Сервис виртуальных конференций Pax Grid

ИП Синяев Дмитрий Николаевич

Биотехнология. Взгляд в будущее.

II Международная научная Интернет-конференция

Казань, 26 - 27 марта 2013 года

Материалы конференции

Казань

ИП Синяев Д. Н.

2013

УДК 663.1(082)

ББК 41.2

Б63

Б63 Биотехнология. Взгляд в будущее.[Текст] : II Международная

научная Интернет-конференция : материалы конф. (Казань, 26 - 27 марта 2013 г.) / Сервис виртуальных конференций Pax Grid ; сост.

Синяев Д. Н. - Казань : ИП Синяев Д. Н., 2013.- 434 с.- ISBN 978-5-906217-14-1.

ISBN: 978-5-906217-14-1 Сборник составлен по материалам, представленным участниками II международной Интернет-конференции "Биотехнология. Взгляд в будущее". Конференция прошла - 27 марта 2013 года. Издание освещает широкий круг воросов в области медицинской биотехнологии, взаимодействия растений и микроорганизмов.

Представлены работы по перспективныем биологически активным веществам, а так же рассмотрены вопросы применения биотехнологии в решении хозяйственных задач.

Книга рассчитана на преподавателей, научных работников, аспирантов, учащихся соответствующих специальностей.

Материалы представлены в авторской редакции ISBN 978-5-906217-14-1 © Система виртуальных конференций Pax Grid, © ИП Синяев Д. Н., © Авторы, указанные в содержании, Секции конференции Медицинская биотехнология q Растения и микроорганизмы q Биотехнология в решении народно- хозяйственных задач q Перспективные биологически активные вещества q ******************************************* Оргкомитет Председатель Багаева Татьяна Вадимовна - профессор д.б.н., зав. кафедрой q биотехнологии, ФГАОУ ВПО "Казанский (Приволжский) федеральный университет Программный комитет Чиков В.И. - д.б.н. Каз НЦ РАН q Каримова Ф.Г. - д.б.н. Каз НЦ РАН q Черезов С.Н. - к.б.н. доц. КФУ Хусаинов М.Б. - к.б.н. ст. преп. КФУ Якушенкова Т.П. - к.б.н. ст. преп. КФУ Алишева Д.А. - исполнительный секретарь Тарасов Д.С. - координатор Pax Grid Изотова Е.Д. - координатор Pax Grid

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СПОСОБА ПЦР-ИДЕНТИФИКАЦИИ

АЛЛЕЛЬНЫХ ВАРИАНТОВ WX-B1-ЛОКУСА WAXY-ГЕНОВ

ПШЕНИЦЫ

Абдулина И.Р., Вафин Р.Р., Зайнуллин Л.И.

Казанский (Приволжский) федеральный университет Руководствуясь принципом совершенствования способа ПЦР-идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы [1] нами был разработан способ генотипирования, отличительной особенностью которого являлось применение взамен праймера Wx-B1F прототипа [1] олигонуклеотида 4F-c, генерирующего ПЦР-продукты размерами 402 bp (Wx-B1a-аллель) и 436 bp (Wx-B1e -аллель), редуцированные в сравнении с ближайшим аналогом на 61 bp, для обеспечения более лучшего разделения амплифицированных фрагментов в агарозном геле и повышения точности интерпретации результатов ДНК-теста.

Разработанный нами способ генотипирования был протестирован в двух его модификациях, как в постановке с олигонуклеотидами 4F-c + Wx-B1R, так и 4F-c + Wx-B2R, обратные праймеры которых были: в первом случае (для праймера Wx-B1R) – без «mismatch-нуклеотида» в третьей позиции с 3 / -конца олигонуклеотида, во втором случае (для праймера Wx-B2R) – с введенным некомплементарным нуклеотидом в процессе химического синтеза.

При тестировании соответствующего протокола ПЦР с праймерами 4F-c + Wx-B1R регистировалась негативно влияющая на анализ полученных результатов реакции наработка неспецифичных ампликонов.

Не характерная для заявленного способа амплификация ПЦР-продукта локуса Wx-A1-аллеля размером 432 bp была наиболее проблемным артефактом, фактически блокирующим дискриминацию аллельного варианта Wx-B1e (436 bp) в связи со схожим друг с другом размерами, и соответственно, мешающим осуществелению корректной идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы.

Причиной же неудовлетворительной работы заявленного протокола ПЦР служила конструктивная особенность аллельспецифичного праймера Wx-B1R без соответствующего «mismatch-нуклеотида».

При последующем тестировании предложенного способа проведения Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ПЦР для идентификации аллельных вариантов Wx-B1-локуса Waxy-гена пшеницы в оптимизированной постановке с заменой стандартного праймера Wx-B1R прототипа [1] на модифицированный нами олигонуклеотид Wx-B2R, удалось значительно повысить специфичность реакции, тем самым обеспечив корректную идентификацию исследуемых генотипов пшеницы Литература 1. Vanzetti, L.S. Genetic variability for waxy genes in Argentinean bread wheat germplasm / L. S. Vanzetti, L.A. Pfluger, M. Rodriguez-Quijano, J.M.

Carrillo, M. Helguera // Electronic Journal of Biotechnology. – 2009. – V.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЁМЫ ОЧИСТКИ ВОД ОТ

НЕФТЯНЫХ ЗАГРЯЗНЕНИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

РАСТИТЕЛЬНЫХ ОТХОДОВ

Казанский (Приволжский) федеральный университет Актуальность научного исследования.

Из многочисленных методов, позволяющих уменьшить концентрацию нефти в экосистемах, наиболее перспективными считаются биологические методы, основанные на естественных процессах самоочищения с участием отселектированных углеводородокисляющих микроорганизмов. [Рогозина, Шиманский, 2007; Бабаев, Мовсумзаде, 2009; Киреева, Григориади, Хайбулина, 2009; Матенькова, Наплекова, 2009].

Среди соединений, обладающих биостимулирующим эффектом в трансформации нефти и нефтепродуктов, наряду с витаминами, аминокислотами, органическими кислотами и др., могут быть применены легкоокисляемые органические субстраты растительного происхождения [Морозов, 2001, 2007, 2010]. В качестве последних рекомендуется использование шелухи зерновых культур (гречихи, ячменя, овса, пшеницы, кукурузы и др.). Эти растительные остатки в процессе разложения нефти и её производных микроорганизмами могут служить активной иммобилизирующей поверхностью (сорбентами) для деструкторов с одной стороны и легкоокисляемыми веществами для выработки адаптивных ферментов с другой.

Достижение подобной цели ведёт к получению значительного экологического и экономического эффекта в ликвидации нефтяных загрязнений. Исходя из проведённых ранее экспериментов, было установлено, что наилучшим субстратом является гречишная и ячменная шелуха, которые при использовании сообщества углеводородокисляющих микроорганизмов УОМ ведут к наиболее эффективной деструкции нефти (70,1 и 55%).

Исходя из этого целью настоящей работы явилось, подбор оптимального размера и концентрации субстрата растительного происхождения шелухи гречихи при использовании его в качестве индуцирующего вещества в окислении нефти и нефтепродуктов Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

углеводородокисляющими микроорганизмами.

На первом этапе работы рассматривали процесс микробной деструкции нефти при применении разных концентраций и размера фракций органического субстрата. Степень трансформации нефти оценивали по динамике растворённого кислорода, биологического потребления кислорода (БПК5), химического потребления кислорода (ХПК) и численности углеводородокисляющих микроорганизмов на среде Раймонда. Эксперимент проводили в колбах объемом 1000 мл со средой Раймонда (по 400 мл в каждой колбе). Температура пассирования равнялась 20 – 230 С. В среду вносили одновременно накопительную культуру, состоящую из трёх УОМ, численностью 102 млн. - млн.кл/мл, товарную нефть Елховского месторождения (185±6 мг) и органические субстраты в концентрации 1, 10 и 50 мг/л.

Варианты опытов:

1. 0,071 –1 мг/л + 3УОМ + нефть 2. 0,071 – 10 мг/л + 3УОМ + нефть 3. 0,071 – 50 мг/л + 3УОМ + нефть 4. 0,071 –1 мг/л + нефть (к) 5. 0,071 – 10 мг/л + нефть (к) 6. 0,071 – 50 мг/л + нефть (к) 7. 0,1 – 1 мг/л + 3УОМ + нефть 8. 0,1 – 10 мг/л + 3УОМ + нефть 9. 0,1 – 50 мг/л + 3УОМ + нефть 10. 0,1 –1 мг/л + нефть (к) 11. 0,1 – 10 мг/л + нефть (к) 12. 0,1 – 50 мг/л + нефть (к) В целом выяснено, что внесение в среду шелухи гречихи всегда сопровождалось видимым изменением плёнки нефти. Она изменяла свою окраску с образованием отдельных разложенных бактериями хлопьев. Динамика углеводородокисляющих микроорганизмов, выявленная при окислении нефтяного загрязнения, в присутствии шелухи гречихи сопровождалось постепенным возрастанием плотности бактериальной массы, что видно из рис.1.

Как видно также из рис. 1, в процессе культивирования УОМ на субстратах с нефтью и без нее происходило постепенное возрастание численности бактериальной массы, а следовательно, достижение эффективности очистки связанной с адаптацией микроорганизмов к углеводородам нефти.

Наибольшая величина оптической плотности УОМ приходилась на день культивирования, что говорит об их активной деструкции нефти. В Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

вариантах с контролем эффективность окисления нефти была намного ниже и не превышало 15%.

С 7 по 13-е сутки численность микроорганизмов постепенно снижалась, так как запас питательных веществ (а именно нефти) в среде уменьшалась в результате её интенсивного разложения УОМ.

Аналогично можно отметить, что в вариантах с размерностью 0,071мм, концентрацией 10 мг/л и размерностью 0,1, концентрацией мг/л, где оптическая плотность достигает максимальных величин (Рис. 1, кривые 2 и 9) по сравнению с остальными вариантами.

Исходя из проделанных анализов основных показателей деструкции нефти с шелухой гречихи видно, что наиболее эффективными являются также варианты: 0,071 – 10 мг/л + 3УОМ + нефть и 0,1 – 50 мг/л + 3УОМ + нефть. Интенсивность окисления нефти по биологическому потреблению кислорода составила – 17,25% и 15,26%, по изменению количества растворённого кислорода - 38,47 % и 37,6%, а по химическому потреблению кислорода – 53,22% и 38,17% соответственно.

По результатам анализа неокисленного количества нефти (рис. 2), наиболее продуктивными вариантами оказались: 0,071 – 10 мг/л + 3УОМ + нефть и 0,1 – 50 мг/л + 3УОМ + нефть (2-ой и 9-ый вариант).

Эффективность их составляет 62,17% и 61,63 % соответственно.

Итак, из приведённых результатов экспериментов следует, что наилучшим размером фракций шелухи, оказывающее биостимулирущее действие на степень окисления исходного субстрата нефти, является шелуха гречихи 0,071 мм с концентрацией субстрата в среде 10 мг/л и 0,1 с концентрацией 50 мг/л.

Для подтверждения полученных результатов размерности и концентрации органических субстратов были проведены дополнительные исследования. Варианты опыта были такими же как и в первом этапе эксперимента, где использовали десять видов УОМ вместо трёх.

Количество потреблённой нефти, как видно из рисунка 3, наименьшее в варианте с размерностью частиц субстрата 0,071мм и концентрацией 50 мг/л и равнялась 0,052 г простив 0,186 г в начале эксперимента. При использовании десяти видов УОМ эффективность деструкции нефти возросла приблизительно на 7%. Это достигнуто в варианте с концентрацией шелухи гречихи 50 мг/л.

Выводы:

1.Активное разложение нефти и продуктов её переработки микроорганизмами всегда связано с наличием в среде легкоокисляемых органических соединений. В этой связи впервые изучено возможность Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

использования для этой цели субстратов растительного происхождения – шелуха гречихи, пшеницы, ячменя, овса и др.

2. Выбран оптимальный размер растительного субстрата, оказывающего биостимулирующий эффект в достижении ускорения биодеградации нефти ассоциацией, включающий 10 видов совместимых между собой углеводородокисляющих микроорганизмов; для шелухи гречихи она равна 0,071мм.

3. Установлена наиболее эффективная концентрация легкоокисляемого органического субстрата при использовании консорциума из десяти УОМ. Она равна 50 мг\л, а для трёх УОМ 10 мг/л.

Рис. 1. Динамика роста численности НиУОМ.

Рис. 2. Эффективность деструкции нефти.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Рис. 3. Эффективность деструкции нефти десятью углеводородокисляющими микроорганизмами.

Литература 1. Бабаев Э.Р., Мовсумзаде М.Э. Преобразование нефти в процессе её микробиологической деградации в почве / Башкирский химический журнал, 2009. – Т.16. - №3. – С. 80-87.

2. Киреева Н.А., Григориади А.С., Хайбулина Е.Ф. Ассоциации углеводородокисляющих микроорганизмов для биоремедиации нефтезагрязнённых почв / Вестник Башкирского университета, 2009. – Т.14. - №2. – С. 391-394.

3. Матенькова Е.А., Наплекова Н.Н. Состав микробных ассоциаций дерново-подзолистых почв с нефтяным загрязнением / Достижения наук

и и техники АПК, 2009. - №4. – С. 20-21.

4. Морозов Н.В. Экологическая биотехнология: очистка природных и сточных вод макрофитами /Н. В. Морозов; - Казань: Изд-во КГПУ, 2001.

5. Рогозина Е.А., Шиманский В.К. Некоторые теоретические аспекты восстановления нефтезагрязнённых почвенных экосистем // Нефтегазовая геология. Теория и практика. – 2007. - №4.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИКРОВОДОРОСЛЕЙ EUSTIGMATOS MAGNUS,

DICTYOCOCCUS VARIANS И PSEUDOCOCCOMYXA SIMPLEX КАК

ПЕРСПЕКТИВНЫХ ОБЪЕКТОВ ДЛЯ БИОТЕХНОЛОГИИ

Бажукова Н.В., Новаковская И.В., Матистов Н.В.

Сыктывкарский государственный университет, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, Сыктывкар Разработка и внедрение комплексной технологии переработки микроводорослей актуальна и экономически целесообразна, в связи с возможностью получения широкого спектра продуктов, содержащих биологически активные вещества водорослей, что является важным направлением развития биотехнологических исследований на современном этапе развития этой отрасли науки.

В последние годы возрастает интерес к использованию микроводорослей, в силу их уникального химического состава. К мало исследованной группе относятся микроводоросли северных и горных местообитаний, которые способны быстро накапливать биомассу, изменять синтез биологически активных веществ (БАВ) под влиянием неблагоприятных факторов. В данной работе рассмотрены условия выращивания и культивирования трех видов микроводорослей, обитающих в высокогорных и тундровых почвах европейского северо-востока.

Цель работы - изучение морфологических, количественных и биохимических особенностей штаммов эустигматовой водолросли Eustigmatos magnus (Peters.) Hibberd, а также зеленых водорослей Dictyococcus varians Gerneck, Pseudococcomyxa simplex (Mainx) Fott из коллекции живых культур Института биологии Коми НЦ УрО РАН. Для культивирования были использованы штаммы, выделенные из различных горно-тундровых сообществ (разнотравно-злаково-ивнякового (h – 630 м над ур. м.) - Eustigmatos magnus, вторичной злаковой луговины (h – 697 м над ур. м.) - Dictyococcus varians, почвы угольных отвалов Pseudococcomyxa simplex) Полярного и Приполярного Урала, а также о.

Шпицберген в 2009-2011 г. [2].

Очистка культур проведена растворами пенициллина и бифосина, а также левомицетина и нистатина. Для культивирования штаммы помещали в стеклянные колбы со 100 мл жидкой среды 3N-BBM (рН Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

5.58). Наращивание биомассы проводили на шейкере (Elpan 357) в течение шести-девяти недель при температуре t = 22-24 C. Для инициации роста клеток использовали световую установку с лампами Sylvania Gero-Lux с плотностью потока фотонов 32 мкМоль м -2 ·с -1.

Соотношение периодов свет/темнота – 14/10 часов. Исследование водорослей проводили на микроскопе Nikon Eclipse 80i при увеличении в х400, х1000 раз. Количественный счет клеток водорослей выполнен с помощью камеры Горяева. Размеры клеток определены с использованием программы AxioVision Rel. 4.7. Сухая биомасса повергалась экстракции для извлечения суммы общих липидов (ОЛ) при трехкратной экстракции смесью гексана/этиловый спирт в соотношении 96/4. Массовую долю ОЛ определяли гравиметрическим методом.

При культивировании водорослей значимых морфологических изменений, по сравнению с природными популяциями отмечено не было.

Размеры и форма клеток исследованных нами штаммов микроводорослей (табл. 1) соответствуют приведенным в определителях [1].

Таблица 1. Морфологические и количественные показатели исследованных штаммах микроводорослей Eustigmatos magnus Dictyococcus varians Pseudococcomyxa 6.7-6.75 2.9-3.1 11.3 1.92±0.59 19.5-54·109 1.9±0. simplex * - погрешность определения биомассы Среди исследованных штаммов микроводорослей наибольшее содержание ОЛ обнаружено для Pseudococcomyxa simplex (6.81%) (табл.

2).

Таблица 2. Массовая доля общих липидов в исследованных штаммов микроводорослей Штамм Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Все исследованные микроводоросли отличались простотой получения альгологически чистых штаммов, активным ростом в культуре, способностью быстро наращивать биомассу, и накапливать липиды.

Данные виды обладают биотехнологическим потенциалом и могут стать объектами интенсивных исследований.

Исследования выполнены при поддержке проекта 12-И-4-2007 «Биоресурсный потенциал и биохимическая оценка микроводорослей европейского северо-востока России в качестве объектов биотехнологии».

Литература 1. Андреева В. М. Почвенные и аэрофильные зеленые водоросли (Chlorophyta: Tetrasporales, Chlorococcales, Chlorosarcinales). – СПб.:

Наука, 1998. – 351 с.

2. Новаковская И.В., Патова Е.Н. Коллекция живых штаммов микроводорослей Института биологии Коми НЦ УрО РАН и перспективы ее использования // Изв. Коми научного центра УрО РАН, 2012. № 2 (10). С. 36-41.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ДЕЙСТВИЕ ДЕЛЬТА-ЭНДОТОКСИНА BACILLUS THURINGIENSIS

НА МОРФОМЕТРИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ CUCUMIS SATIVUS L. IN

В последние годы установлены антибактериальные и антифунгальные свойства Bacillus thuringiensis, в том числе в отношении фитопатогенов. Основным действующим началом бактерии является ее дельта – эндотоксин, воздействие которого приводит к оздоровлению растительного материала. В результате должны изменяться его морфометрические показатели.

В работе были использованы семена огурца посевного наиболее распространенных сортов «Конкурент», «Журавленок», «Фермер». В работе использовали один из промышленных штаммов продуцента дельта - эндотоксина – Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Z-52.

Качество выращенной культуры и оценку кристаллообразования проводили согласно принятой методике.

Из изученных концентраций дельта-эндотоксина достоверное увеличение энергии прорастания (на 3%) и всхожести (на 2%) относительно контроля отмечено только для семян сорта «Конкурент», при концентрации 0,03%.

Достоверные различия интенсивности набухания (на 23%) и массы семян (на 10%) по сравнению с контролем отмечены через 17 часов после замачивания с эндотоксином у семян сорта «Журавленок». Однако через 25 часов у семян сорта «Журавленок» масса увеличилась на 13 %, а интенсивность поступления воды в семя превысила контрольные значения на 30%. В сортах «Конкурент» и «Фермер» различия в интенсивности поступления воды в семена оказались не столь выраженными. Действие дельта-эндотоксина достоверно увеличило поступление воды в среднем на 19%.

Действие дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis при обработке семян огурца раствором дельта-эндотоксина способствовала достоверному увеличению длины проростка на 3 – 10 мм по сравнению с контролем во всех исследуемых образцах.

В результате проделанных исследований можно сделать вывод о том, что использование дельта-эндотоксина благотворно влияет на изученные параметры, что можно рассматривать как проявление стимулирующего эффекта. Эти факты требуют дальнейшего детального исследования и могут лечь в основу разработки технологий получения экологически чистых и безопасных продуктов.

Литература 1. Алехина Н.Д., Балнокин Ю.В., Гавриленко В.Ф. Физиология растений.

– М.: Академия, 2007. – 640с.

дельта-эндотоксина Bacillus thuringiensis // Интегрированная защита растений от болезней и вредителей в Сибири. -Новосибирск, 1985.

3. Головко А.Э., Голышин П.Н., Рябченко Н.Ф.. Роль В. thuringiensis в природных биоценозах // Микробиологический журнал. - 1993. — Т. 55.

-№ 3. - 104-109с.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

РАЦИОНАЛЬНЫЕ РЕШЕНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОЙ

ПЕРЕРАБОТКИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ОТХОДОВ

Бахов Ж.К., Муталиева Б.Ж., Коразбекова К.У.

Южно-Казахстанский государственный университет им.М.Ауезова Сегодня биотехнология стала одним из сверхприоритетных направлений развития человечества в XXI веке. Продукция, получаемая с помощью биотехнологических методов, широко используется в различных отраслях, в том числе в сельском хозяйстве. При этом, используя возобновляемое сырье, биотехнология решает не только краткосрочные задачи, но и долгосрочные проблемыглобального масштаба, что особенно важно в условиях интенсивного истощения минеральных ресурсов [1, 2].

Нами были проведены исследования с целью разработки технологии комплексной и глубокой переработки органических отходов – навоза КРС и свиней в биогаз, высококалорийный белково-витаминный концентрат – кормовую добавку для животных и органическое удобрение.

В начале для интенсификации и оптимизации процесса метанового брожения биомассы исследовано влияние на него иммобилизации метанобразующих бактерий в биореакторе. По их результатам разработаны оптимальные условия культивирования метаногенных бактерий посредством использования иммобилизации клеток, а также для поддержания необходимого кислотно-щелочного баланса для развития и роста метанобразующих бактерий при совместном получении витамина В12, органического удобрения.

Установленные при этом оптимальные условия иммобилизации клеток микроорганизмов позволяют осуществлять контроль над биотехнологическим процессом метаногенеза и ускорить рост микроорганизмов, вырабатывающих метан.

Для реализации процессов иммобилизации микроорганизмов нами разработан экспериментальный биореактор со специальными для этого устройствами, с интенсификациейтеплообмена и гомогенизацией ферментационной среды. Все это нацелено на ускорение метаногенеза за счет закрепления метаногенной микрофлоры в аппарате.

Конструкция разработанного биореактора обеспечивает более эффективное протекание процесса анаэробного сбраживания отходов Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

животноводства, улучшение процесса образования биогаза и удобрений Иммобилизационное устройство, представляющее собой матрицу из инертных носителей, позволяет накапливать метаногенные бактерии в виде биопленки на поверхности носителей. Это обеспечиваетсохранение биомассы независимо от времени гидролитического удержания, а микроорганизмы, иммобилизованные в кольцах менее, подвергаются раневому стрессу и повреждению клеток пузырьками газа.

Основные качественные и количественные особенности образованного из животноводческих отходов биогаза: процентное содержание метана в биогазе из жидкого навоза КРС 63% при нормальных условиях, у биогаза из жидкого свиного навоза 57%. Это связано с тем, что в кишке жвачных (КРС) живут метаногенные бактерии из родов Methanomicrobium и Methanospiriillum [3].

По полученным результатамисследований разработана комплексная оптимизированная технология переработки сотходов, способствующая созданию безотходных животноводческих хозйяств, с получением биогаза, концентрированного белково-витаминного комплекса, а также экологически чистого удобрения.

Изучение кинетики микробиологических процессов при созревании метанового биоценоза, происходящих в субстрате без каких-либо добавок показывает, что в первую и вторую фазы процесса бурно развиваются углеводсбраживающие и аммонифицирующие бактерии [4].

Максимальное их количество достигает в этот период 6·108кл/мл.

(сульфат-восстанавливающие и метанобразующие)достигают интенсивного развития лишь по мере перехода брожения в третью фазу.

В частности, метан, свидетельствующий о начале третьей, метанобразующей фазы процесса брожения, начинает интенсивно образовываться на 14-16 сутки от начала процесса, а на 22-24 сутки наступает торможение процесса (рисунок, а). После этого снижается количество метанобразующих бактерий.

Причиной, тормозящей процесс метанообразования, является образование кислых продуктов бактериального гидролиза. Это подтверждают экспериментальные данные по измерению рН среды.В ходе созревания метановогобиоценоза рН изменилось от 7,5 в начале процесса до 5,7 в конце (рисунок, б). Корректировка рН субстрата слабым содовым раствором позволили устранить торможение процесса брожения. Здесь, при образовании бактериями кислот происходит нейтрализация среды.При орошении бродящей смеси слабым содовым раствором основные группы метановых микроорганизмов сохраняют Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

интенсивность роста.

Известно, что также при анаэробном сбраживании отходов животноводства при создании определенных условий можно получить витамин В12.[5]. Поэтому были проведены опыты по разработке способов повышения содержания витамина В12 в сброженных отходах. Для этого исследовали влияние различных факторов на процесс образования В12.

Поскольку обязательным условием образования витамина В является наличие в среде добавок солей кобальта (в состав каждой молекулы В12 входит один атом кобальта), использованы добавки 5-10 г/м соли СоСl 2* 6Н 2 О, поскольку для синтеза витамина В 12 естественных источников кобальта для метаболизма метанобразующих бактерий нет.

Важнейшими факторами процесса витаминообразования являются температура и рН. Проведенные эксперименты показали, что наибольший выход витамина наблюдается при температуре 45 0 С, дальнейшее увеличение температуры приводит к снижению выхода витамина.

Регулирование рН субстрата проведено посредством добавления слабых растворов соляной кислоты и содового раствора. При этом, максимальный выход витамина достигается при рН 7-7,5. Дальнейшее повышение рН приведет к снижению выхода витамина, так как сильнощелочная среда вызывает нейтрализацию жирных летучих кислот, необходимых в качестве питания метанобразующим бактериям.

Для эффективной переработки органических отходов необходимо, чтобы состав смеси был оптимально сбалансирован по отношению С/N и содержанию других элементов питания для метанобразующих бактерий.

Особое внимание следует уделить процессу подготовки сырья, от которой в значительной мере зависит эффективность всего процесса переработки отходов. Для получения высококачественных нетоксичных ферментированных отходов необходимо организовать раздельный сбор отходов и составлять сбалансированные по составу смеси.

В заключение можно отметить, что результаты исследований позволяют рационально решить вопросы комплексной переработки отходов животноводчества.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Рис. 1. Кинетика образования метана (а) и изменение рН (б) при переработке навоза КРС Литература 1. Шеина О.А., Сысоев В.А. // Биохимия процесса производства биогаза как альтернативного источника энергии // Вестник ТГУ. – 2009. – Т.14, вып.1. – С. 73-76.

2. Морозов Н.М. Направления рационального использования энергетических ресурсов в животноводстве // Техника и оборудование для села. – 2004. - №4. – С.3-5.

3. Ножевникова А.Н., Жилина Т.Н., Соколова Т.Г. Видовой состав метановых бактерий в сброженном навозе крупного рогатого скота.

Прикл. биохим. микробиол., 1988, 24, вып.4, с.555-559.

4. Беляев С.С. Метанобразующие бактерии и их роль в биохимическом цикле углерода: автореф. дис. д-ра биол. наук. – Пущино, 1984. – C. 45.

5. Гуревич Г.С. Микробиологический синтез витамина В12 // Получение и применение ферментов, витаминов, аминокислот, премиксов. -М., 1984. -60с.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ФИТОХИМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА КУРИЛЬСКОГО ЧАЯ POTENTILLA

FRUTICOSA. (L.) ИНТРОДУЦИРОВАННОГО НА ЮЖНОМ УРАЛЕ

Баширова Р. М., Данилова Е. Д., Долотовский И. М., Галкин Е. Г.

Башкирский государственный университет, г. Уфа, В последние годы возросла популярность продуктов на основе курильского чая Potentilla fruticosa L. (s. Dasiphora fruticosa (L.) Rydberg,). Листья и цветки P. fruticosa используют для получения тонизирующих напитков, рекомендуемых при гепатитах вирусной и токсической этиологии, как кровоостанавливающее, противовоспалительное и успокаивающее средство. Включение в рацион БАД на основе P. fruticosa, уменьшает риск развития сосудистых осложнений при диабете, оказывает протекторное действие в отношении поджелудочной железы и печени [1, 2, 3].

Широкий спектр его терапевтического действия обусловлен присутствием комплекса биологически активных веществ. Облиственные побеги P. fruticosa содержат флавоноиды; терпеноиды, дубильные вещества, витамины С и Р. Капилляроукрепляющая и антиоксидантная активность растения обусловлена наличием в нем флавонов (Р-витаминов) и других соединений фенольной природы [1, 4].

Ранее нами было показано, что значительное содержание фенольных соединений в образцах сортов сорта лапчатки ‘Goldstar’и ‘Goldfinger’ позволяет рассматривать их в качестве источников препаратов с антимикробной и антиоксидантной активностью [1].

В литературе достаточно детально проанализирован состав фенольных соединений P. fruticosa, однако, информация о соединениях других классов представлена недостаточно. Учитывая изложенное, нами проведены фитохимические исследования курильского чая P. fruticosa, интродуцированного на южном Урале.

Нами проанализирован спиртовый экстракт курильского чая, отобранного в августе 2012 года на опытном участке с. Бакалы Республики Башкортостан. Экстракт анализировали с использованием хромато-масс-спектрометра Termo Finnigan (хроматограф –Finnigan 800, масс-спектрометр высокого разрешения MAT-95XP ЭВМ “Delta” с системой обработки данных “Data Sistem” содержащей библиотеку Database “NIST02”. Разделение компонент проводили на капиллярной колонке (длина 30 м, диаметр 0.25мм, привитая фаза содержащая 5% диметилфенилсиликона и 95% диметилсиликона).

Идентификация проводилась по полным масс-спектрам с использованием программы “Data Sistem ”входящей в систему хромато-масс-спектрометра. Идентифицировано 25 соединений, индексы сходства которых составляли не ниже 89% с библиотечными.

Из соединений, экстрагированных спиртом, обращает внимание альфа-токоферол (витамин Е), содержание которого составляет 0,1%.

В исследованных образцах обнаружены производные фталевой кислоты: диэтилфталат- 0,1%, дипропил-фталат- 0,24%, дибутил-фталат -0,37%, бис(2-этилгексил) фталат- 33,72%. Данная группа соединений представляет интерес с экологической точки зрения. Известно, что фталаты обладают эстрогенной активностью. Не исключено, что именно их наличие обуславливает клинические эффекты курильского чая при гинекологических заболеваниях. С другой стороны, экологи относят фталаты к «эндокринным дизрупторам», вызывающим нарушение репродуктивной системы, в первую очередь у мужчин.

В спиртовом экстракте обнаружен также представитель алкиламидов - октадеканамид (0,31%). Известно, что амиды жирных кислот обладают анальгезирующими свойствами. Соединения этого класса обладают обезболивающей и анксиолитической активностью. Анксиолитическое действие проявляется уменьшением тревоги, страха (антифобическое действие), эмоциональной напряженности. Они применимы при лечении целого ряда нарушений, в особенности воспалительных заболеваний с выраженным болевым синдромом. Кроме того представляет интерес способность амидов жирных кислот снижать аппетит [5].

Поведенные исследования свидетельствуют о более широком спектре биологически активных соединений курильского чая. Помимо флавоноидов в сырье P. fruticosa содержатся соединения, оказывающие влияние на эндокринную и нервную систему, что следует учитывать при разработке биологически активных добавок на его основе и более тщательном обосновании их применения.

Литература Фитохимическое сравнение интродуцированных сортов курильского чая Pentaphylloides fruticosa (L.) O. Schwarz в республике Башкортостан//Вопросы биол., мед. и фарм. химии. 2012, №7. С.54- 2. Волхонская Т.А., Триль В.М., Грек О.Р. и др. Перспективы создания и Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

применения лечебно-профилактических продуктов из курильского чая кустарникового//Нетрадиц. природ. ресурсы, инновац. технологии и продукты, 2001; Вып.5. - С. 173- 3. Шарафетдинов Х.Х., Зыкина В.В., Плотникова О.А. и др. Оценка эффективности использования в диетотерапии больных сахарным диабетом типа 2 биологически активной добавки, содержащей экстракт курильского чая //Вопросы питания 2008. №4 с.52- 4. Tomczyk M., Pleszczyska M., Wiater A. Variation in total polyphenolics contents of aerial parts of Potentilla species and their anticariogenic activity// Molecules 2010, 15, p. 4639- 5. Astarita G., Giacomo B. Di, Gaetani S.et al. Pharmacological Characterization of Hydrolysis-Resistant Analogs of Oleoylethano-lamide with Potent Anorexiant Properties// J. pharm. experimental therapeuticus 2006. Vol. 318, No. 2 p. 563- Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ВОЗМОЖНОСТЬ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ФРУКТОВО-КРУПЯНЫХ

СМЕСЕЙ В ТЕХНОЛОГИИ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ

Воронежский государственный университет инженерных технологий This article discusses the use of fruit and cereal mixtures prepared according to a special recipe, as an additional raw material in the production of bakery products. That will expand their range, improve organoleptic, nutritional and biological value.

Хлебобулочные изделия являются в России основными продуктами питания, так как они содержат необходимые для нормальной жизнедеятельности человека пищевые вещества, среди которых белки, углеводы, липиды, витамины, минеральные вещества и пищевые волокна.

Эти продукты питания характеризуются высокой энергетической ценностью, легкой перевариваемостью и хорошей усвояемостью, приятны на вкус, значительно дешевле большинства других продуктов массового потребления. Доля хлебобулочных изделий в рационе человека зависит от его привычек, а также экономических и социальных возможностей. В большинстве развитых стран мира уровень потребления хлеба составляет 20-25% от общей массы потребляемой пищи. Уровень потребления хлеба в России аналогичен западному и составляет 70-80 кг на душу населения в год.

Наиболее распространенной на рынке хлебобулочных изделий является сегментация по категориям: хлеб (стандартный ассортимент, 20-25 наименований), батоны (5-6 наименований), нетрадиционные сорта с полезными добавками (порядка 10), мелкоштучные и сдобные изделия (более 20 наименований). Данный принцип делит рынок хлебобулочных изделий массового спроса на две ниши: «социальный» хлеб, который составляет основную часть ассортимента хлебобулочных изделий, а его цена составляет 15-20 руб., и нетрадиционные хлебобулочные изделия с добавками.

По мнению экспертов, сегодня развитие рынка хлебобулочных изделий происходит в основном за счет нетрадиционных сортов, растет спрос на новые сорта хлеба с более сложной рецептурой и сдобу, в то время как потребление «социального» хлеба достаточно стабильно. В Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

связи с тем, что последними тенденциями на рынке стали рост спроса на свежевыпеченный горячий хлеб, рост популярности хлеба с добавками злаков, диетического и диабетического назначения, участники рынка значительно расширяют ассортимент хлебобулочных изделий, стремятся производить качественную продукцию и при этом быть «ближе» к покупателю. Важнейшими критериями выбора при покупке хлебобулочных изделий потребителями являются свежесть изделия, цена, упаковка и внешний вид. Основными критериями выбора места покупки хлеба и хлебобулочных изделий является близость торгового предприятия к месту проживания или работы, а также возможность покупки других продуктов питания в одной точке, поэтому три четверти покупок хлебобулочных изделий приходится на магазины и супермаркеты.

Целью данного исследования является разработка технологии пшеничного хлеба с внесением фруктово-крупяной добавки.

В рамках поставленной цели решались следующие задачи:

- разработка компонентного состава добавки;

- подбор технологии обработки вносимой добавки;

- выбор оптимального количества вносимой добавки;

- определение показателей пищевой ценности хлеба.

Таблица 1. Рецептура хлеба пшеничного с фруктово-крупяной добавкой Наименование сырья Мука пшеничная хлебопекарная высшего сорта Экспериментальным путем подбирали компоненты и их соотношение в добавке: рис : яблоки – 1 : 4. Обработку добавки проводили следующим образом: предварительно замоченный в течение 60 мин рис смешивали с перетертыми яблоками, полученную смесь помещали в вакуум-пакет и вакуумировали в течение 1 мин. Вакуумированную смесь прогревалив пароконвектомате в течение 120 мин при температуре 60 ОС. Готовую смесь освобождали от пакета, размельчали до однородной консистенции и вносили в различных количествах в тесто для хлеба из муки Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

пшеничной хлебопекарной высшего сорта.

Таблица 2. Сравнительная оценка показателей пищевой ценности хлеба Наименование показателя Витамины, мг Минеральные вещества, мг Пищевая, энергетическая и биологическая ценность Энергетическая ценность, Содержание незаменимых аминокислот, мг в 1 г продукта Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Биологическая ценность, По органолептическим показателям опытных образцов определяли оптимальное количество вносимой добавки. При внесении 20 % добавки от количества муки в тесте хлеб отличался лучшей пористостью, объемом, цветом мякиша и ароматом. Рецептура теста для хлеба пшеничного с внесением фруктово-крупяной добавки приведена в таблице 1.

В готовых хлебобулочных изделиях определяли показатели пищевой и биологической ценности (таблица 2), контролем служили образцы хлеба из муки пшеничной высшего сорта, приготовленные по классической рецептуре.

Из полученных данных можно сделать следующие выводы: в связи с развитием рынка хлебобулочных изделий нетрадиционных сортов, с добавками злаков, диетического и диабетического назначения, хлеб с внесением фруктово-крупяной добавки должен пользоваться спросом у потребителя, так как имеет приятный вкус и аромат, значительно выигрывает по внешнему виду. Кроме того, хлеб с фруктово-крупяной добавкой имеет более высокие показатели пищевой ценности, по сравнению с хлебом из муки пшеничной высшего сорта, приготовленного по классической рецептуре.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ЦИТОЛОГИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗМЕНЕНИЙ, ПРОИСХОДЯЩИХ

С КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРОЙ MDCK-II ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ

ГЕПАТОЦИТНОГО РОСТОВОГО ФАКТОРА В УСЛОВИЯХ

МЕХАНИЧЕСКОГО СТРЕССА

ФГБОУ ВПО «Калмыцкий государственный университет»

Введение. В современной клеточной биологии для культивации клеточных культур клетки высаживают а поверхность чашек Петри, которые далее помещаются в клеточный инкубатор. В результате клетки совершенно не подвергаются механическому стрессу, лишь при центрифугировании клеток для отделения их от надосадочной жидкости.

Однако, in vitro клетки, в частности эпителиальные клетки, входящие в состав кровеносных сосудов, печени, почек и других органов, постоянно подвергаются механическому стрессу различного происхождения. В настоящей работе для культивации клеточной культуры MDCK-II (эпителиальные клетки печени кролика) используется микрокапиллярная биосенсорная система на основе кварцевого пьезо-кристалла. Даная система была разработана и апробирована (1,2,3,4), с целью использования ее для альтернативного способа изучения клеточных культур. Последствия, которые вызывает постоянное воздействие на клетки тока жидкости питательного медиума, до сих пор не изучены глубоко. Также интересно, насколько механической стресс вызываемый потоком жидкости в микрокапиллярном биореакторе отличается от стресса, источником которого служит, например, постоянное перемешивание при помощи шейкера. Известно, что результатом механического стресса становится активация -интегрина и следовательно увеличение адгезивных способностей клеток (6). Также механической стресс может воздействовать на полимеризацию актина на фокальных контактах клеток и увеличение их площади (8). Поскольку фокальные контакты содержат большое количество актин-связывающих белков, изменения в содержании актина влияют на структуру и функции всего цитоскелета.

Также описано влияние механического стресса на систему промежуточных филаментов, в частности на К5/К14 кератин. В клетках усиливается синтез ДНК и происходит принципиальная перестройка цитоскелета (7). Таким образом, существует большая вероятность того, что механический стресс активирует многочисленные биохимические Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

процессы (5,8,9), которые усложняют использование микрокапиллярных биосенсорных систем для культивации клеточных культур. С другой стороны, при помощи биосенсорной системы были описаны результаты воздействия гепатоцитного ростового фактора (HGF) на рассматриваемую клеточную культуру. Данный белок, контролирует процессы развития тканей, движения клеток, затягивания ран, морфогенеза и другие важные процессы в организме (10,11,12,13). HGF регулирует взаимодействие между эпителиальными тканями и мезенхимой (11). Описано, что HGF воздействует на цитоскелет эпителиальных клеток – увеличивается площадь соприкосновения клеток с адгезионной поверхностью, однако на втором этапе клетки начинают движение друг от друга, что сопровождается уменьшением количества стресс-фибрилл (12). Такое разнообразие эффектов на клетки может быть объясняется важностью c-met рецептора, который активирует действие данного фактора роста. Воздействие на эпителиальные клетки HGF, также как действие механического стресса тесно связано с перестройкой цитоскелета, поэтому задачей настоявшей работы является выявление влияния данных клеточных стимулов друг на друга.

Материалы и методы. Клеточная культура Madine-Darby Canine Kidney (далее MDCK-II) культивировались в RPMI 1640 медиуме, с добавлением 10% питательного серума (FCS), 1% пенициллина и стрептомицина (все Sigma). Для проведения экспериментов в чашках Петри, клетки высаживались за 24 часа перед началом эксперимента, и помещались в инкубатор при температуре 37°С и содержании СО2 5%, в некоторых случаях на дно опускались части кварцевого кристалла, покрытые напылением золота или титана, предварительно стерилизованные. Для стимуляции гепатоцитным ростовым фактором (Hepatocyte Growth Factor, Invitrogen), сухое вещество растворяли в буфере и далее разбавляли питательным медиумом с содержанием 0,5% FCS до концентрации 50 нг/мл и добавляли к испытуемым пробам. При помощи оптической микроскопии собиралась информация о процессах в чашках Петри (инвертированный микроскоп Nicon), на поверхности кварцевых кристаллов (конфокальный микроскоп Leica). Для создания механического стресса от перемешивания жидкости использовали шейкер (10 перемешиваний в минуту). Для стимуляции клеток на повеhхности кварцевого кристалла, встроенного в биореактор сенсорной системы, описанной ранее (1,2,3,4), клетки культивировались в течение 16 часов при постоянном потоке питательного медиума 1мл/час (1,2,3,4), далее в течение 120 минут через систему пропускали раствор HGF ( Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

нг/мл), далее до конца эксперимента через систему пропускался медиум с 0,5% FCS. В случае, если через систему пропускается медиум с 10% FCS, клетки начинают активно пролиферировать, и трудно оценить степень подвижности клеток в составе колоний. В случае биореактора, зафиксированный инвертированный микроскоп применялся для сбора снимков поверхности кристалла с промежутком 1 мин в течение всего эксперимента.

Обсуждение результатов. На первом этапе рассматривались колонии MDCK-II, культивируемы на поверхности чашек Петри в условиях стандартного клеточного инкубатора инкубатора без приложения механического стресса. Как видно на рис.1, колонии клеток под воздействием HGF через 3,5 часа теряют компактную структуру, а через 7 часов меняют фенотип и начинают расхождение друг от друга.

Далее принципиально решался вопрос о том, насколько сильно влияет на подвижность клеток субстрат, на поверхности которого они культивируются. В нашем случае сравниваются поверхности кварцевого кристалла, покрытого напылением золота и титана. Также в данном случае к клеткам прилагался механический стресс в виде постоянного вращения поверхности, на которой культивируются клетки, при помощи шейкера. Из рис. 2 видно, что механический стресс данного типа практически не влияет на клеточные колонии контрольного экспериемента – без добавления HGF. Видно, что под воздействием ростового фактора через 3,5 и 7 часов наблюдается движение клеток MDCK- II, колонии теряют свою целостность, причем в случае титанового покрытия наблюдается наибольшая подвижность. Видно, что в случае металлической поверхности, по-видимому, адгезия клеток слабее, что объясняет большую скорость движения клеток по сравнению с полипропиленом, из которого сделаны чашки Петри. Интересным представляется вопрос о том, насколько сильно отличается характер механического стресса под воздействием шейкера и под воздействием тока жидкости в микроканале биореактора сенсорной системы. На рис. не наблюдаются видимые различия в поведении клеточных колоний MDCK-II в экспериментах, когда через систему пропускался гепатоцитный ростовой фактор с концентрацией 50 нг/мл или просто питательный медиум с пониженным содержанием FCS. Однако при сравнении с экспериментом, в котором клеточная колония культивируется в отсутствие HGF в отсутствии механического стресса, видно, что в случае, если клетки подвергаются механическому стрессу (в обоих рассматриваемых случаях), клетки проявляют большую подвижность. Таким образом, в данной работе, благодаря возможности Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

сравнить влияние механического стресса, гепатоцитного ростового фактора и их сочетания, можно сделать вывод о том, что благодаря влиянию механического стресса на биологические процессы перестройки и формирования цитоскелета, повышается подвижности MDCK-II клеток. Также повышается подвижность клеток под воздействием ростового фактора, которая характеризуется большей направленностью. При этом, при сочетании данных двух факторов, повышающих подвижность клеток в составе клеточных колоний и в составе клеточного слоя, мы наблюдаем результаты, не сопоставимые с влиянием данных отдельных факторов. Можно сделать вывод о том, что в механизме, который задействован в обоих случаях участвуют одни и те же биологические механизмы, действие которых интерферирует при наложении данных двух факторов. Представляется интересным дальнейшее исследование данного феномена.

Рис. 1. Колонии MDCK-II клеток, культивируемых на поверхности кварцевого кристалла, находящихся в чашках Петри, под действием постоянного перемешивания шейкером:1, 4, 7 – на поверхности кристалла, покрытого золотым напылением без HGF в начале эксперимента (1), через 3,5 ч (4), через 7ч (7); 2, 5, 8 – на поверхности кристалла, покрытого золотым напылением в HGF фактора в концентрации 50 нг/мл в начале эксперимента (2), через 3,5 ч (5), через 7 часов (8); 3, 6, 9 – на поверхности кристалла, покрытого титановым напылением, под воздействием HGF в концентрации 50 нг/мл в начале эксперимента (3), через 3,5 ч (6), через 7 ч (9);

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Рис. 2. Колонии MDCK-II клеток, культивируемые на поверхности кварцевого кристалла, покрытого золотым напылением, встроенного в биореактор микрокапиллярной сенсорной системы, находящиеся под постоянным током жидкости (1 мл/час): 1, 2, 3 - с добавлением HGF в концентрации 50 нг/мл в начале эксперимента (1), через 3,5 ч (2), через 7ч (3); 4, 5, 6 - без добавления HGF в начале эксперимента (4), через 3, ч (5), через 7ч (6);

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Рис. 3. Воздействие гепатоцитного ростового фактора (далее HGF) на подвижность колоний клеточных культур MDCK-II, культивируемых на поверхности чашек Петри (полипропилен) без применения механического стресса:1,2,3 – без добавления HGF, в начале эксперимента, через 3,5 часа, через 7 часов; 4,5,6- HGF в концентрации 50 нг/мл в начале эксперимента, через 3,5 часа, через 7 часов;

Литература 1. Jacobs, T. Online adhesion analysis of hepatocyte growth factor stimulated cells with resonant biosensor / K. Bolaeva, T. Khne, M.

Naumann, P. Hauptmann // Proceedings of the XXII Eurosensors Conference. – 2008. - P. 1185- 2. Jacobs, T. Micro Fluidic Biosensor System Based on Quartz Crystal Resonators for Fast Online Adherent Cell Proliferation and Stimulation Analysis / A. Gomide, T. Khne, A. Kienle, M. Naumann, P. Hauptmann // Proceedings of the 6th IEEE Sensors Conference. 2007. - P. 720- 3. Jacobs, T. Impact of flow-through regime on the cultivation of epithelial cells on quartz crystal resonators in micro fluidic channels /G. Cama, K.

Bolaeva, M. Naumann, P. Hauptmann // Procedia Chemistry. - 2009. - Vol 1. - P. 365- 4. Cama, G. Influence of statistical variations in cell distribution on the proliferation kinetics of Madin-Darby canine kidney cells on quartz crystal resonator / K. Bolaeva, T. Jacobs, M. Hartmann, S. Hirsch, M.

Naumann, P. Hauptmann // Procedia Chemistry. – 2009. – Vol. 1. - P.

373– 5. Davis, P.F. Mechanical stress mechanisms and the cell. An endothelial paradigm / S.C. Tripathi // Circ Res. – 1993. – N 72. – P. 239- integrin-dependent cell adhesion medicated by inositol 1,4, triphosphate-sensitive Ca2+ release in THP-1 cells / H.Takechi, T.Kita.

H.Arai // JBC. – 2003. – Vol 278. – N 11. – P. 9327- 7. Russel, D. Mechanical stress induces profound remodeling of keratin filaments and cell junctions in epidermolysis bullosa simplex keratinocytes /P.D. Andrews, J.James, E.B. Lane //Jour of Cell Science. – 2004. – N 117. – Vol 22. – P. 5233- 8. Hirata, H. Mechanical forces facilitate actin polymerization at focal adhesions in a zyxin-depedent manner /H.Tatsumi, M.Sokobe //Journal of Cell Science. – 2008. – N121. – Vol.17. – P.2795- 9. Hu X, Mechanical stress upregulates intercellular adhesion molecule-1 in pulmonary epithelial cells / Y. Zhang, D. Cheng, Y. Ding, D. Yang, F.

Jiang, C. Zhou, B. Ying, F. Wen.// Respiration. – 2008. – N 76. – Vol 3. – P. 344- 10. Zarnegar, R. The many faces of hepatocyte grouth factor: from hepatopoiesis to hematopoiesis // G. K. Michalopoulos // J Cell Biol. – 1995. – N. 129. – P. 1177- 11. Kunito, M., and Nakamura, T., Emerging Multipotent Aspects of Hepatocyte Growth Factor // J Cell Biol. – 1996. – N. 119. - P. 591- 12. P.G. Dowrick Scatter factor affects major changes in the cytoskeletal organization of epithelial cells /A.R. Prescott, R.M. Warn //Cytokine. – 1991. - Vol 3. - N 4. - P. 299- 13. Lin, Z., Differential response of myifibrillar and cytoskeletal proteins in cells treated with phorbol myristate acetate / J. Eshleman, C. Grund, D.

A.,Fischman, T. Masaki, W. W. Franke and H. Holtzer // The Journal of Cell Biology. - 1989. - Vol 108. - P. 1079- Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

РОЛЬ КИСЛОРОДА В АВТОКОЛЕБАТЕЛЬНОЙ РЕАКЦИИ

БРИГГСА-РАУШЕРА

Саратовский государственный университет Целью работы явилось исследование влияния на механизм протекания реакции Бриггса – Раушера (БР) кислорода и его радикальных форм, входящих практически во все ее стадии в том или ином соединении [1]. В ходе экспериментов было установлено, что на поведение реакции БР влияет не только концентрация исходных реагентов, но и фактор перемешивания, электромагнитное поле и т.д.

При аэрации среды реакция протекает быстрее (~ 15%), возможно, из-за дополнительного перемешивания, вносящего непостоянство в концентрации задействованного в реакции кислорода. При воздействии на среду реакции излучения на частотах спектра поглощения кислорода 129ГГц совместно с аэрацией, скорость реакции увеличилась: период между осцилляциями сократился по сравнению с контролем почти вдвое.

Время колебаний при этом уменьшилось ~ 30%. Полученные результаты подтверждают факт важной роли кислорода в осцилляциях реакции БР.

Можно говорить, что высвобождение эндогенного кислорода в среде происходит также с осцилляциями, что может быть использовано для управления автоколебательным процессом, в частности, его пролонгацией и перезапуском.

Литература 1. Жаботинский А.М., Огмер Х., Филд. Р. И др. Колебания и бегущие волны в химических системах: Пер. с англ. / Под ред. Р.Филда и М.Бургера. - М.: Мир, 1988, 720с.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

ПЕРСПЕКТИВЫ ПОВЫШЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ ДРЕВЕСНЫХ

КУЛЬТУР С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИМБИОТИЧЕСКИХ СВЯЗЕЙ

РАСТЕНИЙ С МИКОРИЗООБРАЗУЮЩИМИ ГРИБАМИ

Бухарина И.Л., Ведерников К.Е., Камашева А.А.

Удмурсткий государственный университет, Ижевская государственная сельскохозяйственная академия В живой природе широко распространены симбиотические связи растений с микоризообразующими грибами. Считается, что 80-85% изученных видов растений в природе имеют экто- или эндомикоризу в корневой системе. Использование симбиотических связей растений с микоризообразующими микроскопическими грибами в целях повышения их устойчивости и улучшения минерального питания при культивировании является современным перспективно развивающимся направлением биотехнологий. Для их использования с целью решения проблем создания устойчивых древесных насаждений на техногенно нарушенных территориях, необходимо выделение полезной микоризообразующей флоры из корней древесных растений, произрастающих в условиях техногенной нагрузки и имеющих высокие баллы жизненности, последующее определение систематической принадлежности грибов, их дальнейшее тестирование на устойчивость к поллютантам.

Исследование систематической принадлежности микоризообразующих грибов является важным и первостепенным этапом в разработке биотехнологического метода устойчивости посадочного материала древесных культур. Оно трудоемко и включает ряд последовательных этапов.

Исследования проводились в г. Ижевск, являющимся крупным промышленным центром Уральского региона с населением свыше тыс. человек и хорошо развитой транспортной инфраструктурой.

Основными отраслями промышленности города являются черная металлургия, машиностроение, теплоэнергетика. Большинство промышленных предприятий располагается в черте города, поэтому экологическая ситуация в городе достаточно непростая. Для города актуальна проблема старения зеленого фонда и реконструкции насаждений, для чего необходим не только подбор определенного Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

перечня древесных культур, но и применение новых технологических приемов его культивирования.

Объектом исследований являлись древесные растения четырех видов: клен ясенелистный (Acer negundo L.) и клён остролистный (Acer platanoides L.); ель колючая (Picea pungens Engelm) и ель европейская ( Picea abies (L). Karst.).

Виды растений были подобраны таким образом, чтобы иметь возможность сравнения представителей аборигенной и интродуцированной флоры. Эти виды широко представлены в насаждениях города различных экологических категорий. Таким образом, исследовались растения, произрастающие в насаждениях, испытывающих техногенную нагрузку разной степени интенсивности:

магистральные посадки и санитарно-защитные зоны промышленных предприятий. Согласно методическим подходам С.Н. Краснощековой (1987), в качестве зон условного контроля выбраны территории городского парка ландшафтного типа - ЦПКиО им. С.М. Кирова (для интродуцированных и аборигенных видов древесных растений) и пригородная зона города (для аборигенных видов древесных растений).

Для сбора образцов корневой системы были отобраны модельные особи древесных растений среднегенеративного онтогенетического (g2) и хорошего жизненного состояния по таксационным и физиолого-биохимическим показателям (не менее трех особей каждого вида растений в разных типах насаждений) (Николаевский, 1999;

Инструкция по проведению…,2002; Бухарина, Поварницина, Ведерников, 2007; Бухарина, Журавлева, Болышова, 2012). Образцы корней у модельных растений отбирались согласно методике отбора образцов корневых систем, не нарушая существующие Правила создания, охраны и содержания зеленых насаждений (1999) с разрешения Управления природных ресурсов и охраны окружающей среды Администрации г.

Ижевска. Был проведен сбор образцов корневой системы у 34 древесных растений. Образцы корней после стерилизации хранились в фиксированном виде (жидкость Корнуа) и воздушно сухом состоянии.

Наличие эндомикоризы определялось при помощи микроскопирования фиксированных корневых образцов. Для этого проводилось удаление фиксирующей жидкости Корнуа, парафинизация образцов и приготовление микропрепаратов. Микроскопирование срезов корней осуществлялось с использованием микроскопа ZEIZZ AXIOSKOP методом световой и люминесцентной микроскопии. В 17 исследуемых образцах из 34 была обнаружена эндомикориза.

Образцы корней, в которых была обнаружена микориза, были использованы для посева и выращивания чистой культуры гриба, для дальнейшего приготовления экстракта и идентификации ДНК.

Предварительно выделено шесть морфотипов микроскопических грибов, проведен анализ спор. Идентификация грибов осуществлялась методом PCR –анализа, методом клонирования фрагментов ДНК с последующей их идентификацией. Из перспективных образцов можно отметить обнаруженных в корневой системе клена остролистного представителей родов Leptodontidium, Tetracladium.

Литература Эколого-биологические особенности древесных растений в урбанизированной среде: монография. - Ижевск: ФГОУ ВПО Ижевская ГСХА, 2007. – 216 с.

2. Бухарина И. Л., Журавлева А. Н., Болышова О. Г. Городские насаждения: экологический аспект: монография: монография. Ижевск : Удмурт. ун-т, 2012. - 204 с.

3. Инструкция по проведению инвентаризации и паспортизации насаждений городских озелененных территорий, Москва, 2002 г.

4. Краснощекова, Н.С. Эколого-экономическая эффективность зеленых насаждений: Обзорная информация. – М. : ЦЕНТИ Минжилкомхоза РСФСР, 1987. – 44 с.

5. Николаевский, В.С. Методы оценки состояния древесных растений и степени влияния на них неблагоприятных факторов / В.С.

Николаевский, Н.Г. Николаевский, Е.А. Козлова // Лесн. Вестник. – 1999. - № 2(7). – С.76-77.

6. Правила создания, охраны и содержания зеленых насаждений в городах Российской Федерации (утв. приказом Госстроя РФ декабря 1999 г. № 153).

7. Habte, M., and N.W. Osorio. 2001. Arbuscular mycorrhizas: producing and applying arbuscular mycorrhizal inoculum. CTAHR, Univ. of Hawaii, Honolulu. 47 pp.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

АДАПТАЦИЯ МЕТОДИКИ ВЫДЕЛЕНИЯ ТОТАЛЬНОЙ РНК ИЗ

ЖИРОВОЙ ТКАНИ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ТКАНЕСПЕЦЕФИЧЕСКОЙ

ЭКСПРЕССИИ КЛЮЧЕВЫХ МЕДИАТОРОВ, ВОВЛЕЧЕННЫХ В

РЕГУЛЯЦИЮ ПРОЦЕССОВ МЕТАБОЛИЗМА ЖИРОВОЙ ТКАНИ

Василенко М.А., Фаттахов Н.С., Мазунин И.О., Литвинова Л.С.

Балтийский федеральный университет им. И.Канта, г. Калининград, Сибирский государственный медицинский университет, г. Томск Жировая ткань является активным гормональным органом. Известно более 100 биологически активных веществ, адипокинов и цитокинов, продуцируемых и секретируемых элементами жировой ткани – адипоцитами и макрофагами. Экспериментальные и клинические исследования последних лет выявили новый феномен: ожирение приводит к воспалению жировой ткани (ВЖТ) [Шварц В., 2009].

Воспалительный процесс решающим образом сказывается на метаболической и секреторной функции жировой ткани и играет ведущую роль в развитии сопровождающих ожирение патологических процессов, таких как метаболический синдром, сахарный диабет 2 типа, атеросклероз и др. [Gaillard S., Gaillard R., 2007]. Дальнейшие исследования в области изучения молекулярных и клеточных механизмов формирования ВЖТ, должны быть сосредоточены на выявлении общих закономерностей и особенностей тканеспецифической продукции ключевых медиаторов, вовлеченных в регуляцию процессов метаболизма жировой ткани.

Известно, что первым шагом в исследовании профилей генной экспрессии является выделение и очистка тотальной РНК из биологического образца. Для этого имеется целый ряд протоколов и готовых к использованию реакционных смесей (китов) [Антонова и др., 2010]. Стратегия определяется источником биологического материала.

Так, экстракция РНК из жировой ткани очень затруднительна из-за высокой скорости процессов посмертной деградации ткани и ее высокой метаболической активности. Стоит также отметить общие трудности работы с РНК по сравнению с ДНК. Условия хранения выделенных образцов и манипуляции с ними, несомненно, являются ключевыми условиями успеха экспериментов по анализу транскрипции РНК, в связи с ее высокой нестабильностью.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

Цель работы: адаптация методики выделения тотальной РНК из жировой ткани разной локализации.

Взятие биологического материала осуществляли в ходе выполнения плановых лапароскопических операций у пациентов, страдающих метаболическим синдромом (МС) (ИМТ>35 кг/м 3 ), с обязательным подписанием информированного согласия на использование биологического материала в эксперименте.

Образцы жировой ткани из мест разной локализации (большой сальник, брыжейка, подкожный жир) (0,5 x 0,5 см) помещали в пробирки с буфером RNA later RNA Stabilization Reagent («QIAGEN», Германия), из расчета 10 мкл буфера на 1 мг ткани. Согласно протоколу производителя, биологические образцы жировой ткани сохраняли в течение 12 часов при 2-8°С после взятия, затем замораживали при температуре -80°С до непосредственного их использования.

Затем, после размораживания, необходимое количество жировой ткани переносили в пробирки объемом 1,5 мкл с помощью хирургического пинцета. Перед выделением РНК жировую ткань тщательно размельчали и гомогенизировали, используя стерильные ножницы и гомогенизатор.

Выделение и очистку тотальной РНК осуществляли с применением набора «ExtractRNA» («ЕВРОГЕН», Россия), являющегося монофазным водным раствором фенола и гуанидин-изотиоцианата.

Протокол производителя включал следующие стадии:

1. 15 мг жировой ткани гомогенизировали в 500 мкл раствора ExtractRNA.

2. Лизат инкубировали при комнатной температуре в течение 10- мин, для полной полной диссоциации нуклеопротеидных комплексов.

2. Центрифугировали лизат при 14 000 об/мин в течение 10 минут для удаления нерастворенных фрагментов. Супернатант переносили в новую пробирку.

3. Добавляли 100 мкл хлороформа, активно перемешивая содержимое пробирки вручную в течение 15 секунд.

4. Инкубировали в течение 3-5 мин при комнатной температуре, периодически встряхивая.

5. Центрифугировали образцы при 12 000 об/мин в течение 15 минут при 4 °C.

6. Аккуратно отбирали водную фазу, держа пробирку под углом 45°, избегая касания органической фазы и интерфазы.

7. Добавляли в водную фазу 250 мкл 100% изопропилового спирта.

9. Инкубировали смесь при комнатной температуре в течение 10 мин.

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

10. Центрифугировали образцы при 12 000 об/мин в течение 10 мин при комнатной температуре.

11. Тщательно убирали супернатант, оставив осадок РНК на дне пробирки.

12. Аккуратно по стенке пробирки добавляли 1000 мкл 80 % этанола.

13. Образец центрифугировали на 15 000 об/мин при комнатной температуре. Осторожно удаляли этанол.

14. Высушивали осадок на воздухе в пробирке с открытой крышкой в течение 7 мин.

15. Растворяли РНК в 50 мкл воды, свободной от РНКаз.

Перемешивали раствор пипетированием. Для лучшего растворения осадка, встряхивали на вортексе.

Концентрацию выделенной РНК определяли на спектрофотометре NanoVue Plus («GE Healthcare», США).

Концентрация РНК из 15 мкг жировой ткани, в среднем, составляла 80±20 мкг/мл.

Элюированную РНК распределяли на аликвоты и замораживали на -80°С для дальнейших исследований.

Дальнейшие манипуляции (синтез комплементарной ДНК и полимеразная цепная реакция в реальном времени) показали, что выделенная таким способом РНК пригодна для исследований, связанных с изучением экспрессии определенных генов.

Вывод: адаптированная методика выделения тотальной РНК из жировой ткани позволяет получать достаточное количество РНК для изучения особенностей тканеспецифической экспрессии ключевых медиаторов, вовлеченных в регуляцию процессов метаболизма жировой ткани.

Исследование выполнено в рамках реализации Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009 – 2013 годы (ГК №П329, а также в рамках Соглашения № 14.A18.21.1518).

Биотехнология. Взгляд в будущее, март 2013.

АКУШЕРСКАЯ ПАТОЛОГИЯ У ВЫСОКОПРОДУКТИВНЫХ

МОЛОЧНЫХ КОРОВ КАК СЛЕДСТВИЕ НАРУШЕНИЙ В СИСТЕМЕ

Венцова И.Ю., Пелевина Г.А., Артемов Е.С.

ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный университет Среди множества проблем ведения интенсивного молочного скотоводства наиболее актуальной продолжает оставаться проблема патологии беременности, родов и послеродового периода у высокопродуктивных коров, во многом связанная с расстройством метаболических процессов в организме животных [1-4].

Основной задачей наших исследований было изучение процессов пероксидации липидов и состояния отдельных звеньев системы антиоксидантной защиты у коров красно-пестрой породы, принадлежащих ГПЗ "Дружба" Павловского района Воронежской области, со среднегодовой молочной продуктивностью 6 – 6,5 тыс.кг и более на завершающем этапе беременности и в динамике послеродового периода, как при нормальном, так и при патологическом их течении.

В цельной крови и сыворотке определяли содержание малонового диальдегида, активность каталазы, глутатионредуктазы, ферроксидазную активность церулоплазмина, содержание витамина Е и каротина. Исходя из этих данных, был проведен сравнительный ретроспективный анализ интенсивности течения процессов ПОЛ и состояния системы АОЗ у коров с нормальным течением родов и послеродового периода (n = 83) и с акушерской патологией (задержание последа, субинволюция матки, катарально-гнойный эндометрит, n = 71).

Анализ состояния системы ПОЛ-АОЗ у коров с нормальным течением послеродового периода и у животных с акушерской патологией показал, что уже за два месяца до отела у последних выявляется пониженная мощность как неферментативного, так и ферментативного звеньев системы АОЗ. Об этом свидетельствуют более низкие показатели в крови всех биооксидантов: витамина Е – на 3,9-23,2% (32,4±2,40 – 25,9±2,