Санкт-Петербургский государственный политехнический университет

УТВЕРЖДАЮ

Декан ФМФ

В.К. Иванов

«_» _ _ г.

РАБОЧАЯ ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ

Молекулярные механизмы репликации Кафедра-разработчик Биофизика Направление (специальность) подготовки 011200 Физика Наименование ООП Квалификация (степень) выпускника Магистр Образовательный стандарт Федеральный ГОС Форма обучения очная Соответствует ФГОС ВПО.

Утверждена протоколом заседания кафедры Биофизика № 2 от 17.05. Программу в соответствии с ФГОС ВПО разработали:

к.б.н. Г.Р. Виноградская 1. Цели и результаты изучения дисциплины 1.1. Цели изучения дисциплины Дисциплина "Молекулярные механизмы репликации" представляет собой подраздел молекулярной биологии, являющейся одной из базисных дисциплин для специалистов в области биологии и медицины. Цель курса состоит в формировании у студентов современных представлений о структуре, функционировании и механизмах безошибочного воспроизведения генома. Наряду с процессами собственно синтеза ДНК в курсе рассмотрены также механизмы регуляции репликации в клетках про- и эукариот, ее взаимосвязи с фазами клеточного цикла, восстановления нуклеопротеиновой структуры хромосом и сегрегации вновь синтезированных геномов по дочерним клеткам. Часть курса посвящена экспериментальным подходам и молекулярным методам исследования, что должно способствовать более глубокому пониманию предмета слушателями и их подготовке к самостоятельной научной деятельности.

1.2. Результаты обучения (компетенции) выпускника, в формирование которых вносит вклад освоение дисциплины Код Результат обучения (компетенция) выпускника ООП ОК- способностью демонстрировать углубленные знания в области биологии и других естественных наук ОК- способностью самостоятельно приобретать с помощью информационных технологий и использовать в практической деятельности новые знания и умения, в том числе в новых областях знаний, непосредственно не связанных со сферой деятельности, расширять и углублять свое научное мировоззрение ОК- способностью порождать новые идеи (креативность) 1.3. Планируемые результаты освоения дисциплины -способность самостоятельно выполнять биофизические исследования по темам магистерской программы;

-способность планировать, организовывать и проводить научно-исследовательские работы с применением современной аппаратуры, оборудования и компьютерных технологий;

-способность самостоятельно анализировать, обобщать и систематизировать результаты биофизических работ;

-умение использовать знания и методы молекулярной биологии для решения исследовательских и инновационных задач в профессиональной области.

2. Место дисциплины в ООП Согласно ФГОС ВПО направления 011200 «Физика» (квалификация «магистр») дисциплина «Молекулярные механизмы репликации» относится к дисциплинам по выбору профессионального цикла М.2.

Дисциплину «Молекулярные механизмы репликации» студенты изучают в 9-м семестре (пятый год обучения).

Изучение дисциплины «Молекулярные механизмы репликации» опирается на знания в области общей биологии, молекулярной биологии клетки, молекулярной генетики, полученные студентами на предшествующих этапах обучения.

Результаты изучения дисциплины «Молекулярные механизмы репликации»

используются при изучении дисциплин профессионального цикла М.3, при выполнении НИРС и при подготовке магистерской диссертации.

Курс состоит из лекционного материала.

3. Распределение трудоёмкости освоения дисциплины по видам учебной работы 3.1. Виды учебной работы в том числе творческая проблемно-ориентированная самостоятельная – работа Общая трудоемкость освоения дисциплины в академических часах: 3.2. Формы контроля 4. Содержание и результаты обучения 4.1. Разделы дисциплины и виды учебной работы ДНК-полимеразы Индивидуальные характеристики ДНК-полимераз Структурные изменения матричной ДНК в ходе репликации. Геликазы. Топологические проблемы репликации. Топоизомеразы.

Репликационные комплексы Организация праймосом и реплисом в клетках про- и эукариот Регуляция репликации Инициации и терминация репликации у E.coli Три схемы репликации Структурно-регуляторные элементы эукариотического генома Регуляция репликации в эукариотах Репликация эпигенома 4.2. Содержание разделов и результаты изучения дисциплины 1. Введение 1.1. Общие представления о репликации генома Знание основных этапов и основных Исторический обзор. Основные вехи в исследовании механизма воспроизведения генома. Первые эксперименты, давшие общие представления о молекулярных механизмах репликации (опыты Месельсона, Сталя, Винограда; радиоавтография бактериальной реплицирующейся ДНК Джона Кэрнса; ДНКполимераза Корнберга; фрагменты Оказаки).

Однорепликонные и многорепликонные системы, методы их исследования.

2. ДНК-полимеразы 2.1. Общая характеристика ДНК-полимераз Общие представления о механизме Реакция, осуществляемая ДНК-полимеразами, их структур и функций.

и энергетика процесса; трехмерные структуры полимераз, особенности их структуры, контролирующие точность синтеза; 3'экзонуклеазные активности ДНК-полимераз, их вклад в точность репликации. Исследование репликации in vivo: роль анализа разнообразных мутантов с нарушением репликации. Синтез напротив повреждения ДНК. Полимеразы, входящие в Y-семейство, их свойства и связь с SOS-ответом клетки, сходство и отличие структур точных и неточных ДНК-полимераз.

2.2. Индивидуальные характеристики ДНК- Знание индивидуальных характеристик Индивидуальные характеристики ДНКполимераз из E. coli: ДНК-полимераза I (5'экзонуклеазная активность, фрагмент Кленова, реакция nick-translation), роль ДНК-полимеразы I в репликации. ДНК-полимераза II. ДНКполимераза III (10 субъединиц комплекса, процессивность, общие субъединицы с ДНКполимеразой II). ДНК-полимеразы IV и V из E.

coli. ДНК-полимеразы эукариот, краткий общий обзор с выделением репликационных ДНК-полимераз. Многообразие ДНКполимераз, ведущих синтез напротив повреждения ДНК в клетках эукариот.

Конвергентная эволюция на примере скользящих кольцевых зажимов ДНКполимераз про- и эукариот. Участие ДНКполимераз в процессах, отличных от репликации (репарации, рекомбинации, контролировании продвижения по клеточному циклу).

3. ДНК в ходе репликации 3.1. Структурные изменения матричной ДНК в ходе репликации. Геликазы и SSB– белки.

Геликазы: трехмерная структура, механизм действия мономерных геликаз на примере бактериальной геликазы PcrA. Принцип действия гексамерных геликаз на примере репликационной геликазы из E. coli DnaB.

Репликационная геликаза МСМ в клетках эукариот. Белки, связывающиеся с однонитевой ДНК. Конвергентная эволюция на примере белков, связывающихся с однонитевой ДНК (бактериального SSB, продукта гена бактериофага Т4 и белка RPA человека).

3.2. Топологические проблемы репликации. Знание основных структурных Топоизомеразы.

Основные структурные характеристики ДНК; действия. Гираза и обратная гираза.

В-, А- и Z-формы ДНК, их биологическое значение; суперспирализация замкнутой ДНК, параметры, характеризующие суперспирализованные структуры; биологическая роль отрицательной и положительной суперспирализации. Топоизомеразы I и II типа:

трехмерная структура и механизм действия.

Гираза и обратная гираза. Участие топоизомераз в разнообразных процессах в клетке.

4. Репликационные комплексы 4.1. Организация репликационных комплексов в клетках про- и эукариот АТР-азы ААА+-типа, структура функционирования в образовании белоклидирующей и запаздывающей нитей белковых и ДНК-белковых комплексов.

Организация праймосомы. Три функциональных модуля холофермента ДНКполимеразы III; -погрузчик, его структура и принцип действия при погрузке и разгрузке кольцевого скользящего -зажима; взаимосвязь -погрузчика с погрузчиком DnaX.

Организация реплисомы, позволяющая одновременный синтез лидирующей и запаздывающей нитей ДНК. Процессирование фрагментов Оказаки у E. coli. Участие скользящих зажимов в последовательном функционировании ферментов в репликационной вилке. Организация мультибелковых комплексов при синтезе эукариотической ДНК. Посттрансляционные модификации белка PCNA, влияющие на его способность стимулировать разные процессы метаболизма ДНК (репликацию, точную репарацию или синтез напротив повреждения ДНК). Процессирование фрагментов Оказаки в клетках эукариот.

5. Регуляция репликации 5.1. Инициации и терминация репликации Организация ориджинов и образование инициирующих комплексов у бактерий E. coli.

Регуляция инициации репликации. Терминация репликации. Общий принцип исследования структурно-регуляторных областей в применении к ориджину репликации у бактерий E. coli. Структура бактериального ориджина. Белки, необходимые для инициации репликации на ориджине. Сборка инициирующего комплекса. Регуляция инициации репликации хромосомы E. coli:

взаимосвязь репликации и клеточного роста;

модель титрования белка DnaA; секвестрация вновь синтезированных ориджинов и участие в этом процессе метилирования отдельных участков хромосомы, белок SeqA; зависимость процесса от ассоциации с мембраной.

Регуляция терминации репликации бактериальной хромосомы.

5.2. Три схемы репликации небольщих кольцевых геномов Образование интермедиатов (-структура, Dпетля или -форма). Строгий и ослабленный контроль репликации. Репликация по механизму на примере плазмиды ColE1.

Использование антисмысловой РНК для контроля числа копий плазмиды. Репликация через образование D-петли на примере плазмид и ДНК из митохондрий и хлоропластов.

Репликация по механизму катящегося кольца на примере ДНК бактериофагов, плазмид и амплификации генов рибосомной РНК в ооцитах земноводных. Несовместимость плазмид как следствие подавления репликации.

5.3. Структурно-регуляторные элементы эукариотического генома Особенности репликации ДНК в клетках эукариот: динамические и структурные параметры репликации, методы их определения. Ориджины репликации у эукариот: клонирование ARSпоследовательностей у дрожжей S. cerevisiae, сравнительная характеристика ориджинов из разных организмов. Цетромеры и сегрегация эукариотических хромосом: клонирование центромерных последовательностей у дрожжей S. cerevisiae; моторные белки в центромерных комплексах, принцип их передвижения вдоль микротубулиновых волокон, подвижная динамика самих микротубулинов. Когезия сестринских хроматид и репликация.

Клонирование теломерных последовательностей. Теломеразы.

Искусственные хромосомы.

5.4. Регуляция репликации в эукариотах Контроль инициации репликации.

Циклинзависимые киназы – главные регуляторы клеточного цикла. Факторы репликационного лицензирования, регулируемые циклинзависимыми киназами:

комплекс ORC, Cdc6/18, Cdt1 и МСМ-геликаза.

Активация лицензированных ориджинов и блокирование ре- репликации. Решение проблемы несоответствия между высокой консервативностью белков и комплексов, участвующих в инициации репликации у эукариот, и отсутствием такой же консервативности в организации самих ориджинов. Фокусирование ориджинов в процессе эмбриогенеза.

5.5. Репликация эпигенома Принципы, лежащие в основе сопряжения репликации ДНК и хроматиновой сборки.

Репликация эухроматина происходит в ранней S-фазе: гистоновые модификации, характерные для эухроматина. Гипотетические молекулярные механизмы, участвующие в разнесении во времени процессов репликации и транскрипции. Репликация гетерохроматина происходит в более поздний период S-фазы.

Эпигенетические модификации, идентифицированные в поздних репликационных вилках: метилирование ДНК, ацетилирование гистонов, ремоделирующие хроматин комплексы WICH и ACF, метилирование гистонов и связывание белка HP1, роль некодирующей РНК в образовании гетерохроматина. Гистоновый код и его воспроизведение.

5. Образовательные технологии В преподавании дисциплины «Молекулярные механизмы репликации» используются преимущественно традиционные образовательные технологии - лекции.

Семинары по дисциплине «Молекулярные механизмы репликации»

осуществляются как в рамках данного курса, так и в рамках общей программы дисциплины «Иностранный язык в сфере профессиональной коммуникации» (9-й, 10-й и 11-й семестр).

Лабораторный практикум по дисциплине «Молекулярные механизмы репликации»

осуществляется в рамках общей программы дисциплины «Научно-исследовательская работа» на 5-м курсе обучения.

Объм лекционных занятий составляет 100% общего объма аудиторных занятий. Превышение предельного норматива, установленного ФГОС ВПО для ООП, компенсируется уменьшенной долей лекционных занятий по другим дисциплинам в рамках ООП и в целом по ООП норматив выполнен.

Занятия в активной и интерактивной формах 6. Лабораторный практикум Лабораторный практикум по дисциплине «Молекулярные механизмы репликации»

осуществляется в рамках общей программы дисциплины «Научно-исследовательская работа» на 5-м курсе обучения.

7. Практические занятия Семинары по дисциплине «Молекулярные механизмы репликации»

осуществляются как в рамках данного курса, так и в рамках общей программы дисциплины «Иностранный язык в сфере профессиональной коммуникации» (9-й, 10-й и 11-й семестр).

8. Организация и учебно-методическое обеспечение самостоятельной работы студентов Самостоятельная работа студентов направлена на закрепление и углубление освоения учебного материала, развитие практических умений. Самостоятельная работа студентов в рамках дисциплины «Молекулярные механизмы репарации» включает следующие виды самостоятельной работы:

- работу с лекционным материалом и с рекомендованной учебной литературой;

- подготовку к коллоквиуму и зачету;

Творческая проблемно-ориентированная самостоятельная работа в рамках дисциплины «Молекулярные механизмы репарации» включает в себя:

- поиск, обработку и презентацию информации по печатным изданиям и электронным источникам информации по заданной проблеме в рамках данного курса и общей программы дисциплины «Иностранный язык в сфере профессиональной коммуникации» (10-й семестр);

- выступление на указанном выше семинаре;

Методы контроля самостоятельной работы студентов включают написание проверочных работ, проведение коллоквиума, выступление на семинаре. Учебные и методические пособия, рекомендуемые для использования при самостоятельной работе, указаны ниже в разделе 9.2.

Примерное распределение времени самостоятельной работы студентов работа с лекционным материалом, с учебной литературой подготовка к контрольным работам, коллоквиумам, зачтам 9. Учебно-методическое обеспечение дисциплины 9.1. Адрес сайта курса РПД размещается по адресу http://biophysics.spbstu.ru/399_01w.html.

9.2. Рекомендуемая литература Основная литература № Автор, название, место издания, издательство, год Год К-во Место Политехнический университет, Гатчина, ИПО ПИЯФ, Дополнительная литература 1. Введение в клеточную биологию / Ченцов Ю.С. — М. : Академкнига, 9.3. Технические средства обеспечения дисциплины http://www.humbio.ru/, база знаний по биологии человека;

http://www.bio.fizteh.ru/student/files/biology/biolections/ Интернет-портал «Легендарный Физтех».htm 10. Материально-техническое обеспечение дисциплины Аудиторный класс, наличие проектора для демонстрации наглядных пособий и экрана.

Компьютерный класс, лицензионное программное обеспечение, Internet.

Наличие лабораторной базы для проведения научно-исследовательской работы, включая химические реактивы, приборы (хроматографическое оборудование ультратермостаты, спектрофотометр, аналитические весы, центрифуги, рН-метр) и лабораторные принадлежности (химическую посуду, автоматические пипетки).

11. Критерии оценивания и оценочные средства 11.1. Критерии оценивания Качество освоения дисциплины "Молекулярные механизмы репликации" оценивается при проведении контрольной, коллоквиума и зачета (девятый семестр).

При выставлении зачета принимается во внимание активность студента на занятиях, проводимых в интерактивной форме, учитывается качество выполненной в рамках семинарских занятий курсовой работы и качество представления данных в виде доклада на семинаре.

11.2. Оценочные средства Варианты вопросов, выносимых на зачет.

1. Визуальные методы исследования реплицирующейся ДНК (радиоавтография и электронная микроскопия). Какие характеристики репликации были получены в этих исследованиях? Их сравнение для про- и эукариотических организмов.

2. Экспериментальные доказательства полуконсервативного механизма репликации и прерывистого синтеза запаздывающей нити (опыты Месельсона и др., Оказаки).

3. ДНК-полимераза Корнберга: принцип действия (реоранжировка ковалентных связей), структурная организация и конформационные перестройки каталитического домена, ферментативные активности. Ее роль в репликационной вилке.

4. ДНК-полимераза III, свойства, позволяющие претендовать на роль главной репликазы бактериальной клетки. Мультисубъединичная структура, роль отдельных субъединиц и их комплексов.

5. Точность репликативного синтеза. Какие механизмы задействованы в его обеспечении?

6. Полимеразы, осуществляющие TLS, их структура и свойства (на примерах про- и эукариот).Синтез через повреждения ДНК.

7. Роль кольцевого зажима, как фактора процессивности и регуляторной платформы, направляющей действие ферментов и белков, задействованных в метаболизме ДНК. Примеры и объяснение взаимодействий - и PCNA-зажимов с ферментами и белками.

8. Эукариотические ДНК-полимеразы, участвующие в репликации хромосомной ДНК (, и ), их субъединичная структура и функции в репликационной вилке.

9. Функция и структурная организация репликативных хеликаз у прокариот.

10. Функция и структурная организация репликативных хеликаз у эукариот.

11. В-, А- и Z-формы ДНК, их биологическое значение.

12. Параметры суперскрученности и ее биологическая роль.

13. Топоизомеразы I типа, формальный механизм действия, структурная организация. В качестве примеров рассмотреть topI и III у E. coli, их роль в репликации ДНК.

14. Топоизомеразы II типа, формальный и структурно-схематичный механизм действия. Гираза, модель «инверсии знака». Роль топоизомераз II типа в клетке.

15. Организация праймосомы через белок-белковые и ДНК-белковые взаимодействия у E. coli.

16. Белки и ферменты, действующие в репликационной вилке и организующие реплисому.

Механизмы погрузки хеликазы и кольцевого зажима можно не рассматривать.

17. Молекулярный механизм погрузки скользящего кольцевого зажима на примере E. coli.

18. Процессинг фрагментов Оказаки в прокариотической клетке.

19. Процессинг фрагментов Оказаки в эукариотической клетке.

20. Общий принцип исследования структурно-функциональных областей в применении к ориджину репликации. Организация oriC, сборка инициационного комплекса.

21. Взаимосвязь репликации и клеточного роста (дихотомическая репликация).

22. Белок инициатор DnaA. Механизмы, задействованные в регуляции инициации репликации хромосомы E. coli.

23. Терминация репликации генома E. coli. Биологический смысл организации терминирующих областей как ловушек репликационной вилки.

24. Разнообразные структуры, образующиеся в ходе репликации бактериальных и вирусных геномов, плазмид, митохондриальной и хлоропластной ДНК ( -структура, -форма и D-петля).

Рассмотреть их образование и привести примеры.

25. Регуляция репликации плазмиды ColE1. Несовместимость плазмид как следствие событий, используемых для регуляции репликации.

26. Общий принцип клонирования структурно-функциональных областей (ориджинов, центромер, теломер) на примере дрожжей S. cerevisiae. Решение проблемы концов эукариотических хромосом. Теломеразы, способ действия. Искусственные хромосомы.

27. Выделение репликаторов дрожжей - ARS-последовательностей, их структура и взаимодействие с белками, инициирующими репликацию. Структура ориджинов высших эукариот.

28. Когезия сестринских хроматид, ее связь с репликацией. Центромеры и сегрегация эукариотических хромосом.

29. Регуляция репликации у эукариот. Основные «игроки», участвующие в процессе упорядочивания цикла клеточного деления (CDK) и лицензирования репликации (факторы инициации).

30. Регуляция репликации у эукариот. Лицензирование репликации. Активация лицензированных ориджинов и блокирование ре- репликации.

31. Как разрешается «несоответствие» между консервативными инициаторами и дивергентными репликаторами в клетках эукариот? Фокусирование ориджинов в процессе развития организма.

32. Репликация эпигенома. Какой принцип лежит в основе эпигенетического наследования?

Механизмы, задействованные в установлении эпигенетического состояния хроматина в ранней S-фазе. Наследование гистоновых модификаций.

33. Репликация эпигенома. Эпигенетические модификации, идентифицированные в поздних репликационных вилках (метилирование ДНК, ацетилирование и деацетилирование гистонов, метилирование гистонов и белок НР1, некодирующая РНК).

12. Методические рекомендации по организации изучения дисциплины После изложения лекционного материала по первой части курса рекомендуется осуществлять промежуточный контроль уровня знаний обучающихся в виде проведения коллоквиума, требующего от студентов изложения фактического материала и ответа на вопросы, показывающие его более глубокое понимание ( в виде небольших задач). Разбор наиболее частых ошибок позволяет скорректировать недочеты в освоении курса. Этому же способствует проведение семинара. В своих докладах на семинаре студенты должны обратить особое внимание на организацию эксперимента и адекватность выводов. Связь конкретного материала с логикой эксперимента должна способствовать более глубокому пониманию предмета слушателями и их подготовке к самостоятельной научной деятельности.