На правах рукописи
Дергунова Елена Сергеевна
НОВЫЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ, ОСНОВАННЫЕ НА ИММУНОХИМИЧЕCКИХ
РЕАКЦИЯХ НА ПОВЕРХНОСТИ ПЬЕЗОКВАРЦЕВЫХ СЕНСОРОВ
02.00.02 – аналитическая химия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Воронеж – 2007 2
Работа выполнена на кафедре химии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Липецкий государственный технический университет»
Научный руководитель: доктор химических наук, профессор Ермолаева Татьяна Николаевна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Решетилов Анатолий Николаевич кандидат химических наук, доцент Суханов Павел Тихонович
Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
Защита состоится «29» мая 2007 г. в 16 ч. 00 мин. в аудитории 439 на заседании диссертации совета Д 212.038.19 по химическим наукам при Воронежском государственном университете по адресу:
394006, г. Воронеж, Университетская пл., 1, химический факультет, (ауд.439)
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Воронежского государственного университета Автореферат разослан «24» апреля 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, д.х.н., проф. Г.В. Семенова
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность. Иммунохимические методы анализа находят применение при анализе объектов окружающей среды, пищевой и фармацевтической промышленности, в клинической диагностике. Они основаны на специфическом гомогенном или гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обеспечивает селективное определение целевых компонентов в сложных матрицах. Такие методы характеризуются достаточно высокой чувствительностью и селективностью. Однако, как правило, анализ выполняется в дискретном режиме и плохо поддается автоматизации.Известно, что проведение иммунохимических реакций на поверхности электродов сенсоров облегчает автоматизацию анализа, снижает его продолжительность. Применение пьезокварцевых резонаторов, чувствительных к изменению массы, и специфических иммунореагентов, иммобилизованных на поверхности электродов, позволяет разработать пьезокварцевые иммуносенсоры, обеспечивающие прямое детектирование токсичных соединений в водных средах без введения дополнительных меток. Такие сенсоры положительно зарекомендовали себя при определении ряда токсикантов, характеризуются высокой чувствительностью, малой инерционностью, что обеспечивает наблюдение за ходом иммунохимических взаимодействий практически в режиме реального времени.
Загрязнение объектов окружающей среды соединениями, оказывающими негативное влияние на эндокринный статус человека (эндокринные деструкторы), явилось следствием широкого применения их при производстве пластмасс, моющих средств, красителей и гербицидов. Эндокринные деструкторы (бисфенол А - BPA, нонилфенол - NP, линейные алкилбензолсульфонаты – LAS; ПДК – 1, 20, 500 нг/мл, соответственно) подобно половому гормону эстрогену влияют на репродуктивные функции человека, блокируют выработку мужских гормонов, характеризуются мутагенным и канцерогенным свойствами, вызывают расстройства половой и эндокринной систем.
Присутствующий в качестве примеси в фармацевтических препаратах на основе парацетамола 4-аминофенол (4-АР) обладает пирогенным эффектом и вызывает заболевания кожных покровов, глаз, нарушает работу печени (содержание в препарате не должно превышать 0,01%). Котинин (СОТ) может служить маркером для оценки степени отравления курильщиков никотином при проведении анализа биологических проб.
Высокочувствительное и селективное определение таких биологически активных веществ (БАВ) в объектах окружающей среды, лекарственных препаратах и биологических образцах является актуальной задачей аналитической химии.
Цель работы. Исследование закономерностей иммунохимических реакций, протекающих на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров, и разработка методик проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных деструкторов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
- Изучить и научно обосновать стратегию сайт-направленной ковалентной иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов, антител или аналитов на предварительно активированной поверхности пьезокварцевого резонатора;
- Исследовать закономерности гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело;
- Исследовать кинетику взаимодействия гаптен-белковых конъюгатов, иммобилизованных на поверхности электрода сенсора с антителами;
- Оценить специфичность применяемых иммунореагентов;
- Выявить доминирующие факторы, определяющих чувствительность проточно-инжекционного определения биологически активных соединений;
- Разработать методики проточно-инжекционного определения эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в различных объектах с применением пьезокварцевых иммуносенсоров в качестве детектора.
Научная новизна.
- Установлены и реализованы на практике принципы формирования многослойного биорецепторного покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспечивающие высокую активность биослоя и сохранение его постоянной массы в течение 15-30 циклов измерений.
- Изучено влияние природы рецепторных покрытий и технологии их получения на величину аналитического сигнала сенсора при определении нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов.
- Установлены закономерности иммунохимической реакции, протекающей на поверхности сенсора, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий проточно-инжекционного определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов, 4-аминофенола и котинина в сложных по составу смесях с применением пьезокварцевого сенсора.
- Оценено влияние различных форматов иммунохимического анализа (конкурентный, анализ с утяжелением массы) на аналитический сигнал пьезокварцевого иммуносенсора.
- Установлены количественные взаимосвязи чувствительности определения фенолов (А) с величинами электронных эффектов заместителя в их молекулах, имеющие прогнозирующие функции.
- Выявлены основные факторы, влияющие на оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров при проточно-инжекционном определении БАВ в жидких средах.
- Показана возможность конкурентного определения следовых концентрации эндокринных ядов, 4-аминофенола в жидких средах на уровне нг/мл.
Практическая значимость. Предложены способы получения многослойных рецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ, широкий диапазон определяемых содержаний и продолжительность эксплуатации.
Разработаны методики высокочувствительного и селективного проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в жидких средах. Методика определения нонилфенола в жидких средах защищена патентом РФ (Патент № 2287820).
Показана возможность применения пьезокварцевого иммуносенсора для экспрессного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях.
На защиту выносятся:
– Результаты исследований и выбора способов формирования биорецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, предназначенных для определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов.
– Результаты изучения закономерностей иммунохимических реакций антиген-антитело, протекающих на поверхности пьезокварцевого сенсора и лежащих в основе определения биологически активных веществ в жидких средах.
– Кинетические исследования иммунохимических реакций, рассчитанные значения констант скоростей прямой и обратной реакции, констант аффинности комплементарных иммунореагентов – Коэффициенты перекрестного реагирования поликлональных антител с эндокринными ядами и их структурными аналогами.
– Результаты исследования условий проточно-инжекционного определения биологически активных веществ и факторы, обеспечивающие оптимальные оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров.
– Методики проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах, котинина в биологических жидкостях.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003); XII научнопрактической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); I Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004); Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», «Ломоносов-2007» (Москва, 2005, 2007); II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии»
(Краснодар, 2005); Всероссийской студенческой научно-технической школе – конференции «Инженерные науки – защите окружающей среды» (Тула, 2006); The International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва, 2006); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика – 2006» (Самара, 2006);
Всероссийской конференции «Фагран-2006» (Воронеж, 2006).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в статьях, 12 тезисах докладов, 1 патенте РФ на изобретение.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на страницах машинописного текста, включает рисунков и таблиц. Состоит из введения, глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего ссылок на отечественные и зарубежные работы.
Работа выполнялась при финансовой поддержке программ Минобрнауки РФ: «Развитие научного потенциала высшей школы» (тема № 01970006723 «Проточные пьезокварцевые иммуносенсоры: новые возможности для определения физиологически активных веществ»), темплана Минобрнауки РФ (тема «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ»), регионального гранта РФФИ (грант № 06-03-96339_р_центр_а), стипендии Президента РФ.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Обзор литературы состоит из двух частей: в первой части рассмотрены опубликованные за последние пять лет современные методы определения эндокринных деструкторов в объектах окружающей среды. Как правило, применяемые методы анализа требуют сложного и дорогостоящего оборудования, процесс анализа продолжителен, поскольку включает многостадийные процедуры пробоподготовки. Показано, что альтернативу таким методом составляют способы анализа с применением иммуносенсоров. Во второй части обобщены литературные сведения по способам иммобилизации иммунореагентов на поверхности пьезокварцевых сенсоров.Подчеркнуто, что общие подходы для выбора способа иммобилизации до настоящего времени не разработаны.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Объектами исследования являлись: нонилфенол, бисфенол А, линейные алкилбензолсульфонаты, котинин (“Sigma”, USA).Иммунореагенты - котинин, 3-(р-сульфофенил)-бутановая кислота и бисфенол А, конъюгированные с белковыми молекулами (бычий (BSA), яичный(OVA) и соевый (STI) альбумины) (СОТ-STI, BPA-BSA, BPA-OVA, BPASTI); 4-аминофенол и 4-нонилфенол, конъюгированные с бычьим и яичным сывороточным альбумином с помощью глутарового альдегида (4-AP-GABSA и NP-OVA), кроличьи антисыворотки, содержащие поликлональные антитела к линейным алкилбензолсульфонатам (p-SPh-azo-OV-A, p-SPh-azoBSA-B, pSPh-but-TG-A, 6-pSPh-hex-OV-A, p-SPh-but-BSA-A), котинину (LOT ILS-106, LOT ILS– 983-6, LOT ILS - 985-7, NOS 3, NOS 12), 4аминофенолу (Myg 2 и 3, IgG Myg 2) предоставлены д.х.н., проф. С.А. Ереминым (МГУ им. М. В. Ломоносова); поликлональные антитела к нонилфенолу (anti-NP(STI), anti-HHA(BSA), ser. 8-3(NP-BSA), anti-NP(NP-BSA)R-8) - к.б.н. А. А. Мартьяновым (Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН); моноклональные антитела к нонилфенолу (4Н6) – проф. М. Франеком (Институт Ветеринарии, Брно, Чехия); куриные сыворотки, содержащие поликлональные антитела к бисфенолу А (Kip 28/4 и An-НPVA) – проф. Б. де Меленаер (Университет Гента, Гент, Бельгия) и проф. Р. А. Абукнеша (Королевский Колледж, Лондон, Великобритания). Синтез гаптен-белковых конъюгатов для определения LAS (LAS-43-BSA, LAS-43-OVA, LAS-43-STI) был осуществлен карбодиимидным методом.
Для формирования подложек были использованы аминопропилтриэтоксисилан (-APTS), меркаптопропионовая кислота (MPA), меркаптоэтиламин (MEA) (“Sigma”, USA), тетраэтоксисилан (TESi) (х. ч., Россия). В качестве кросс-реагентов применяли глутаровый альдегид (GA) (“Reanal”, Hungary), 1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид (EDAC), N,N-дициклогексилкарбодиимид (DCC) (“Sigma”, USA).
Лабораторная установка для проточно-инжекционного анализа включала перистальтический насос, дозатор, проточную ячейку детектирования, объемом 15-20 мкл, с пьезокварцевым резонатором АТ-среза с серебряными или золотыми электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебаний 107±1 Гц (ЗАО «ЭТНА», ОАО «Квант», Россия), частотомер ЧЗ-54, персональный компьютер.
Аналитическим сигналом сенсора служит изменение частоты его колебаний (f, Гц) при увеличении массы биорецепторного покрытия за счет образования поверхностного иммунного комплекса. Важнейшими характеристиками применяемых покрытий при проточно-инжекционном определении являются: концентрационная чувствительность (А, Гц·мл·мкг-1) сенсора, показывающая изменение частоты колебаний иммуносенсора (f) при введении в поток раствора-носителя пробы, содержащей 1мкг/мл антител; число циклов измерений (N), в которых аналитический сигнал не снижается более чем на 5 %.
ИССЛЕДОВАНИЕ УСЛОВИЙ ПОЛУЧЕНИЯ РЕЦЕПТОРНОГО СЛОЯ
НА ПОВЕРХНОСТИ ЭЛЕКТРОДОВ ИММУНОСЕНСОРОВ
К биорецепторным покрытиям пьезокварцевых сенсоров предъявляются следующие требования:прочность закрепления рецепторных молекул на поверхности электрода;
сохранение высокой активности иммобилизованных биомолекул;
равномерность распределения активных сайтов связывания по всей площади электрода;
физическая и химическая устойчивость покрытия в течение цикла измерения при контакте с жидкостью (включая устойчивость в процессе регенерации);
минимальная масса рецепторного слоя (чем меньше масса покрытия, тем большая величина приращенной массы может быть определена микровзвешиванием).
Обзор литературы показал, что в наибольшей степени таким условиям отвечают покрытия, полученные ковалентным закреплением биомолекул.
Ковалентная иммобилизация рецепторных молекул. Изучены многослойные способы иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов на предварительно активированной поверхности серебряных и золотых электродов, включающие получение подложки с высокой адгезией к металлу, активацию поверхности с применением бифункциональных реагентов и ковалентное закрепление биомолекул. Методом поэтапного пьезокварцевого микровзвешивания регистрировали массу (mп) покрытий на основе различных модификаторов (TESi, -APTS, MPA, MEA), формирующих тонкую промежуточную прослойку с распределенными на ней активными функциональными группами, не разрушающуюся при длительном контакте с жидкостью.
Максимальная масса и толщина покрытия (hп, нм) наблюдается при модификации поверхности методом золь-гель технологии с помощью TESi, что может служить причиной сужения диапазона определяемых содержаний всех изучаемых аналитов (Табл. 1).
При формировании подложек методом самособирающихся монослоев (SAM, self-assembled monolayers) на основе -APTS, MPA, MEA отмечается оптимальное сочетание чувствительности и воспроизводимости при определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов. Более высокую адгезию к металлу показывают подложки на основе -APTS, который предохраняет поверхность Ag-электродов от окисления и способствует высокой упорядоченности поверхностных NH2-групп для удобного прикрепления биомолекул с помощью кросс-реагентов. Морфология поверхности такой подложки существенно зависит от температуры и продолжительности высушивания: оптимальные параметры - 120 С и 15 мин, соответственно. В этом случае формируется более легкое (3,35 мкг) и тонкое (0,12 нм) промежуточное покрытие.
Монослои на основе тиолов (MPA, MEA) имеют более низкую массу прослойки, однако процедура получения слоя модификатора более продолжительна (1-12 час). Результаты последующей ковалентной пришивки на таких покрытиях биореагентов через GA и EDAC показывают, что в этом процессе задействованы не все активные группы подложки, что приводит к возрастанию доли неспецифического взаимодействия по сравнению с покрытиями на основе -APTS. Было установлено, что оба применяемых кроссреагента GA и EDAC достаточно прочно закрепляют белковые молекулы на всех изученных подложках и обеспечивают равную доступность активных центров для связывания с антителами. Однако, структура бифункциональных реагентов и природа активных функциональных групп оказывают влияние на стерическую доступность центров связывания. Применение в качестве кросс-реагента GA, присоединяющего биомолекулы через более длинную линкерную цепочку, обеспечивает лучшую пространственную доступность для иммунохимического взаимодействия, что подтверждается более высокими значениями аналитического сигнала сенсора f.
Таблица 1. Характеристики биорецепторных покрытий (САТ=50 мкг/мл).
TESi-GA-BSA-BPA -APTS-GA-BSA-BPA MEA-GA-BSA-BPA MPA-EDAC-BSA-BPA Линейные алкилбензолсульфонаты (антитела 6-pSPh-hex-OV-A) TESi-GA-BSA-LAS -APTS-GA-BSA-LAS MEA-GA-BSA- LAS MPA-EDAC-BSA- LAS TESi-GA-OVA-NP -APTS-GA-OVA-NP MEA -GA- OVA-NP MPA-EDAC- OVA-NP На чувствительность определения аналитов в жидких средах конкурентным методом влияет и природа белковой молекулы, входящей в состав гаптен-белкового конъюгата. Например, значение А при определении BPA и LAS снижается в следующем ряду протеинов BSA>OVA>STI и, следовательно, зависит от природы и молекулярной массы применяемого белка.
Установленные закономерности изменения аналитического сигнала сенсора и чувствительности от способа иммобилизации сохраняется для всех изученных эндокринных деструкторов. В тоже время абсолютная величина f выше при определении ВРА, по сравнению с аналогичными значениями для LAS и NP. Совокупность оптимальных характеристик сенсоров достигается при иммобилизации иммунореагентов на силоксановой подложке на основе -APTS, полученной методом самособирающихся монослоев с помощью глутарового альдегида, которая обеспечивает до 30 измерений на одном биослое.
Фотоиммобилизация рецепторных молекул. Этим методом получены покрытия на основе производных бисфенола А, содержащих –СООН функциональные группы, взаимодействующие при УФ-облучении с NH2-группами подложки (Табл. 2).
Таблица 2. Характеристики биослоев, полученных методом фотоиммобилизации.
-APTS-EDAC-BPA -APTS-DCC-BPA методики является: расширение диапазона определяемых соединений, вследствие более низкой массы покрытия (mп < 6 мкг); исключение гаптен-белковых конъюгатов из схемы иммобилизации; ускорение процесса получения биорецепторного слоя (30-45 мин). Формирование более легкого и тонкого покрытия объясняется отсутствием на поверхности белковых молекул. Однако небольшой объем, занимаемый молекулой BPA, создает стерические затруднения для взаимодействия с антителами, поэтому чувствительность определения аналита несколько ниже по процесса фотоиммобилизации
ОЦЕНКА АФФИННОСТИ И СПЕЦИФИЧНОСТИ
ИММУНОРЕАГЕНТОВ
Кинетические исследования изменения частотного сигнала сенсора при протекании реакции взаимодействия гапен-белковых конъюгатов со специфичными антителами позволили (с применением методики Скетчардта) установить константы скорости прямой и обратной реакции, и рассчитать константы аффинности иммунореагентов (Табл. 3).Скорость взаимодействия комплементарных пар иммунореагентов зависит от вида антител (поли- или моноклональные), структуры применяемого гаптен-белкового конъюгата и способа его иммобилизации.
Наиболее высокая скорость образования иммунокомплекса характерна для реакции между гомологичными антителами и гаптен-белковыми конъюгатами. Например, при взаимодействии антител к 4-аминофенолу IgG Myg- и конъюгата 4-AP-GA-BSA значение k0 составляет 60,70·103 M-1·c-1, что в раз превышает аналогичное значение для пары anti-NP(STI) и 4-AP-GA-BSA (11,37·103 M-1с-1). А при взаимодействии моноклональных антител 4Н6 с различными конъюгатами (4-AP-GA-BSA и NP-OVA) скорость образования гомологичного комплекса выше в 20 раз. Влияние способа иммобилизации на кинетику взаимодействия в основном определяется плотностью упаковки рецепторных молекул и отсутствием стерических затруднений для доступа антител к активным сайтам связывания. В этом случае для покрытия -APTSGA-конъюгат наблюдается более высокая скорость взаимодействия по сравнению с рецепторными слоями, сформированные другими способами.
«