гидробионтов При разработке методики определения УВ в качестве добавок использовались УВ, выделенные из льяльной воды методом тонкослойной хроматографии. УВ вносили в мышечную ткань, печень и гонады промысловых рыб Азовского и Черного морей - пиленгаса и акулы-катран и мягкую ткань двустворчатых моллюсков Cerastoderma glaucum. УВ экстрагировали гексаном из гомогенизированных и обезвоженных сульфатом натрия проб. Эффективность выделения УВ контролировали по интенсивности люминесценции при возб = 370 нм, люм = 460 нм и по сумме интенсивностей полос поглощения при 2926 и 2956 см-1 в ИК-области спектра, соответственно на спектрофлуориметре RF-5301PC фирмы Shimadzu (Япония) и ИК-спектрофотометре IR-270 фирмы Hitachi (Япония).
Любой метод регистрации количества УВ будет искажать получаемые результаты из-за соединений, извлеченных из биологических проб вместе с углеводородами. Например, при использовании люминесцентного метода анализа предварительная очистка необходима, чтобы «избавиться» от таких соединений, как жирорастворимые витамины, гормоны, пигменты и т.п., которые из-за структурных особенностей обладают люминесцирующими свойствами. Применение метода ИК-спектроскопии также невозможно без предварительной очистки, так как все органические соединения имеют полосы поглощения валентных колебаний метильных и метиленовых групп, по интенсивности которых определяют количество УВ.
При анализе гидробионтов, важным этапом является процесс извлечения аналита из биологической матрицы, т.к. дальнейшее его определение будет зависеть от полноты экстракции. К наиболее распространенным способам выделения УВ различными растворителями (гексан, хлороформ, этиловый эфир, циклогексан, метиленхлорид или смеси растворителей) относятся: прямая экстракция, ультразвуковая, с применением микроволнового излучения, экстракция в аппарате Сокслета, сверхкритическая флюидная экстракция, жидкостная экстракция под давлением, твердофазная микроэкстракция.
Для разделения выделенных компонентов наиболее часто используется колоночная (КХ) или тонкослойная (ТСХ) хроматография, которой предшествует стадия очистки экстракта. Очистку чаще всего проводят кипячением пробы в спиртовом растворе щелочи с последующим выделением углеводородов и неомыляемых липидов в неполярном растворителе.
Сравнительная оценка ряда предложенных способов щелочного гидролиза, показала, что эта довольно длительная и трудоемкая стадия анализа не всегда приводит к желаемым результатам, особенно при высоком содержании липидов. С другой стороны, как показали наши сравнительные испытания, наиболее предпочтительно применение для прямой экстракции гексана, который в наименьшей степени извлекает мешающие полярные соединения.
Для дальнейшего разделения УВ и отделения их от липидной фракции нами использован метод тонкослойной хроматографии, в тонком слое сорбента граница отделения УВ от липидов достаточно четко определяется визуально под УФ-светом, что позволяет контролировать эффективность очистки экстракта.
В качестве сорбентов для ТСХ-разделения изучались силикагель и оксид алюминия. С активированного оксида алюминия не элюируются жиры, жирные кислоты, жирные спирты и ряд других соединений, что, несомненно, является положительным моментом стадии разделения, однако, при этом одновременно необратимо сорбируются ароматические углеводороды.
Например, с активированного оксида алюминия не элюируется до 30% трехядерных ПАУ и до 100 % - четырех- и пятиядерных ПАУ.
На оксиде алюминия III степени активности при элюировании смесью гексана и четыреххлористого углерода (70:30), липиды образуют размытую хроматографическую зону, перекрывающуюся с зоной УВ. Аналогичная картина наблюдалась и при использовании в качестве подвижной фазы гексана. Двукратное элюирование гексаном также не улучшило разделения. В качестве подвижной фазы кроме гексана использовали ацетонитрил, в котором растворимость липидов существенно меньше, чем в гексане. Однако на оксиде алюминия липиды, как и при других использованных элюентах, в ацетонитриле растягиваются по всему слою сорбента вплоть до зоны УВ. На силикагеле при элюировании смесью гексана с четыреххлористым углеродом липиды и УВ остаются на старте, а при элюировании ацетонитрилом происходит более четкое их отделение от липидов.
При модифицировании поверхности сорбентов возрастает возможность специфического взаимодействия между полярной поверхностью сорбента с полярными и поляризованными группами или участками молекул. На импрегнированных сорбентах возможно также проявление процесса хемосорбции полярных липидов, который приводит к значительному повышению времени удерживания или необратимой сорбции и омылению липидов, что повышает эффективность отделения их от определяемых УВ.
Для импрегнирования силикагеля и оксида алюминия был выбран гидроксид натрия.
Наилучшие результаты были получены при использовании в качестве сорбента – силикагеля, подвижной фазы – ацетонитрила. УВ и липиды разделились на две зоны с четкими границами, имеющие Rf = 0.8 и 0.1. Кроме визуального, полноту разделения липидов и УВ проверяли по наличию полос поглощения различных функциональных групп в инфракрасных спектрах элюатов углеводородной зоны.
В ИК-спектре гексанового экстракта моллюска (C. glaucum) обнаружены полосы поглощения в области =2800-3100 см -1, присущие симметричным и ассиметричным валентным колебаниям групп -СН, -СН2 и СН3 и в области =1550-1750 см -1, характерные для карбонильной группы. В этой же области полоса поглощения при 1650 см -1 может также характеризовать присутствующие в липидах и УВ сопряженные группы – СН2=СН2– с другими виниленовыми и карбонильными группами (рисунок 1-I).
После хроматографирования экстракта в системе: сорбент – силикагель, импрегнированный гидроксидом натрия, подвижная фаза – ацетонитрил, в ИК-спектре элюата УВ-зоны, помимо полос поглощения метильных и метиленовых групп, наблюдалась полоса при 1740 см -1, интенсивность которой значительно уменьшилась по сравнению с исходной. Однако наличие этой полосы свидетельствует о недостаточной очистке от липидов (рисунок 1II).
Для предварительной очистки экстракта до разделения методом ТСХ использовали оксид алюминия, импрегнированный щелочью. В зависимости от количества и состава липидов дополнительная очистка уменьшила количество липидов в исходной пробе на 90-95 %. Предварительная очистка экстракта в статических условиях на импрегнированном оксиде алюминия и последующее разделение в тонком слое импрегнированного силикагеля позволила полностью отделить УВ от соэкстрагируемых липидов. Это подтверждает спектр элюата в инфракрасной области, который не имеет заметного поглощения при 1750 см -1 (рисунок 1-III).
Удаление липидов из экстракта происходит не только за счет адсорбционных процессов на развитой поверхности сорбента, но и процесса щелочного гидролиза омыляемых липидов на поверхности сорбента.
Использование в качестве элюента ацетонитрила также способствует улучшению разделения УВ и липидов за счет их разной растворимости в этом растворителе.
Определение количества выделенных УВ можно проводить по интенсивности поглощения в ИК-области или по интенсивности люминесценции полиаренов, входящих в состав УВ. После двукратной очистки экстракта происходит практически полное отделение УВ от полярных фракций липидов. Однако в зоне УВ находятся не только УВ, полученные извне, но и собственные УВ гидробионтов. Например, в составе УВ, выделенных из C. glaucum, при высоких концентрациях обнаружены полиолефин - С21Н32 (НЕН) и углеводород ряда гопана, которые будут существенно завышать результаты, получаемые методом ИКспектрофотометрии (рис. 2).
«