«Е.А. Скиба, Н.А. Шавыркина, М.Э. Ламберова ОСНОВЫ ПРОМЫШЛЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ Допущено научно-методическим советом БТИ АлтГТУ для внутривузовского использования в качестве учебного пособия для студентов направлений ...»

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ

Бийский технологический институт (филиал)

федерального государственного бюджетного образовательного

учреждения высшего профессионального образования

«Алтайский государственный технический университет

им. И.И. Ползунова»

Е.А. Скиба, Н.А. Шавыркина, М.Э. Ламберова

ОСНОВЫ

ПРОМЫШЛЕННОЙ МИКРОБИОЛОГИИ

Допущено научно-методическим советом БТИ АлтГТУ для внутривузовского использования в качестве учебного пособия для студентов направлений подготовки 240700.62 и 260100.62 Бийск Издательство Алтайского государственного технического университета им. И.И. Ползунова УДК 663. ББК 36. С Рецензенты: А.Н. Иркитова, к. б. н., зав. лаб. микробиологии Сибирского НИИ сыроделия Россельхозакадемии, г. Барнаул;

В.В. Елесина, к. б. н., доцент кафедры ОХЭТ БТИ АлтГТУ Скиба, Е.А.

Основы промышленной микробиологии: учебное пособие / С42 Е.А. Скиба, Н.А. Шавыркина, М.Э. Ламберова; Алт. гос. техн.

ун-т, БТИ. – Бийск: Изд-во Алт. гос. техн. ун-та, 2013. – 110 с.

В учебном пособии представлены конспект лекций по основам промышленной микробиологии, а также контрольные и тестовые задания. Пособие является информационно-обучающим дополнением к базовым дисциплинам «Основы промышленной микробиологии», «Основы биотехнологии», «Технология отрасли», «Пищевая микробиология», а также дипломному и курсовому проектированию, и предназначено для студентов направлений подготовки 240700.62 «Биотехнология» и 260100.62 «Продукты питания из растительного сырья»

всех форм обучения.

Учебное пособие написано в соответствии с требованиями Федерального государственного образовательного стандарта высшего профессионального образования и Стандартов дисциплин.

УДК 663. ББК 36. Рассмотрено и одобрено на заседании научно-методического совета Бийского технологического института Протокол № 6 от 16 мая 2013 г.

© Скиба Е.А., Шавыркина Н.А., Ламберова М.Э., © БТИ АлтГТУ,

СОДЕРЖАНИЕ

Введение

Модуль 1. Основы получения продуктов микробного синтеза............... 1.1 Микроорганизмы, используемые в биотехнологических процессах

1.2 Классификация продуктов биотехнологических производств..... 1.3 Общая схема производства продуктов микробного синтеза......... 1.4 Условия культивирования микроорганизмов

1.4.1 Питание и метаболизм микроорганизмов

1.4.2 Влияние температуры на жизнедеятельность микроорганизмов

1.4.3 Влияние активной кислотности среды на жизнедеятельность микроорганизмов

1.4.4 Влияние окислительно-восстановительного потенциала на жизнедеятельность микроорганизмов.................. 1.4.5 Активность воды

1.5 Взаимоотношения микроорганизмов

1.6 Производственная инфекция и дезинфекция

Модуль 2. Общая характеристика дрожжей

2.1 Морфология и систематика дрожжей

2.2 Строение дрожжевой клетки

2.3 Метаболизм дрожжевой клетки

2.4 Верховые и низовые дрожжи

Модуль 3. Промышленное использование дрожжей

3.1 Классификация продуктов брожения в зависимости от вида микроорганизмов, используемых в производстве............... 3.2 Производство этанола

3.3 Виноделие

3.4 Пивоварение

3.5 Хлебопечение

3.6 Производство хлебного кваса

3.7 Применение дрожжей в молочной промышленности................. 3.8 Дрожжи как источник белка

3.9 Посторонняя микрофлора бродильных производств.................. 3.9.1 Молочнокислые бактерии

3.9.2 Уксуснокислые бактерии

3.9.3 Маслянокислые бактерии

3.9.4 Гнилостные бактерии

3.9.5 Дикие дрожжи

3.9.6 Микрофлора воды и воздуха

3.10 Дрожжи – источник производственной инфекции в небродильных производствах

Модуль 4. Общая характеристика молочнокислых бактерий............... 4.1 Систематика молочнокислых бактерий

4.2 Классификация молочнокислых бактерий

4.2.1 Род Lactobacillus

4.2.2 Род Leuconostoc

4.2.3 Род Pediococcus

4.2.4 Род Streptococcus

4.2.5 Разные подходы к номенклатуре молочнокислых бактерий

4.3 Распространение молочнокислых бактерий в природе............... 4.4 Особенности метаболизма молочнокислых бактерий................ 4.4.1 Условия работы и питательные потребности

4.4.2 Сбраживание углеводов

4.4.3 Выделение и хранение

Модуль 5. Промышленное использование молочнокислых бактерий

5.1 История использования

5.2 Молочная промышленность

5.3 Биологическое консервирование

5.4 Мясная и рыбная промышленность

5.5 Получение молочной кислоты

5.6 Получение декстрана

Контрольные вопросы

Тесты контроля знаний

Литература

ВВЕДЕНИЕ

Учебное пособие предназначено для студентов направлений подготовки 240700.62 «Биотехнология» и 260100.62 «Продукты питания из растительного сырья» всех форм обучения.

Промышленная микробиология разрабатывает научные основы для решения задач практического использования микроорганизмов на службе человека. Основные разделы и подразделы промышленной микробиологии приведены в таблице 1.

В данном учебном пособии будут рассмотрены только разделы промышленной микробиологии, касающиеся пищевых производств.

Особое внимание уделено применению в промышленности дрожжей и молочнокислых бактерий.

Чтобы управлять микробиологическим процессом, необходимо знать физиологию применяемых культур микроорганизмов. Это позволит контролировать процессы, протекающие в клетке, условия культивирования и влияние основных факторов окружающей среды на направленный биосинтез.

В первом разделе рассмотрены основы получения продуктов микробного синтеза: микроорганизмы, используемые в биотехнологических процессах, классификация продуктов биотехнологических производств, общая схема производства продуктов микробного синтеза, условия культивирования микроорганизмов, влияние различных факторов на жизнедеятельность микроорганизмов, виды взаимоотношений микроорганизмов.

Во втором разделе приведены общая характеристика дрожжей, их систематика и морфология, производственная классификация. Базируясь на этом, можно понять те требования, которые предъявляются к отдельным штаммам дрожжей в производственных процессах. Эти требования и микробиологическая классификация производств приводятся в третьем разделе. Раздел заканчивается рассмотрением технически вредной микрофлоры бродильных производств.

В четвёртом разделе подробно приводится современная классификация молочнокислых бактерий, имеются сравнительные таблицы, позволяющие сопоставить информацию современной литературы и использовавшуюся ранее, так как именно классификация молочнокислых бактерий вызывала споры и многократно пересматривалась.

В пятом разделе рассмотрены промышленные процессы, в которых используются молочнокислые бактерии.

Таблица 1 – Разделы промышленной микробиологии Пищевые Микробиология виноделия производства Микробиология пива Микробиология хлебопекарного производства Микробиологические аспекты производства сахара, кофе, кондитерских изделий, морепродуктов Бродильные Производство спиртов (этилового, бутилового, производства амилового и др.) для технических целей. Производство органических кислот (лимонной, молочной, масляной, глюконовой, итаконовой и др.) Медицинская Использование микроорганизмов при создании и промышленность модификации сложных лекарственных средств.

Синтез новых антибиотиков, гормонов и интерферонов Производство Ферментные препараты для пищевой промышферментных ленности, для медицинской диагностики, для препаратов кормопроизводства, для синтетических моющих Производство Кормовой белок из гидролизатов целлюлозосокормового белка держащего сырья, из сульфитных щелоков, из и других биоло- парафинов нефти. Производство аминокислот гически актив- (глутамат натрия, лизин, др.), стимуляторов роста ных веществ растений Производство Дендробациллин для борьбы с сибирским шелкомикробных прядом, боверин для защиты сельскохозяйственсредств защиты ных культур, вирусные препараты от вредителей Микробная Улучшение методов тестирования и мониторинга экология загрязнений окружающей среды.

Использование микроорганизмов для переработки сельскохозяйственных, бытовых и промышленных отходов

МОДУЛЬ 1. ОСНОВЫ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКТОВ

МИКРОБНОГО СИНТЕЗА

1.1 Микроорганизмы, используемые в биотехнологических процессах Из более чем 100 тыс. известных микроорганизмов в промышленности применяются всего несколько сотен видов, так как промышленный штамм должен отвечать ряду строгих требований:

1) расти на дешёвых субстратах;

2) обладать высокой скоростью роста или давать высокий выход продукта за короткое время;

3) проявлять синтетическую активность в сторону желаемого продукта; образование побочных продуктов должно быть низким;

4) быть стабильным в отношении продуктивности и к требованиям условий культивирования;

5) быть устойчивым к фаговым и другим типам инфекций;

6) быть безвредным для людей и окружающей среды;

7) желательны термофильные, ацидофильные (или алкофильные) штаммы, поскольку с ними легче поддерживать стерильность в производстве;

8) интерес представляют анаэробные штаммы, так как аэробные создают трудности при культивировании – требуют аэрирования;

9) образуемый продукт должен иметь экономическую ценность и легко выделяться.

На практике применяются штаммы четырёх групп микроорганизмов, к ним относятся: дрожжи; бактерии; мицелиальные грибы (плесени); актиномицеты.

Термин «дрожжи» в строгом смысле не имеет таксономического значения. Это одноклеточные эукариоты, относящиеся к трём классам:

Ascomycetes, Basidiomycetes, Deuteromycetes.

К аскомицетам относят, прежде всего, Saccharomyces cerevisiae, определенные штаммы которого используются в пивоварении, виноделии, производстве хлеба, этилового спирта.

Аскомицеты Saccharomyces lipolytica деградируют углеводороды нефти и употребляются для получения белковой массы.

Дейтеромицет Candida utilis используют как источник белка и витаминов и выращивают на непищевом сырье: сульфитных щелоках, гидролизатах древесины и жидких углеводородах.

Дейтеромицет Trichosporon cutaneum окисляет многие органические соединения, в том числе токсичные (например, фенол), и используется при переработке стоков.

Полезные бактерии относятся к эубактериям.

Промышленное применение с давних времен имеют молочнокислые бактерии родов Lactobacillus, Leuconostoc, Lactococcus.

Уксуснокисные бактерии родов Acetobater, Gluconacetobacter превращают этанол в уксусную кислоту.

Бактерии рода Bacillus используются для производства вредных для насекомых токсинов, а также для синтеза антибиотиков и аминокислот.

Бактерии рода Corynebacterium используются для производства аминокислот.

Мицелиальные грибы используют:

– в получении органических кислот: лимонной (Aspergillus niger), глюконовой (Aspergillus niger), итаконовой (Aspergillus terreus), фурмаровой (Rhizopus chrysogenum);

– в получении антибиотиков (пенициллина и цефаллоспорина);

– в производстве специальных видов сыров: камамбера (Penicillium camamberti), рокфора (Penicillium roqueforti);

– вызывают гидролиз в твёрдых средах: в рисовом крахмале при получении сакэ, в соевых бобах при получении темпеха, мисо.

Из актиномицетов наиболее представительными являются роды Streptomyces и Micromonospora, используемые в качестве продуцентов антибиотиков. При росте на твёрдых средах актиномицеты образуют тонкий мицелий с воздушными гифами, которые дифференцируются в цепочки конидиоспор.

В настоящее время с помощью микроорганизмов синтезируют следующие соединения: алкалоиды, аминокислоты, антибиотики, антиметаболиты, антиоксиданты, белки, витамины, гербициды, ингибиторы ферментов, инсектициды, ионофоры, коферменты, липиды, нуклеиновые кислоты, нуклеотиды и нуклеозиды, окислители, органические кислоты, пигменты, поверхностно-активные вещества, полисахариды, противоглистные агенты, противоопухолевые агенты, растворители, ростовые гормоны растений, сахара, стерины и превращенные вещества, факторы транспорта железа, фармакологические вещества, ферменты, эмульгаторы.

1.2 Классификация продуктов биотехнологических производств Продуктами биотехнологических производств являются природные макромолекулы – белки, ферменты, полисахариды, полиэфиры, выделенные из клеток микроорганизмов, тканей и органов растений и животных.

По отношению к процессам роста низкомолекулярные продукты метаболизма живых клеток делятся на первичные и вторичные метаболиты (рисунок 1).

Рисунок 1 – Динамика изменения биомассы и образования первичных (А) и вторичных (Б) метаболитов Первичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения (молекулярная масса менее 1500 Да), необходимые для роста микроорганизмов. Одни из них являются строительными блоками макромолекул, другие участвуют в синтезе коферментов. Среди наиболее важных для промышленности метаболитов можно выделить аминокислоты, органические кислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, растворители и витамины.

Вторичные метаболиты – это низкомолекулярные соединения, не требующиеся для роста в чистой культуре. Ко вторичным метаболитам относятся: антибиотики, алкалоиды, гормоны роста растений и токсины.

1.3 Общая схема производства продуктов микробного синтеза Процессы биотехнологических производств разнообразны, но все они имеют пять основных стадий:

1) приготовление питательной среды;

2) подготовка посевного материала;

3) культивирование микроорганизмов;

4) выделение целевого продукта;

5) очистка целевого продукта.

Принципиальная биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза показана на рисунке 2.

Независимо от типа биотехнологического производства процесс начинается с приготовления питательной среды. Среда должна отвечать двум основным требованиям. Во-первых, она должна быть полноценной для питания и недорогой. Углерод и азот в усвояемой форме требуются для биосинтеза белка; фосфор необходим для синтеза ДНК и АТФ; микроэлементы требуются для образования ферментов, также для нормальной жизнедеятельности нужны факторы роста и витамины. Во-вторых, среда должна быть стерильной, что достигается температурной, ультрафиолетовой, ультразвуковой и другими видами обработки.

Получение посевного материала (инокулята) проводится по следующей схеме:

получение культуры в микробиологической лаборатории выращивание микроорганизмов в малом инокуляторе выращивание микроорганизмов в большом инокуляторе Количество стадий варьирует в зависимости от вида применяемого микроорганизма. Качество полученного посевного материала контролируют путем микроскопирования.

Культивирование (ферментация) представляет собой совокупность последовательных операций от внесения в заранее приготовленную питательную среду посевного материала до завершения процессов роста и биосинтеза вследствие исчерпания питательных веществ среды.

приготовление питательной среды подготовка посевного материала продуцент биомасса живых клеток биомасса убитых клеток обезвоживание Рисунок 2 – Принципиальная биотехнологическая схема производства продуктов микробного синтеза Существуют два основных типа ферментаций: получение биомассы микроорганизмов и получение метаболитов.

Для работы микробиологического производства важно найти высокопродуктивный штамм и обеспечить условия реализации его возможностей. Подбирая и поддерживая на оптимальном уровне состав среды и условия культивирования, удается в несколько раз повысить выход целевого продукта.

Выделение и очистка целевого продукта. По окончании ферментации, которая может длиться от нескольких часов до нескольких дней, в культуральной жидкости содержатся остатки веществ среды, продукты, синтезированные микроорганизмом и микробная биомасса.

В зависимости от целей производства используют всю культуральную жидкость без разделения и очистки продуктов или разделяют биомассу и фильтрат. Если требуется разделение биомассы и культуральной жидкости, то проводят центрифугирование, фильтрование и дальнейшее концентрирование биомассы, например на фильтр-прессах. Если целевой продукт находится в составе клеток, то последние подвергают дезинтеграции, после чего извлекают продукт. Если нужный продукт (органические кислоты, аминокислоты и др.) находится в растворе, то биомасса – побочный продукт.

1.4 Условия культивирования микроорганизмов Одна из особенностей микроорганизмов – их необычайная зависимость от условий окружающей среды. Малые размеры клеток определяют тесный контакт микроорганизмов со средой, поэтому они реагируют на изменение условий среды в большей степени, чем другие живые существа. Факторы внешней среды весьма разнообразны. Решающее значение для жизнедеятельности микроорганизмов имеют набор и соотношение компонентов питательной среды. Чрезвычайно важны также физико-химические факторы: активная кислотность среды (рН), окислительно-восстановительные условия (Еh), аэрация, температура, свет и другие. Развитие микроорганизмов возможно лишь в определенных пределах каждого фактора. Для представителей различных групп микроорганизмов эти пределы часто неодинаковы. Изменение того или иного фактора существенно влияет на рост и обмен веществ микроорганизмов.

1.4.1 Питание и метаболизм микроорганизмов В зависимости от характера источника углерода и азота микроорганизмы делятся на автотрофов и гетеротрофов.

Автотрофы – организмы, которые для углеродного питания используют неорганические соединения.

Гетеротрофы – организмы, для питания которых требуются сложные органические соединения – белки, сахара, жиры, мочевина.

Обмен веществ у микроорганизмов складывается из процессов ассимиляции, или анаболизма, и диссимиляции, или катаболизма.

В результате ассимиляции происходит увеличение сложности соединений. Из аминокислот синтезируются белки, из моносахаридов – полисахариды. Это приводит к синтезу новых клеточных компонентов.

При диссимиляции, наоборот, происходит расщепление сложных соединений на более простые, низкомолекулярные соединения.

Диссимиляция сопровождается выделением энергии, которая используется для поддержания жизнедеятельности клетки и ассимиляции.

1.4.2 Влияние температуры на жизнедеятельность микроорганизмов Известно, что живые организмы могут существовать в диапазоне температур от 5 до +95 С. Принято классифицировать прокариоты в соответствии с диапазоном температур их роста (таблица 2). Для каждого класса микроорганизмов характерна некоторая оптимальная температура, при которой скорость роста достигает максимума, а также верхняя и нижняя температурные границы, вне которых популяция вообще не способна к росту.

Таблица 2 – Классификация микроорганизмов в соответствии с зависимостью скорости их роста от температуры Группа микроорганизмов Психрофильные И дрожжи, и посторонние микроорганизмы бродильных производств относят к мезофилам. В таблице 3 приведены температуры их развития.

Таблица 3 – Температурные диапазоны развития микроорганизмов, участвующих в процессах брожения и сопутствующей микрофлоры Микроорганизмы Бактерии Техническая микробиология молока и молочных продуктов намного сложнее, так как в молоке могут развиваться различные группы микроорганизмов (таблица 4) при различных условиях.

Таблица 4 – Температурные диапазоны развития микроорганизмов молока и молочных продуктов Микроорганизмы Плесеневые Oospora –4…–8 значения, т.к. психрофилы грибы Penicillium –5 в молоке не могут развиваться при температуре Дрожжи Продолжение таблицы Бактерии сульфатредуцирующие споровые анаэ- 16…18 37…45 – Бактерии 1.4.3 Влияние активной кислотности среды на жизнедеятельность микроорганизмов Одним из важных условий для проявления жизнедеятельности микрооргнизмов является активная кислотность среды, которую выражают величиной рН – отрицательным логарифмом концентрации ионов водорода. Значение рН от 0 до 14 характеризует степень кислотности или щелочности раствора. Микроорганизмы по-разному относятся к активной кислотности среды.

Некоторые могут развиваться в широких пределах рН, другие в узкой зоне (таблица 5). Даже небольшие изменения рН заметно влияют на рост и развитие микроорганизмов. Конформация белка и его активность зависят от рН. Поэтому рН оказывает существенное влияние на процессы клеточного транспорта, скорости ферментативных реакций, а следовательно, и на скорость роста клеток. Обычно отклонение от оптимального рН на 1,5…2 единицы в любую сторону от оптимальной величины приводит к практически полному прекращению роста.

Таблица 5 – Отношение микроорганизмов к реакции среды Ацидофильные Лучше растут в кислых условиях Нейтрофильные Предпочитают нейтральную реакцию среды, некоторые из них (кислотоустойчивые) способны развиваться и в кислой среде (рН 5,0…4,5) Алкалифильные Лучше растут при рН 9, На практике важно знать диапазон рН не только для целевой, но и для посторонней микрофлоры производств (таблицы 6 и 7). В обоих случаях не представлена алкалифильная микрофлора, поскольку она подавляется селективными значениями рН.

Таблица 6 – Оптимальные и предельные значения рН для развития микроорганизмов, участвующих в процессах брожения и сопутствующей микрофлоры Микроорганизмы фильные Продолжение таблицы АцидоМезофильные мофильные Нейтрофильные Маслянокислые Таблица 7 – Оптимальные и предельные значения рН для развития микроорганизмов молока и молочных продуктов Ацидо- Термофильные фильные лактобациллы фильные C. perfringens 5,0…5,8 6,0…7,6 8,5…9, 1.4.4 Влияние окислительно-восстановительного потенциала на жизнедеятельность микроорганизмов Для развития, роста и размножения микророрганизмам требуется энергия. Способы добывания энергии у микроорганизмов различны.

Большинство из них живет за счет окисления веществ кислородом воздуха. Микроорганизмы, не имеющие другого способа добывания энергии, называют облигатными аэробами.

Некоторые облигатные аэробные бактерии гибнут на воздухе, но могут развиваться при концентрации кислорода около 2 % (в 10 раз ниже, чем в атмосфере); они получили название микроаэрофилов.

Есть микроорганизмы, которые получают энергию без участия кислорода воздуха за счет сопряженного окисления-восстановления веществ субстрата. Такие микроорганизмы называют облигатными анаэробами. Кислород подавляет их развитие.

Некоторые микроорганизмы способны переключаться с одного энергетического пути на другой и развиваться как в присутствии, так и в отсутствии кислорода. Они получили название факультативных аэробов, или название факультативных анаэробов. К ним относятся, например, дрожжи.

Анаэробный тип метаболизма называют также брожением. Примеры: спиртовое брожение дрожжей, молочнокислое брожение молочнокислых бактерий.

Аэробный тип метаболизма называют дыханием. Пример: размножение хлебопекарных дрожжей.

Аэробам требуется много кислорода. Для окисления 1 г глюкозы до углекислого газа и воды требуется примерно 1 г кислорода.

Однако представить необходимый кислород микроорганизму в большой концентрации нельзя, так как он является сильным окислителем, особенно при наличии катализаторов – ферментов. Могут произойти нежелательные цепные окислительные реакции в клетке, в следствие чего разрушаются биологические мембраны и образуются пероксиды и другие токсичные вещества.

Допустимая концентрация кислорода в воде, переносимая микроорганизмами, достигает 10 мг/дм3. Если насытить воду чистым кислородом, то в ней растворится до 40 мг/дм3 кислорода. Такую концентрацию не выдержит ни один микроорганизм.

При огромной потребности в кислороде микроорганизмы очень быстро используют ничтожное количество растворенного кислорода, и их рост зависит от скорости поступления в раствор новых порций кислорода.

Если микроорганизмы выращивать на поверхности жидкой или твердой фазы, то он не испытает затруднений в поступлении кислорода, черпая его из воздуха. При глубинном культивировании, когда микроорганизм растёт в толще среды, он может пользоваться только кислородом, растворённым в среде.

Степень окисления и восстановления среды характеризуется rH2. Символ rH2 аналогичен рН. Но рН выражает степень кислотности и щелочности, а rH2 – окислительную и восстановительную способность среды. Если для определения рН необходимо знать только концентрацию ионов Н+, то для определения rH2 – как рН раствора, так и окислительно-восстановительный потенциал Еh.

Окислительно-восстановительный потенциал (Еh) показывает разность потенциалов (мВ), возникающих в растворе между платиновыми и нормальным водородным электродами, составляющими гальванический элемент.

В микробиологии окислительно-восстановительный потенциал выражают через rH2. Связь между rH2, Eh и рН описывается следующей формулой:

Величины rH2 от 0 до 41 характеризуют все степени насыщения водного раствора водородом и кислородом, то есть любую степень аэробности среды.

Чем меньше rH2, тем больше восстановительная способность раствора. Наибольшая восстановительная способность водного раствора равна 0 (выделению водорода), а наименьшая примерно 41 (выделение кислорода).

Облигатные анаэробы могут существовать при rH2 не выше 12…14, а размножаться при rH2 не выше 3…5. Факультативноаэробные формы живут в средах при rH2 от 0 до 30, но высокие значения rH2 для них нежелательны. Строгие аэробы могут осуществлять жизнедеятельность при rH2 12…15, а размножаться при rH2 12…36.

Как аэробы, так и анаэробы в определенной степени способны изменять rH2 питательной среды, на которой они растут, доводя его до наиболее подходящего для их роста значения посредством выделения восстановителей.

В основе размножения микроорганизмов лежит совокупность последовательно протекающих ферментативных реакций. Микроорганизмы начинают размножаться после того, как установится оптимальное значение rH2, требуемое для протекания этих реакций.

Особо важное значение окислительно-восстановительный потенциал имеет в технологии продуктов брожения.

1.4.5 Активность воды Активность воды (aw) в каком-либо растворе определяется как отношение давления пара над раствором к давлению пара над чистой водой. Для чистой воды aw = 1. Все без исключения дрожжи способны расти при aw, приближающейся к 1. Большинство видов дрожжей перестает расти при aw = 0,9. Такую активность воды имеет, например, 50%-ный раствор глюкозы или 14%-ный раствор NaCl. В таблице приведены предельные значения активности воды.

Таблица 8 – Предельные значения активности воды (aw) для развития микроорганизмов 1.5 Взаимоотношения микроорганизмов В природных условиях микроорганизмы образуют сложный биоценоз – сообщество, в котором каждый микроорганизм находится в определенном отношении (стимулировании или угнетении) со стороны других микроорганизмов.

В производственных условиях чаще всего используется монокультура микроорганизмов. Вместе с тем в любом производстве есть сопутствующие микроорганизмы. Отношения микроорганизмов называются симбиозом и могут быть следующими.

Мутуализм – взаимовыгодный симбиоз, когда оба партнера выигрывают от ассоциации. Примеры: взаимоотношения между микроорганизмами в кефирных грибках, между микрофлорой кваса. Молочнокислые бактерии, продуцируя молочную кислоту, создают благоприятные условия для развития дрожжей. В свою очередь, дрожжи обогащают среду обитания аминокислотами и витаминами, стимулируя развитие молочнокислых бактерий. Крайней степенью мутуализма является такой, когда партнеры уже не могут существовать вне ассоциации, как, например, в кефирных грибках.

Синергизм – разновидность мутуализма, характеризующаяся тем, что совместная культура партнеров проявляет более высокую физиолого-биохимическую активность, чем каждый из партнеров порознь. Пример: симбиоз лактобактерий и дрожжей, неспособных сбраживать лактозу.

Комменсализм – когда один из партнеров питается продуктами обмена второго партнера, не принося ему никакой пользы.

Метабиоз – когда один партнер подготавливает благоприятные условия для последующего развития другого партнера. Пример:

дрожжи, развиваясь на сахаристых средах, преобразуют сахар в этанол, далее на этой культуральной среде могут развиться уксуснокислые бактерии, превращая этанол в уксусную кислоту, которую могут использовать плесени, разлагая ее до углекислого газа и воды.

Антагонизм – когда один партнер активно подавляет другого партнера. Примеры: лактобактерии, образуя молочную кислоту, снижают рН, создавая тем самым невыносимые условия для многих видов микроорганизмов, например, сенной палочки. Дрожжи образуют спирт, который не дает развиваться другим микроорганизмам.

Паразитизм – когда один партнер использует ресурсы второго партнера, зачастую приводя его к гибели. Классический пример – культура бактерий, заражённая вирулентным бактериофагом.

1.6 Производственная инфекция и дезинфекция Под производственной инфекцией понимают загрязнение посторонними микроорганизмами, попадающими на полупродукт и готовую продукцию из сырья, полуфабрикатов, воды, воздуха. Источник инфекции может находиться на самом предприятии, если неэффективны меры борьбы с посторонней микрофлорой, нерегулярно удаляют отходы, не соблюдают правила личной гигиены и т.п.

Развиваясь на различных стадиях производства, микроорганизмы уменьшают выход готового продукта (например, спирта) или приводят к порче продукта (например, вина).

Роль переносчика микроорганизмов может играть воздух производственных помещений. В него микроорганизмы (бактерии, дрожжи, плесени) попадают вместе с пылью, которая затем оседает на поверхности продукта и оборудовании. Воздух закрытых помещений считается чистым при содержании не более 2000 микроорганизмов в 1 м3.

Снижение запылённости производственных цехов достигается регулярной уборкой, использованием системы вентиляции, своевременным удалением отходов и отбросов.

Производственная вода также может содержать различные микроорганизмы (железобактерии, сапрофиты, бактерии группы кишечной палочки). Поэтому в соответствии с требованиями стандарта по бактериологическим показателям в 1 мл воды должно содержаться не более 100 клеток бактерий и не более 3 бактерий группы кишечной палочки в 1 л воды.

На производстве источники инфекции возникают в труднодоступных для чистки местах производственного оборудования, в которых задерживаются остатки питательной среды. При соприкосновении с ними производственные жидкости инфицируются и сами становятся источниками инфекции.

Для уничтожения и подавления вредных микроорганизмов проводят дезинфекцию всех производственных помещений, аппаратуры и инвентаря.

Способы дезинфекции. В соответствии с установленными правилами на пищевых предприятиях проводят профилактические дезинфекции с целью предупреждения возникновения очагов инфекции на производстве.

Наряду с профилактическими проводят также экстренную дезинфекцию, если зафиксированы инфекционные заболевания обслуживающего персонала, присутствие вредных микроорганизмов в сырье, полуфабрикатах, вспомогательных материалах и т.д.

На пищевых предприятиях дезинфекцию оборудования, трубопроводов, инвентаря, производственных и бытовых помещений проводят механическими, физическими и химическими способами.

Механическими способами удаляют затвердевшие частицы, различные отложения, частично микроорганизмы с поверхностей оборудования, трубопроводов и инвентаря. Для проведения такой очистки используют сетки, мётлы, скребки и т.д.

Полного удаления микроорганизмов такие способы не обеспечивают.

К физическим способам относятся: действие высоких температур (автоклавирование, обработка паром и горячей водой, кипячение, пастеризация), бактерицидные облучения, обеспложивающая фильтрация и ультразвук.

Большинство неспорообразующих бактерий гибнет при нагревании до 60…70 С в течение 20…30 минут. Более устойчивы термобактерии и слизеобразующие бактерии, они не всегда погибают даже при нагревании до 80…90 С. Споры микроорганизмов ещё более устойчивы к действию высокой температуры. Пропаривание трубопроводов острым паром убивает вегетативные и споровые формы.

Мелкое оборудование и инвентарь дезинфицируют погружением в горячую воду температурой 80…85 С на 20…30 минут.

Химические способы основаны на использовании различных моющих и дезинфицирующих средств (детергентов).

При химической дезинфекции соблюдают следующую последовательность обработки оборудования и трубопроводов: механическая очистка; промывка тёплой водой; обработка дезинфицирующим раствором; пропаривание; промывка холодной водой.

Эффективность санитарной обработки зависит от многих факторов: степени загрязнённости, состава, концентрации, температуры моющих и дезинфицирующих средств, способа очистки и т.д.

Традиционные моющие средства, например, тринатрийфосфат, гидроокись натрия (каустическая сода) хорошо растворяют грязь, отмывают масла, жиры и обладают антимикробным действием. Однако они оказывают коррозионное действие на некоторые металлы, поэтому стали применять синтетические моющие средства, такие как сульфанол, сульфохлорантин, санпор, дезмол, йодонат катапин и др.

Действие ультразвука сводится к разрыву клеток микроорганизмов под действием кавитации, кроме того, усиливается проникновение детергентов внутрь клеток.

Таким образом, тщательная борьба с производственной инфекцией обеспечивает высокий выход и качество продукции.

МОДУЛЬ 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДРОЖЖЕЙ

2.1 Морфология и систематика дрожжей Русское слово «дрожжи» имеет общий корень со словами «дрожь», «дрожать», которые применялись при описании вспенивания жидкости, зачастую сопровождающего брожение, осуществляемое дрожжами. Английское слово «yeast» (дрожжи) происходит от староанглийского «gist», «gyst», что означает «пена, кипеть, выделять газ».

Дрожжи, вероятно, одни из наиболее древних «домашних организмов». Тысячи лет люди использовали их для ферментации и выпечки. Археологи нашли среди руин древнеегипетских городов жернова и пекарни, а также изображение пекарей и пивоваров. Предполагается, что пиво египтяне начали варить за 6000 лет до н. э., а к 1200 году н. э.

овладели технологией выпечки дрожжевого хлеба наряду с выпечкой пресного.

Изначально, для сбраживания нового хлеба люди использовали остатки старого. В результате в различных хозяйствах столетиями происходила селекция дрожжей и сформировались новые физиологические расы, не встречающиеся в природе, многие из которых даже изначально были описаны как отдельные виды. Они являются такими же продуктами человеческой деятельности, как сорта культурных растений.

В 1881 г. Эмиль Христиан Хансен выделил чистую культуру дрожжей, а в 1883 г. впервые использовал её для получения пива вместо нестабильных заквасок. В конце XIX века при его участии создаётся первая классификация дрожжей, в начале XX века появляются определители и коллекции дрожжевых культур. Во второй половине века наука о дрожжах (зимология) помимо практических вопросов начинает уделять внимание экологии дрожжей в природе, цитологии, генетике.

До середины XX века учёные наблюдали половой цикл только у аскомицетных дрожжей и рассматривали их всех как обособленную таксономическую группу сумчатых грибов. Японскому микологу Исао Банно в 1969 г. удалось индуцировать половой цикл размножения у Rhodotorula glutinis, которая является базидиомицетом.

Современный период изучения биологического разнообразия характеризуется интенсивным развитием филогенетической систематики, которая направлена на реконструкцию конкретных путей исторического развития организмов. В микробиологии филогенетическая систематика получила мощный импульс развития лишь в самом конце XX века в связи со сравнительным изучением консервативных нуклеотидных последовательностей в р-РНК.

Оказалось, что группирование дрожжей на основе сходства нуклеотидных последовательностей р-РНК во многих случаях не совпадает с группированием по фенотипическим признакам. Многие традиционные признаки, используемые в классификации дрожжей, такие как характеристики вегетативного размножения, форма аскоспор, способность к сбраживанию и ассимиляции сахаров, стали считаться ненадежными, непригодными для определения филогенетического родства.

Секвенирование р-РНК (р-ДНК) сейчас считается необходимым при описании новых видов дрожжей.

В большинстве пищевых бродильных производств используются дрожжи-сахаромицеты, согласно классификации аскомицетовых (сумчатых) грибов (Kurtzman C.P., Fell J.W. eds., 1998 г.) их характеризуют следующим образом:

– класс Hemiascomycetes;

– порядок Saccharomycetales;

– семейство Saccharomycetaceae (ранее было Endomycetaceae);

– род Saccharomyces;

– вид сerevisiae.

В природе дрожжи находятся в почве, на поверхности растений, плодов, ягод. В основном дрожжи размножаются многосторонним почкованием (рисунок 3), иногда – спорообразованием и простым делением. Диплоидизация происходит в результате слияния двух гаплоидных клеток (хологамия). Вегетативно размножаются в основном диплоидные клетки.

Некоторые дрожжи размножаются, как и бактерии, простым Рисунок 3 – Многостороннее делением, то есть образованием почкование дрожжей одной или нескольких поперечных Saccharomyces сerevisiae перегородок.

Споры у дрожжей образуются только при недостатке питательных веществ в присутствии достаточного количества кислорода. Из вегетативных диплоидных клеток образуются сумки-аски, содержащие 2…4 иногда до 12 спор. Аскоспоры имеют круглую или слегка овальную форму, гладкие, бесцветные. При созревании спор сумки-аски не вскрываются и сохраняются. Они более устойчивы к неблагоприятным условиям, чем их вегетативная форма. Попадая в благоприятные условия, зрелые споры прорастают, образуя гаплоидные клетки (рисунок 4). Аскообразование легко вызвать при высеве дрожжей на агар с ацетатом.

Рисунок 4 – Жизненный цикл аскомицетовых гаплоидных дрожжей Дрожжевые клетки бывают яйцевидной, эллипсоидальной, овальной или вытянутой формы, которая, как и величина дрожжевых клеток, составляющая (5…7) (8…11) мкм, зависит от условий их развития. Отношение поверхности клетки к ее объему влияет на скорость массообменных процессов между клеткой и питательной средой и, следовательно, на интенсивность жизнедеятельности дрожжей.

Колонии Saccharomyces сerevisiae пастообразные, кремовые или коричневато-кремовые, обычно с довольно ровной, гладкой, иногда слегка пузырчатой или покрытой точками поверхностью, с блестящими или тусклыми секторами. Край колоний цельный, иногда лопастый, изредка образуется примитивный псевдомицелий.

2.2 Строение дрожжевой клетки Дрожжевые клетки являются достаточно сложными одноклеточными организмами. Почкующаяся дрожжевая клетка (рисунок 5) состоит из оболочки, протоплазмы и ядра.

Клеточная стенка – наружная часть оболочки – образована полисахаридами типа гемицеллюлоз, преимущественно маннаном и небольшим количеством хитина, внутренняя – белковыми веществами, фосфолипидами и липоидами. Оболочка регулирует состояние клеточного содержимого и имеет избирательную проницаемость, чем существенно отличается от обычных полупроницаемых мембран. Толщина клеточной стенки дрожжей до 400 нм.

Цитоплазматическая мембрана (плазмалемма) толщиной 7…8 нм расположена под клеточной стенкой и отделяет ее от цитоплазмы. Плазмалемма – основной барьер, определяющий осмотическое давление в клетке, обеспечивает избирательное движение питательных веществ из среды в клетку и вывод метаболитов из клетки. Плазмалемма состоит из бимолекулярного слоя липидов, в который включены белковые молекулы. Липиды ориентированы неполярными концами внутрь друг к другу, а полярными – наружу.

Перемещение веществ через цитоплазматическую мембрану происходит вследгликоген; 4 – цитоплазма;

ствие молекулярной диффуволютин; 6 – вакуоль;

зии (по градиенту конценмитохондрии трации) и в результате активного движения, в котором участвуют специфические ферменты, и в этом случае вещества могут поступать в клетку и против градиента концентрации. Например, аминокислоты легко проникают в клетку из среды, даже если их концентрация в цитоплазме в 100…200 раз выше, чем в питательной среде.

Цитоплазма имеет гетерогенную структуру и вязкую консистенцию. Коллоидный характер обусловлен белковыми веществами. Кроме них в цитоплазме содержатся: рибозонуклеопротеиды, липоиды, углеводы и значительное количество воды. Цитоплазма молодых клеток внешне гомогенна. При старении в ней появляются вакуоли, равномерная зернистость, жировые и липоидные гранулы. В цитоплазме с ее органоидами (хондриосомами, микросомами, вакуолями) и включениями протекают важнейшие ферментативные процессы.

Митохондрии (хондриосомы) имеют форму зернышек, палочек и нитей. Митохондриальные мембраны состоят из белков (80 %) и липидов (20 %). В состав митохондрий входят также полифосфаты, рибонуклеиновая (РНК) и дезоксирибонуклеиновая (ДНК) кислоты. Митохондрии размножаются самостоятельно, реплицируя собственную митохондриальную ДНК и продуцируя собственные белки. Питательные вещества, проникающие в клетку, адсорбируются и аккумулируются митохондриями и подвергаются быстрым превращениям из-за концентрации в этих участках соответствующих ферментов. В митохондриях полностью осуществляется цикл трикарбоновых кислот и важнейшая энергетическая реакция – окислительное фосфорилирование. Поэтому их рассматривают как основную «энергетическую станцию» клетки.

Здесь происходят реакции активирования аминокислот в процессе синтеза белка, липидов и других соединений.

Эндоплазматический ретикулум расположен в цитоплазме дрожжевых клеток. Это система каналов, пузырьков и цистерн, связанная с цитоплазматической мембраной и ядерной стенкой – нуклеоммой. Эндоплазматический ретикулум обеспечивает транспорт различных веществ (белков, ионов, углеводов) по клетке. На эндоплазматической сети расположены рибосомы.

Рибосомы представляют собой включения в виде субмикроскопических зернышек, состоящих из липидов, белков и РНК, которые обеспечивают синтез белков за счет активированных аминокислот, поступающих из митохондиальной системы.

Ядро – небольшое шаровидное или овальное тело, окруженное цитоплазмой и нерастворимое в ней. В ядре в виде включений обособленно расположены ДНК, ее протеид, а также большое количество РНК. ДНК служит для передачи наследственной информации, сохранения свойств микроорганизмов. В ядре осуществляется транскрипция (синтез молекул информационных РНК путем считывания информации с ДНК с помощью фермента РНК-полимеразы), а также репликация ДНК при делении клетки.

Аппарат Гольджи – мембранное образование, морфологически связанное с эндоплазматической сетью и нуклеоммой. Роль аппарата заключается в выводе вредных веществ из клетки, обеспечении защитных функций. В нем локализуются ферменты, катализирующие разрушение биополимеров. Мембраны аппарата Гольджи являются местом образования лизосом. Лизосомы представляют собой плотные гранулы, они защищают клетку от повреждений продуктами распада и чужеродными агентами.

Вакуоли – производные аппарата Гольджи – это обязательные органоиды клетки, представляют собой полости, наполненные клеточным соком и отделенные от цитоплазмы вакуолярной мембраной. Форма вакуолей изменяется вследствие движения цитоплазмы. Вакуоль в молодых клетках состоит из множества мелких полостей, в старых – из одной очень большой. Клеточный сок предствляет собой водный раствор различных солей, углеводов, жиров, белков, в том числе ферментов. В вакуолях сосредотачиваются различные соединения, которые подвергаются ферментативным превращениям и образуют продукты жизнедеятельности и отбросы. Это структуры, изолирующие продукты распада и аккумулирующие чужеродные токсические вещества.

Волютин (метахроматин) скапливается в вакуолях в виде коллоидного раствора или гранул. Гранулы могут быть локализованы непосредственно в цитоплазме. В центре гранулы располагаются полифосфаты, связанные с РНК двухвалентными ионами магния или кальция.

Оболочка гранулы состоит из сложного комплекса РНК, белка и липидов. Таким образом, волютин – источник фосфора и аккумулятор энергии.

В молодых дрожжевых клетках жира обычно нет, в зрелых он содержится лишь в немногих клетках в виде мелких капель, а в старых – в виде крупных. Гликоген – запасное питательное вещество дрожжей, накапливающееся при культивировании дрожжей на средах, богатых сахаром. При недостатке питательных веществ гликоген быстро расходуется. В молодых клетках гликогена мало, в зрелых – до 40 %.

По внешнему виду клеток можно определить физиологическое состояние дрожжей. В производственных средах одновременно присутствуют молодые, зрелые, почкующиеся, старые и отмершие клетки.

Наибольшей бродильной энергией обладают зрелые клетки.

2.3 Метаболизм дрожжевой клетки В основе жизнедеятельности любого организма лежат процессы обмена веществ, для протекания которых требуется постоянный и непрерывный приток энергии. Большинство организмов для поддержания своей жизнедеятельности используют энергию, освобождающуюся во время диссимиляции органических веществ, в первую очередь сахара. В дрожжевой клетке диссимиляция сахара может происходить либо аэробным (дыхание), либо анаэробным (брожение) путём (рисунок 6).

Для развития, роста и размножения дрожжевая клетка нуждается в питательных веществах, растворимых в воде. Цитоплазматическая мембрана пропускает питательные вещества в клетку и препятствует их возвращению в среду. Вода свободно проникает в клетку и уходит из неё. В водных растворах с небольшой концентрацией веществ всегда устанавливается некоторый приток воды в клетку. Вода создаёт давление внутри клетки, и протоплазма оказывается плотно прижатой к эластичным внутренним стенкам клетки. При таком состоянии, называемом тургором, все процессы обмена в дрожжевой клетке протекают быстро. Питательные вещества под действием ферментов клетки включаются в различные продукты обмена. Основными процессами, характеризующими жизнедеятельность дрожжей, являются ассимиляция (анаболизм) и диссимиляция (катаболизм).

При ассимиляции клетки перерабатывают питательные вещества в соединения, используемые для синтеза. Диссимиляция представляет собой процесс преобразования и распада веществ в организм, который сопровождается выделением энергии. Эта энергия используется в процессе синтеза и поддержания жизнедеятельности клеток.

Дрожжи, развиваясь на сахаросодержащих средах без доступа воздуха, осуществляют сбраживание глюкозы до этанола и углекислого газа. Процесс аэробного дыхания, при котором сахар окисляется до углекислого газа и воды, протекает в присутствии воздуха. Оба процесса являются экзотермическими. При спиртовом брожении в дрожжевых клетках энергии выделяется в 22 раза меньше, чем при дыхании.

Сбраживание глюкозы дрожжами является анаэробным процессом, хотя сами дрожжи – аэробные микроорганизмы. В анаэробных условиях брожение протекает интенсивно, но роста дрожжей практически не наблюдается. При доступе воздуха брожение ослабевает и интенсифицируется дыхание и размножение дрожжей. При хорошей аэрации спиртовое брожение практически прекращается. При аэробном дыхании дрожжи получают необходимую энергию при меньшем расходе сахара.

Рисунок 6 – Общая схема метаболизма дрожжей Расщепление сахаров происходит по циклу Кребса. Образующаяся при этом щавелевоуксусная кислота может реагировать с аммиаком, превращаясь в аспарагиновую кислоту, являющуюся основой белковой структуры клетки. Другой путь питательного превращения углеводов – пентозофосфатный цикл. Предполагается, что основное значение этого цикла – снабжение живого организма пентозами, необходимыми для синтеза нуклеиновых кислот и накопления биомассы. Основная роль в синтезе белка принадлежит нуклеиновым кислотам. В их состав входят пуриновые или пиримидиновые основания, сахар (пентоза) и фосфорная кислота. Синтез белков происходит на рибосомах клеток за счет энергии, выделяющейся при диссимиляции. В улавливании и использовании этой энергии клеткой участвуют макроэргические соединения, и в первую очередь аденозинтрифосфорная кислота. Ферментативный синтез белка в живых системах начинается с процесса активирования аминокислот. Для каждой аминокислоты существует свой фермент.

Дрожжи рода Saccharomyces не ассимилируют нитраты, так как не имеют ферментов, способных восстанавливать их до ионов аммония. Дрожжи вида Saccharomyces cerevisiae в аэробных условиях используют глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, на 1/3 раффинозу, очень медленно используют галактозу. Способность к использованию L-сорбозы, трегалозы, мелецитозы, инулина, L-арабинозы, D-рибозы, глицерина, D-маннита, D-сорбита, -метил-6-глюкозида и молочной кислоты варьирует. В анаэробных условиях трегалозу не используют.

Не ассимилируют целлобиозу, лактозу, мелибиозу, крахмал, ксилозу, D-арабинозу, L-рамнозу, эритрит, рибит, дульцит, салицин, янтарную и лимонную кислоты, инозит. Штаммы имеют различную способность расти на средах в отсутствие витаминов. Органические кислоты меласс и глицерин ассимилируются дрожжами в присутствии моно- и диглицеридов.

Некоторые виды дрожжей (не сахаромицеты) способны утилизировать полисахариды, чаще всего инулин и крахмал. Известны дрожжи, растущие на средах с углеводородами и некоторыми спиртами, в том числе метанолом и этанолом, а также органическими кислотами и другими углеродными cyбстратами.

В качестве источника азота дрожжи используют обычно соли аммония, аминокислоты, небольшие пептиды, реже нитраты и нитриты. Некоторые виды нуждаются в одном или более витаминах (чаще в биотине и тиамине), другие способны все необходимые для роста витамины синтезировать сами.

2.4 Верховые и низовые дрожжи Штаммы Saccharomyces c cerevisiae подразделяют на расы низового и верхового брожения. К расам низового брожения относится большинство винных и пивных дрожжей, к расам верхового – спиртовые, хлебопекарные и некоторые пивные. Дрожжи низового брожения функционируют в производстве при температуре от 6 до 10 °С и ниже (до 0 °С), а верхового – обычно температуре от 14 до 25 °С.

В конце брожения низовые дрожжи оседают на дно, формируя плотный осадок, верховые всплывают на поверхность и образуют «шапку». Способность последних подниматься на поверхность обусловлена тем, что клетки после почкования остаются соединенными в небольшой цепочке; пузырьки углекислого газа поднимают их на поверхность. Оба свойства, однако, не абсолютны.

По поведению в бродящей среде дрожжи разделяют также на хлопьевидные и пылевидные. В основе этого разделения лежит различие в их флокуляционных свойствах (флокуляция – обратимая агрегация, или агглютинация, клеток).

Хлопьевидные дрожжи в конце брожения слипаются в комки (флокулы) и либо оседают на дно, либо поднимаются на поверхность.

Пылевидные дрожжи в течение всего процесса брожения находятся во взвешенном состоянии. Флокулируют дрожжи как низового, так и верхового брожения. Клетки хлопьевидных дрожжей крупнее и тяжелее, чем пылевидных; последние особенно подвержены автолизу. Пылевидные дрожжи дают меньший прирост биомассы, но обладают более высокой бродильной активностью и полнее сбраживают сусло, образуют больше диацетила и высших спиртов. Хлопьевидные дрожжи лучше создают аромат напитков. Способность дрожжей к хлопьеобразованию не является стойким признаком, и штаммы могут её постепенно утрачивать.

МОДУЛЬ 3. ПРОМЫШЛЕННОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

ДРОЖЖЕЙ

3.1 Классификация продуктов брожения в зависимости от вида микроорганизмов, используемых в производстве В данном разделе будут рассмотрены только продукты брожения, получаемые с помощью дрожжей (таблица 9). Технология пищевых органических кислот, также относящаяся к бродильным производствам, здесь не рассматривается.

Таблица 9 – Классификация продуктов брожения в зависимости от вида микроорганизмов, используемых в производстве МикробиологичеНазвание Продукты, приго- и другие товляемые с ис- национальАссоциация молочнокислых пользованием ные напитки, нокислых бактерий ное дрожжевое молоко, Продолжение таблицы Продукты, приго- этиловый ХII, X, В, Ял, V-30 и др.

дрожжей верхово- Saccharomyces сerevisiae (приго брожения Пиво меняются в Великобритании, др.

Saccharomyces сerevisiae, Saccharomyces bayanus, SchizosacПродукты, приго- Вино товляемые с использованием Saccharomyces сerevisiae (carlsдрожжей низово- bergensis) 776, 41, 44, Продукты микробиологического синтеза Метаболиты дрожжей различ- кислоты ных классов 3.2 Производство этанола Этанол широко применяется в химической промышленности как исходное соединение для синтеза многих веществ, как растворитель, экстрагент, антифриз и т.п. Есть мнение, что у этанола большое будущее и как топлива в двигателях внутреннего сгорания: этанол гораздо более экологически чистое топливо, чем бензин.

Сырьем для производства спирта служат разнообразные растительные материалы, содержащие в достаточном количестве сбраживаемые сахара или другие углеводы, которые можно осахарить. Наиболее широко используются: крахмалосодержащие материалы – зерно (рожь, пшеница, кукуруза, ячмень, овес, просо) и картофель – и сахаросодержащие материалы – меласса (отход сахарного и крахмало-паточного производства) и дефектная сахарная свекла. Из данных видов сырья вырабатывают этанол пищевого и медицинского назначения.

Дальнейшее увеличение производства спирта будет идти по пути увеличения мощностей предприятий, использующих непищевое целлюлозосодержащее сырьё, такое как древесина, отходы сельскохозяйственных растений, биомасса быстрорастущих «энергетических» растений. Углеводы целлюлозосодержащего сырья осахаривают химическим или ферментативным способом. Получаемый этанол может быть использован в химической промышленности и как топливо.

Процесс производства спирта из крахмалистого сырья включает ряд стадий. Вначале сырье очищают, измельчают и разваривают с целью извлечения и растворения крахмала. Поскольку крахмал не подвержен действию ферментов дрожжей, способных сбраживать только дисахариды и моносахариды, охлажденную разваренную массу обрабатывают амилолитическими ферментами солода или микробиальных ферментных препаратов.

Следующая стадия – сбраживание осахаренной массы. Для этого используют естественно-чистые культуры дрожжей, последние систематически ведут на производственных заторах в специальном дрожжевом отделении.

Спиртовые дрожжи, применяемые при переработке крахмалистого сырья, должны обладать высокой бродильной активностью; быстро и полностью сбраживать сахара, а также использовать другие компоненты питательной среды в анаэробных условиях, быть устойчивыми к продуктам своего обмена (особенно к спирту), хорошо противостоять развитию инфекции.

Уже около 100 лет применяют Saccharomyces сerevisiae, раса XII.

Эти дрожжи хорошо сбраживают глюкозу, фруктозу, сахарозу, мальтозу, на 1/3 раффинозу, несколько слабее галактозу. В среде накапливают до 10…11 об. % спирта. Раса XII – верхнебродящая, хорошо распределяется во всем объеме затора, пылевидная, не образует хлопьев.

Оптимальная температура ее развития 30…38 °С, максимальная 38 °С, минимальная температура 5 °С. Значение рН во время брожения поддерживают в пределах 3,8…4,0. Используют также другие расы дрожжей, но не так широко. После сбраживания заторов в них остаются неиспользованными около 0,1 % галактозы, 0,4 % декстринов и 0,5 % пентоз.

Проводится селекционная работа по получению рас дрожжей с более высокими производственно ценными свойствами, в частности, способных интенсивно использовать галактозу и декстрины. В последние годы большое внимание уделяется селекции термотолерантных рас, дающих в промышленном производстве ряд преимуществ (ускорение микробиологических процессов, уменьшение расхода хладагента и др.). Разрабатываются методы получения этанола на различных субстратах с использованием иммобилизованных клеток микроорганизмов.

Этанол может быть выработан из сахаросодержащего сырья – мелассы. Меласса – побочный продукт сахарного производства, содержит около 80 % сухих веществ и 20 % воды, в сухих веществах содержится до 45…50 % сахарозы. К дрожжам, используемым для сбраживания мелассных растворов, предъявляются в основном те же требования, что и к расам для производства спирта на крахмалистых средах. Кроме того, они должны обладать способностью переносить высокие концентрации сухих веществ, содержащихся в мелассе, и более полно сбраживать раффинозу.

В производстве широкое применение нашла раса Я Saccharomyces сerevisia, а при использовании дрожжей после брожения в качестве хлебопекарных – раса В (венгерская). Дрожжи этих рас хорошо сбраживают сахарозу, глюкозу и фруктозу, раффинозу только на 1/3. При большом содержании раффинозы в мелассе недобор спирта может быть значительным.

Крупномасштабное получение этанола в качестве топлива осуществляется в основном в Бразилии и других странах Южной Америки. В качестве источника углеводов используется сахарный тростник и маниока, в качестве продуцента этанола – Saccharomyces cerevisiae.

Сырьем для получения технического спирта могут служить гидролизаты древесины и другого целлюлозосодержащего сырья.

Древесина хвойных и лиственных пород содержит 40…75 % полисахаридов. Различают легко- и трудногидролизуемые полисахариды.

Легкогидролизуемые полисахариды состоят из гемицеллюлоз и пектиновых веществ. Трудногидролизуемые полисахариды содержат целлюлозу с небольшой примесью гемицеллюлоз.

Растительное сырье под давлением подвергают кислотному гидролизу. Полученный гидролизат содержит 3,2…3,5 % редуцирующих сахаров, преимущественно глюкозу, в небольших количествах галактозу и маннозу, а также пентозы – ксилозу, арабинозу, рамнозу.

Для сбраживания древесных гидролизатов используют ряд рас Saccharomyces и Schizosaccharomyces. Присутствующие в гидролизате вредные примеси играют роль антисептиков – подавляют развитие посторонних микроорганизмов. Поэтому на гидролизных спиртовых заводах отсутствуют установки для размножения чистых и производственных культур дрожжей, а одни и те же дрожжи используют на протяжении многих месяцев.

Зрелая бражка по окончании брожения содержит 1,0…1,5 % этанола и побочные продукты брожения, несброженные сахара и другие органические вещества. При перегонке бражки и ректификации гидролизного спирта не удается полностью избавиться от этих примесей;

гидролизный спирт (ректификат) содержит до 0,05…0,1 % метанола и несколько большее количество кислот, сложных эфиров и альдегидов, чем ректификат из пищевого сырья.

При традиционном способе получения этанола из гидролизатов древесины и отходов сельскохозяйственных растений значительная часть моносахаридов, в основном ксилозы, остается неиспользованной. Выявлены дрожжи Pachysolen tannophilus, Candida shehatae, Pichia stipitis и другие, способные сбраживать ксилозу с образованием этанола. Теоретически использование таких дрожжей может обеспечить утилизацию до 90 % сахаров, образующихся при гидролизе растительной массы.

Кроме химического гидролиза, целлюлозодержащее сырьё может быть осахарено с помощью ферментативного гидролиза. Эта технология активно разрабатывается, обсуждаются способы подготовки сырья к гидролизу, разработка ферментативных комплексов для проведения осахаривания, схемы брожения и выделения этанола из бражки.

Сульфитные щелока являются отходами целлюлозного производства. Для извлечения целлюлозы древесину обрабатывают при повышенной температуре варочным раствором, обычно представляющим смесь сернистой кислоты с водными растворами бисульфитов и моносульфитов – Ca(HSO3)2, Mg(HSO3)2, NH4HSO3 и NaHSO3. При этом целлюлоза извлекается в неповрежденном виде, а гидролизуются только гемицеллюлозы. Лигнин, входящий в состав древесины, образует с сернистой кислотой водорастворимые лигносульфокислоты. Суммарная концентрация сахаров достигает 3,0…3,5 %, из них 62…68 % сбраживаемые, рН 1,5…1,0.

Сульфитные щелока сбраживают расами Saccharomyces сerevisiae, которые хорошо используют галактозу, обладают флокулирующими свойствами и сорбируются волокнами целлюлозы. Благодаря наличию в щелоках ряда антисептических веществ нет необходимости в процессе производства размножать дрожжи в специальных аппаратах. Отбродившие дрожжи вновь идут в производство.

Зрелая бражка содержит 0,5…1,0 % этилового спирта и много летучих примесей (альдегиды, эфиры, высшие спирты, метанол, фурфурол, сернистый ангидрид, сероводород). В сульфитном спирте остаются трудноотделяемые сернистые соединения, значительное количество альдегидов и эфиров, а также 2,0…8,0 % метанола. Сульфитный спирт является самым дешевым.

3.3 Виноделие Микробиология виноделия призвана решить две главные задачи:

первая – наиболее полно выяснить биологические и биохимические свойства организмов, превращающих виноградное сусло в вино; вторая – осуществлять контроль за деятельностью полезных микроорганизмов и посторонних, вредных, являющихся причиной производственных потерь и порчи получаемого продукта. Круг исследований включает: оценку видов и рас дрожжей рода Saccharomyces и других родов дрожжей, встречающихся в виноделии; определение оптимальных условий развития и биосинтеза тех или иных продуктов метаболизма с целью более эффективного использования технологии, возможностей дрожжей для повышения качества вин; определение посторонней дрожжевой флоры, являющейся возбудителем заболеваний вин; оценку возможности промышленного использования молочнокислых и уксуснокислых бактерий, способы регулирования технологических режимов для индуцирования полезных процессов и предотвращения заболеваний; методы контроля процессов, вызываемых дрожжами и бактериями, и оценку микробиологического состояния вина на различных стадиях технологии.

В основе получения вина лежит сбраживание фруктозы и глюкозы виноградного сока с образованием этилового спирта. Собранный виноград давят и получают виноградное сусло, или муст, в котором содержится от 10 до 25 % сахара.

В традиционных процессах приготовления вина сбраживание муста ведется с помощью дрожжей, присутствующих на винограде. При этом в брожении участвует множество видов дрожжей, сменяющих друг друга, таких как Hanseniaspora, Brettanomyces, Saccharomyces.

В современном виноделии для сбраживания в основном используют чистые культуры специальных рас сахаромицетов. При этом «дикие» дрожжи сначала убивают, пропуская через муст двуокись серы или используя другие технологические приёмы. После окончания брожения молодое вино необходимо осветлить и дать ему созреть. Эти процессы для высококачественных вин могут занимать несколько лет.

В процессе созревания вина может происходить рост бактерий, которые удаляют из него яблочную кислоту, а также различные биохимические изменения, которые улучшают вкусовые качества вина.

При производстве некоторых сортов вин в качестве исходного сырья используется не виноградный сок, а уже готовое вино. Такое так называемое вторичное виноделие включает процессы дображивания и модификации вин с использованием специальных рас дрожжей. К наиболее известным продуктам вторичного виноделия относятся шампанские вина. Шампанское получают из смеси вин (купажа), в которую добавляют сахар и дрожжи, после чего выдерживают в замкнутом объеме для вторичного брожения (шампанизации). Традиционные процессы шампанизации проводятся в бутылках, на крупных заводах – в больших емкостях. При шампанизации происходит растворение и химическое связывание образующейся углекислоты, которая при открывании бутылки в результате перепада давления освобождается и придает вину неповторимую игристость.

Дрожжи вносят в производство вина двойной вклад: они ответственны за образование этанола в напитке, а также за накопление в нем множества соединений, от которых зависит его вкус и аромат. Такие соединения называются органолептическими. Часть из них образуется непосредственно в ходе брожения, часть – при химических превращениях компонентов вина в ходе его созревания.

3.4 Пивоварение Пиво – слабоалкогольный напиток, который получают путем сбраживания охмеленного сусла специальными расами дрожжей. Вкус и аромат его создают экстрактивные вещества, извлеченные из солода, горькие и ароматические вещества хмеля, а также этиловый спирт, углекислый газ и другие продукты брожения. Сортовые различия пива определяются типом используемого солода, количеством и видом добавляемых неосоложенных продуктов.

Процесс производства пива включает ряд стадий: изготовление солода из ячменя, получение затора и сусла, сбраживание сусла, дображивание и созревание молодого пива, фильтрацию и розлив.

Пивные дрожжи, используемые в пивоваренной промышленности, обладают высокой флокуляционной способностью, медленно и полно оседают при осветлении молодого пива в конце главного брожения и готового – в конце дображивания. Они активно сбраживают глюкозу и фруктозу, медленнее – мальтозу и еще медленнее – трисахарид мальтотриозу. Декстрины не сбраживаются и играют важную роль в создании полноты и вкуса пива. Пивные дрожжи в незначительном количестве накапливают высшие спирты, диацетил и сернистые соединения, а также обеспечивают насыщенность пива углекислотой. В настоящее время в России в пивоваренной промышленности применяют главным образом дрожжи Saccharomyces сerevisiaе низового брожения (наиболее широко используют расы 776, 41, 44, SЛьвовская, 11, 8а (М), а также расы Р и F).

При производстве пива могут развиваться посторонние виды дрожжей. Они ухудшают процесс брожения и осветления пива, вызывают его помутнение, придают посторонний вкус и запах. Описано около 30 видов «диких» дрожжей, инфицирующих пиво. Некоторые исследователи считают, что многочисленные «виды» в большинстве случаев являются мутантами культурных дрожжей, ими предложено рассматривать такие «виды» как синонимы Sacch. cerevisiae.

В пивоварении различают два типа брожения: верховое (теплое) и низовое (холодное). Вызывающие их дрожжи различаются рядом свойств и ранее рассматривались как различные виды: верховые S. cerevisiae и низовые S. cerevisiae (carlsbergensis). Дрожжи низового брожения функционируют при температуре от 6 до 10 °С, в то время как верховое брожение протекает при 14…25 °С. Для максимального превращения сахара в этанол необходимо, чтобы дрожжи оставались суспендированными в бродящей жидкости. С другой стороны, флокуляция дрожжей после того, как брожение закончилось или достигло желаемой стадии, очень облегчает удаление дрожжей из напитка. Другими словами, дрожжи должны флокулировать только на определенной стадии брожения. Хотя важность процесса флокуляции в изготовлении алкогольных напитков была оценена уже более ста лет назад, физиологический механизм этого явления был изучен лишь в последние десятилетия. В слипании клеток участвуют присутствующие в растворе ионы двухвалентного кальция, взаимодействующие с карбоксильными и фосфодиэфирными группами на поверхности клеточных стенок дрожжей.

3.5 Хлебопечение Производство хлеба включает сложный цикл микробиологических и биохимических процессов, происходящих в тесте с момента смешивания муки с водой и заканчивающихся выпечкой. В сортах муки, используемой для выпечки пшеничного и ржаного хлеба, входят компоненты, необходимые для развития многих микроорганизмов.

Кроме крахмала в муке содержится до 0,7…1,8 % (в пересчете на сухое вещество) сбраживаемых сахаров – глюкозы, фруктозы, мальтозы, сахарозы, раффинозы, существенно влияющих на первые стадии брожения теста.

Важнейшую роль в брожении теста играют дрожжи и молочнокислые бактерии, для которых имеются все необходимые условия:

влажность 40…50 %, незначительное содержание молекулярного кислорода и наличие питательных веществ. Микробиологические процессы и связанные с ними биохимические изменения в тесте определяют пористость, окраску, прочность среза и сохранение свежести хлеба, придают ему вкус и аромат.

Все дрожжи, которые используются в хлебопечении, относятся к виду Saccharomyces cerevisiae и исторически происходят от штаммов пивных дрожжей. В конце XIX века развилась целая отрасль по производству прессованных или сухих пекарских дрожжей. Современное производство пекарских дрожжей имеет ряд существенных особенностей по сравнению с бродильной промышленностью. Основная цель такого производства – получение дрожжей, которые с высокой скоростью вырабатывают в тесте углекислый газ за счет брожения в анаэробных условиях. Однако производить их надо при хорошей аэрации, чтобы добиться большего выхода дрожжевой биомассы (эффект Пастера). Полученные дрожжи должны не только обладать высокой бродильной активностью в тесте, но и хорошо храниться, не теряя своих качеств в замороженном или высушенном состоянии.

Питательная среда, основой которой обычно служит меласса, подается постепенно или порциями. Если добавить сразу много сахара, то метаболизм дрожжей переключится на бродильный (эффект Кребтри), и выход биомассы уменьшится. По завершении роста дрожжи концентрируют центрифугированием и фильтруют. Образующийся на фильтре осадок можно превращать в брикеты прессованных дрожжей.

Сухие дрожжи получают высушиванием массы в специальных распылительных сушилках.

Для получения хлебопекарных дрожжей используют быстрорастущие расы верхового брожения. Они должны иметь крупные клетки (не менее 7,011,0 мкм), хорошо сбраживать сахара при высокой концентрации сухих веществ в тесте, быть солеустойчивыми и устойчивыми к вредным примесям мелассы, иметь высокую скорость генерации ( = 0,2 ч–1), обладать высокой подъемной силой и мальтазной активностью. Подъемная сила отражает активность бродильных ферментов клетки, ее зимазного комплекса, а мальтазная активность свидетельствует о скорости сбраживания мальтозы.

Ржаное тесто часто готовят на густых заквасках, обеспечивающих его разрыхление и кислотонакопление. Их изготавливают с помощью чистых культур гомо- и гетероферментативных молочнокислых бактерий и дрожжей.

Жидкие закваски – полуфабрикат, при получении которого на осахаренных заварках или жидких водно-мучных смесях при температуре 28…30 °С непрерывно-поточным способом одновременно размножаются мезофильные гетероферментативные молочнокислые бактерии и дрожжи, попавшие туда спонтанно (например, с мукой) или внесенные специально. При использовании жидких заквасок в тесте протекает не только спиртовое, но и активное молочнокислое брожение, при этом рН теста снижается до 4,7…4,8.

Осахаренная и охлажденная до 50 °С мучная заварка заквашивается бактериями Lactobacillus delbrueckii (рН 3,7…3,9). На закисшем заторе при 28 °С в другой емкости культивируют дрожжи, используемые для разрыхления теста.

3.6 Производство хлебного кваса Хлебный квас – национальный русский напиток – является продуктом незаконченного спиртового и молочнокислого брожения. Сырьём для производства кваса служат ржаной и ячменный солод, ржаная мука, вода, сахар. Ржаной солод и ржаную муку запаривают и вводят ячменный солод, который гидролизует крахмал, белки и частично некрахмальные полисахариды. После фильтрации сусло сгущают, упаривают при температуре 105…115 С, при этом образуются меланоидины, придающие квасу характерную окраску.

В квасоварении применяют сушеные квасные дрожжи Saccharomyces cerevisiae расы М, 131-К, С-2, винные, Штейберг 6, Киевские низового брожения, Днепропетровские 6 и хлебопекарные. Также применяют молочнокислые гетероферментативные бактерии рас 11 и 13.

В процессе спиртового брожения в квасе накапливается 0,3…0,5 % (по объёму) спирта и углекислого газа. Кроме того, образуются продукты гетероферментативного молочнокислого брожения – молочная и уксусная кислоты, этиловый спирт, углекислый газ, летучие ароматические вещества (диацетил и этилацетат), которые создают специфический аромат и вкус кваса. В готовом квасе при хранении количество спирта не должно превышать 1,2 % (по объёму).

3.7 Применение дрожжей в молочной промышленности В свежевыдоенном молоке дрожжи появляются через несколько часов. 90 % из них относятся к роду Candida, также представлены роды Pichia, Rhodotorula, но они являются посторонней микрофлорой в молочной промышленности.

Дрожжи – необходимый компонент заквасок, используемых для получения кефира, кумыса, курунги и других национальных напитков.

Особенно важны дрожжи, сбраживающие лактозу с образованием спирта – Klueveromyces lactis, Klueveromyces fragilis и Candida pseudotropicalis. Спиртовое брожение лежит в основе получения напитков из сыворотки.

Saccharomyces cerevisiae используются в составе заквасок для получения ацидофильного дрожжевого молока, напитков из сыворотки.

Во всех остальных случаях дрожжи играют отрицательную роль в молочной промышленности (см. п. 4.2).

3.8 Дрожжи как источник белка В конце XIX века в Германии была разработана технология производства хлебопекарных дрожжей, во время Первой мировой войны дрожжи стали использоваться в качестве пищевой добавки в производстве супов и колбас, а также начала развиваться технология производства кормовых дрожжей.

До сих пор культивирование пивных дрожжей Saccharomyces serevisiae (carlsbergensis) остается важным резервом пищевого белка и витаминов. Организм человека усваивает свыше 90 % всех питательных веществ, содержащихся в них. В составе этих дрожжей обнаружено 14 витаминов, особенно они богаты витаминами группы В.

При переработке биомассы в пищевой белок ее тщательно очищают. Сначала разрушают стенки дрожжевых клеток путем механической, щелочной, кислотной или ферментативной обработки с последующей экстракцией гомогенной дрожжевой массы подходящим органическим растворителем. Затем щелочным раствором растворяют белки, и белковый раствор отделяют от клеточной массы диализом.

Очищенные от низкомолекулярных примесей белки осаждают и используют в качестве белковых добавок в различные пищевые продукты – сосиски, колбасы, паштеты, мясные начинки. Также сухой белок можно текстурировать.

Для кормовых целей можно применять дрожжи других родов.

Дрожжи родов Candida, Rhodotorula, Torulopsis, Trichosporon в качестве источника углерода для роста способны использовать неразветвленные углеводороды с числом от 10 до 30 углеродных атомов в молекуле. В основном они представлены жидкими фракциями углеводородов нефти с температурой кипения от 200 до 320 С. Первоначально проект возник из необходимости утилизировать парафины, остающиеся в количестве от 10 до 15 % после очистки газойля. В питательную среду добавляют макро- и микроэлементы, витамины и аминокислоты.

В России завод по производству кормовых дрожжей на парафинах нефти был построен в 1971 г. (его продуктивность составила около 1 млн т в год). Высушенная белковая масса гранулируется и используется как белково-витаминный концентрат в кормопроизводстве.

Хорошим субстратом для выращивания кормовых дрожжей родов Torula, Kluyveromyces является молочная сыворотка. В 1 т молочной сыворотки содержится около 10 кг белка и 50 кг лактозы. Методом ультрафильтрации белки отделяют, а раствор лактозы используют для культивирования дрожжей.

В качестве источников углерода дрожжевые клетки могут использовать и низшие спирты – метанол и этанол, получаемые из природного газа или растительных отходов. При этом дрожжевая масса содержит больше белков (56…62 % от сухой массы) и меньше вредных примесей (производных бензола, D-аминокислот, аномальных липидов, токсинов, канцерогенов), чем кормовые дрожжи, выращенные на парафинах нефти.

Для выращивания дрожжей на гидролизатах растительного сырья используются Candida arborea и Candida utilis, они применяются для пищевых целей и используются в качестве белковых добавок к различным продуктам. Например, в США на основе Candida utilis производят торутеин, который добавляют в продукты питания, после чего они считаются диетическими, с высоким содержанием протеина.

3.9 Посторонняя микрофлора бродильных производств 3.9.1 Молочнокислые бактерии Молочнокислые бактерии: кокки или палочки грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, гетероферментативные. Молочнокислые бактерии, как и другие бесспоровые бактерии, погибают при температуре 70…75 С. Оптимальная температура роста для мезофильных видов – 20…30 С, для термофильных – 49…51 С. Наиболее часто встречаются молочнокислые бактерии родов Lactobacillus (L. plantarum, L. brevis, L. fermenti) и Leunconostoc (L. mesenteroides, L. dextranicum, L. agglutinans).

Палочки являются кислотообразующими, повышают кислотность сусла в процессе культивирования и снижают генеративную активность дрожжей.

Лейконостоки Leunconostoc mesenteroides и Leunconostoc dextranicum синтезируют декстран, что приводит к сгущению приточной мелассы и затрудняет ее поступление в дрожжерастильные аппараты.

Leunconostoc mesenteroides имеют слизистую капсулу, поэтому устойчивы к высокой температуре и кислотам. В жидких средах погибают при 110…120 С в течение 20 минут.

Leunconostoc agglutinans обладают способностью прилипать к дрожжам и склеивать (агглютинировать) их клетки в комки, которые оседают на дно аппаратов. Размножение дрожжей почти прекращается.

3.9.2 Уксуснокислые бактерии Уксуснокислые бактерии Acetobacter aceti, Acetobacter pasterianum, Acetobacter oxydans имеют форму палочек длиной 1…3 мкм, часто соединены в цепочки, грамотрицательные, бесспоровые, аэробные организмы, развиваются в тех же условиях, что и дрожжи. Оптимальная температура 20…35 С. Окисляют этанол в уксусную кислоту, пропанол – в пропионовую, бутанол – в масляную кислоту. Некоторые виды способны окислять глюкозу, ксилозу и арабинозу в глюконовую, ксилоновую и арабановую кислоты соответственно. Acetobacter aceti выдерживают 10…11%-ную концентрацию этанола. При накоплении в сусле 0,01 % уксусной кислоты задерживается, а при 0,2 % подавляется развитие жизнедеятельности дрожжей. Обнаруживают уксуснокислые бактерии окраской препарата йодом – бактерии приобретают золотисто-желтый цвет.

3.9.3 Маслянокислые бактерии Маслянокислые бактерии Clostridium butyricum, Clostridium pasterianum, Clostridium saccharobutyricum – грамположительные, облигатные (строгие) анаэробные, имеющие подвижные крупные спорообразующие палочки длиной 10 мкм. Споры цилиндрической или эллипсоидальной формы. Оптимальная температура роста бактерий 30…40 С, при рН ниже 4,9 они не развиваются. Наряду с масляной кислотой они образуют уксусную, капроновую, молочную, каприловую и другие кислоты, а также спирты: этанол и бутанол. Маслянокислые бактерии, метаболизирующие масляную кислоту, опасны для бродильных производств. Даже в очень малых концентрациях (0,0005 %) они подавляют развитие дрожжей. Обнаруживают маслянокислые бактерии окраской препарата люголем в голубой цвет.

3.9.4 Гнилостные бактерии Гнилостные бактерии вызывают распад белковых веществ и проявляют свою деятельность как в аэробных, так и в анаэробных условиях. Аэробы минерализуют белок до углекислого газа, аммиака, сероводорода, воды, минеральных солей. При метаболизме анаэробов накапливаются органические дурнопахнущие и ядовитые вещества.

К факультативным анаэробам относятся грамотрицательные, неспорообразующие бактерии семейства Enterobacteriaceae, представленное родами Escherichia (кишечная палочка – E. coli), Proteus (P.

vulgaris и др.) и Enterobacter (Enb. aerogenes и др.), а также грамположительные неспорообразующие кокки семейства Micrococcus. К облигатным анаэробам относятся Clostridium putrificum, Clostridium sporogenes. Все они вызывают разложение белков, что приводит к быстрой порче прессованных дрожжей (разжижению) и появлению неприятно пахнущих продуктов гниения (сероводорода, индола, скатола и др.).

К аэробам относятся грамотрицательные, неспоробразующие палочки рода Pseudomonas (синегнойная палочка – P. aeruginosa и другие виды) и грамположительные, спорообразующие почвенные бактерии рода Bacillus (сенная палочка B. subtilis, B. mesentericus, B. megatherium, B. mycoides и др.).

Бактерии рода Bacillus подвижны, их споры отличаются высокой термоустойчивостью (оптимальная температура 36…50 С). Являются также нитритообразующими бактериями, редуцирующими нитраты в нитриты, содержание которых в концентрации 0,0005 % задерживает размножение дрожжей, а при увеличении концентрации до 0,02 % накопление биомассы снижается на 40…50 %. Стойкость дрожжей при хранении под влиянием нитритообразующих бактерий снижается, они вызывают разложение дрожжевых клеток и разжижение прессованных дрожжей.

3.9.5 Дикие дрожжи Дикие дрожжи родов Candida (С. parapsilosis, C. clausseni, C. tropicalis, C. mycoderma, С. Gillermondii и др.), Torula (T. nigra и др.), Rodotorula (R. rubra и др.), Torilopsis sp. представляют значительную опасность для бродильных производств. Дикие дрожжи конкурируют с культурными, развиваясь быстрее, потребляя большое количество сахара с малым выходом этанола. Многие из них превращают сахар в органические кислоты и окисляют этанол. Несовершенные дрожжи вызывают агглютинацию дрожжевых клеток.

Основной источник посторонней микрофлоры на производстве – сырье. Также это могут быть плохопромытые аппаратура и трубопроводы, а также вода и воздух.

3.9.6 Микрофлора воды и воздуха Микрофлора воды и воздуха представлена различными бактериями. Особенно заражена ими вода из открытых водоемов и прудов. В ней чаще всего находятся микроорганизмы следующих видов: Escherichia coli, Escherichia freundi, Klebsielle aerogenes, Actobacter cloacae, Bacillus subtilis, Bacillus mesentericus, Pseudomonas nonliguefaciens.

В воздухе часто встречаются бактерии родов Bacillus (B. subtilis, B. mesentericus, B. megatherium, B. mycoides и др.), Sarcina (Sarcina lutea), споры плесневых грибов родов Penicillium и Aspergillus, дрожжеподобные грибы рода Candida и редко – молочнокислые бактерии.

3.10 Дрожжи – источник производственной инфекции в небродильных производствах Дрожжи могут наносить существенный урон ряду отраслей пищевой промышленности. Необходимо помнить, что питательными веществами для дрожжей являются сахара.

Порчу хлебопекарных изделий могут вызывать неосмофильные и осмофильные виды дрожжей. Неосмофильные дрожжи обусловливают три вида порчи. Аспорогенные дрожжи при попадании в тесто могут понизить качество хлеба и придать ему нежелательный запах. Saccharomyces сerevisiaе и другие бродящие дрожжи, заражая хлеб после выпечки, вызывают появление сильного запаха («фруктового», «ацетонового» и др.). Виды дрожжей, образующие гифы, могут давать на поверхности хлеба хорошо видимый рост. На темных сортах хлеба возможно появление белого налета «меловой плесени», порчу чаще всего вызывают Hyphopichia burtonii.

Осмофильные дрожжи (Zygosacch. rouhii, Zygosacch. bisporus) опасны для кондитерских хлебопекарных изделий, при изготовлении которых компоненты с высоким содержанием сахара (джемы, мармелад, фруктовые наливки и др.) могут портиться (забраживать).

При производстве сахара Kluyveromyus marxianus вызывают разложение сахарозы, ослизнение соков и сиропов, образуют органические кислоты, ухудшают качество полупродуктов и готовой продукции.

Kluyveromyus marxianus ассимилируют сахарозу, способны расти при температуре 50 С и концентрации сахарозы до 75 %.

В сахаре-сырце кристаллы сахарозы окружены плёнкой из мелассы. В плёнке могут обитать осмофильные дрожжи Zygosacch. bisporus, Zygosacch. rouxi, Zygosacch. bailii, Torulaspora delbrutckii.

Дрожжи – основные возбудители порчи плодово-ягодных соков и безалкогольных напитков. Развитию дрожжей способствует ряд факторов: наличие хорошо сбраживаемых сахаров, азотсодержащих соединений, низкое рН среды и относительно анаэробные условия, содействующие подавлению конкурентных видов бактерий. Особенности таких видов дрожжей: психротропность (0 С), осмофильность, способность адаптироваться к консервирующим веществам. В соках развиваются представители родов Saccharomyces, Hanseniaspora, Candida.

Развитие дрожжей отрицательно отражается на качестве напитков: уменьшается содержание сахара, частично он сбраживается в спирт. Продукты жизнедеятельности дрожжей ухудшают вкус напитков, а образующийся в результате брожения углекислый газ может вызвать разрыв бутылок.

В молочной промышленности дрожжи, инфицируя сливки, сметану, кисломолочные продукты, вызывают вспенивание и дрожжевой привкус, попадая в сыр, вызывают вспучивание и вкусовые дефекты (сладкий, фруктовый, дрожжевой привкус).

Candida lipolitica вызывает гидролиз маргарина, мыльный и дрож-жевой вкус и запах. Candida lactiscondensi вызывает бомбаж и мыльный вкус и запах сгущенного молока.

МОДУЛЬ 4. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ

Молочнокислые бактерии, как правило, неподвижны, не образуют спор, положительно окрашиваются по Граму, не восстанавливают нитраты в нитриты, не образуют пигментов, обладают небольшой протеолитической активностью. Цитохромы и каталазу не образуют, но некоторые продуцируют пероксидазу, разлагающую Н2О2.

4.1 Систематика молочнокислых бактерий Молочнокислые бактерии делят на две большие группы – гомоферментативные и гетероферментативные. Гомоферментативные в результате брожения образуют, главным образом, молочную кислоту и лишь ничтожные количества других продуктов (летучих кислот, этилового спирта и углекислоты). Гетероферментативные, помимо молочной кислоты, образуют углекислый газ, уксусную кислоту и (или) этиловый спирт, используя на это до 50 % сбраживаемых гексоз.

4.2 Классификация молочнокислых бактерий Все молочнокислые бактерии относят к родам Lactobacillus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus и Pediococcus.

4.2.1 Род Lactobacillus Род Lactobacillus объединяет палочковидные бактерии, форма которых весьма разнообразна – от коротких коккообразных до длинных нитевидных (рисунок 7). Род, в соответствии с предложением ОрлаЙенсена (1919, 1943 гг.), подразделяется на три подрода: Streptobacterium, Thermobacterium и Betabacterium. Они различаются рядом признаков (таблица 10). Например, термобактерии, в противоположность стрепто- и бетабактериям, растут при 45 °С и не растут при 15 °С, колонии чаще шероховатые, клетки длинные, нитевидные. Бетабактерии в отличие от двух других подродов образуют газ на средах с углеводами. Среди представителей рода Lactobacillus есть гомо- и гетероферментативные виды (см. таблицу 10).

Широкое применение молочнокислых бактерий привело к более тщательному изучению их свойств, и современные методы исследований позволили накопить новые сведения и детализировать таксономические признаки (таблицы 11, 12, 13).

Рисунок 7 – Электронно-микроскопические фотографии клеток, А – Lactobacillus coryniformis subsp. coryniformis 7500;

В – Lactobacillus brevis 7800; Г – Lactobacillus cellobiosus 7800;

Таблица 10 – Классификация бактерий рода Lactobacillus (по Sharpe, 1979) Номер признака L. helveticus L. plantarum L. cellobiosus L. trihodes L.delbrueckii L. coryniformis L. viridescens L. heterohiochii (–) – признак отрицателен; (+) – признак положителен; а – признак, который следует использовать на начальных этапах идентификации;

b – признак варьирует; 1 – образование СО2 из глюкозы; 2 – для роста нужен тиамин; 3 – имеется альдолаза; 4 – рост при 45 С; 5 – рост при 15 С; 6 – сбраживание рибозы; 7 – образование СО2 из глюконата Таблица 11 – Виды лактобацилл группы I (Thermobacterium по Орла-Йенсену) 1. L. delbrueckii deibrueckii Хлеб из кислого теста bulgaricus Производство йогурта и других кисломолочных напитков 2. L. acidophilus Производство ацидофильных звездочкой, термофильные (растут при 45 °С, но не при 15 °С). Виды L. amylophilum, L. farciminis, L. sharpeae и L. yamanashiensis растут при 15 °С, но не при 45 °С.

По степени гомологии ДНК/ДНК выделяются 2 подгруппы, первая объединяет подвиды L. delbrueckii (deibrueckii, bulgaricus и lactis) с коэффициентом подобия свыше 80 %, а вторая – виды L. acidophilus, L. gasseri, L. crispatus и L. helveticus.

Таблица 12 – Виды лактобацилл группы II (Streptobacterium по Орла-Йенсену) В зависимости от условий культивирования осуществляют брожение по гомоферментативному или по гетероферментативному пути.

Почти все виды являются мезофилами (растут при 15 °С и не растут при 45 °С). Исключение представляют вид L. agilis и подвид L. casei subsp. rhamnosus (не растут при 15 °С, но способны расти при 45 °С).

В отличие от термобактерий ферментируют рибозу и образуют СО2 из глюконата.

Клетки мельче, чем у термобактерий, часто располагаются в виде почек. Наличие цепочек характерно для отдельных видов лактобацилл, интенсивность образования цепочек зависит от фазы роста и рН среды.

L. bavaricus, L. curvatus и L. sake образуют родственную группу с коэффициентом ДНК/ДНК-гомологии 50 %.

Внутри вида L. casei подвиды casei, pseudoplantarum и tolerans образуют группу с коэффициентом ДНК/ДНК гомологии 80…100 %.

Штаммы вида L. plantarum распадаются на 2 группы – большинство проявляют ДНК/ДНК гомологию на уровне 80…100 %, а примерно четвертая часть штаммов – только на уровне 30…70 %.

Таблица 13 – Виды лактобацилл группы III (Streptobacterium по ОрлаЙенсену) 1. L. bifermentas - L. brevis - Хлеб из кислого теста, квашеные овощи (пикули), ферментированные растительные соки 16. L. sanfrancisco - Хлеб из кислого теста 18. L. viridescens - Всегда сбраживают углеводы по гетероферментативному пути.

L. bifermentas сбраживает глюкозу гомоферментативно до L-лактата, который при определенном рН может далее распадаться до ацетата, СО2 и Н2. Все, за исключением L. fermentum, L. reuteri и L. confusus, являются мезофилами и пробиотиками. Все сбраживают глюкозу с образованием смеси DL-изомеров лактата.

Слабая ДНК/ДНК-гомология по отношению друг к другу.

Ряд видов отличаются от большинства лактобактерий по типу пептидоглюкана, составляющего каркас клеточной стенки. Из всех лактобацилл бетабактерии имеют наиболее мелкие и тонкие клетки.

4.2.2 Род Leuconostoc В таблицах 14 и 15 отражены основные таксономические признаки лейконостоков.

Таблица 14 – Лейконостоки (род Leuconostoc) промышленности) (в винной промышленности) teroides Таблица 15 – Дифференциация подвидов Leuconostoc mesenteroides из сахарозы Род Leuconostoc объединяет гетероферментативные кокковидные бактерии, которые бывают овальными или яйцевидными. Род включает виды Leuc. cremoris, Leuc. dextranicum, Leuc. lactis, Leuc. mesenteroides, Leuc. oenos. Лейконостоки по форме клеток иногда сложно отличить от гетероферментативных лактобацилл (бетабактерии). В таких случаях следует помнить, что их представители (не бетабактерии) часто сбраживают трегалозу, не образуют NH3 из аргинина, продуцируют D(–)-молочную кислоту из глюкозы.

4.2.3 Род Pediococcus К роду Pediococcus относят гомоферментативные кокковидные бактерии. Деление их клеток идет в двух плоскостях, в результате чего часто образуются тетрады или гроздья. Род включает виды: P. acidilactici, P. damnosus, P. dextranicum, P. halophilus (таблица 16).

Таблица 16 – Свойства, дифференцирующие виды Pediococcus (d – замедленная реакция) Род Streptococcus объединяет гомоферментативные бактерии, сферической или овальной формы, делящиеся в одной плоскости и располагающиеся парами или цепочками. Стрептококки разделяют на фекальные, молочные, стрептококки ротовой полости (оральные) и пиогенные (таблица 17).

Таблица 17 – Группы стрептококков Фекальные (энтерококки) S. equinus S. raffinolactis S. salivarius S. disgalactiae S. faecalis (с разновидностями S. faecalis subsp.

liquefaciens и S. faecalis subsp.

zymogenes) S. faecium subsp.

casseliflavus 4.2.5 Разные подходы к номенклатуре молочнокислых бактерий В производственной технологической документации и в научной литературе, различающейся по времени издания, встречаются разные названия (синонимы) одних и тех же молочнокислых бактерий и их группировки (таблицы 18…23).

Таблица 18 – Лактококки (род Lactococcus) Вид* Подвид (subspecies) Биовариант (biovariant) L. lactis lactis (молочный) промышленности Таблица 19 – Кокковидные лактобактерии Гомоферментативное сбраживание глюкозы с обЛактококки разованием L(+)-молочной кислоты. Не растут pод Lactococcus при 45 °С, в бульоне с 6,5%-ной соли или рН 9,6.