«Оптимизация метода ВЭЖХ для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов, метотрексата и циклоспорина А ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ

ЛИМНОЛОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ФЕДОРОВА ГАЛИНА АФАНАСЬЕВНА

Оптимизация метода ВЭЖХ

для терапевтического лекарственного мониторинга

противосудорожных препаратов, метотрексата и циклоспорина А 05.11.11 – хроматография и хроматографические приборы Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

доктор химических наук Г.И.Барам

Научный консультант:

кандидат медицинских наук А.В.Стародубцев Иркутск-

ОГЛАВЛЕНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Введение

2.2. Неподвижные фазы

2.3. Хроматографические колонки

2.4. Подвижные фазы

2.5. Детектирование лекарственных веществ в ОФ ВЭЖХ

2.6. Подготовка пробы

2.7. Валидация биоаналитических методов

2.8. Заключение

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

3.1. Оборудование

3.2. Материалы

3.3. Методы 3.3.1. Условия хроматографического определения ЛВ

3.3.2. Отбор и хранение проб крови

3.3.3. Удаление липидов из сыворотки крови

3.3.4. Удаление белков из сыворотки крови

3.3.5. Подготовка пробы сыворотки крови для определения гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата

3.3.6. Подготовка пробы для определения этосуксимида

3.3.7. Подготовка пробы для определения вальпроевой кислоты............. 3.3.8. Подготовка пробы для определения клоназепама

3.3.9. Подготовка пробы для определения циклоспорина А

3.3.10. Оценка степени извлечения из сыворотки крови клоназепама и циклоспорина А

3.3.11. Определение градуировочных зависимостей для ЛВ

3.3.12. Оценка селективности и специфичности методик анализа.......... 3.3.13. Оценка метрологических характеристик методик анализа...........

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Выбор масштаба ВЭЖХ

4.2. Выбор неподвижной фазы

4.3. Выбор подвижной фазы

4.4. Выбор условий хроматографического определения 4.4.1. Выбор длин волн детектирования

4.4.2. Элюенты и режим элюирования

4.4.3. Выбор температуры колонки

4.5. Подготовка пробы 4.5.1. Удаление липидов

4.5.2. Осаждение белков

4.5.3. Подготовка пробы для определения этосуксимида

4.5.4. Подготовка пробы для определения клоназепама

4.5.5. Подготовка пробы для определения циклоспорина А

4.5.6. Подготовка пробы для определения вальпроевой кислоты........... 4.6. Определение ПСП в сыворотке крови

4.7. Определение циклоспорина А в сыворотке крови

4.8. Определение метотрексата в сыворотке крови

4.9. Метрологические характеристики разработанных методик 4.9.1. Предел обнаружения, предел количественного определения и линейный диапазон

4.9.2. Оценивание характеристики воспроизводимости

4.9.3. Оценивание правильности

5. ВЫВОДЫ

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Приложение 1. Структурные формулы ЛВ, подлежащих мониторингу в РФ

Приложение 2. Структурные формулы ЛВ, рекомендованных Приложение 3. Гексамидин, Вальпроевая кислота, Дифенин, Карбамазепин, Клоназепам, Ламиктал, Фенобарбитал, Приложение 4. Результаты определения противосудорожных препаратов Карбамазепин

Фенобарбитал и бензонал

Комплексная терапия

человеческой деятельности, успехи которой прямо и косвенно зависят как от уровня развития аналитической химии в общем, так и от степени внедрения наиболее передовых методов химического анализа в практику. К таким методам относится и высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ), которая за последние 30 лет во многом определила заметный прогресс в практической медицине. Важнейшим приложением ВЭЖХ стал терапевтический лекарственный мониторинг, позволяющий оптимизировать индивидуальную дозировку лекарств, которая необходима для предотвращения побочных эффектов и повышения эффективности лечения.

ВЭЖХ как высокочувствительный и универсальный метод анализа, которому во многих случаях нет альтернативы, позволяет одновременно следить за изменением концентрации несколько лекарственных веществ (ЛВ), отличается достаточной точностью и воспроизводимостью. Однако, активное использование ВЭЖХ в повседневной (рутинной) клинической практике ограничено из-за отсутствия унифицированных методик анализа. В настоящее время для определения какого-либо ЛВ применяются своя "уникальная" процедура подготовки пробы и своя методика ВЭЖХ-анализа, которые в каждом конкретном случае предписывают использование разных колонок, разных элюентов и разных детекторов. Очевидно, что эти обстоятельства приводят к необходимости каждый раз изменять хроматографическую систему и калибровать хроматограф, что, в конечном итоге, значительно увеличивает продолжительность всего анализа, требуют высокой квалификации персонала и, наконец, существенно повышают стоимость анализа.

Один из возможных путей решения этой проблемы – разработка максимально унифицированных, экономичных и экспрессных методик подготовки пробы и хроматографических процедур. Реализация такого подхода, очевидно, позволит снизить расходы на проведение анализа и широко внедрить ВЭЖХ в практику лекарственного мониторинга.

Это направление развития ВЭЖХ, безусловно, представляется нам важным и актуальным.

Цель и задачи исследований.

1. Оптимизировать метод ВЭЖХ для задач терапевтического лекарственного мониторинга препаратов в сыворотке крови с целью широкого его внедрения в клиническую практику.

2. Унифицировать и оптимизировать метод ВЭЖХ для определения ряда лекарственных веществ (метотрексат, циклоспорин А, этосуксимид, гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин, бензонал, клоназепам, депакин), которые являются важнейшими объектами терапевтического лекарственного мониторинга.

3. Унифицировать и оптимизировать процедуру подготовки образцов крови для определения в них методом ВЭЖХ вышеперечисленных препаратов.

Определить метрологические характеристики разработанных методик для подтверждения их соответствия требованиям, принятым для биоаналитических методов.

4.Апробировать разработанные методики в клинической практике и подтвердить их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

Научная новизна работы представленной работы заключается в следующем:

1. Предложена унифицированная, оптимизированная и экономичная ВЭЖХметодика для определения этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина, клоназепама и депакина (все – противосудорожные препараты), метотрексата и циклоспорина А, позволяющая хроматографировать все соединения на колонке с обращенно-фазовым сорбентом типа "C18" при использовании одной и той же двухкомпонентной подвижной фазы.

2. Предложена унифицированная и экономичная методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови методом ВЭЖХ. Ее отличительная особенность – возможность работы с малыми объемами образцов крови. Методика подготовки образца обеспечивает достаточную степень его очистки от балластных веществ крови и позволяет проводить более анализов противосудорожных препаратов в сыворотке на одной колонке, что существенно повышает экономичность всего метода.

3. Показана пригодность разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХанализа для терапевтического лекарственного мониторинга противосудорожных препаратов (ПСП), метотрексата и циклоспорина А путем апробации в рутинной клинической практике. На примере свыше 700 определений подтверждено соответствие метрологических характеристик разработанных методик требованиям, принятым для биоаналитических методов.

Практическая значимость работы.

Предложенные методики были использованы для терапевтического лекарственного мониторинга ПСП, метотрексата и циклоспорина А в крови пациентов, проходившим лечение в Иркутской Государственной областной детской клинической больнице и в Иркутском Государственном институте усовершенствования врачей в период 1997-2003 гг. Данные мониторинга в сочетании с клиническими показателями были использованы врачами для коррекции доз лекарственных препаратов.

Внедрение разработанных методик для терапевтического лекарственного мониторинга в клиническую практику позволит более обоснованно определять тактику и стратегию лечения, сделав лечение эффективнее и безопаснее.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Оптимизированная ВЭЖХ-методика для определения ПСП, метотрексата и циклоспорина А, которая является экспрессной и экономичной вследствие унификации как условий ВЭЖХ-анализа, так и применения микроколоночного варианта ВЭЖХ. Время анализа составляет 10-15 мин.

2. Методика подготовки образца для прямого анализа этосуксимида, гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, дифенина, карбамазепина и метотрексата в сыворотке крови, являющаяся простой, экспрессной и экономичной. Объем сыворотки крови для одного определения не превышает 50 мкл. На одной колонке выполняется более 400 анализов ПСП.

3. Результаты апробации разработанных методик подготовки пробы и ВЭЖХанализа в рутинной клинической практике, подтверждающие их пригодность для терапевтического лекарственного мониторинга.

4. Результаты исследования метрологических характеристик разработанных методик анализа, полученные путем обработки экспериментального материала, подтверждающие их соответствие требованиям, принятым для биоаналитических методов анализов.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы были представлены и обсуждены на: Всероссийском симпозиуме по теории и практике хроматографии и электрофореза (Москва, 1998); Всероссийском симпозиуме по химии поверхности, адсорбции и хроматографии (Москва, 1999); V Национальном Съезде фармацевтов Украины "Достижения современной фармацевтики и перспективы его развития в новом тысячелетии" (Киев, 1999); VI Конференции "Аналитика Сибири и Дальнего Востока – 2000" (Новосибирск, 2000);

VIII Всеросийском съезде неврологов (Казань, 2001); II Объединенной научной сессии СО РАН и СО РАМН (Новосибирск; 2002); Х Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство", (Москва, 2003); 3-ем Международном симпозиуме по методам разделения в биологических науках (Москва, 2003).

По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 137 страницах текста, содержит 23 рисунок, 12 таблиц и приложения. В списке цитируемой литературы 127 наименований.

ПРИМЕНЕНИЕ ВЭЖХ В ТЕРАПЕВТИЧЕСКОМ

ЛЕКАРСТВЕННОМ МОНИТОРИНГЕ

Терапевтический лекарственный мониторинг (ТЛМ) как самостоятельное направление в фармакокинетическом анализе сформировался около 20 лет назад.

Он представляет собой контроль концентрации лекарственного вещества и/или его активных метаболитов в организме пациента в течение всего периода лечения. ТЛМ особенно важен, когда соединение имеет узкий терапевтический интервал действия, фармакокинетика и значительная вариабельность фармако-кинетических параметров у разных пациентов.

В Российской Федерации список лекарственных веществ (ЛВ), подлежащих мониторингу, регламентируется Приказом № 64 Министерства здравоохранения РФ от 21 февраля 2000 г.; он содержит около 50 наименований и приведен в табл. 1 [1].

Структурные формулы ЛВ приведены в Приложении 1. Отметим, что Приказ носит весьма декларативный характер – в нем не только не указываются методы анализа для перечисленых лекарственных препаратов, но и не приведены значения их терапевтических и токсических концентраций. Эти данные, суммированные в табл. 1 и 2, взяты нами из обзора [2]. Так как они являются лишь ориентировочными и должны рассматриваться в контексте с клиническими показателями для каждого конкретного пациента, то это вносит некоторую неоднозначность в определение терапевтических и токсических концентраций.

общепринятых правил о проведении ТЛМ. В США документы носят обладающих узким терапевтическим диапазоном (NTR-drugs, NTI-drugs), подготовленный рабочей группой Center for Drug Evaluation and Research of пересматривается один раз в несколько лет. Структурные формулы и молекулярные массы ЛВ из этого списка приведены в Приложении 2.

Таблица 1. Список лекарственных веществ, подлежащих мониторингу в РФ.

Сиднокарб** Таблица 1. (продолжение) Бензодиазепины (метаболиты) Производные барбитуровой кислоты:

Морфин (метаболиты) Международное непатентованное название.

Концентрация лекарственного вещества в крови (сыворотке или плазме) человека, при которой лекарственное вещество оказывает эффективное клиническое действие без значительных побочных эффектов.

Концентрация лекарственного вещества в крови (в сыворотке или плазме) человека, при которой появляются значительные токсические симптомы.

* Минимальная зарегистрированная концентрация, при которой отмечены токсические симптомы.

** Показатели в литературе нами не найдены.

***) Показатели приведены для высокодозной терапии (48 час).

Поиск литературы, проведенный по ключевой фразе "therapeutic drug monitoring" за период 1995-2003 г.г показал, что список ЛВ, при применении которых рекомендуется использовать ТЛМ, значительно шире приведенных в таблицах 1 и 2 и включает в себя более 100 названий, при этом их число постоянно увеличивается в связи с появлением новых лекарственных веществ.

биологических жидкостях (кровь, слюна, моча, ликвор), но терапевтический эффект лучше всего коррелирует с концентрацией вещества в крови, поэтому кровь является наиболее распространенным объектом исследования.

Таблица 2. Список лекарственных веществ, рекомендованных для мониторинга (определение в крови) в США.

Aminophylline (Эуфиллин) Clindamycin hydrochloride** Etinil Estradiol/Progestin** Isoproterenol sulphate** (Изадрин) Metaproterenol sulphate** (Орципреналина сульфат) Minoxidil** (Новокаинамид) 1-3) Как в Таблице 1.

* Минимальная зарегистрированная концентрация, при которой отмечены токсические симптомы.

** Показатели нами в литературе не найдены.

Для определения концентрации ЛВ в крови используются различные методы аналитической химии: газовая и жидкостная хроматография, капиллярный электрофорез, иммунологические тесты. Каждый из этих методов имеет свои достоинства и недостатки.

высокоспецифичным, универсальным, быстрым, чувствительным, дает возможность одновременно определять несколько веществ, отличается достаточной точностью и воспроизводимостью, легко автоматизируем. Несмотря на существование большого разнообразия вариантов ВЭЖХ, к настоящему времени многие из них потеряли свое значение и обычно для определения ЛВ используется метод обращенно-фазной ВЭЖХ. Литература за 1995-2003 гг.

свидетельствует о том, что для подавляющего числа ЛВ в рутинном клиническом анализе ВЭЖХ применяется в следующем виде:

Колонка: 4,0 - 4,6 х 150 - 250 мм.

Неподвижная фаза: обращенная фаза типа С18.

Подвижная фаза: ацетонитрил-вода (рН 3).

Температура: комнатная.

Давление: 50 - 150 атм.

Детектор: УФ-фотометр.

Далее мы последовательно рассмотрим каждый из этих параметров.

Большинство задач по ТЛМ решается с применением колонок с обращенными фазами (ОФ) на основе объемно-пористого силикагеля. Другие типы сорбентов используются очень редко, причем довольно часто они могут быть заменены теми же обращенными фазами. Применение ОФ вполне оправдано, так как большинство лекарственных веществ - умеренно полярные, достаточно хорошо растворимые в воде соединения.

Наиболее популярной обращенной фазой для определения лекарственных соединений в настоящее время является фаза С18, которая представляет собой силикагель с привитыми линейными радикалами СН3-(СН2)16-СН2-. На этой фазе выполняется 80-85% разделений. Около 10% разделений выполняется на фазе С8 с привитым радикалом CН3-(СН2)6-СН2-.

Коммерчески доступные ОФ обладают сходными характеристиками. Как правило, это сорбенты с "мономерным" типом прививки алкильного радикала, зернами сферической формы с диаметром 3-10 мкм, размером пор 8-12 нм, содержанием углерода 12-20% и прошедшие процедуру дезактивирования поверхности ("эндкеппинг").

Размер пор применяемых в ТЛМ сорбентов обусловлен размерами молекул анализируемых веществ, молекулярная масса которых в большинстве случаев не превышает 500. От пористости силикагеля зависит его площадь поверхности. Для типичного объемно-пористого силикагеля, имеющего размер пор 8-12 нм, она составляет 180-320 м2 на 1 г силикагеля. Площадь поверхности силикагеля, в свою очередь, определяет количество силанольных групп, к которым присоединяются алкильные радикалы в процессе синтеза ОФ.

Содержание углерода. Эта величина прямо или косвенно связана с площадью поверхности и плотностью прививки радикалов. Для используемых в ТЛМ сорбентов она обычно составляет 12-20% от веса сорбента. При таком содержании углерода достигаются приемлемые значения коэффициентов емкости для большинства ЛВ. Сорбенты с более низким содержанием углерода обладают более низкой емкостью и не обеспечивают достаточного удерживания гидрофильных соединений. Сорбенты с очень высоким содержанием углерода (25-30%) проявляют склонность к "коллапсу" в подвижных фазах с большим содержанием воды и также непригодны для определения гидрофильных веществ [3, 4]. Коллапс обращенной фазы – явление, связанное со "слипанием" радикалов С18 между собой, которое приводит к резкому уменьшению гидрофобной поверхности и перекрыванию пор матрицы.

Эндкеппинг. При синтезе обращенных фаз типа С18 обычными методами из-за стерических препятствий не удается, как правило, добиться полной модификации поверхности силикагеля и около 50% силанольных групп остаются свободными.

Их взаимодействие с веществами основного характера приводит ко многим нежелательным эффектам - искажению формы пика, невоспроизводимости времен удерживания, неполному элюированию компонентов пробы.

Проблема остаточных силанольных групп обычно решается с помощью процедуры дезактивирования поверхности ОФ сорбента ("эндкеппинг"), которая заключается в дополнительной обработке уже модифицированного силикагеля низкомолекулярными алкилхлорсиланами. Большинство современных ОФ "эндкеппированы". Некоторые сорбенты, выпускаемые фирмами в двух вариантах с полным и частичным эндкеппингом - заметно различаются между собой по селективности.

За последние несколько лет появились целые классы ОФ, где дезактивирование поверхности силикагеля решается другими, более сложными, способами [5-9]. К таким сорбентам относятся сорбенты с полимерной защитой поверхности (polymer encapsulation) [5]; с горизонтальной полимеризацией [6]; с "включеными" полярными группами (embedded polar groups) [7, 8]; бидентатные ОФ [9] и пр.

Необходимо отметить, что эти сорбенты существенно дороже "традиционных", а их "уникальные" свойства фирмы-производители часто слишком преувеличивают.

Селективность ОФ. Хроматографические свойства (селективность) номинально идентичных ОФ нередко существенно различатаются. Причиной этого могут быть разная плотность прививки радикалов, концентрация и тип остаточных силанольных групп, примеси металлов и некоторые другие факторы [10]. Для характеристики селективности ОФ сорбентов используют спектроскопические и хроматографические методы, достоинства и недостатки каждого из которых подробно обсуждаются в обзоре [11]. На практике для сравнительной оценки селективности сорбентов чаще применяют хроматографирование различных тестовых смесей. Вещества, включаемые в состав тестовой смеси, могут являться аналогами исследуемых соединений [12], но, в более общем случае, тестовый раствор состоит из нескольких веществ, каждое из которых (или их группа) характеризует определенное свойство сорбента. Примеров таких тестовых смесей в сочетании с разными подвижными фазами очень много, но общепринятой процедуры, тем не менее, пока нет.

Хотя сравнение предлагаемых тестов между собой часто показывает, что получаемые результаты весьма неоднозначны [13, 14], тем не менее, их использование позволяет хотя бы качественно сравнивать сорбенты по селективности и разделять их на отдельные группы. Внутри этих групп сорбенты обладают сходными хроматографическими характеристиками и небольшие различия в селективности ОФ можно скорректировать, варьируя условия анализа [15].

Размеры колонок. Хроматографические колонки, используемые в ТЛМ, имеют типичные для ВЭЖХ размеры: их внутренний диаметр составляет 4,0-4,6 мм, а длина составляет 100-250 мм. В последние несколько лет, благодаря появлению более совершенного хроматографического оборудования, чаще стали применять колонки длиной 100-150 мм и в настоящее время на таких колонках выполняется около 50% разделений. Применение коротких колонок - один из важных путей снижения стоимости анализа, позволяющий сократить длительность анализа и уменьшить расход растворителей [16-18].

Еще больше уменьшить стоимость анализа можно переходом к полумикро- или к микроколонкам (1-2 х 100-250 мм), но такие колонки требуют специального хроматографического оборудования, которое само по себе весьма дорого. Видимо, по этой причине микро-ВЭЖХ в ТЛМ используется редко.

Размеры колонок определяют многие важные характеристики любой хроматографической методики и ниже мы рассмотрим это подробнее.

Эффективность колонки. Современные методы упаковки позволяют получать колонки, для которых высота приведенной теоретической тарелки (т.т.) составляет 2-3 диаметра зерна сорбента:

где H - высота приведенной теоретической тарелки; H - высота эквивалентная теоретической тарелке; d p - диаметр зерна сорбента. Эффективность колонок, упакованных фазами с диаметром частиц 5 мкм может достигать 100000 т.т./м, но, на практике составляет обычно не более 70000-80000 т.т./м.

Литература по ТЛМ свидетельствует, что большинство задач решается на колонках длиной 250 мм, которые должны иметь эффективность 15000-20000 т.т.

Однако, реальная эффективность этих колонок, найденная из приводимых хроматограмм, часто не превышает всего 3000-5000 т.т. Причины такого несоответствия связаны, по всей вероятности, с неоптимальным составом подвижной фазы, значительным внеколоночным уширением зон, перегрузкой колонки, большим объемом пробы и пр. Если принять, что 5000 т.т. является достаточной эфективностью колонки, то очевидно, что оптимизация анализа, направленная на достижение максимальной эффективности колонки, должна позволить уменьшить ее длину до 50-100 мм. Это, в свою очередь, даст возможность значительно уменьшить объем подвижной фазы, требуемой для выполнения одного разделения [17].

Нагрузка на колонку. Известно, что для обеспечения максимальной эффективности колонки нагрузка на типичный ОФ сорбент не должна превышать 1-10 мкг вещества-аналита на 1 г сорбента [19]. Отсюда следует, что для "стандартной" колонки 4,6х250 мм максимальное количество вещества в пробе не должно быть более 4-40 мкг. В ТЛМ на практике количество самого веществааналита в пробе не превышает обычно 10-100 нг, но из-за высокого содержания сильно удерживаемых балластных веществ суммарная нагрузка может превышать 100 мкг на колонку. Для того, чтобы избежать перегрузки колонки и, как следствие, уменьшения ее эффективности, надо или применять более высокочувствительные детекторы, или специально освобождаться от балластных веществ на стадии подготовки образца.

При уменьшении диаметра колонки следует помнить, что нагрузка должна быть снижена пропорционально изменению ее объема.

Скорость потока подвижной фазы. Многими исследованиями показано, что в ВЭЖХ для достижения максимальной эффективности колонки, упакованной сорбентом с диаметром частиц 5 мкм, линейная скорость потока должна быть равной примерно 1 мм/сек [20]. Соответствующая ей объемная скорость потока для колонки с внутренним диаметром 4,6 мм составит примерно 1 мл/мин. Ускорение анализа за счет увеличения скорости потока неизбежно приводит к уменьшению эффективности колонки.

Давление на входе в колонку. Давление в хроматографической колонке само по себе не влияет на ее эффективность. Величина давления определяется скоростью потока и вязкостью элюента, длиной и диаметром колонки, а также размером зерна сорбента и описывается эмпирическим уравнением [21]:

где P - давление на входе в колонку, МПа; F - скорость потока, мл/мин; L - длина колонки, мм; - вязкость подвижной фазы, спз; dp - диаметр частиц сорбента, мкм;

- диаметр колонки, мм.

Очевидно, что чем большее давление может развивать насос хроматографа, тем большую скорость потока можно достичь и тем быстрее можно выполнить разделение. С другой стороны, чем выше давление, при котором осуществляется разделение, тем быстрее изнашивается дорогостоящее хроматографическое оборудование. Хотя современные хроматографы позволяют работать при давлениях 40-50 МПа, однако рабочее давление редко превышает 15 МПа.

Отметим также, что конструкция типичных для ВЭЖХ насосов плунжерного типа из-за больших пульсаций потока обычно не дает возможности работать при обстоятельство мешает применять короткие колонки с низким гидродинамическим сопротивлением. Для работы с такими колонками целесообразно применять непульсирующие насосы шприцевого типа.

Состав подвижных фаз (ПФ) является в ВЭЖХ важнейшим фактором, определяющим селективность колонки. Варьируя состав ПФ путем изменения типа органического растворителя, его концентрации, рН, вводя нейтральные соли, хиральные или ион-парные агенты, изменяя температуру, можно регулировать селективность по отношению к определяемым компонентам в весьма широких пределах. Рассмотрим влияние каждого из этих параметров на селективность колонки с типичной обращенной фазой (ОФ).

Органические растворители. В ОФ ВЭЖХ обычно применяются бинарные ПФ, состоящие из воды и органического растворителя. Органический растворитель играет роль конкурента по отношению к определяемому веществу, то есть вытесняет его из колонки. К органическим растворителям, используемым в ОФ ЖХ, предъявляют следующие требования:

- смешиваемость его с водой во всем используемом интервале концентраций;

- низкая вязкость элюента для обеспечения малого гидродинамического сопротивления колонки;

- химическая инертность его по отношению к определяемым веществам.

Кроме того, растворитель не должен мешать детектированию. Так, при использовании УФ-детектора он должен быть "прозрачен" в соответствующей области спектра.

Всем этим требованиям в различной степени удовлетворяют несколько растворителей - метанол, ацетонитрил, этанол, изопропанол, н-пропанол, тетрагидрофуран и диоксан. Каждый из них обладает своей элюирующей силой, которая в вышеприведенном ряду повышается.

На практике в ВЭЖХ чаще всего используется ацетонитрил (более 95% случаев). Он "прозрачен" в области УФ спектра от 190 нм и обладает самой низкой вязкостью. Другие растворители используются реже, но иногда их применение необходимо для достижения требуемой селективности. В отдельных работах для улучшения разделения используются трех- или четырехкомпонентные смеси:

- вода/ацетонитрил/метанол [22];

- вода/ацетонитрил/ТГФ [23];

- вода/ацетонитрил/метанол/2-пропанол [24].

Параметром, влияющим на удерживание вещества, является концентрация органического растворителя в ПФ. Для разделения простых смесей ее подбирают эмпирически, в более сложных случаях оптимизацию состава можно проводить на основе анализа зависимостей, связывающих удерживание соединений с концентрацией органического растворителя в ПФ [24-26].

Величина рН подвижной фазы. Интервал значений рН подвижной фазы при работе с ОФ сорбентами на основе силикагеля обычно ограничен интервалом стабильности силикагеля (рН 2-8), хотя некоторые современные сорбенты устойчивы до рН 10-11 [5, 6, 9]. За пределами этих интервалов время эксплуатации хроматографической колонки существенно сокращается.

Определение ЛВ в ТЛМ выполняется чаще при кислых или слабокислых значениях рН подвижной фазы и реже – в нейтральных или слабощелочных ПФ.

Элюенты, состоящие только из органического растворителя и воды практически не используются даже при определении нейтральных соединений, так как сама матрица содержит большое количество ионогенных веществ и в "безбуферной" ПФ получить воспроизводимые результаты разделения трудно.

Наиболее часто при ОФ ВЭЖХ ЛВ используется подвижная фаза с рН3. Это связано со следующими причинами:

- диссоциация остаточных силанольных групп ОФ сорбента при этом значении рН подавлена (рКа силанольных групп находится в интервале 3,5 - 4,0) и их взаимодействие с веществами основного характера минимизировано;

- большинство органических кислот при рН3 находятся в молекулярной форме (обычно их рКа>4) и удерживаются на обращенной фазе лучше по сравнению с их анионами;

- при рН3 ОФ стабильна в течение длительного времени.

Для поддержания заданных значений рН используется буферная система, выбор которой зависит от требуемого значения рН. Для обеспечения достаточной буферной емкости необходимо выполнение условия рН=рКа±1, где Ка - константа диссоциации выбранной кислоты или основания [27, 28]:

Ионная сила ПФ. Концентрация буфера в ПФ обычно составляет 0,01-0,05 М и эта величина определяет ионную силу элюента, если в него не добавлена нейтральная соль. С повышением концентрации органического растворителя ионная сила ПФ уменьшается вследствие подавления диссоциации. Как регулятор селективности, ионная сила ПФ используется по отношению к слабо удерживающимся гидрофильным соединениям: увеличение удерживания этих веществ связано с высаливающим эффектом. В качестве нейтральных солей для повышения ионной силы ПФ применяют перхлораты натрия и лития, сульфаты натрия или аммония [29-31]. Фосфат калия используется с этой целью очень редко и только в сочетании с ПФ, содержащей низкие концентрации органического растворителя [32]. Удобнее всего применять перхлорат лития, так как он, в отличие от других солей, хорошо растворяется в органических растворителях, не поглощает в УФ-области и не обладает буферной емкостью, т.е. может использоваться для ПФ во всем диапазоне рН.

Ион-парная ВЭЖХ на обращенных фазах. Распространенным приемом для повышения удерживания гидрофильных ионов, слабо удерживающихся на обращенных фазах, является использование режима ион-парной хроматографии.

При этом в водно-органическую ПФ вводят гидрофобные ионы (ион-парные агенты) для образования ионных пар по схемам:

Для определения оснований применяют натриевые соли алкилсульфо- или алкилсульфоновых кислот с числом атомов углерода алкильной цепи от 4 до 12. В ТЛМ часто используются 1-гексан-или 1-гептансульфокислоты [33, 34]. Довольно распространенным ион-парным агентом является додецилсульфат натрия [35].

При определении кислот в качестве ион-парного агента в ПФ вводят соли триалкиламинов или тетраалкиламмония. Обычно это тетрабутиламмоний [36] или реже - тетраметиламмоний [37]. Длина алкильной цепи используемого ион-парного агента определяет удерживание образующейся ионной пары - с увеличением длины цепи время удерживания увеличивается.

Концентрация ион-парного агента в подвижной фазе составляет обычно 0,001М [33-37]. Концентрация буфера в ПФ в режиме ион-парной хроматографии выбирается в интервале 0,005-0,01 М. Она должна быть достаточна низкой, чтобы не мешать образованию ионных пар - повышение ионной силы элюента приводит к нежелательной их диссоциации.

Температура колонки. Температура колонки в процессе разделения играет важную роль в ВЭЖХ. В общем виде зависимость удерживания соединения от температуры колонки для изократической ОФ ВЭЖХ описывается уравнением log k=f(T). В узком диапазоне изменения температуры эта зависимость близка к линейной [20]. При градиентном элюировании зависимость удерживания от температуры более сложная [38].

Если функции k=f(T) для разделяемых соединений заметно различаются, то, изменением температуры можно регулировать селективность. Значительное влияние температуры на селективность отмечено для ионогенных веществ, степень диссоциации которых существенно зависит от температуры [39]. Температура может влиять и на пространственную структуру молекулы, что также сопровождается изменением селективности [40]. Особенно это касается биополимеров.

Из вышесказанного следует, что термостатирование хроматографической воспроизводимости анализа. Если требуется воспроизводимость времени удерживания в пределах 1%, то колебания температуры колонки не должны превышать ±0,35°С [20].

Кроме улучшения воспроизводимости анализа, термостатирование позволяет выполнять разделения при более высокой (по отношению к комнатной) температуре, что ведет к уменьшению вязкости подвижной фазы и, как следствие, к снижению рабочего давления.

Отметим, что на сегодняшний день большинство хроматографических методик в ТЛМ не предусматривают обязательного термостатирования колонки.

Определение ЛВ выполняется обычно при комнатной температуре и число работ, в которых использовано термостатирование колонки, невелико.

Режим элюирования. Анализ в ТЛМ предполагает определение, как правило, одного, реже - двух и более соединений. Если определяемые вещества не слишком различаются между собой по удерживанию, обычно удается подобрать такую ПФ, которая позволяет осуществить разделение за приемлемое время в изократическом режиме. Применение изократического элюирования экономически более выгодно.

Оно позволяет уменьшить продолжительность анализа и снизить требования к чистоте растворителей, оборудование для изократической ВЭЖХ дешевле.

В случае одновременного определения двух и более сильно различающихся по полярности соединений изократическое элюирование становится нецелесообразным, так как при попытке уменьшить удерживание гидрофобного вещества, слабоудерживаемые соединения перестают удерживаться. В таких случаях используют градиентное элюирование, когда сила элюента (концентрация органического растворителя) в процессе элюции повышается. Форма градиента подбирается в соответствии с желательным временем и степенью разделения веществ. Как правило, это выполняется экспериментально. Для строгой оптимизации формы градиента существуют компьютерные программы, в том числе и коммерчески доступные [41, 42].

Градиентное элюирование является универсальным подходом к разделению сильноудерживаемые компоненты. Следует отметить, однако, что этот режим требует применения более дорогостоящего оборудования и более чистых растворителей (квалификация "для градиентной ВЭЖХ", "for gradient HPLC").

Кроме этого, анализ с использованием градиентного элюирования более продолжителен, так как необходима регенерация колонки в каждом цикле. И, наконец, градиентное элюирование нежелательно использовать в ион-парной ВЭЖХ, хотя такие работы встречаются [43].

В заключение отметим, что в ТЛМ градиентное элюирование используется редко, вероятно, из экономических соображений.

2.5. Детектирование лекарственных веществ в ОФ ВЭЖХ.

Детектирование является важной составной частью аналитического метода.

Выбор детектора – универсальный или селективный, – зависит от конкретной аналитической задачи и определяется многими соображениями. В ВЭЖХ-анализе лекарственных соединений чаще всего применяются 4 типа детектирования – фотометрическое (ФМ), флуоресцентное (ФЛ), электрохимическое (ЭХ) и массспектрометрическое (МС).

Фотометрические детекторы. Фотометрические детекторы в ВЭЖХ-анализе ЛВ получили наибольшее распространение, так как практически все эти вещества в растворенном состоянии способны поглощать свет. К достоинствам фотометрических детекторов можно отнести достаточно высокую чувствительность и большой линейный диапазон. Кроме этого, ФМ детекторы являются неразрушающими, что позволяет выделять вещество из элюата в чистом виде и исследовать его дополнительно.

Чаще всего применяются детекторы по поглощению света в ультрафиолетовой области спектра (УФ фотометры и УФ спектрофотометры). Их чувствительность достигает 10-8-10-9г вещества в пробе. ФМ детекторы можно подразделить на три вида и все они применяются в ТЛМ:

- с фиксированной длиной волны, которая определяется типом лампы и типом светофильтра;

- с перестраиваемой длиной волны;

- с многоканальной регистрацией.

ФМ детектор с фиксированной длиной волны – самый недорогой и простой по конструкции. Среди этого типа наибольшее распространение получили УФ детекторы, источником излучения в которых является ртутная лампа низкого давления с интенсивной полосой излучения 253.7 нм ("254 нм"). К достоинствам таких фотометров можно отнести низкий уровень шумов (2х10-5 оптических единиц), но в последние годы они редко используются в ТЛМ, так как не позволяют детектировать вещества, которые не поглощают (или слабо поглощают) при длине волны 254 нм.

ФМ детектор с перестраиваемой длиной волны (спектрофотометр) является самым распространенным в ТЛМ. Источником излучения в нем служит дейтериевая лампа с непрерывным спектром (190-400 нм) или галогеновая лампа для видимой части спектра (400-800 нм).

соответствующей максимальному поглощению (макс). Когда макс лежит в области коротких длин волн (200-220 нм), возникают проблемы, связанные с мешающим поглощением веществ матрицы (например, сыворотки крови) и примесей в растворителях. В этих случаях необходима либо более эффективная колонка, позволяющая отделить мешающие вещества, либо более полное отделение мешающих веществ в процессе подготовки пробы. Детектирование в длинноволновой области УФ спектра иногда предпочтительнее, даже несмотря на некоторое снижение чувствительности, так как при этом уменьшается число пиков на хроматограмме за счет исключения пиков непоглощающих в этой области спектра соединений [44].

ФМ детекторы с многоканальной регистрацией. К ФМ детекторам с многоканальной регистрацией относятся диодно-матричные детекторы (ДМД; поанглийски - Diode Array Detector или DAD) и многоволновые детекторы.

При применении ДМД фотометрирование элюата выполняется одновременно во всем спектре через короткие промежутки времени. Получаемая спектральная информация повышает достоверность идентификации пиков, позволяет оценивать их гомогенность и выполнять "математическое" разделение неразрешенных пиков [45]. ДМД применяются для создания библиотек спектральных данных, которые получили широкое распространение в токсикологических исследованиях [46, 47].

Несмотря на широкие возможности таких детекторов, они пока мало применяются в рутинной практике ТЛМ вследствие их высокой стоимости.

К другому типу детекторов с многоканальной регистрацией относятся детекторы хроматографов серии "Милихром" (ЗАО "Научприбор" и ЗАО "ЭкоНова", Россия), детекторы М 490 (Waters, USA), SPD-10A (Shimadzu, Япония).

Фотометрирование элюата в этих детекторах осуществляется по циклической программе, при этом детекторы серии "Милихром" позволяют выполнять фотометрирование на многих длинах волн ("Милихром А-02" до 8 длин волн), а детекторы WATERS M 490 и Shimadzu SPD-10A - на двух длинах волн. Количество получаемой спектральной информации при применении таких детекторов меньше, чем в случае ДМД, но значительно больше по сравнению с одноканальными фотометрами. Эти детекторы значительно дешевле ДМД и не требуют мощного математического обеспечения.

Чувствительность фотометрического детектора. Важным преимуществом ФМ детектора является возможность предварительной оценки его чувствительности по отношению к веществу-аналиту, т.е. оценки уровня минимально определяемой концентрации вещества при заданном отношении "сигнал/шум" для данной хроматографической системы. Формула для расчета предела детектирования приведена ниже [16]:

где: Смин - предел детектирования (минимальная детектируемая концентрация) при отношении "сигнал/шум"=2; Ашум – уровень шумов детектора; Vo – свобод-ный (мертвый) объем колонки; k - фактор удерживания вещества; - коэф-фициент экстинкции вещества; l - длина оптического пути измерительной ячейки; Vs - объем образца; N - эффективность хроматографической колонки.

Электрохимический и флуоресцентный детекторы обладают рекордной чувствительностью (до 10-10-10-11 г) и высокой селективностью [48-50], но в ТЛМ они имеют ограниченное применение, так как лишь небольшая часть лекарственных соединений имеет низкие окислительно-восстановительные потенциалы или обладает природной флуоресценцией. Например, только для 30% ЛВ, подлежащих мониторингу в РФ (таблица 1), возможна ЭХ детекция и только два обладают природной флюоресценцией - индометацин и хинидин.

Расширить круг соединений, для определения которых можно применять ЭХ или флуоресцентное детектирование, позволяют фотохимические реакторы. В результате фотохимической реакции при облучении элюата УФ-излучением (=254 нм) многие ЛВ (например, алкалоиды, антибиотики, барбитураты, бензодиазепины, диуретики) превращаются в ЭХ-активные или флуоресцентные производные [51-53]. Сочетание ЭХ детектора с фотохимическим реактором обеспечивает более высокую чувствительность определения ЛВ в плазме крови еще и за счет разрушения части ЭХ-активных эндогенных соединений матрицы [52]. Однако, несмотря на высокие потенциальные возможности фотореактивного детектирования, применяется оно довольно редко из-за своих низких метрологических характеристик.

Масс-спектрометрическое детектирование – относительно новый, высокочувствительный и высокоселективный метод анализа. Детекторы-массспектрометры с ионизацией при атмосферном давлении, позволяют детектировать соединения на уровне нескольких пикограмм [54]. Возможность применения МС детектора продемонстрирована практически для всех ЛВ. Этот метод достаточно широко известен в токсикологических исследованиях [54-56], но применение МС детектора в рутинном анализе пока экономически невыгодно в связи с высокой стоимостью аппаратуры. Кроме того, конструкция масс-спектрометрического детектора весьма сложна и требует высокой квалификации персонала, что также ведет к повышению стоимости анализа.

Химическая дериватизация. Вещества, которые не поглощают или слабо поглощают в УФ-области спектра, можно детектировать в виде УФ-поглощающих производных (дериватов), получаемых в результате специальных реакций. Условия получения многих таких производных хорошо разработаны и некоторые часто используемые реакции приведены ниже.

Для получения УФ-поглощающих производных первичных или вторичных аминов применяются такие реагенты, как 2,4-динитрофторбензол или фенилизотиоцианат [57, 58]. Реакция с орто-фталевым альдегидом приводит к образованию флуоресцентных производных, которые можно также и фотометрировать в УФ-области спектра [59, 60]:

NCS NH C NH R

Органические кислоты удобно определять в виде УФ-поглощающих парабромфенациловых эфиров [61]:

Вещества, в структуре которых присутствует гидразидная группа, можно определять в виде оснований Шиффа, полученных по реакции [62]:

CH CH CH N NH R

Непрямое фотометрирование. Для детектирования непоглощающих веществ можно использовать непрямое (косвенное) детектирование [63]. Суть этого метода определяемых веществ. В процессе элюирования соединение-конкурент вытесняет вещества-аналиты с сорбента и занимает их места на его поверхности. Т.к.

концентрация конкурента в ПФ при этом уменьшается, то на хроматограмме регистрируются "отрицательные" пики оптического поглощения, площадь которых пропорциональна концентрации определяемых веществ.

Этот метод детектирования часто используется в ионной хроматографии для определения непоглощающих органических и неорганических анионов. В ТЛМ непрямое фотометрирование практически не используется, по-видимому, из-за мешающего влияния поглощающих свет соединений матрицы.

Подготовка пробы в химическом анализе часто является длительной, трудоемкой и, вследствие этого, наиболее дорогостоящей частью аналитического процесса. Ее целью может быть удаление из пробы веществ, мешающих определению, перевод определяемого соединения в форму, удобную для анализа, концентрирование определяемого соединения. Обычно подготовка пробы состоит из нескольких стадий, каждая из которых требует определенного времени и является дополнительным источником погрешности.

Рассмотрим существующие методы подготовки пробы в ТЛМ.

Традиционным объектом исследования в ТЛМ служит плазма или сыворотка крови, которая отличается от плазмы отсутствием фибрина. Большая часть лекарственных веществ не связывается с фибрином, поэтому подготовка проб плазмы и сыворотки и результаты хроматографического анализа в таких случаях идентичны. В дальнейшем все, что будет сказано о сыворотке крови, можно относить и к плазме.

Сыворотка крови содержит белки (70-80 мг/мл), минеральные соли (около 7,5 мг/мл), липиды (4-8 мг/мл). Кроме этого, в ней содержится большое количество низкомолекулярных органических веществ, которые потенциально могут мешать проведению анализа: гормоны, биогенные амины, витамины, креатин, креатинин, билирубин, мочевая кислота и др.

Показано, что при прямом введении сыворотки крови в колонку с ОФ присутствующие в ней белки, липиды и некоторые другие компоненты вызывают заметное уменьшение эффективности колонки, а осаждение этих веществ на поверхности сорбента и на фильтрах колонки резко повышает ее гидродинамическое сопротивление [64]. Такой подход в настоящее время не используется.

Современные методы подготовки биологических проб, используемые в ТЛМ, направлены либо на удаление мешающих компонентов (осаждение белка) с последующим анализом супернатанта, либо на извлечение определяемого вещества из биологической матрицы (методы экстракции).

самостоятельный метод подготовки пробы, или как промежуточная стадия для других методов. Эта процедура простая, быстрая и недорогая и поэтому довольно распространена при подготовке проб биологических жидкостей, содержащих белки. Белки осаждают добавлением к пробе органических растворителей, неорганических солей или сильных кислот с последующим центрифугированием [22-24, 33, 36, 37, 54, 57, 65-68]. Для избежания потерь аналита важно, чтобы добавление любого из этих реагентов разрушало комплекс белок-лекарственное вещество. Кратность разбавления образца при добавлении осадителя варьируется от 1 до 5, чаще 2-3, а степень извлечения определяемого вещества обычно находится в интервале 90-100%. После центрифугирования надосадочную жидкость (супернатант) вводят в хроматографическую систему. Достаточно часто для повышения чувствительности супернатант упаривают досуха, сухой остаток растворяют в подходящем растворителе или в самой ПФ и инжектируют в колонку [33, 37, 67].

Наиболее удобным реагентом для осаждения белков с последующим анализом супернатанта методом ВЭЖХ с УФ детектированием является ацетонитрил – он используется авторами в подавляющем большинстве работ. Высокое содержание ацетонитрила в образце (50% и выше) снижает эффективность колонки с ОФ, что наиболее заметно при анализе гидрофильных веществ. Для решения этой проблемы применяют экстракцию ацетонитрила из супернатанта хлороформом или хлористым метиленом. Кроме ацетонитрила при этом экстрагируются и липиды.

Такой простой прием позволяет повысить эффективность колонки, увеличить чувствительность анализа и, что особенно важно, продлить "время жизни" колонки вследствие удаления липидных компонентов пробы [68].

После осаждения белка в пробе остается довольно большое количество эндогенных компонентов, которые мешают при анализе проб с низкими концентрациями ЛВ. Кроме этого, в пробе остаются высокогидрофобные компоненты сыворотки, которые поздно элюируются и, тем самым, удлиняют время анализа. Более того, они могут вообще не элюироваться и аккумулироваться в колонке при каждом введении пробы, постепенно снижая ее эффективность.

Однако, несмотря на все вышеперечисленные недостатки, осаждение белка с последующим инжектированием супернатанта остается наиболее широко используемым методическим приемом в ТЛМ.

Жидко-жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – традиционный метод подготовки проб, требующих концентрирования определяемого вещества перед анализом.

Экстракция ЛВ выполняется после осаждения белка [22, 57] или напрямую из биологической матрицы [49, 69-71]. Селективность экстракции зависит от различия коэффициентов распределения вещества-аналита и эндогенных компонентов матрицы.

Полярность ЛВ определяет выбор эктрагента, которыми могут быть хлороформ [69], хлористый метилен [70], толуол [57], этилацетат и некоторые другие эфиры [22, 49]. Повышение селективности экстракции достигают с помощью бинарных растворителей – хлороформ/изопропиловый спирт[71], гептан/этилацетат [72]. Для увеличения константы распределения вещество-аналит перед экстракцией часто переводят в молекулярную форму, для чего в пробу добавляют растворы минеральных кислот или оснований. После экстракции неполярными экстрагентами целевой раствор, наряду с определяемым веществом, содержит большое количество липидных компонентов плазмы (сыворотки). Одним из способов дальнейшей очистки экстракта может быть реэкстракция определяемого вещества слабыми растворами кислот или оснований [71, 72].

Степень извлечения ЛВ методом ЖЖЭ составляет обычно 70-90 % и при этом их концентрацию в инжектируемом экстракте можно повысить в 5-10 раз по сравнению с исходной пробой.

Недостаток ЖЖЭ – необходимость использования больших объемов высокочистых, дорогих и токсичных органических растворителей, а сама процедура экстракции трудоемка, длительна и требует упаривания экстрагента (обычно несколько миллилитров). Кроме этого, ЖЖЭ мало применима для полярных соединений, константы распределения которых, как правило, низки.

Хотя ЖЖЭ может быть автоматизирована [73], это сделать весьма сложно и такое оборудование пока мало распространено.

Твердофазная экстракция (ТФЭ) как метод подготовки пробы в ТЛМ используется весьма широко. Эффективность колонок-картриджей для ТФЭ составляет всего 50-100 тт, и их применение позволяет отделить только те компоненты, которые значительно отличаются по удерживанию от определяемого вещества. Применение двумерной (2D) ТФЭ обеспечивает более высокую селективность за счет использования ПФ, различающихся элюирующей силой и рН [74].

Наиболее распространенными стационарными фазами в ТФЭ до недавнего времени были ОФ С18 и С8. Сейчас стали использовать полимерные сорбенты, лишенные недостатков, характерных для обращенно-фазных сорбентов, синтезируемых на основе силикагеля: они пригодны для работы в широком интервале рН; обладают более высокой емкостью по отношению к полярным веществам, не требуют кондиционирования перед нанесением пробы [75].

Полимерные сорбенты универсальны: они пригодны для извлечения полярных и неполярных, нейтральных и ионогенных веществ. Для ТФЭ лекарственных веществ в ТЛМ часто используют картриджи Abselut Nexus (Varian, США) [76] и OasisТМ HLB (Waters, США) [74]. Кроме полимерных сорбентов, в современной ТФЭ для извлечения полярных аналитов используются также комбинированные сорбенты, например, Bond Elut Certify [77], Bond Elut Certify II [78], которые представляют собой комбинацию ОФ С8 и ионообменников. Более высокую селективность ТФЭ по сравнению с комбинированными сорбентами обеспечивает последовательное применение картриджей, упакованных полимерным и ионообменным сорбентами, предложенное для основных ЛВ [79]. Появление современных сорбентов, не "боящихся" высыхания перед нанесением пробы, способствовало развитию оборудования для параллельной (много-канальной) ТФЭ.

При массовом анализе часто используется 96-камерная рабочая станция, которая позволяет одновременно обрабатывать до 96 образцов [74].

Для повышения производительности, кроме параллельной ТФЭ, используется и автоматизированная ТФЭ. В настоящее время известны два варианта автоматизации ТФЭ, которые в зарубежной литературе получили название "at-line" и "on-line".

Вариант "at-line" заключается в использовании роботизированных систем с традиционными одноразовыми или многоразовыми картриджами, когда оператор задает алгоритм, а затем обработанная проба попадает в хроматограф. Примером такой автоматизированной системы является ASPEC XL (Gilson, Франция-США) [80]. Эти системы довольно дороги и используются в рутинном анализе только в крупных аналитических лабораториях, где требуется высокая производительность.

Вариант "on-line" основан на методе переключения колонок. Этот вариант является модификацией традиционной ВЭЖХ с предколонкой. Проба инжектируется в предколонку, которая в это время отсоединена от аналитической колонки. Предколонка промывается по соответствующей программе растворителями и только затем, с помощью дополнительного крана, соединяется с аналитической. Этим самым исключается попадание в аналитическую колонку нежелательных веществ. После разделения предколонка снова отсоединяется от аналитической и освобождается от сильноудерживаемых веществ. Затем цикл повторяется. Вариант "on-line" реализуется с помощью относительно простого оборудования и поэтому он все чаще используется при анализе биологических проб, в том числе и в ТЛМ. Возможность применения многоразовых экстракционных предколонок многократно снижает стоимость анализа.

Чувствительность этого метода выше, так как степень извлечения вещества составляет, как правило, 100%.

Главным лимитирующим фактором режима "on-line" является ограниченное время эксплуатации экстракционной колонки, которое зависит от характера и объема инжектируемой пробы. На колонке, упакованной ОФ сорбентом С (10х4,6 мм) при прямом нанесении сыворотки можно выполнить анализ 75- проб (7,5-10 мл сыворотки) [44]. Осаждение белков перед нанесением пробы на экстракционную колонку позволяет выполнять до 500 анализов (15 мл сыворотки) на экстракционной колонке С1(10х2,0 мм), но снижает степень извлечения определяемых ЛВ до 85-95% [81]. Для увеличения времени эксплуатации ОФ экстракционной колонки обычно выполняют обратную промывку колонки "сильной" ПФ после анализа нескольких проб.

Интересным способом увеличения "времени жизни" колонки является использование для ее упаковки сорбентов с "ограниченным доступом". Сорбенты с "ограниченным доступом" ("restricted-access media", "RAM", бифильные сорбенты) имеют внешнюю гидрофильную и внутреннюю гидрофобную поверхность. Такие сорбенты применяются для прямого введения биологических жидкостей, при этом высокомолекулярные компоненты пробы, например, белки, элюируются в свободном объеме колонки, а низкомолекулярные компоненты, диффундируя во внутреннее пространство частицы сорбента, удерживаются на ее внутренней поверхности и разделяются. К настоящему времени синтезировано несколько видов бифильных сорбентов, различающиеся свойствами исходного силикагеля и типом модификатора, но чаще всего используются алкилдиолсиликагели (ОФАДС или ОФ-8 АДС) [82-84]. Для гидрофильных ЛВ, которые плохо удерживаются даже на ОФ-18 АДС синтезирован LiChrospher 60 XDS (SO3/Diol), содержащий сульфо-кислоту на внутренней поверхности сорбента [85].

Объем применяемой экстракционной колонки определяет объем наносимой пробы и, следовательно, чувствительность анализа. Типичная экстракционная колонка имеет объем 0.03-0.3 мл, объем пробы при этом составляет 50-100 мкл.

Применение экстракционных колонок большего размера, например, 10х10 мм (V 0,8 мл), позволяет наносить пробу сыворотки до 1-2 мл и, тем самым, существенно повысить чувствительность определения [86].

Хотя бифильные фазы предназначены именно для прямого нанесения биологических проб, опасность осаждения белка все-таки существует, если ПФ для элюирования определяемого вещества с экстракционной колонки на аналитическую содержит более 10-20% органического растворителя. Чтобы предотвратить денатурацию белка необходимо также контролировать ионную силу и рН ПФ [87]. При соблюдении всех этих условий суммарный объем вводимой в колонку с бифильной фазой неразбавленной плазмы может достигать 50-100 мл [83, 84].

В последнее десятилетие большое внимание уделяется валидации методов анализа. Валидация биоаналитических методов, т.е. методов, которые применяются для определения ЛВ и их метаболитов в биологических объектах, является обязательным условием при использовании их в официальных лабораториях. В США "Правила…" для валидации биоаналитических методов сформулированы US FDA в мае 2001 г. [88].

В соответствии с этими "Правилами…" обязательное требование предварительная валидация используемого аналитического оборудования, которая выполняется в соответствии со стандартной процедурой.

Валидация аналитического метода состоит из:

- валидации подготовки стандартных образцов (СО);

- валидации аналитической методики (первичную);

- валидации аналитической методики в рутинной практике;

- валидации документации.

Основным условием правильности подготовки СО является документально подтвержденное содержание основного вещества. Согласно "Правилам…", валидацию аналитической методики (первичную) рекомендовано проводить, оценивая следующие показатели: селективность, точность, воспроизводимость, степень извлечения, правильность построения градуировочной зависимости, стабильность пробы. Для каждого из них рекомендована своя процедура оценки (минимально возможное число проб, их концентрации, число параллельных определений, допустимые отклонения). Указано, что правильность и воспроизводимость применяемых методик не должны быть хуже 15% (для предела обнаружения 20%).

В процессе рутинного использования валидированной методики контроль правильности и воспроизводимости рекомендовано проводить, анализируя контрольные (стандартные) образцы, приготовленные во всем интервале определяемых концентраций. Отклонение от номинального значения по меньшей мере четырех из каждых шести контрольных образцов не должно превышать 15%.

Документация должна соответствовать установленным требованиям и должна быть доступна для аудита и инспекций.

В Российской Федерации валидация аналитических методов для контроля качества лекарственных средств принята для фармацевтических предприятий и нормативно закреплена в ОСТ 42-510-98 [89]. Нормативных документов, касающихся валидации аналитических методов, применяемых в клинической практике, нам найти не удалось. В соответствии с Приказом МЗ РФ №45 от 7.02.2000 г. контроль качества аналитических методик должен проводиться путем оценки сходимости при проведении 10-20 параллельных определений, и он распространяется только на определение биохимических показателей крови и мочи [90].

Обзор литературных данных по ВЭЖХ-анализу лекарственных соединений, рекомендованных для ТЛМ, показывает, что существуют общие подходы к определению ЛВ в биологических жидкостях.

Подавляющее число определений выполняется на обращенных фазах С различных торговых марок, обладающих некоторыми сходными характеристиками (форма и диаметр зерна, размер пор, плотность прививки, эндкеппинг), но существенно различающиеся селективностью.

Различия в селективности используемых сорбентов зачастую обуславливают разнообразие используемых ПФ, хотя достаточно часто применяется бинарная ПФ ацетонитрил-водный буфер (рН 3). Концентрация ацетонитрила в ПФ варьируется в широких пределах, в зависимости от определяемого соединения, так как в ТЛМ используется обычно изократический режим элюирования.

Детекторы, чаще всего используемые в ТЛМ - УФ-спектрофотометры с перестраиваемой длиной волны. Применение детекторов с многоканальной регистрацией повышает достоверность идентификации пиков, позволяет оценивать их гомогенность, но высокая стоимость таких детекторов ограничивает их применение в рутинном анализе.

Подготовка пробы в ТЛМ зависит от концентрации определяемого ЛВ, его физико-химических свойств. Традиционные методы подготовки пробы включают в себя осаждение белка, ТФЭ или, реже, жидко-жидкостную экстракцию. К современным методам можно отнести применение предколонок, заполненными сорбентами с "ограниченным доступом".

Обращает на себя внимание тот факт, что в ТЛМ практически для каждого ЛВ существует своя методика определения, предполагающая определенный сорбент, определенные элюенты, детектор, методику подготовки пробы. Работ, где в одних условиях определяется несколько различных ЛВ, очень мало, хотя очевидно, что необходимость анализа различных ЛВ в рамках одной лаборатории при большом разнообразии методик ведет к увеличению продолжительности анализа, требует высокой квалификации персонала и, в конечном итоге, существенно повышает стоимость анализа. Эту стоимость можно заметно снизить путем унификации условий подготовки пробы и условий хроматографического разделения, и такой подход для анализа ЛВ в биологических объектах используется в токсикологическом скрининге, где он обусловлен самой аналитической задачей [91, 92]. Аналогичный подход к определению терапевтических ЛВ позволил бы широко внедрить этот метод в рутинную практику. Решение этой проблемы представляется нам актуальной задачей.

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

В работе использовали микроколоночный жидкостный хроматограф "Милихром А-02" (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск) с колонками 2х75 мм, заполненными сорбентами Nucleosil 100-5 C18, Nucleosil 100-5 C18 РАН, Nucleosil 100-5 C18 АВ и Nucleosil 300-5 C8 (Macherey-Nagel, Германия); KromasilC18, Kromasil-100-5-C8 и Kromasil-100-5-C4 ("EKA Chemicals" (Швеция).

Центрифуга ОС-6МУХЛ (6000 об./мин), рН метр-иономер И-120.2.

В качестве стандартных (контрольных) веществ были использованы фармацевтические субстанции ЛВ, содержание основного вещества в которых не ниже 98%.

В качестве реагента для модификации вальпроевой кислоты использован пбромфенацил бромистый ("Sigma", США).

Для приготовления элюентов и обработки проб использованы: ацетонитрил (сорт 1) и гексан фирмы "Криохром" (Санкт-Петербург); трифторуксусная кислота ("Sigma", США), уксусная кислота, фосфорная кислота, перхлорат лития квалификации не ниже "х.ч". Хлористый метилен, метанол и триэтиламин были перегнаны перед использованием. Дистиллированная вода была дополнительно очищена с помощью системы "Norganic, Millipore Corporation" (США).

3.3.1. Условия хроматографического определения ЛВ.

Элюенты и режимы элюирования. В качестве элюента А использовали 0,2 М LiClO4 - Н3РО4 (рН 3); элюент Б - МеСN. При определении индивидуальных противосудорожных препаратов (ПСП) использовали изократическое элюирование. Содержание ацетонитрила в ПФ для каждого из определяемых соединений приведено в Главе 4 (п. 4.3). При определении двух и более ПСП применяли градиентное элюирование: 2000 мкл от 10 до 30% Б; 1000 мкл 30% Б.

При определении метотрексата применяли следующий режим градиентного элюирования: 2200 мкл от 5 до 20% Б; 1000 мкл 20% Б.

Циклоспорин А определяли при градиентном элюировании: 2500 мкл от 50 до 80% Б; 1000 мкл 80% Б.

Скорость потока элюента при всех режимах была 150 мкл/мин.

Длины волн детектирования для каждого из определяемых соединений приведены в Главе 4 (п. 4.4.1) Температура колонки. При определении циклоспорина А температура колонки в процессе разделения была 70°С; при совместном присутствии в пробе дифенина и карбамазепина - 55°С; во всех остальных случаях - 40°С.

Запись УФ-спектров. Для записи УФ-спектров готовили стандартные растворы определяемых соединений с концентрацией 0,2 мг/мл. В качестве растворителей для приготовления стандартных растворов использовали: метанол (гексамидин, фенобарбитал, ламиктал, дифенин, карбамазепин); воду (этосуксимид, метотрексат); смесь ацетонитрил - вода (циклоспорин А); нейтрализованный реакционный раствор (пара-бромфенациловый эфир вальпроевой кислоты).

Спектры записывали во время хроматографического анализа после остановки потока вблизи максимума пика (интервал длин волн 190 - 360 нм, шаг 2 нм).

Для определения максимального содержания ПСП кровь из локтевой вены отбирали через 1,5-2 часа после утреннего приема препарата или в течение суток в заданное время. Для определения минимальной концентрации циклоспорина А кровь из локтевой вены отбирали за 1-2 часа до утреннего приема препарата. Для определения содержания метотрексата пробы крови отбирали через подключичный катетер через установленные интервалы времени после начала инфузии метотрексата (9 проб в процессе инфузии и 9-11 проб после ее окончания).

После добавления к цельной крови 1 капли раствора гепарина, плазму отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин. Аликвоту плазмы анализировали или хранили при - 20°С до анализа.

Отделение наиболее гидрофобных соединений сыворотки крови (липидов) от целевых компонентов проводили экстракцией гексаном, для чего к сыворотке крови добавляли гексан в соотношении 1:5 по объему, встряхивали в течение 5 мин, центрифугировали для разделения слоев, гексановый слой отбрасывали, а сыворотку использовали для дальнейшей работы.

После отделения удаления липидов к сыворотке крови добавляли 0,6 М раствор перхлората лития в ацетонитриле, содержащем 1% уксусной кислоты, в соотношении 1:1 по объему, центрифугировали и верхний слой (супернатант) использовали для работы.

3.3.5. Подготовка пробы сыворотки крови для определения гексамидина, фенобарбитала, бензонала, ламиктала, В пробирку вносили 120 мкл сыворотки крови и проводили обработку в соответствии с п. 3.3.3. В две пробирки помещали по 50 мкл обработанной сыворотки и осаждали белки в соответствии с п. 3.3.4. Аликвоту супернатанта (5мкл) инжектировали в колонку.

3.3.6. Подготовка пробы для определения этосуксимида.

В пробирку вносили 200 мкл сыворотки крови, содержащей этосуксимид и обрабатывали в соответствии с п. 3.3.3. В две пробирки помещали по 80 мкл обработанной сыворотки и осаждали белки в соответствии с п. 3.3.4. Аликвоту супернатанта (2 мкл) инжектировали в колонку. Если концентрация этосуксимида в исходной сыворотке была ниже 3,3 мкг/мл, то в каждую пробирку, содержащую супернатант, добавляли по 200 мкл хлористого метилена для экстракции ацетонитрила, встряхивали и после разделения слоев 2-10 мкл верхнего раствора инжектировали в колонку.

3.3.7. Подготовка пробы для определения вальпроевой кислоты.

Вальпроевую кислоту в сыворотке крови определяли в виде парабромфенацилового эфира, методика получения которого была любезно предоставлена Г.Г.Шамовским (ЗАО "ЭкоНова", Новосибирск). Подготовка пробы проводилась следующим образом: для удаления липидов к 200 мкл сыворотки крови добавляли 1 мл гексана, встряхивали 5 мин и гексановый слой отбрасывали.

Для экстракции вальпроевой кислоты к оставшемуся водному слою добавляли 200 мкл 2 М водного раствора Н3РО4, 1 мл гексана, встряхивали 5 мин и разделяли слои центрифугированием. 500 мкл верхнего гексанового слоя переносили в другую пробирку и упаривали досуха в токе аргона. Для получения парабромфенацилового эфира к остатку приливали 400 мкл раствора парабромфенацила бромистого в ацетонитриле (5 мг/мл), 20 мкл раствора триэтиламина в ацетонитриле (28 мг/мл) и выдерживали при комнатной температуре 1 час. К пробе добавляли 10 мкл 2 М водного раствора Н3РО4 и хроматографировали.

Производное стабильно не менее суток.

3.3.8. Подготовка пробы для определения клоназепама.

К 1,1 мл сыворотки крови, содержащей клоназепам, добавляли 5 мл гексана для удаления липидов. 1 мл обработанной сыворотки переносили в другую пробирку. Клоназепам экстрагировали из обработанной сыворотки следующим образом: к 1 мл сыворотки добавляли 50 мкл 2 М водного раствора КОН и 1 мл хлористого метилена, встряхивали 5 мин и отделяли нижний слой раствора, содержащий клоназепам. К оставшемуся водному раствору добавляли еще 1 мл хлористого метилена, повторяли экстракцию, экстракты объединяли и упаривали досуха в токе аргона. Остаток растворяли в 50 мкл раствора ацетонитрил-вода (1:1) и 20 мкл этого раствора инжектировали в колонку.

3.3.9. Подготовка пробы для определения циклоспорина А.

Из 1,2 мл сыворотки крови удаляли белок в соответствии с п. 3.3.4. После этого 2,2 мл супернатанта помещали в пробирку, добавляли 2,2 мл хлористого метилена, энергично встряхивали в течение 5 мин и центрифугировали для разделения слоев.

Верхний (водный) слой удаляли, в другую пробирку переносили аликвоту нижнего слоя (хлористый метилен-ацетонитрил) объемом 3 мл и упаривали досуха в токе аргона при 40°С. Для экстракции липидов остаток растворяли в 140 мкл 50%-ного водного ацетонитрила, содержащем 1% трифторуксусной кислоты, добавляли 1 мл гексана и встряхивали 5 мин. После разделения слоев 100 мкл нижнего слоя (водаацетонитрил) инжектировали в колонку.

3.3.10. Оценка степени извлечения из сыворотки крови Степень извлечения клоназепама и циклоспорина А из сыворотки оценивали путем добавки известных количеств этих соединений в образцы донорской сыворотки. Пробы с добавкой обрабатывали в соответствии с методиками. Степень извлечения рассчитывали как отношение площадей пиков веществ на хроматограммах экстракта сыворотки и стандартного раствора.

3.3.11. Определение градуировочных зависимостей для ЛВ.

Градуировочные растворы для всех определяемых ЛВ готовили путем добавления 10 мкл стандартных растворов этих ЛВ с подходящей концентрацией к 200–4000 мкл донорской сыворотки. Далее пробы обрабатывались в соответствии с методиками. Градуировочная зависимость для каждого определяемого ЛВ получена для пяти концентраций (n=10).

3.3.12. Оценка селективности и специфичности методик анализа.

определяемого ЛВ оценивали путем анализа 10 различных образцов сыворотки крови как доноров, так и пациентов, не принимающих этот препарат.

Оценку селективности разработанных ВЭЖХ-методик (включая подготовку пробы) выполняли для каждого определяемого противосудорожного препарата путем добавок других ПЭП, используемых при проведении комплексной терапии.

3.3.13. Оценка метрологических характеристик методик анализа.

Предел обнаружения (ПрО) для каждого определяемого вещества рассчитывали как минимальную концентрацию этого соединения в исходной сыворотке крови, для которой отношение "сигнал/шум" в инжектируемой пробе равно 3. Относительное стандартное отклонение и отклонение от номинального значения при этом были менее 20%.

Предел количественного определения рассчитывали как концентрацию определяемого соединения в исходной сыворотке, для которой отношение "сигнал/шум" в инжектируемой пробе равно 10. Относительное стандартное отклонение и отклонение от номинального значения при этом были менее 15%.

Оценку воспроизводимости во всем интервале определяемых концентраций для всех определяемых соединений выполняли, используя модельные образцы, приготовленные на основе донорской сыворотки (n=10).

Влияние матрицы оценивали по воспроизводимости методик определения фенобарбитала, карбамазепина и ламиктала с использованием результатов анализа рабочих (реальных) проб (n=20).

Правильность метода оценивали методом добавок при количестве параллельных определений для каждой концентрации не менее 5.

Линейность метода для каждого ЛВ оценивали в интервале рабочих концентраций.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Как было нами отмечено в Главе 2, длина хроматографических колонок, используемых в ТЛМ, варьируется от 100 до 250 мм, а их внутренний диаметр составляет 4,0-4,6 мм. При этом в настоящее время около 50% разделений в ТЛМ выполняется на колонках длиной 100-150 мм. Применение коротких колонок – один из возможных путей снижения стоимости анализа за счет сокращения его длительности и уменьшения расхода ПФ [16-18]. Уменьшение диаметра колонки при сохранении нагрузки на сорбент приводит к повышению чувствительности анализа, что, в свою очередь, снижает требования к чистоте растворителей [18].

Очевидно, что одновременное уменьшение длины и диаметра колонки по сравнению со "стандартной" колонкой позволяет получить существенные выгоды [17]. Простой расчет показывает, что применение колонки размером 2х75 мм взамен традиционной (4,6х250 мм) в 10–20 раз снижает расход растворителей и во столько же раз повышает чувствительность определения.

ВЭЖХ на колонках 2х75 мм мы считаем оптимальным масштабом для целей ТЛМ. Дальнейшее уменьшение колонки до размеров капиллярной представляется нецелесообразным, так как ее нельзя использовать в сочетании со стандартным аналитическим хроматографическим оборудованием (инжекторы, насосы, ячейка детектора), оборудование, специально разработанное для капиллярной ВЭЖХ, пока слишком дорого и поэтому мало пригодно для рутинного анализа. Отметим также, что выигрыш в чувствительности определения и экономия растворителей при переходе от колонок диаметром 2 мм к колонкам диаметром 1 мм и менее, становятся уже не такими заметными.

Для определения лекарственных веществ в ТЛМ используются обращенные фазы С8 и С18 различных торговых марок, синтезированные на основе силикагеля.

Известно, что практически все ОФ, даже при условии "одинаковости" их нормируемых характеристик, могут существенно различаться по селективности.

Для оценки пригодности конкретных ОФ нами совместно с М.О.Родинко и И.Н.Азаровой было исследовано 7 сорбентов (частицы сферической формы с диаметром 5 мкм), некоторые характеристики которых приведены в таблице 3.

Таблица 3. Некоторые характеристики исследованных ОФ Nucleosil® 300-5 C Nucleosil® 100-5 C Nucleosil® 100-5 C18 AB Nucleosil® 100-5 C18 РАН Kromasil® 100-5 C Nucleosil® - торговая марка фирмы "Macherey-Nagel" (Германия).

Kromasil® - торговая марка фирмы "EKA Chemicals" (Швеция).

*)Данных нет.

Все ОФ были упакованы в колонки 2х75 мм и было изучено их поведение в бинарном элюенте с высоким содержанием воды. Для этого в режиме градиентного элюирования записывали хроматограммы экстракта черного чая, содержащего большое количество гидрофильных веществ. Показано, что градиентное элюирование с начальной концентрацией ацетонитрила 2% возможно лишь для двух фаз – Nucleosil 100-5-C18 (рис. 1 Г) и Nucleosil 300-5-C8 (рис. 2 В). Остальные сорбенты при таком высоком содержании воды в ПФ "коллапсировали". Это явление характерно для фаз с высоким содержанием углерода – в данном случае ими были полимерные сорбенты Nucleosil 100-5-C18 AB, Nucleosil 100-5-C18 PAH и мономерный сорбент Kromasil 100-5-C18 с высокой степенью прививки радикалов С18 (табл. 3). Содержание углерода для сорбентов Kromasil 100-5-C4 и Kromasil 100-5-C8 значительно ниже, но "полный" эндкеппинг, декларируемый для сорбентов этой марки, также способствует их склонности к коллапсу. Снижение содержания воды в ПФ с 98 до 90% в начальной точке градиента лишь частично "снимает" коллапс сорбента Kromasil 100-5-C18 (рис. 2Г).

Nucleosil 100-5 C Сравнение времен удерживания основных пиков гидрофильных соединений, на колонках с сорбентами Nucleosil 300-5-C8 и Nucleosil 100-5-C18 (рис. 1Г и рис. 2В) позволяет сделать вывод о более высокой селективности сорбента Nucleosil 100-5C18, что обусловлено более высокой его емкостью. В связи с этим в дальнейшей работе мы использовали именно фазу Nucleosil 100-5 C18.

Kromasil-100-5-C4 Kromasil-100-5-C Kromasil-100-5-C Как было отмечено в Главе 2, важнейшей характеристикой используемой ОФ поверхности сорбента, взаимодействие которых с исследуемыми соединениями нежелательно. Экранирование остаточных силанольных групп достигается как "эндкеппингом" неподвижной фазы, так и путем закисления подвижной фазы в сочетании с повышением ее ионной силы.

Выбранный нами сорбент Nucleosil 100-5 C18 является эндкеппированным, то хроматографические пики основных соединений на таком сорбенте должны быть симметричными. Для проверки этого предположения нами была записана хроматограмма специального 8-компонентного (тестового) раствора (рис. 3). Два его компонента – прозерин и трифтазин (структуры приведены в табл. 4) – неэкранированных силанольных групп сорбента.

Бромид-анион Колонка: 2x75 мм; Nucleosil 100-5 C18.

Элюент А: 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3. Элюент Б: ACN.

Градиент: линейный; 4000 мкл от 5 до 100%Б; 300 мкл 100%Б.

Скорость потока: 100 мкл/мин. Температура: 40oC. УФ-детектор: 210 нм.

Объем пробы: 5 мкл симметричных пиков. Коэффициенты асимметрии, рассчитанные на уровне 10% высоты пиков (А10%) равны 1,15 (прозерин) и 1,19 (трифтазин). Величины А10%, близкие к единице, свидетельствуют об отсутствии значимых ионообменных взаимодействий. Отметим, что хорошая симметрия пиков обусловлена также присутствием в ПФ перхлората лития, о котором будет говорится в следующем разделе. Таким образом, нами был сделан вывод, что ОФ Nucleosil 100-5 C взаимодействовать с открытыми силанольными группами сорбента.

выполняется при рН3 и причины этого обсуждены в Главе 2. При длительной эксплуатации колонки с ОФ при таком значении рН существует реальная вероятность, что в течение времени за счет отщепления от силикагеля радикалов С18 на поверхности сорбента будут образовываться свободные силанольные группы. Для того, чтобы заранее подавить эффект "силанолов", мы увеличили ионную силу ПФ путем введения в нее перхлората лития.

Перхлорат лития в составе подвижной фазы используется довольно редко, хотя авторы многих работ отмечают его способность подавлять ионообменные взаимодействия в растворе и сорбцию аминов на силанольных группах [30, 31, 93, 94]. Выбор оптимальной концентрации LiClO4 в ПФ выполнен нами совместно с М.О.Родинко экспериментальным путем. Для этого в качестве тестовых выбрано веществ, формулы которых приведены в табл. 4.

Концентрация LiClO4 в водной части ПФ изменялась от 0 до 0,5 М.

Зависимости объемов удерживания и ширины пиков на половине их высот от концентрации LiClO4 приведены на рис. 4 и 5. Из этих рисунков видно, что изменение концентрации LiClO4 заметно влияет на подвижность только двух соединений этой тестовой смеси, которые являются аминами.

Увеличение объемов удерживания прозерина и трифтазина можно связать с образованием слабогидрофобных нейтральных ионных пар аминов с анионом ClO4. Подвижности протонированного в этих условиях менее, чем на 50% метанитроанилина и незаряженных орто-нитроанилина и уридина не зависят от концентрации LiClO4. Изменение концентрации LiClO4 не влияет также и на подвижность бромид-аниона, который в этой системе служит маркером свободного объема колонки. Резкое уменьшение полуширины пика для уридина, прозерина и трифтазина наблюдается при изменении концентрации перхлората лития от 0 до 0,2 М.

Изменение полуширины пика для орто- и мета-нитроанилинов и бромида не отмечено. Уменьшение полуширины пика аминов можно объяснить способностью перхлората лития подавлять ионообменные взаимодействия.

Таким образом, нами показано, что концентрация перхлората лития, равная 0,2 М, достаточна для подавления ионообменных взаимодействий и получения симметричных пиков, и, тем самым, может считаться оптимальной. Концентрация ацетонитрила в ПФ и режим элюирования (изократический или градиентный) обсуждаются в последующих разделах.

Таблица 4. Структурные формулы тестовых соединений.

4.4. Выбор условий хроматографического определения.

При работе с УФ-детектором длина волны определяется, исходя из УФ-спектра определяемого соединения. Чаще всего такой длиной волны является длина волны, соответствующая максимальному поглощению раствора вещества или близкая к ней. Большая часть изучаемых ЛВ поглощает только в области коротких длин волн и длина волны детектирования для них обычно составляет 210 нм [95-102].

Рис. 4. Зависимость объемов удерживания компонентов тестовой смеси от Вальпроевая кислота не поглощает в УФ-области спектра и ее определение выполняют в виде производных [103, 104]. В этом случае длина волны детектирования зависит от поглощения самого производного.

Нормированные УФ-спектры ЛВ приведены в Приложении 3. Длины волн максимального поглощения и детектирования приведены в таблице 5. В качестве базовой для всех соединений выбрана длина волны, близкая к длине волны максимального поглощения, за исключением метотрексата и клоназепама. Для этих соединений, имеющих вторые максимумы в длинноволновой области, в качестве базовой были выбраны длины волн =300 нм для метотрексата и =310 нм для клоназепама.

Рис. 5. Зависимость полуширины пика от концентрации LiClO4.

Детектирование ЛВ в длинноволновой области позволяет минимизировать мешающее влияние эндогенных соединений плазмы крови и такой прием достаточно часто используется в ТЛМ [44, 70, 105]. Кроме этого, детектирование карбамазепина в случае комплексной терапии.

Таблица 5. Длины волн максимального поглощения и детектирования определяемых соединений. Растворитель: MeCN- 0,2 М LiClO4 (pH 3).

Определяемое соединение Вальпроевая кислота (в виде Спектральные отношения для всех определяемых соединений, рассчитанные как отношение площадей пиков, зарегистрированных при длинах волн х и баз, приведены в Приложении 3.

Таким образом, выбранные нами длины волн позволяют определять каждое из исследуемых соединений на длине волны максимального поглощения или близкой к ней. Дополнительные длины волн используются для расчета спектральных отношений, применение которых для идентификации пиков существенно повышает надежность идентификации пиков на хроматограмме.

Противосудорожные препараты (ПЭП). Индивидуальные соединения определяют, как правило, с применением бинарных ПФ, состоящих из ацетонитрила (метанола) и буферного раствора. рН буферного раствора обычно находится в интервале 3-7 [70, 98-100, 106]. При рН выше 4 наиболее сильно проявляются взаимодействия соединений основного характера с остаточными силанольными группами сорбента, поэтому для подавления этих взаимодействий в ПФ добавляют 0,1-0,5% триэтиламина (ТЭА) [105, 107, 108] или используют специальные сорбенты C18 [70]. При одновременном определении нескольких ПСП используются трех- или даже четырех-компонентные ПФ, состоящие из метанола, ацетонитрила, буфера и ТЭА [101, 102, 108].

Бинарный элюент состава ацетонитрил - 0,2 М LiClO4 (рН 3), предлагаемый в данной работе, позволяет хроматографировать все определяемые соединения в виде симметричных пиков на "обычном" обращено-фазном сорбенте Nucleosil 100C18, что свидетельствует об отсутствии значимых взаимодействий ПСП с остаточными силанолами силикагеля в данном элюенте. Кроме этого, LiClO хорошо растворим в ацетонитриле и не поглощает в УФ-области спектра, что делает его удобным при проведении градиентного элюирования.

Изократическое элюирование, как уже было нами отмечено в Главе 2, является более экономичным и поэтому более предпочтительным при определении одного соединения. В таблице 6 приведено содержание ацетонитрила в ПФ, значения коэффициентов емкости (k) для данной концентрации ацетонитрила и значения коэффициентов асимметрии. Хроматограммы стандартных растворов ПСП, записанных в нижеприведенных условиях, приведены в Приложении 3. Пики всех определяемых соединений в данных условиях симметричны; коэффициенты А10% составляют 1,02 - 1,15.

Концентрацию ацетонитрила в ПФ выбирали таким образом, чтобы было достигнуто полное отделение определяемого ПСП от эндогенных компонентов сыворотки крови при минимальном времени анализа. Коэффициенты емкости в выбранных условиях находятся в интервале 4-6, т.е. длительность определения одного соединения не превышает 10 минут.

Таблица 6. Содержание MeCN в ПФ и значения коэффициентов емкости (k).

Гексамидин Градиентное элюирование мы использовали при одновременном определении нескольких ПСП. При проведении комплексной терапии применяют одновременно до трех ПСП в различных сочетаниях. При определении гексамидина, активным метаболитом которого является фенобарбитал, мы также использовали градиентное элюирование. На рис. 6 приведена хроматограмма стандартного раствора шести ПСП.

Для разделения был выбран линейный градиент ацетонитрила от 10 до 30% за 2000 мкл, 30% 1000 мкл. Эти условия элюирования, например, позволяли определять любые сочетания ПСП, применяемые в практике Иркутской Государственной Областной детской клинической больницы.

Метотрексат (МТХ). Метотрексат – гидрофильное соединение, которое может существовать в непротонированной или протонированной формах или в виде цвиттер-иона, в зависимости от рН растворителя (рКа 3,36; 4,70; 5,71).

Рис. 6. Хроматограмма стандартной смеси ПСП.

Колонка: Нуклеосил 100-5 С18, 2 x 75 мм.

Элюенты: А- 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Б- MeCN Градиент: линейный; 2000 мкл от 10 до 30%Б. Скорость потока: 150 мкл/мин.

Температура: 55oC. УФ-детектор: 210, 220, 230, 240 нм.

Проба: 2 мкл стандартного раствора противосудорожных препаратов:

Определение МТХ на обращенной фазе проводится обычно в бинарных системах МеCN-буфер (рН 2,6-6,0) [109-111]. Для увеличения удерживания в состав ПФ вводят тетраалкиламмоний в нейтральной среде [112, 113] или гексансульфокислоту в кислой среде [114] (ион-парная хроматография). В предложенном нами элюенте МТХ хроматографируется симметричным пиком с коэффициентом асимметрии 1,2 (рис. 7-I) в отсутствии ион-парного агента. Для определения МТХ в сыворотке крови был выбран режим градиентного элюирования. На рис. 7. приведены хроматограммы стандартного раствора МТХ в режиме изократического (I) и градиентного (II) элюирования. При близких временах удерживания (12 мин) высота пика МТХ в режиме градиентного элюирования примерно в 3,3 раза выше, так как концентрация ацетонитрила в ПФ в момент выхода пика выше (17% Б), чем при изократическом элюировании, где она составляет 10% Б. В данном случае градиентное элюирование обеспечивает большую чувствительность определения МТХ, что является важным при проведении фармакокинетических исследований.

Рис. 7. Хроматограммы стандартного раствора метотрексата в режиме изократического (I) и градиентного (II) элюирования.

Колонка: Нуклеосил 100-5 С18, 2 x 75 мм.

Элюенты: А- 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Б- MeCN.

I- 10% Б; II-- линейный градиент, 2200 мкл от 5% до 20% Б; 500 мкл 20% Б Скорость потока: 150 мкл/мин. Температура: 40oC. УФ-детектор: =300 нм.

Проба: 2 мкл стандартного раствора метотрексата в воде (0,5 мг/мл).

Циклоспорин А – циклический пептид, содержащий 11 остатков амино-кислот.

Хроматографическое определение на обращенной фазе выполняется в двух- или трехкомпонентных ПФ, состоящих из ацетонитрила, метанола и воды или буфера.

рН буферного раствора изменяется от 3,5 до 6,5 [115-116].

симметричным пиком с коэффициентом асимметрии А10%=1,09 (Приложение 3).

Применение градиентного элюирования позволяет повысить чувствительность определения циклоспорина А в 2 раза:

Режим элюирования ТR, мин Как отмечалось в Главе 2, ранее вопросам термостатирования не уделялось большого внимания и большинство работ в ТЛМ выполнялось обычно без термостатирования колонки. К настоящему времени показано, что термостатирование колонки является необходимым условием достижения хорошей воспроизводимости времен удерживания [20]. Кроме того, работа при повышенной температуре колонки позволяет уменьшить вязкость ПФ, снизить давление в колонке и повысить эффективность разделения. В данной работе практически все разделения мы проводили при 40°С, но в ряде случаев для достижения требуемого разрешения пиков температуру варьировали.

Разделение карбамазепина и дифенина. Карбамазепин и дифенин, сочетание которых часто используется на практике при лечении некоторых видов эпилепсии, можно разделить при температуре хроматографической колонки 40°С, только используя ПФ с низким содержанием ацетонитрила. Это снижает чувствительность определения, удлиняет время анализа и не позволяет одновременно определять другие ПСП. Для выбора условий, при которых достигается полное разделение карбамазепина и дифенина в присутствии других ПСП, наиболее часто применяемых при комплексном лечении, была исследована зависимость удерживания шести противосудорожных препаратов от температуры колонки.

При повышении температуры колонки времена удерживания веществ, как правило, уменьшаются. Эта зависимость отмечена для всех шести исследуемых ПСП (табл. 7).

Относительное удерживание обычно также уменьшается при повышении температуры колонки, что отмечено, например, для пары "фенобарбиталламиктал". Для пары "дифенин-карбамазепин" зависимость обратна - с повышением температуры относительное удерживание увеличивается (рис. 8). В результате проведенных исследований показано, что оптимальной температурой для разделения карбамазепина и дифенина в присутствии других ПСП является 55°С (табл. 7). Относительное удерживание () пары "дифенин-карбамазепин" в этих условиях равно 1,16 (рис. 8), а степень разделения Rs=1,6 (при эффектив-ности колонки 3000 т.т). Дальнейшее повышение температуры нецелесообразно, т.к. это приводит к ухудшению разделения для других соединений.

Таблица 7. Зависимость величины фактора емкости (k') ПСП при различных температурах колонки. Элюент: MeCN-0,2 M LiClO4 (pH 3)=25:75.

Рис. 8. Влияние температуры колонки на селективность разделения.

Определение циклоспорина А на ОФ С18 выполняют обычно при температуре 70-80°С [115]. Хроматографирование этого соединения на фазах меньшей емкости (CN- или С6Н6-) выполняют при 50°С и даже при комнатной температуре, в зависимости от используемого сорбента [117-119].

лекарственной формы циклоспорина А, полученные при температурах колонки от 40 до 70°С, упакованной сорбентом Nucleosil 100-5 C18. При температуре 40-60°С циклоспорин А хроматографируется в виде аномально широкого несимметричного пика, который обусловлен существованием стабильных конформеров в полярных растворителях [120] и неполным отделением от сопутствующих компонентов.

Ниже приведены значения полуширины пика циклоспорина А и значение А10% при различных температурах колонки:

При температуре 70°С пик циклоспорина А симметричен и полностью отделен от сопутствующих компонентов. В связи с этим все дальнейшие определения циклоспорина А проводились при температуре 70°С.

Очень гидрофобные соединения, содержащиеся в сыворотке крови, могут сорбироваться на обращенной фазе С18, сокращая время эксплуатации хроматографической колонки. Полное удаление таких веществ из колонки возможно только при введении в состав ПФ таких растворителей, как ацетон, гексан, хлороформ, что, как правило, неудобно [121]. Предварительная обработка пробы гексаном позволяет удалить часть таких соединений. Нами показано, что (сыворотка:гексан=1:5; рНсыв. 7) от 0,8 до 1,2 мг липидов, что составляет 10-20 % от их общего количества. Гексан является неденатурирующим довольно слабым экстрагентом и поэтому в данных условиях извлекает только свободные и слабосвязанные нейтральные вещества липидного характера.

Рис. 9. Хроматограммы стандартного раствора лекарственной формы циклоспорина А (Neoral, Novartis) при различных температурах на колонке Более полное извлечение липидов возможно при экстракции гексаном из кислой среды (рН 2) после осаждения белков ацетонитрилом. Такой прием используется, например, при определении циклоспорина А в сыворотке крови.

На рис. 10 приведены хроматограммы сыворотки крови после осаждения белков ацетонитрилом без обработки гексаном (I) и после экстракции гексаном из нейтральной (II) и кислой среды (III).

I II III

Рис. 10. Хроматограммы сыворотки при различных способах обработки пробы.

I - без обработки гексаном; II – после экстракции гексаном, рН 7;

Колонка: 2x75 мм, Нуклеосил 100-5 С18.

Элюенты: А- 0.2 M LiClO4 - H3PO4, pH 3; Б – MeCN.

Линейный градиент: 2500 мкл от 50% до 80% Б; 1000 мкл 80% Б.

Скорость потока: 150 мкл/мин. Температура: 70oC. УФ-детектор: =200 нм.

Проба: 100 мкл обработанной сыворотки крови.

Более высокое оптическое поглощение элюата на рис. 10(I) и (II) в области 6мин свидетельствует о большей концентрации УФ-поглощающих гидрофобных соединений в хроматографируемом образце. К сожалению, такая обработка пробы невозможна для всех определяемых соединений, в то время как удаление свободных и слабосвязанных нейтральных липидов можно использовать во всех случаях. В таблице 8 приведены эффективность и величина давления на входе колонки и разрешение для двух соединений тестового раствора в зависимости от числа анализов, выполненных на этой колонке. Число анализов, приведенное в левом столбце таблицы, указано для определения ПСП, где объем пробы составляет, чаще всего, 5 мкл (2,5 мкл сыворотки). При определении метотрексата, когда объем пробы составляет 5-20 мкл и число проб будет меньше, мы привели еще и общий объем сыворотки.

Таблица 8. Эффективность, давление на входе в колонку и разрешение.