[ «HLA (класс II) и естественный отбор. Функциональный генотип, гипотеза преимущества функциональной гетерозиготности. ...»
ГНЦ ИНСТИТУТ ИММУНОЛОГИИ ФМБА РОССИИ
На правах рукописи
Болдырева Маргарита Николаевна
HLA (класс II) и естественный отбор. «Функциональный» генотип, гипотеза
преимущества «функциональной» гетерозиготности.
Специальность:
14.00.36 – Аллергология и иммунология
Диссертация на соискание ученой степени Доктора медицинских наук
Научный консультант:
Доктор медицинских наук, профессор Алексеев Л.П.
Москва, 2007 2 Оглавление.
Введение…………………………………………………………………………. 6 Глава 1. Материалы и методы………………………………………………….. 1.1. Характеристика обследованных групп………………………...……...….. 1.1.1. Для раздела «Полиморфизм системы HLA среди популяционных групп России и стран СНГ»……………………………………………………………. Краткая историко-этнографическая справка.………………………. 1.1.1.1.
1.1.2. Для раздела «Репродукция»…………………………………………..…. 1.1.3. Для раздела «Ассоциация генов HLA c сахарным диабетом 1 типа»... 1.2. Лабораторные методы……………………………………………………… 1.2.1. HLA-генотипирование……….……………..……………………………. 1.3. Статистическая обработка данных……..……………………………….… Глава.2. Современные представления о строении и антиген-представляющих функциях главного комплекса тканевой совместимости…………………….. 2.1. Строение главного комплекса тканевой совместимости………………… 2.1.1. HLA класс I……………………………………………………………….. 2.1.1.1. Пептид-связывающий мотив…………………………………………... 2.1.1.2. Пептиды MHC класса I………………………………………………… 2.1.1.3. Процессинг АГ молекулами I класса HLA ………..…………………. 2.1.2. HLA класс II…………………..…………………………………….…….. 2.1.2.1. Структура HLA II и природа связанных пептидов……….………….. 2.1.2.2. Процессинг и презентация АГ молекулами II класса HLA………….. 2.2. Эволюция MHC………..…………………………………………………… 2.3. Полиморфизм и номенклатура HLA………………………………………. Заключение…..………………………………………………………………….. Глава 3. Полиморфизм системы HLA II и популяционные исследования…. 3.1. HLA и демографическая история…………………………………………. 3.2. Полиморфизм системы HLA среди популяционных групп России и стран СНГ………………………………………………………………………………. 3.2.1. Исследование генетического родства 20 исследованных популяций на основании полиморфизма гена HLA II DRB1 и гаплотипов DRB1-DQA1DQB1……………………………………………………………………………. 3.2.2. Исследование генетического родства 20 исследованных популяций и популяций из разных стран мира на основании полиморфизма гена HLA II DRB1……………………………………………………………….……………. 3.3. Селекция HLA полиморфизма……………….……………………………. 3.3.1. Есть ли селекция гена DRB1 в обследованных группах?……………… Заключение………………………………………………………………………. Глава 4. Естественный отбор и HLA II………………………………………… 4.1. Основные принципы естественного отбора………………………………. 4.2. Естественный отбор на индивидуальном уровне…..….………………… 4.2.1. Инфекции …..…………………………………………………………….. 4.2.1.1. Полиморфизм АГ-распознающих сайтов..………………………….. 4.2.1.2. Гетерозиготное предпочтение ………………………………………. 4.2.1.3. Частотно-зависимая селекция ……………………………………….. 4.2.1.4. Варианты генов HLA класса II и инфекции ………………………… 4.2.2. Репродукция………………………………………………………………. 4.2.2.1. Сексуальное предпочтение…………………………………………….. 4.2.2.1.1. HLA гомозиготность и репродуктивный результат среди пар с невынашиванием беременности неясного генеза …………………………… 4.2.2.1.2. Возможные механизмы селекции…………………………………… 4.2.2.2. Селективный блок беременности …………………………………… 4.2.2.2.1. Невынашивание беременности……………………………………… 4.2.2.2.2. Совпадения по гену DRB1 среди пар с невынашиванием беременности неясного генеза…………………………………………………. 4.2.2.2.3. Бесплодие неясного генеза ………………………………………… 4.2.2.3. Репродукция и инфекции ……………………………………………… 4.2.2.3.1. HLA II и нарушение репродукции в результате инфекций …….. 4.2.2.4. Репродукция и аутоиммунные заболевания ………………………. 4.2.2.4.1. Повторные выкидыши, аутоиммунитет и HLA …………………. 4.2.2.4.2. DRB1 среди пар с невынашиванием беременности неясного генеза.…………………………………………………………………………. Заключение…………………………………………………………………….. Глава 5. Аутоиммунные заболевания как возможный механизм действия отбора на HLA II………………………………………………………………. 5.1. Ассоциации генов HLA класса II и аутоиммунных заболеваний……… 5.1.1. Заболевания эндокринной системы …………………………………… 5.1.2. Заболевания соединительной ткани ……………………………...…… 5.1.3. Заболевания желудочно-кишечного тракта…………………………… 5.1.4. Заболевания кожи ………………………………………………………. 5.1.5. Полиорганные поражения ……………………..……………………… 5.2. Ассоциация генов HLA c сахарным диабетом 1 типа, «классическим»
аутоиммунным заболеванием ………………………………………….……. 5.2.1. Исследование ассоциаций вариантов гена DRB1 c сахарным диабетом типа в 11 популяционных группах России и стран СНГ……..…………….. Заключение…………………………………………………………………….. Глава 6. Инфекции и аутоиммунитет ………………………….…………… 6.1. Сравнение DRB1 маркеров чувствительности и устойчивости к аутоиммунным и инфекционным заболеваниям …………………………… 6.2. Роль инфекций в этиологии аутоиммунных заболеваний (сахарного диабета 1 типа)…………………………………………………………………. 6.3. Механизмы микробной индукции аутоиммунных заболеваний.…….. 6.3.1. Молекулярная мимикрия……………………………………………….. 6.3.2. «Случайная активация» (bystander activation) ………………………. 6.3.3. Персистенция вирусной инфекции ……………………………………. Заключение …………………………………………………………………….. Глава 7. «Функциональный» генотип. Гипотеза преимущества «функциональной» гетерозиготности ……………………………………… 7.1. Что такое «функциональный» генотип и «функциональная»
гетерозигота? ……………………………….………………………………… 7.2. Гипотеза преимущества «функциональной» гетерозиготности …….… 7.3. Возможные механизмы реализации HLA генетической предрасположенности ………………………………………………………… Выводы ………………………………………………………………………… Библиография …………………………………………………………………..
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.Исследования полиморфизма главного комплекса тканевой совместимости человека (HLA) проводятся с середины 60-х годов, когда методами серологического типирования было выявлено, что в разных популяциях определяются разные наборы вариантов HLA антигенов. Первое Международное Рабочее Совещание по изучению HLA (IHWS) состоялось в 1964 году в США. С этого момента в рамках Совещания десятки лабораторий из разных стран мира стали заниматься изучением полиморфизма системы HLA. Эти исследования сопровождались интенсивным международным обменом типирующими сыворотками, что привело к быстрому накоплению сведений о широчайшем полиморфизме этой системы. В 1972 году пятое Рабочее Совещание уже полностью было посвящено этому направлению.
В 1967 году Amiel J.C. [56] на третьем Рабочем Совещании впервые сообщил об обнаруженной им связи антигенов HLA с развитием болезни Ходжкина. Это сообщение послужило началом развития направления «HLA и болезни». Особенно актуальными эти исследования стали после открытия Цинкернагелем и Догерти [525] иммунного распознавания вирусных антигенов Т-лимфоцитами «в контексте» белков главного комплекса тканевой совместимости хозяина, в результате которого стало ясно, что гены, кодирующие HLA белки, являются, по сути, генами иммунного ответа, определяя направление процессов, происходящих в иммунной системе. В последующем целый ряд исследователей получили многочисленные доказательства роли HLA в развитии заболеваний, связанных с иммунной системой: инфекционных, аутоиммунных и онкологических [460].
В 80-х годах исследователи обратили внимание на связь антигенов HLA и репродуктивные проблемы. Целый ряд работ был посвящен изучению совпадений по HLA антигенам среди пар с необъяснимым бесплодием [1, 2, 118, 120, 126, 500]. В 90-х годах группа датских исследователей во главе с Christiansen O.B. нашла взаимосвязь антигенов HLA класса II и репродуктивными потерями [107] у женщин. С тех пор продолжается накопление фактов о роли HLA в процессах репродукции.
Прогрессу в области исследований популяционного полиморфизма способствовало открытие K Mullis в 1983 г полимеразной цепной реакции (ПЦР) [333] и развитие на ее основе новых методов и технологий HLA генотипирования, которые стали широко использоваться зарубежными исследователями системы HLA.
Однако в России до начала 90-х годов практически все исследования полиморфизма системы HLA выполнялись только серологическими методами и касались, главным образом, изучения распределения антигенов I класса, что было связано с отсутствием в России доступных для исследователей качественных типирующих сывороток к антигенам II класса.
Именно поэтому подавляющее большинство отечественных публикаций было посвящено изучению распределения антигенов HLA класса I.
Популяционные исследования антигенов HLA были проведены среди народов Сибири и Дальнего Востока [16,21,33,35,40,165]. Ряд публикаций касался изучения некоторых финно-угорских народов, проживающих на территории России [15,37]. В то же время было очевидно, что популяционное разнообразие населения России, занимающей огромную евразийскую территорию и генетически очень разнообразную, было изучено недостаточно. Кроме того, к моменту начала исследований уже было установлено, что II класс HLA определяет значительную часть генетической предрасположенности к развитию ряда заболеваний, связанных с иммунной системой [136,320,378,438].
В начале 90-х годов сотрудники отдела иммуногенетики (рук.
профессор Л.П.Алексеев) ГНЦ Института иммунологии ФМБА России в рамках 11 IHWS выполнили популяционное исследование HLA класса II генотипирующими реагентами, предоставленными организаторами Международного Совещания [45].
В 1996г. Трофимов Д.Ю. [36] разработал метод мультипраймерной ПЦР и реагенты для типирования полиморфных генов HLA класса II.
Разработка метода и создание генотипирующих реагентов позволили коллективу сотрудников отдела иммуногенетики Института реализовать проведение настоящего исследования.
Цель исследования.
Изучить популяционное разнообразие и генетическое родство ряда этнических групп России и стран СНГ на основе типирования генов HLA класса II (DRB1,DQA1,DQB1). Оценить значение генов HLA (класс II) для развития аутоиммунных заболеваний. Предложить и обосновать гипотезу об участии генов HLA (класс II) в естественном отборе.
Задачи.
1. Определить частоты вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQADQB1 в 20 популяционных группах России и стран, граничащих с Россией, определить степень их генетического родства между собой и по отношению к другим народам мира.
2. Определить частоты гена DRB1 в 11 популяционных группах больных сахарным диабетом 1 типа, определить HLA DRB1 маркеры чувствительности и устойчивости к развитию заболевания.
невынашивании беременности.
предложить и обосновать гипотезу об участии генов HLA II в естественном отборе на индивидуальном и популяционном уровне.
Научная новизна.
Впервые получены данные о частотном распределении вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 в 20 популяционных группах (русские из Архангельской, Костромской, Смоленской, Вологодской областей;
белорусы из Витебской, Брестской, Гомельской областей; украинцы из Львовской и Хмельницкой областей, марийцы, удмурты, татары, гагаузы, армяне, ненцы, саамы, казахи, калмыки, тувинцы, буряты), на основании частот вариантов гена DRB1 и гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 определены генетические расстояния между исследованными популяциями, на основании частот вариантов гена DRB1 определены генетические расстояния между исследованными популяциями и популяциями из разных стран мира.
Впервые получены данные о частотном распределении гена DRB среди больных сахарным диабетом 1 типа в 11 популяционных группах (русские из Москвы, Архангельской, Вологодской областей и Удмуртии;
татары, мари, удмурты, узбеки, тувинцы, калмыки и буряты), определены генетические маркеры предрасположенности и устойчивости к заболеванию по каждой популяции, а также общие маркерные генотипы, ассоциированные с чувствительностью и устойчивостью к развитию сахарного диабета 1 типа.
Впервые получены данные об отрицательном значении гомозиготности по генам DRB1 для репродуктивного успеха у мужчин.
На основании данных полученных в результате проведенных исследований и данных литературы предложена новая концепция «функционального» генотипа, в котором «функционально» гомозиготный генотип может состоять из разных вариантов гена DRB1, ассоциированных с функционально сходным проявлением и гипотеза преимущества «функциональной» гетерозиготности.
Научно-практическая значимость.
Данные о частотном распределении гена DRB1 и гаплотипа DRB1DQA1-DQB1 20 популяционных групп России и стран, граничащих с Россией, имеют самостоятельное популяционно-генетическое значение и могут быть использованы как база данных для региональных, федеральных и международных антропологических исследований, также в качестве контрольных для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих регионах.
Данные о частотном распределении гена DRB1 среди жителей г.Москвы, Удмуртии, принадлежащих к русской популяции, могут быть использованы в качестве контрольных для исследований по проблеме «HLA и болезни» в соответствующих регионах.
Данные о степени генетического родства исследованных популяций, можно использовать для оптимизации банка неродственных доноровдобровольцев гемопоэтических стволовых клеток по количественному и популяционному составу, а также для лучшего подбора пар донор-реципиент при органных трансплантациях. Новый подход к оценке генетической предрасположенности к развитию аутоиммунных заболеваний на основании оценки DRB1 генотипа можно использовать для дифференциальной диагностики и генетического прогнозирования в семьях больных аутоиммунными заболеваниями.
гипотеза «функциональной» гетерозиготности могут служить вкладом в теорию иммуногенетики и иммунологии.
Положения, выносимые на защиту.
Полиморфизм генов HLA II класса был использован для определения генетического родства 20 популяционных групп России и стран. Было установлено, что в большинстве изученных популяционных групп действуют балансирующие формы естественного отбора, в результате которых количество гетерозигот по генам HLA класса II превышает ожидаемое при нейтральных вариантах селекции. Такие формы селекции, сохраняя полиморфизм системы генов HLA, позволяют использовать ее для изучения степени генетического родства популяций и геногеографических исследований.
Это удивительно потому, что гены HLA II являются генами иммунного ответа, представляя чужеродные пептиды в составе HLA/пептидного комплекса антиген-распознающим структурам CD4+ Т клеток. К тому же существуют убедительные доказательства участия генов HLA II в развитии инфекционных и аутоиммунных заболеваний (приводящих также и к репродуктивным проблемам), то есть, очевидно, что гены HLA на индивидуальном уровне находятся под давлением факторов окружающей среды, участвуя в естественном отборе. Тем не менее, варианты генов, ассоциированные с заболеваниями, продолжают циркулировать в популяциях.
В результате анализа собственных данных об ассоциациях вариантов гена DRB1 с развитием и устойчивостью к СД1, полученных на популяционных группах, а также данных литературы об ассоциациях генов HLA класса II с разными аутоиммунными и инфекционными заболеваниями, было сделано предположение о двойной физиологической функции вариантов генов HLA класса II, ассоциированных с аутоиммунными заболеваниями – это ассоциация с хорошим ответом на инфекции и наоборот, вариантов, ассоциированных с устойчивостью к развитию патологического аутоиммунного процесса – с чувствительностью к развитию тяжелых инфекций.
благоприятных условиях в популяции происходит накопление «средних» и «слабых» по уровню иммунного ответа генотипов при постоянном отсеве «сильных» по уровню иммунного ответа генотипов, предрасполагающих (при наличии и других факторов) к аутоиммунным заболеваниями и ограничению репродукции. Носители «слабых» генотипов не выживают в период выраженных инфекционных нагрузок и при неблагоприятных условиях жизни. «Средний», «функционально» гетерозиготный генотип – наиболее выгоден для индивидуума, при этом в популяции сохраняются и «слабые» и «сильные» варианты генов HLA.
Микроорганизмы – главный фактор эволюции иммунной системы, у носителей «слабых» генотипов вызывают гибель или развитие вялотекущих хронических процессов, приводящих к нарушению функции, у носителей «сильных» генотипов – являются триггером развития чрезмерной разрушительной воспалительной реакции или аутоиммунных патологических процессов.
Глава 1. Материалы и методы 1.1. Характеристика обследованных групп 1.1.1. Для раздела «Полиморфизм системы HLA среди популяционных групп России и стран СНГ»
В ходе работы были обследованы 2525 здоровых (не имеющих тяжелых хронических заболеваний и жалоб на момент обследования), взрослых, не связанных кровным родством представители двадцати этнотерриториальных групп, проживающих в различных регионах России, Украины, Белоруссии и Казахстана. Количество обследованных индивидуумов, их этническая принадлежность представлены в таблице 1.1.
Исследования проводились сотрудниками отдела иммуногенетики в период 1994 -2004 годов.
исследования, были получены из разных источников. Биоматериал от русских из Смоленской области, белорусов из Витебской, Брестской, Гомельской областей, украинцев из Хмельницкой и Львовской областей, марийцев из республики Марий Эл, гагаузов из республики Молдова, полученный в результате этнографических и медико-генетических экспедиций, предоставила д.б.н. Балановская Е.В. (Медико-генетический научный центр РАМН); биоматериал, от большеземельских ненцев (Ненецкий Автономный Округ), кольских саамов (п.Ловозеро, Мурманская область), русских из Архангельской области, полученный в ходе медикогенетических экспедиций, предоставлен д.м.н. Евсеевой И.В. (Северный госмедуниверситет, г.Архангельск), биоматериал от удмуртов, собранный в различных районах республики Удмуртия предоставил предоставили к.м.н.
Поздеева О.С. и Ганичева Л.Л. (Ижевская государственная медакадемия);
биоматериал от русских из Костромской области предоставлен Костромской областной больницей (Целинская И.Н.); биоматериал от русских из Вологодской области предоставлен Вологодской областной больницей (Кашинин М.Н.); биоматериал от татар (потомков переселенных в годы отечественной войны из Казани) был собран в Кировской области и предоставлен переливания крови); биоматериал от тувинцев из разных районов республика Тыва предоставлен д.м.н. Осокиной И.В. (Институт медицинских проблем Севера СО РАМН, г.Красноярск).
Численный и популяционный состав обследованных популяций Сотрудниками Института иммунологии ФМБА России был собран биоматериал от казахов (Актюбинская область республики Казахстан), бурят (Гусино-Озерского района Бурятии), калмыков (из разных районов республики Калмыкия) и армян (республика Армения).
Каждая из обследованных популяций представлена только коренным сельским населением, относящимся к целому ряду населенных пунктов и поэтому репрезентативно представляющим данный этнос. В выборку включались только те неродственные между собой индивиды, все бабушки и дедушки которых относятся к данному этносу и родились в пределах данной популяции.
1.1.1.1. Краткая историко-этнографическая справка.
Русские – К началу 19 века сложились две крупные этнографические группы – севернорусская и южнорусская. Они различались типом жилища, одеждой, особенностями языка, формой ведения хозяйства. Севернорусская группа занимала территорию от реки Волхов на западе до реки Мезень и верховьев Вятки и Камы на востоке (современные Карелия, Новгородская, Архангельская, Вологодская, Ярославская, Ивановская, Костромская, часть Тверской и Нижегородской областей. Южные великорусы – жители черноземной полосы России от бассейна реки Десна на западе до реки Сура (приток Волги) на востоке (современные Рязанская, Пензенская, Калужская, Тульская, Липецкая, Тамбовская, Воронежская, Брянская, Курская, Орловская, Белгородская области). Междуречье Оки и Волги (современные Московская, Владимирская, Калужская, Рязанская, Пензенская, часть Тверской и Нижегородской областей) оказались «переходной» зоной, в культуре которой скрещивались и видоизменялись южнорусские и севернорусские черты. [23].
Белорусы вместе с русскими и украинцами относятся к восточным славянам. При общей однородности белорусской культуры выделяются шесть историко-этнографических районов: Поозерье (север), Поднепровье (восток), Центральная Белоруссия, Понеманье (северо-запад), Восточное Полесье и Западное Полесье. [23].
Украинцы.
территорий Украины, их географические различия обусловили возникновение историко-этнографических районов Украины: центральное Поднепровье, Юг, Подолия, Карпаты и Слобожанщина [23].
Марийцы – финно-угорский народ. Формирование марийского этноса происходило в 1 тыс.н.э. в Волго-Вятском междуречье на основе финноугорских племен пермско-волжской этнолингвистической общности. После нашествия монголотатар земли марийцев вошли в состав Золотой Орды, а затем Казанского ханства. Этническое развитие протекало в тесном контакте с соседними народами – волжскими болгарами, чувашами, татарами и впоследствии – с русскими. [24].
среднеевропейский, иногда с уральским или кавказским компонентом. Этнос удмуртов сложился на основе слияния индоиранских, угорских, тюркских и славянских племен, населявших в древности территорию Приуралья [24].
Татары (волго-уральские) – татарский народ региона Среднего Поволжья и Приуралья формировался путем консолидации различных, прежде всего, тюркоязычных, отчасти и отюреченных финно-угроязычных компонентов. В состав татар вошли также скифы, аланы и другие народы [24].
Гагаузы – говорят на гагаузском языке тюркской группы алтайской семьи. Вероятнее всего основу гагаузов составили тюркоязычные кочевники (огузы, печенеги, половцы), европейские исследователи рассматривали в качестве вероятных предков гагаузов - тюркоязычных протоболгар, пришедших на Балканы с берегов Волги [25].
Армяне – говорят на армянском языке, образующем отдельную группу индоевропейской семьи. Становление древнеармянской народности происходило в рамках государства Урарту. В непрерывной борьбе армян с различными завоевателями (персы, римляне, парфяне, арабы, туркисельджуки и др.) укреплялась и развивалась армянская народность [26].
Ненцы - коренные жители Севера и северо-востока России. Район большеземельской тундры, административно относящийся к Ненецкому Автономному Округу, территориально ограничен бассейнами рек Печора, Кара и Уса. Антропологи предполагают, что ненцы являются представителями переходной уральской расы, имея в своем происхождении несколько этнических компонентов: восточная группа аборигенов с побережья Ледовитого океана, самодийские племена с северных склонов Саянского нагорья, энецкие и угорские группы, позднее влившиеся в состав ненцев [18].
Саамы - этническая группа коренных жителей северо-запада Европы, проживают в северных частях Норвегии, Швеции, Финляндии, а также в России с максимальной концентрацией на Кольском полуострове в поселке Ловозеро (940 человек). Саамы относятся к лапоноидному (субарктическому) антропологическому типу, сформировавшемуся как результат древней метисации европеоидной и монголоидной больших рас. По языку саамы входят в финно-угорскую группу, однако часть лексики не находит соответствия среди финно-угорских языков [18].
Казахи. В формировании казахского этноса приняли участие многие древние племена. Антропологи считают, что исходной формой расового типа населения Казахстана начала первого тысячелетия нашей эры считается древне-казахстанский антропологический тип с ярко выраженными чертами большой европеоидной или средиземноморской расы. В последующие эпохи, в результате монгольского нашествия происходит интенсивное смешение рас. Казахи приобретают черты монголоидности [28].
Калмыки – единственный в Европе монголоязычный народ, коренное население Республики Калмыкия. Древняя родина калмыков – Центральная Азия, их предки – монголоязычные племена ойраты, пришли на территорию нынешнего обитания калмыков в конце XVI – начале XVII вв., принеся с собой в Прикаспийские степи развитую кочевую культуру и древнейшую мировую религию – буддизм. Калмыки принадлежат к центральноазиатскому типу большой монголоидной расы и обладают всеми характерными особенностями, присущими монгольским народам [25].
Тувинцы. Республика Тыва расположена на юге Сибири, на границе с Монголией. Коренное тувинское население (карагасы) составляет 210. человек,. Вопрос о происхождении карагасов до сих пор остается открытым.
Это был долгий этнический процесс, протекавший в течение многих веков в Саянах и на сопредельных территориях Южной Сибири. С другими тюркоязычными народами южной Сибири тувинцы составляют коренное население Саяно-Алтайской историко-этнографической области. [27].
Буряты – один из самых многочисленных народов Сибири в целом рассматриваются как представители единого центрально-азиатского расового типа. У бурят устанавливаются признаки сходства с эвенками, которые в монголоидной расе относились к особому байкальскому (общесибирскому типу) расовому типу [27].
1.1.2. Для раздела «Репродукция».
Были обследованы 240 супружеских пар с повторными прерываниями беременности и неудачными ЭКО (экстракорпоральное оплодотворение), проходившими обследование в Центре иммунологии репродукции (98 пар) и лаборатории клинической цитогенетики Медико-генетического научного центра РАМН (142 пары). Контролем служили 74 пары, имеющие детей, обратившиеся в Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН по поводу установления отцовства, которое было подтверждено, и 300 здоровых доноров крови (97 женщин и 203 мужчин) из г. Москвы.
1.1.3. Для раздела «Ассоциация генов HLA c сахарным диабетом типа».
Совместно с сотрудниками Эндокринологического научного центра РАМН были обследованы 6 популяционных групп больных сахарным диабетом типа и соответствующие им контрольные группы, представлявшие собой случайным образом отобранных, здоровых на момент исследования, лиц различной этнической принадлежности: русские из г.Москвы, татары, мари, калмыки, буряты, узбеки. Биоматериал от больных сахарным диабетом 1 типа русских из Архангельской области предоставлен д.м.н.
Евсеевой И.В. (Северный госмедуниверситет, г.Архангельск); русских из Вологодской области предоставлен Кашининым М.Н. (Вологодская областная б-ца); русских из Удмуртии и удмуртов - Ижевской государственной медакадемией (Ганичева Л.Л.), тувинцев - Институтом медицинских проблем Севера СО РАМН (Осокина И.В.).
Численный и популяционный состав больных СД1 и контрольных образцов 1. 2. Лабораторные методы.
1.2.1. HLA - генотипирование.
высаливания по стандартной процедуре [319]. Полученные образцы ДНК сразу использовали для генотипирования, либо хранили при -20°С.
Концентрация ДНК, определенная по флуоресценции с Hoechst 33258 на ДНК-минифлуориметре (Ноеfer, США) составляла в среднем 50-100 мкг/мл.
Общее время процедуры выделения ДНК составляло 30-40 минут.
мультипраймерной полимеразной цепной реакции (ПЦР) [36]. Для типирования генов HLA класса II (DRB1, DQA1, DQB1) использовали наборы HLA-ДНК-Тех (фирма «НПФ ДНК-Технология», Россия).
Полимеразную цепную реакцию проводили в 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл образца ДНК и следующие концентрации остальных компонентов: 0,2 мМ каждого дНТФ (дАТФ, дЦТФ, дТТФ, и дГТФ), 67 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 2,5 мМ MgCl, 50 мМ NaCl, 1 мМ 2меркаптоэтанола, а также 1 единицу термостабильной ДНК-полимеразы.
Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере "МС2" (НПФ "ДНК-Технология", Москва).
Типирование локуса DRB1 проводили в два этапа. Во время первого раунда геномная ДНК амплифицировалась в двух различных пробирках. В первой пробирке использовалась пара праймеров, амплифицирующая все известные аллели гена DRB1 (праймеры DRBsen и DRBal), а во второй – пара праймеров, амплифицирующая только аллели, входящие в группы DR*03, DR*05, DR*06, DR*08 (праймеры DRB38ns и DRBal). В обоих случаях температурный режим амплификации (для термоциклера «МС-2», запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования) был следующим:
Полученные продукты амплификации разводили в 10 раз и использовали на втором раунде.
Для амплификации на втором раунде использовали следующий точного(“precise”) регулирования):
Типирование локуса DQA1 проводилось в два этапа. На первом раунде использовалась пара праймеров, амплифицирующая все специфичности локуса DQA1, а на втором раунде – пары праймеров, амплифицирующие специфичности *0101, *0102, *0103, *0201, *0301, *0401, *0501, *0601. Для проведения амплификации использовали программу, приведенную для амплификатора типа МС2, запрограммированного на объем 10 мкл в режиме активного, быстрого (“fast”) регулирования:
Продукты амплификации первого раунда разводили в 10 раз и использовали на втором раунде по следующей программе в режиме активного, точного(“precise”) регулирования:
Типирование локуса DQB1 также проводилось в два этапа. На первом специфичности локуса DQB1. Температурный режим был следующий:
На втором раунде использовали пары праймеров, амплифицирующих следующие специфичности: *0201, *0301. *0302, *0303, *0304, *0305, *0401/02, *0501, *0502/04, *0503, *0601, *0602/08; продукты первого раунда разводили в 10 раз и проводили амплификацию в следующем температурном режиме:
Проведение электрофореза. В каждую из лунок 3% агарозного геля под буфер отдельным наконечником вносят по 5 мкл окрашенного амплификата.
Электрофорез проводили при напряжении 200-250V. Время проведения электрофореза: после окончания I этапа - 10 минут, после окончания II этапа - 20 минут. После проведения электрофореза гель вынимали из прибора для электрофореза и просматривали на трансиллюминаторе в проходящем ультрафиолетовом свете с длиной волны 254 нм. Окрашивание геля проводили бромистым этидием. Продукт амплификации виден в виде светящейся полосы красно-оранжевого цвета. В качестве маркера длин использовали перевар плазмиды pUC19 рестриктазой Msp I.
1.3. Статистическая обработка данных Определение частот генов. Для определения частот генов DRB1, DQA1, DQB1 и их гаплотипов методом максимального правдоподобия (maximumlikelihood) использовали компьютерную программу «Арлекин» [424], версия 2.1 (URL:http://anthro.unige.ch/arlequin).
Расчет генетических расстояний по М.Нею [340] на основании генных частот вариантов гена DRB1 и гаплотипов генов DRB1-DQA1-DQB проводили при помощи компьютерной программы «DJgenetic», версия 0. (Ю.А.Серегин, Е.В.Балановская). Графически результаты кластерного анализа представлены в виде дендрограмм и графиков многомерного шкалирования по двум осям [17], построение которых проводили с помощью компьютерной программы «Статистика» (версия 6.0).
Тест на гомозиготность Ewens-Watterson. Тест основан на теории выборки нейтральных аллелей Ewens W.J. [158]. Watterson G. [493] показал, что при селективно нейтральном распределении гаплотипических (аллельных) частот, суммарная величина частот аллелей (гаплотипов) (F) будет эквивалентна ожидаемой гомозиготности для диплоидов. Тестирование на селективную нейтральность по Ewens-Watterson для локуса DRB1 было проведено при помощи компьютерной программы «Арлекин» [424], версия 2.1 (URL:http://anthro.unige.ch/arlequin).
Относительный риск (ОР) развития/устойчивости к сахарному диабету типа вычисляли по формуле B.Woolf [32]. Этот показатель означает, во сколько раз чаще встречается заболевание при наличии в генотипе индивидуумов какого-либо варианта HLA генов по сравнению с частотой заболевания у индивидуумов без этого HLA варианта. Значения ОР большие, чем 1, свидетельствуют о том, что конкретный вариант DRB1 гена ассоциирован с развитием заболевания, причем, чем больше величина относительного риска, тем ассоциация более выражена. Значения ОР, меньшие, чем 1, свидетельствуют об ассоциации вариантов HLA генов с устойчивостью к развитию заболевания, причем, чем меньше величина относительного риска, тем ассоциация того или иного варианта гена DRB1 с устойчивостью к развитию заболевания более выражена. Значения ОР, близкие к 1, свидетельствует об отсутствии ассоциаций.
Статистическую достоверность значений ОР определяли по точному двустороннему критерию Фишера без корректировки на количество аллелей [32].
Глава 2. Современные представления о строении и антигенпредставляющей функции главного комплекса тканевой совместимости.
2.1. Строение главного комплекса тканевой совместимости.
В соответствии с современными представлениями, в реализации адаптивного иммунного ответа участвуют рецепторы В клеток (иммуноглобулины), распознающие чужеродные антигены, HLA молекулы главного комплекса тканевой совместимости (MHC) и рецепторы Т-клеток, которые распознают HLA-пептидный комплекс антиген-представляющих клеток (АПК). Распознавание антигена Т-клетками осуществляется при участии двух наборов рецепторов, один из которых включает HLA молекулы I и II класса на антиген-представляющих клетках, а другой - клонально распределенные антигенспецифические Т-клеточные рецепторы, экспрессируемые Т-клетками.
Классические HLA молекулы кодируются шестью различными, гомологичными локусами (HLA-A, B, C, DR, DQ и DP), расположенными на коротком плече 6-ой хромосомы человека [260]. Эта область была названа главным комплексом тканевой совместимости (Major Histocompatibility Complex -MHC), что отражает историческое открытие этого комплекса генов как главного кластера генных локусов, которые контролируют отторжение или приживление аллотрансплантата [58, 441, 442]. Этот аспект биологии HLA клинически чрезвычайно важен, но не отражает физиологическую роль и эволюционное значение генов HLA и их белков.
В соответствии с современными представлениями, HLA (MHC) гены являются «генами иммунного ответа» (Immune Response - IR), функция которых по распознаванию антигенов поначалу не связывалась с MHC [310].
Однако, на сегодняшний день функция «представления» белками MHC антигенов Т-клеткам, обеспечивающая, реализацию специфического иммунного ответа, включая высокоаффинный иммунный ответ, считается основной.
сгруппированы в три класса генов, названные класс I, II и III. Различия этих трех классов генов касаются как структуры, так и функции кодируемых ими белков.
Антиген-представляющие молекулы, кодируемые MHC, относятся к классическим генам классов I и II. Область MHC содержит также ряд генов, презентации их иммунной системе. Класс III генов кодирует различные молекулы, как связанные, так и не связанные с иммунной системой, большинство из которых не участвует в презентации антигена, но включает гены цитокинов и компонентов системы комплемента [70].
большинстве ядерных клеток, в то время как молекулы II класса HLA вне активации ограничиваются специализированными антигенпредставляющими клетками (В-клетки, дендритные клетки, макрофаги).
Уровень экспрессии молекул HLA обоих типов может быть усилен цитокинами, такими как ИЛ-4, -интерферон и ТНФ. Эти цитокины, действуя исключительно на регуляторные области HLA генов, могут индуцировать экспрессию молекул II класса HLA на клетках, которые в норме не экспрессируют эти белки, например эндотелиальные клетки сосудов [309].
Распределение молекул HLA I и II класса на разных клетках отражает их различные роли в иммунном надзоре.
Доминирующее значение молекул HLA в специфическом иммунном ответе проявляется в том, что на сегодняшний день они рассматриваются в качестве основной генетической составляющей аутоиммунитета, опухолевого иммунитета, аллергического ответа и защиты против инфекционных заболеваний [217, 278, 427, 460, 477].
2.1.1. HLA класс I.
Все HLA молекулы I класса - A, B и Cw состоят из тяжелой цепи, связанной с легкой цепью, известной как 2-микроглобулин [73, 74], Рис 1А.
Тяжелая цепь закреплена в мембране и имеет короткий цитоплазматический хвост. Хотя структура генов и общая форма молекул HLA-A, B и Cw похожа, первичные последовательности этих молекул существенно отличаются одна от другой. Все тяжелые цепи молекул I класса HLA-A, B и Cw нековалентно связаны с одинаковой неполиморфной молекулой 2-микроглобулина, которая кодируется на хромосоме 17. Большинство типов клеток вырабатывает избыток 2-микроглобулина, обеспечивая необходимые количества легких цепей для сборки всех молекул I класса, экспрессируемых клеткой. На поверхности большинства ядерных клеток присутствует от до 106 молекул I класса.
Белковые продукты трех генов экспрессируются ко-доминантно (то есть на клетках одновременно экспрессируются продукты материнских и отцовских MHC генов). Уровень поверхностной экспрессии молекул HLACw – ниже, чем продуктов генов HLA-A и HLA-B.
Структура молекул I класса идеально подходит для фиксирования коротких пептидов с целью презентации их Т-клеткам [74, 180]. Рис 2.1(А). Наружные домены 1 и 2 включают две длинные -петли, разделенные щелью, дно которой выполнено -складчатой подложкой. Щель содержит несколько карманов: A, B, C, D, E и F, которые отличаются друг от друга по своим химическим свойствам в соответствии с тем, как отличается одна генетическая форма (аллотип) от другой [180]. - рис.2.2. Все молекулы I класса HLA-A, B и Cw высокополиморфны. Главной зоной структурного полиморфизма молекул HLA класса I является область антиген-связывающей щели [75] - рис.2.3.
Рис.2.1. Трехмерное строение молекул HLA. (А) Молекула HLA-B8 вид сверху (верхний рисунок), вид сбоку (нижний рисунок) – тяжелая цепь I –желтого цвета, микроглобулин – оранжевый; пептид происходит из вируса Эпштейна-Барр. (В) – молекула II класса HLA-DQ8 связывает пептид из глютена. Показаны и цепи разного оттенка синего цвета. Вид сверху (верхний рисунок) и сбоку (нижний рисунок).
Подчеркнем, что пептид выступает за пределы антиген-связывающей щели. [309].
Рис. 2.2. Модель упаковки молекулы I класса человека. Антиген-связывающая щель молекулы содержит 6 главных карманов (A-F), которые определяют специфичность связывания пептидов [309].
Полиморфизм молекул класса I может проявляться в различиях электростатического заряда, гидрофобности и формы щели, что влияет на пептид-связывающие свойства таким образом, что каждый аллель будет связываться с определенным набором подходящих пептидов.
Длина пептидов, связываемых молекулами I класса, обычно составляет 8-10 аминокислот, поэтому концы связанных пептидов помещаются в щели, где они закрепляются сетью водородных связей между остатками тяжелой цепи и свободными амино- и карбоксильными окончаниями пептидов. Это позволяет пептидам с различными сиквенсами быть связанными по концам аналогичным образом различными молекулами I класса.
Рис 2.3. Расположение полиморфизмов в антиген-связывающих щелях молекул HLA. Полиморфные остатки окрашены таким образом, что полиморфизм сайтов окрашенных в красный цвет > синий > зеленый. Подчеркнем, что цепь DR чрезвычайно мономорфна, поэтому полиморфизм молекулы DR сосредоточен в одной половине щели [309].
Пептиды, длиной более 8-10 аминокислот также могут иногда связываться с молекулами I класса, но в таком случае концы пептидов оказываются помещенными в щель, а центральная часть пептида может выступать за ее пределы [395].
Относительно консервативная структура мембрано-проксимального домена молекулы I класса взаимодействует с CD8 корецепторной молекулой на Т клетках [178].
2.1.1.1. Пептид-связывающий мотив.
В наборе пептидов, который связывается с любым конкретным аллотипом I класса существует предпочтительный сиквенсный «мотив», который определяется расположением боковых цепей аминокислот, образующих доминантные заякоривающие сайты для связывания с конкретным аллотипом HLA I [390, 406]. Для прогнозирования связывания молекул HLA существуют пептид-лигандные базы данных с указанием пептид-связывающих «мотивов», однако по пептид-связывающим «мотивам»
невозможно однозначно предсказать будет или нет связываться конкретный пептид с конкретным аллотипом I класса. Невозможно также cосчитать все пептиды, которые свяжутся с конкретной молекулой HLA I класса.
Алгоритмы для прогнозирования пептид-связывающих «мотивов», по мнению многих авторов [196, 253, 271], должны будут усовершенствоваться, с учетом возможного влияния протеосомального расщепления белков при образовании антигенных пептидов.
Пептид-связывающий мотив обычно содержит два или три основных якорных выступающих остатка, которыми аминокислоты хорошо входят в разные карманы внутри пептид-связывающей щели аллотипа HLA I класса, что обеспечивает значительную энергию связывания [390].
Основные якорные сайты обычно занимают В-карман и F-карман молекул I класса. В-карман может иметь различную химическую структуру, которая определяется главным образом позицией 45 тяжелой цепи. В Вкармане могут фиксироваться остатки аминокислот, имеющие как положительный [95], так и отрицательный [137] заряд. У других молекул класса I В-карман может быть неглубоким или плохо выраженным [315]. В кармане F, в зависимости от его химических или пространственных свойств, могут быть фиксированы пептиды с разными окончаниями: карбоксильными, гидрофобными [230], ароматическими [520] или даже заряженными [285].
Между основными местами заякоривания существуют другие, второстепенные сайты, которые также могут участвовать в HLA-связывании [135], но обычно связывание в этих областях более слабое. Тем не менее, такое дополнительное связывание усиливает связывание по основным сайтам.
Не якорные аминокислоты, не принимающие участия в связывании с молекулой HLA I класса, могут выдаваться над пептид-связывающей щелью, что позволяет им взаимодействовать с антиген-специфическим Т-клеточным рецептором.
2.1.1.2. Пептиды MHC класса I.
связывают молекулы I класса MHC, происходят из эндогенных белков, как собственных, так и чужеродных [74, 390]. Около 200 различных пептидов может представлять на клеточной поверхности молекула MHC I класса HLA [230].
Обычно молекулы I класса связывают и представляют эндогенные пептиды, которые образуются в результате протеосомно-зависимого протеолиза в цитоплазме, однако специализированные дендритные клетки могут фиксировать также и интактные антигены экзогенного происхождения [204]. Антигены, фиксированные такими дендритными клетками, могут быть процессированы и представлены посредством TAP-зависимых и TAPнезависимых механизмов [41, 282, 402, 432]. Этот процесс, известный как кросс-презентация, важен в случае представления пептидов из белков, которые не синтезируются в дендритных клетках, ответственных за начало иммунного ответа, например, на вирусы, которые не инфицируют дендритные клетки [99]. Кросс-презентация также имеет значение для синтезироваться в дендритных клетках [205]. Однако, в большинстве типов клеток основная часть пептидов, представляемых молекулами I класса, происходит из эндогенных белков, которые разрезаются мультикаталитическими протеазами в протеосомах [425]. Источником части эндогенных белков, подвергающихся протеосомной деградации, могут быть также «неправильно» свернутые белки, содержащиеся в живых клетках среди вновь транслированных продуктов [385]. Многие из этих полипептидов связаны с убиквитином и, таким образом, помечены для деградации в протеосомах [213, 362].
Поскольку источником пептидов, которые представляют молекулы I класса, в основном являются, белки, синтезированные внутри клетки, для презентации чужеродных АГ молекулами HLA I класса (в большинстве клеточных типов) обычно необходима внутриклеточная инфекция, цитоплазматической трансляцией и деградацией соответствующих белков.
Пептиды, представляемые молекулами I класса, обычно распознаются антиген-специфическими Т-клетками CD8+ фенотипа. Молекулы I класса необходимы, главным образом, для презентации антигенов Т-клеткам киллерам. Однако, некоторые неклассические молекулы I класса, такие как HLA-E [88, 90] и G [283], служат в качестве лигандов для естественных киллерных клеток (NK), физиологическая функция которых - элиминировать клетки, которые утрачивают экспрессию белков I класса. Молекулы HLA-E и HLA-G также представлены в плацентарных клетках трофобласта, где они могут служить для обеспечения мирного сосуществования с большим количеством NK клеток, которые инфильтрируют слизистую матки на ранней стадии беременности [257].
2.1.1.3. Процессинг АГ молекулами I класса HLA.
координации множества процессов, включая производство пептидов, их транспорт и загрузку в щель молекулы I класса в эндоплазматическом ретикулуме [501]. Считается, что главным источником пептидов для презентации молекулами I класса, являются процессированные в протеосомах пептиды из цитоплазмы [429]. Протеосомы – это эволюционно древние, бочкообразные структуры, которые «разрезают» полипептиды на пептиды, длиной от 8 до 17 аминокислот [281, 395]. Протеосомы состоят из 14 субъединиц, две из которых, известные как LMP2 и LMP7, кодируются внутри области генов II класса MHC [362]. Эти связанные с MHC индуцируются цитокинами, такими как интерферон-, во время иммунного ответа, образуя «иммунопротеасому». Небольшая часть (около 1%) деградированных пептидов активно транспортируется через мембрану эндоплазматического ретикулума в его просвет, где находятся «пустые» (не связанные с пептидом) молекулы I класса [170]. Этот переход облегчается гетеродимерным молекулярным насосом, известным как молекула TAP (Transporter associated with Antigen Processing) [327]. TAP гены картированы внутри области генов II класса MHC, в непосредственной близости от генов, кодирующих LMP2 и 7 [308]. Это наблюдение может свидетельствовать о совместной эволюции генов, контролирующих образование пептидов в цитоплазме (иммунопротеосомы LMP2 и 7), их захват, транспорт в эндоплазматический ретикулум (TAP1/2) и презентацию Т клеткам.
Физическая близость перечисленных генов дает возможность их координированной регуляции цитокинами [308]. Другим объяснением связи локусов TAP с MHC может быть участие TAP в «подгонке» пептидных специфичностей к полиморфным молекулам I класса, так как пептиды, провзаимодействовавшие с TAP, как правило, хорошо соответствуют связывающим зонам полиморфных молекул I класса.
мембраны эндоплазматического ретикулума, а с молекулами I класса – на просветной ее стороне, то есть молекула TAP способна доставлять пептиды непосредственно к молекулам I класса [308]. С TAP могут связываться пептиды длиной 8-16 аминокислот, однако наиболее эффективно молекула TAP перемещает пептиды длиной 8-10 аминокислот, что соответствует оптимальной длине пептидов, связывающихся с молекулой I класса [325].
Молекула TAP перемещает пептиды, образованные в протеосоме, в результате чего они содержат гидрофобные или карбоксильные окончания, хорошо подходящие для связывания большинством молекул I класса [475, 482]. Пептиды, которые были перемещены в эндоплазматический ретикулум, могут быть защищены белками теплового шока, которые облегчают АГ загрузку и презентацию [326]. Часто пептиды, более длинные, чем 8- аминокислот, перемещаются в эндоплазматический ретикулум, где они могут быть укорочены до оптимальной длины концевыми аминопептидазами, которые затем создают N-окончания пептидов [170, 402, 428].
TAP ассоциированный гликопротеин, так называемый тапасин (tapasin), функция которого заключается в облегчении загрузки пептидов в молекулы I класса в эндоплазматическом ретикулуме, также картируется в пределах комплекса генов MHC. Тапасин стабилизирует пустой димер I класса, удерживая его в эндоплазматическом ретикулуме до пептидной сборки с пептидным загрузочным комплексом [125].
2.1.2. HLA класс II.
К классическим молекулам II класса MHC человека относят HLA-DR, DQ, и DP, каждая из которых кодируется двумя различными генетическими локусами. Гены, которые кодируют перечисленные молекулы кластеризованы в области генов II класса, простирающейся приблизительно на 2 мегабазы. В целом структура белка молекул II класса похожа на класс I., но достигается это нековалентной связью двух мембрано-связанных цепей, известных как и [182, 297]. Рис.1.1. Эти и цепи вместе образуют АГ связывающую щель, расположенную над консервативной мембранной структурой, которая может взаимодействовать с CD4+ на Т-клетках, рис 1.1.В. MHC класс II и цепи кодируются различными локусами, которые тесно связаны как пары и генов (например, DR/ DR; DQ /DQ ;
DP/DP ).
Локусы HLA-DR, DQ и DP высокополиморфны. Полиморфизм этих молекул ограничивается в основном антиген-связывающей щелью. Только молекула HLA-DR состоит из полиморфной DR цепи (DRB ген) и мономорфной DR цепи (DRA ген) [309], рис 1.3. HLA-DP и DQ полиморфны и в, и в цепях генов (DPA-DPB, DQA-DQB).
2.1.2.1. Структура HLA II и природа связанных пептидов.
Пептиды, которые связывают и представляют Т-клеткам молекулы HLA класса II, как правило, длиннее тех, которые связывают молекулы I класса [104, 447], а пептид-связывающие мотивы молекул MHC II значительно менее хорошо охарактеризованы.
Пространственная структура молекул MHC класса II обеспечивает такое связывание пептидов, что около трети пептидной поверхности доступно для растворителей и для взаимодействия с АГ рецептором на Т клетках [92, 242, 243, 334, 447], рис 1.1.В. Исследование структуры молекулярного комплекса, состоящего из молекулы HLA-DR1 и матричного пептида вируса гриппа показало, что 5 из 13 боковых цепей пептида были погружены в пептид-связывающие карманы, а обширная сеть водородных связей между свободными остатками молекулы HLA-DR1 и пептидным остовом фиксировала пептид в щели. Этот пример показывает, каким образом подобная форма связывания может обеспечивать большое разнообразие пептидов, связавшихся с молекулой MHC класса II [92]. Очень немногие работы, по определению спектра пептидов, связывающихся с молекулами II класса, были выполнены в конце 80-х, начале 90-х годов. Чуть ли не единственным, кто попытался при помощи масс спектрометрии посчитать общее количество вариантов, которые могут связывать молекулы II класса был Hunt D.F. и соавт. (1992). Оказалось, что молекула II класса MHC мыши (I-Ad) может связывать от 650 до 2000 различных пептидов [230].
Способность некоторых пептидов связываться со множеством HLADRB1 аллелей для представления их Т клеткам была названа «неразборчивым» (promiscuous) Т клеточным распознаванием и описана для некоторых АГ, таких как, например, пептиды из гемагглютинина вируса гриппа, токсина столбняка, малярийного Plasmodium falciparum [105, 144, 363, 400, 405, 437].
Т-клеточные эпитопы из белка вируса кори связывались с несколькими изотипическими и аллотипическими формами молекул II класса HLA [273, 358, 367].
Hammer J и соавт. (1993) на основании исследования связывания пептидов с разными вариантами DR молекул пришли к заключению, что DR молекулы имеют как общие для разных пептидов, так и аллельспецифические якорные участки [198].
Наблюдения Schuenke KW и соавт. (1998) указывают на то, что связывание пептида HBs АГ с молекулой II класса зависит от полиморфизма алеллей HLA II, в то же время отсутствие ответа на вакцину против гепатита В не является результатом неспособности процессированного HbS АГ связываться с молекулами II класса [426]. Исследования Kruger A и соавт.
(2005) показали, что оценка связывания пептидов не отражает презентацию АГ in vivo: HLA-DR ассоциации с вакцинальным ответом на HBs АГ не объясняются различиями в связывании пептидов или изменениями Th1/Th профиля [268].
Концы пептидов, связанных с молекулами класса II, выступают за пределы связывающей щели, в пределах которой он фиксируется сетью водородных связей, аналогичной классу I, свешиваясь за пределами щели рис 1.1.В и образуя изгибы, что влияет на пространственную структуру комплекса [519].
Многие пептиды, связывающиеся с молекулами II класса, происходят из других белков MHC [104, 105].
Суперантигены, такие как стафилококковый энтеротоксин, связываются с молекулами MHC класса II как интактный белок без соответствующего пептидного АГ-связывающего сайта, что объясняет отсутствие рестрикции иммунного ответа на этот АГ по аллелям II класса [242].
2.1.2.2. Процессинг и презентация АГ молекулами II класса HLA.
Путь процессинга и презентации АГ молекулами HLA класса II принципиально отличается от молекул класса I [124, 476]. Молекулы HLA класса II главным образом связывают пептиды, произведенные в эндоцитозном компартменте (включая лизосомы) [104, 105], однако значительная часть пептидов может также поступать и из цитоплазмы [143].
Эндосомы – это связанные с мембраной полости, которые перемещают белки между различными вакуолярными отсеками клетки и отделены от цитоплазмы липидным слоем. Экзогенные АГ попадают в клетку в результате эндоцитоза и переносятся в эндосомы и лизосомы, а также отделы, содержащие протеолитические ферменты [337], так что многие пептиды, представляемые молекулами II класса, происходят из экзогенных АГ.
Первоначально молекулы II класса связываются в эндоплазматическом ретикулуме с мономорфным белком, известным как инвариантная цепь (Ii).
Каждый /Ii комплекс класса II представляет собой состоящий из субъединиц трансмембранный белок, содержащий три гетеродимера, ассоциированных с гомотримером Ii цепи [401]. Инвариантная цепь предохраняет молекулы класса II от загрузки пептидами, происходящими из эндоплазматического ретикулума и сопровождает вновь синтезированные молекулы к специализированному эндосомальному компартменту (MCII), ориентируясь по цитозольному хвосту. MCII компартмент, вероятно, - место, где большинство пептидов загружается в молекулы HLA класса II. По достижении окислительного эндосомального компартмента инвариантная цепь последовательно деградируется катепсин-опосредованным протеолизом [337], образуя CLIP, или класс II ассоциированный пептид инвариантной цепи [394], который связывается со щелью молекулы II класса способом, не отличающимся от номинальных антигенных пептидов [184, 523].
Для успешной загрузки пептидами молекул II класса обычно необходима функция, которую выполняет белок HLA DM [329]. Молекула HLA DM состоит из двух генных продуктов HLA-DM A и В, которые также кодируются в пределах II класса MHC. HLA DM, вероятно, взаимодействует непосредственно с молекулами II класса, катализируя диссоциацию CLIP и помогая загрузке пептидов и в кислом эндосомальном, и в утилизирующем компартментах [89, 133, 134, 439]. Эта функция HLA-DM может регулироваться другой молекулой II класса HLA – DO, которая при некоторых условиях усиливает функцию DM, но иногда может ей препятствовать [89]. Молекула HLA DO экспрессирована главным образом на В клетках, что может свидетельствовать о ее роли в обеспечении преимущественной презентации специфических (соответствующих) АГ высокоаффинными В клетками по сравнению с неспецифическими, низкоаффинными. Действуя как пептидный редактор, HLA-DM может также изменять конечную конформацию MHC-II/пептидного комплекса, образовавшегося в различных клеточных компартментах таким образом, что эти конформационные варианты могут различаться специфическими Т клетками [386].
Большинство пептидов, которые связываются с молекулами II класса, состоят из 8-15 аминокислот и получаются в результате деятельности эндосомных и лизосомных протеаз, особенно катепсинов [337, 487]. Разные катепсины играют различную роль в тимических и периферических антигенпредставляющих клетках [337, 487]. У человека обнаружена лизосомальная тиолредуктаза (GILT), индуцированная -интерфероном, которая определяется в поздних эндоцитозных компартментах антигенпредставляющих клеток и, которая, вероятно, необходима для разрыва дисульфидных связей, что предупреждает эффективный процессинг АГ катепсинами и другими протеазами [301].
Молекулы II класса могут представлять АГ по крайней мере двумя различными путями, которые позволяют загружать как эндогенно, так и экзогенно происходящие антигенные пептиды. Так, например, Т-клеточный ответ на токсины, фагоцитированный материал и неинфекционные вирионы может осуществляться по пути II класса.
Созревание молекул II класса регулируется сигналами воспаления, которые выключают эндоцитоз и мобилизуют внутриклеточные молекулы II класса и другие компоненты АГ-представляющей «машины» к максимальной презентации АГ [101, 276].
Т-клетки, распознающие молекулы II класса – это, в основном, CD4+ хелперные Т-клетки. Роль хелперных Т-клеток заключается в усилении АГ представляющей функции и содействие дифференцировке и пролиферации В клеток и цитотоксических Т-клеток.
Таким образом, с одной стороны распознавание АГ Т клетками обеспечивается эффективными функциональными связями между клеточными механизмами, осуществляющими фиксирование АГ, его процессинг и презентацию молекулами I и II класса. С другой стороны ему соответствует не менее совершенный молекулярный механизм по образованию огромного репертуара T клеточных рецепторов. Это позволяет адаптивной Т клеточной системе производить огромное число всевозможных рецепторов для распознавания АГ, сравнимое по количеству с набором чужеродных инфекционных или измененных собственных антигенов.
2.2. Эволюция MHC.
В процессе эволюции компоненты адаптивной иммунной системы, включающей MHC, появляются рано у позвоночных, но точно отряд и временные рамки этого события неизвестны. MHC молекулы не обнаружены у беспозвоночных, в то время как челюстные позвоночные уже имеют гены MHC I/II класса, Т-клеточного рецептора и иммуноглобулинов [261, 269].
Общая организация MHC также, вероятно, сохранилась с тех пор. Регионы, кодирующие молекулы I и II класса генетически связаны. Это наблюдается в случае млекопитающих, кур, Xenopus и филогенетически таких наиболее древних из исследованных видов, как хрящевые акулы [353]. Костные рыбы являются исключением, демонстрирующим, что ряд областей генов I и II классов не существенна для функционирования иммунной системы [269, 449].
Сходство функционирования генов MHC не всегда сопровождается идентичностью в строении. Например, секвенирование, и картирование генов демонстрирует, что биологические виды могут существовать с различным количеством разных групп генов II класса. Например, у мыши по сравнению с человеком значительно более ограничен набор генов класса II, а DPподобные гены являются псевдогенами и приблизительно половина инбредных и диких линий не имеет этих молекул [450]. Локус DP также не активен у кошек. Кроме того, кошки не используют DQ-подобные гены II класса, но, возможно, поэтому количество генов DR локуса у них компенсаторно увеличено [67]. Коровы, козы и овцы, вероятно, имеют специфичный для жвачных ген класса II вместо DP [214]. Несмотря на такие видо-специфичные модификации, пять ортологических групп генов II класса главным образом сохранились среди всех млекопитающих.
немлекопитающими, за исключением DM [252]. Филогенетический анализ показывает, что неклассический DM II класса дивергировал рано в процессе эволюции II класса [451]. DM был идентифицирован у кур, в то время как DP, DQ и DR гены не представлены у кур [252]. В отличие от млекопитающих, кластер генов II класса у птиц является видоспецифическим, не сохранившимся у других отрядов [152].
Очень сложный комплекс MHC плацентарных млекопитающих млекопитающих имеет высокую плотность генов; например MHC человека содержит 264 гена и псевдогена на протяжении 3,6 Mb. У немлекопитающих MHC в основном содержит меньше генов, чем у млекопитающих, и области I и II классов находятся рядом.
У плацентарных млекопитающих регион I класса содержит набор консервативных «рамочных» генов, которые обнаруживаются у разных видов; гены I класса увеличиваются в числе и разнообразии между этими «рамочными» генами [55]. Не сообщалось об обнаружении этих генов у немлекопитающих.
Сравнительный анализ MHC опоссума и других видов млекопитающих поддерживает идею о том, что в эволюции позвоночных было время, когда существовал единый «иммунный суперкомплекс» генов, который содержал MHC гены I и II класса, гены антигенного процессинга (TAP и PSMB) CD1 и гены рецептора NK клеток С-типа и Ig-типа [470]. Общее происхождение белков I и II класса предполагается авторами работы, также исходя из сходства функции и трехмерной структуры [297].
2.3. Полиморфизм и номенклатура HLA.
Классические гены HLA I и II класса HLA-A, B, Cw, DR, DQ и DP являются наиболее полиморфными локусами из числа известных на сегодняшний день полиморфных генов у человека [Marsh SG с соавт.2000].
Количество известных аллелей в каждом из этих локусов неуклонно возрастает, так как высокоразрешающее HLA типирование используется в клинике и антропологических исследованиях [302, 303]. На начало 2007 года общее количество аллелей в локусах HLA составило 2816. В таблице 2. представлено распределение аллелей по различным генам HLA. Аллели в указанных локусах могут отличаться друг от друга по 1-30 аминокислотным остаткам [399].
Номенклатура HLA аллелей и локусов определяется Номенклатурным Комитетом по факторам системы HLA (WHO) [303]. Этот комитет следит за наименованием новых аллелей и регулярно публикует обновления списка вновь открытых аллелей HLA. База данных Комитета IMGT/HLA (http://www.ebi.ac.uk/imgt /hla) осуществляет централизованное хранение сиквенсов аллелей, названных Номенклатурным Комитетом. Список вновь открытых на основании сиквенирования HLA аллелей, утверждается Номенклатурным Комитетом по факторам HLA системы и ежемесячно публикуется в журнале Tissue Antigens. Кроме того, полный список аллелей публикуется каждые несколько лет в Tissue Antigens, European Journal of Immunogenetics и Human Immunology.
Аллельный полиморфизм классических генов системы HLA Класс I Класс II Все аллели в соответствии с сиквенсами объединены в группы аллелей.
Различия между сиквенсами аллелей, принадлежащих к одной группе существенно меньше, чем между аллелями из разных групп.
Заключение.
Таким образом, основная физиологическая функция молекул HLA II класса, в отличие от I, в представлении антигенов экзогенного происхождения (главным образом инфекционных агентов) клетками иммунной системы для запуска иммунного ответа на них. Формирование в процессе эволюции системы генов II класса, выделение их из общих с I классом предковых генов и специализация функции, возникла, вероятно, в результате действия инфекционного и паразитарного окружения.
Глава 3. Полиморфизм системы HLA II и популяционные исследования.
На основании результатов исследований ученых из разных стран мира на сегодняшний день сформировалось представление, что гены HLA II класса, наряду с генами I класса, можно использовать для поиска исторических и современных генетических связей между популяциями [154], несмотря на то, что гены HLA, являясь генами иммунного ответа, участвуют в развитии заболеваний, связанных с иммунной системой, в частности, инфекционных, аутоиммунных и т.д. [217, 278, 427, 460, 477], что ранее ставило под сомнение возможность использования их в таком качестве в связи с возможным действием направленного отбора.
Наоборот, в соответствии с современными представлениями, считается, что значительный уровень полиморфизма генов HLA II предоставляет почти уникальные возможности для исследований в области популяционной геномики, поиска ассоциаций с заболеваниями и эволюции [154]. Например, изучение распределения аллельного разнообразия HLA локусов в различных человеческих популяциях может помочь понять, каким образом действуют силы природы для образования и сохранения полиморфизма у человеческих видов. Кроме того, исторические и эволюционные связи между современными человеческими популяциями могут быть выявлены на основании филогенетического анализа частотного распределения аллелей и гаплотипов HLA. Сравнение различий в распределении аллелей и гаплотипов между популяциями, может быть использовано для обнаружения в истории популяций таких демографических событий как, например «узкое место» или “bottleneck” и «эффект основателя». Наконец, различия в частотах аллелей и гаплотипов между популяциями из различных этнических групп может быть использовано для лучшего понимания ассоциаций между HLA и заболеваниями, в некоторых случаях проливающих свет на механизмы их развития и резистентности к ним. [154] 3.1. HLA и демографическая история Исторические и современные генетические связи между популяциями можно исследовать, используя для анализа построение филогенетических деревьев (или дендрограмм) на основании расчета генетических расстояний между популяционными группами, используя для этого данные по частотам аллелей и гаплотипов различных генов [154].
В рамках 11 международного рабочего совещания Imanishi T. с соавт.
(1992) на основании анализа результатов типирования 77 популяций по генам HLA I класса и 20 популяций – по генам II класса (DRB1, DQA1, DQB1) обнаружили выраженное соответствие между географическим (на континентальном уровне) и генетическим родством популяций, определенном на основании аллельных частот генов HLA классов I и II, в отличие от генов комплемента [235].
Позже филогенетический анализ распределения частот аллелей HLA был использован для исследования родства между популяциями в разных регионах мира.[69, 94, 201, 236, 238, 286, 296, 323, 485] и особенно интересным было использование этого анализа для проверки антропологических и исторических гипотез [201, 286, 296]. Например, считается, что около 9000 лет назад континент Австралия и острова Новая Гвинея и Тасмания были частью единого материка, известного как Сахул (Sahul). Была выдвинута гипотеза, что аборигены Тасмании, Австралии и жители нагорья в Папуа Новой Гвинее являются современными потомками древней сахульской популяции, которые были изолированы в результате повышения уровня моря. Гипотеза предполагала, что популяции из горных районов Папуа Новой Гвинеи должны быть генетически более близкими к австралийским популяциям, чем к равнинным популяциям Папуа Новой Гвинеи. Лингвистический анализ свидетельствовал о близком родстве между языками жителей гор из Папуа Новой Гвинеи и австралийскими аборигенами [345]. Филогенетический анализ аллельных частот генов HLA класса II (DRB1, DQB1) также показал более близкую генетическую связь между горными популяциями Папуа Новой Гвинеи и австралийскими аборигенами, чем между жителями гор и жителями равнины Папуа Новой Гвинеи [296, 485].
Филогенетический анализ HLA гаплотипов, образовавшихся за счет неравновесного сцепления соседствующих генов, также может быть полезным для составления представлений об истории популяций и их родстве. Образовавшиеся таким образом HLA гаплотипы могут служить для дальнейшего «подразделения» аллелей. Например, Begovich и соавторы [69] показал, что выявление высоко частотного аллеля DPB1*0402 у африканцев и южно-американских индейцев привело к ложному заключению о генетической близости этих популяций на филогенетическом дереве, однако филогенетический анализ гаплотипов DPA1-DPB1 переместил эти две популяции уже в отдаленные друг от друга части филогенетического дерева, что свидетельствует о том, что две указанные популяционные группы не являются генетически близкими.
3.2. Полиморфизм системы HLA среди популяционных групп России и стран СНГ.
Население России, занимающей огромную территорию, исключительно разнообразно по этническому составу, но в отличие от основных европейских и азиатских популяций, изучено значительно хуже с точки зрения HLA популяционного полиморфизма.
полиморфизма системы HLA было выполнено разными авторами в 90е годы методами серологического типирования антигенов I класса. Наибольшее количество публикаций касается народов Сибири и Дальнего Востока:
тувинцев (Сартакова М.Л. и соавт., 1998) - [35], якутов (Fevelova V.V., 1990) эвенков (Рычков Ю.Г. и Удина И.Г., 1985) - [33], долган, нганасан, чукчей и чуванцев (Коненков В.И. и соавт., 1993) - [21], северных кхантов (Дегтярева Е.А. и Пузырев В.П., 1993)- [16], бурят (В.В. Яздовский и соавт., 1998) - [40]. Распределение антигенов HLA I класса описано для некоторых финно-угорских народов, проживающих на территории России. В статье Гусевой И.А. и соавт.(1998) представлены частоты антигенов HLA-A и HLAВ среди представителей двух этнических групп мордвы (эрзи, мокши) и марийцев [15], а особенности распределения этих антигенов среди коми и коми-пермяков описаны в работе Удиной И.Г. и Раутян Г.С. (1994) - [37].
Были публикованы данные по распределению антигенов I класса HLA-A и -B у армян (Нерсисян В.М. и Мартиросян И.Г., 1982) - [29].
Исследованиям популяционного полиморфизма генов II класса было посвящено значительно меньшее число публикаций, так как оно стало возможным только в результате появления молекулярно-генетических методов типирования. Такие популяционные исследования II класса генов HLA совместно с японскими учеными были выполнены в 1993 г. Сартаковой М.Л. и соавт. [34]. Типирование генов DRB1 DQA1 и DQB1у алеутов с Командорских островов было проведено Володько Н.В. и соавт.(2003) [13], генов DRB1 у башкир, татар, чувашей, удмуртов, мари и коми (Хидиятова И.М. и соавт. 2004) - [38], генов DQA1, DQB1, DPB1 у жителей г.С.Петербург (Kapustin S. et al.1999) - [249], генов DRB1, DQA1, DQB1, DPB1 у жители Чукотки (Крылов М.Ю. и соавт.1995) - [22].
3.2.1. Исследование генетического родства 20 исследованных популяций на основании полиморфизма гена HLA II DRB1 и гаплотипов DRB1DQA1-DQB1.
В отделе иммуногенетики человека (рук.профессор Л.П.Алексеев) ГНЦ Института иммунологии ФМБА России с 90-х годов проводятся исследования популяционного разнообразия населения России и граничащих с Россией стран по генам HLA II класса: Алексеев Л.П. и соавт. [3, 5, 45, 48, 50, 51, 52]; Болдырева М.Н. и соавт. [7, 10, 11, 12, 80, 81, 82, 85]; Евсеева И.В.
и соавт.- [18, 156, 157], Хромова Н. А. и соавт. 2006 [39] методом мультипраймерной ПЦР, также разработанным в отделе иммуногенетики Трофимовым Д.Ю. в 1996 году [36].
В результате многолетней работы было проведено типирование генов HLA класса II DRB1-DQA1-DQB1 представителей 20 популяционных групп (см. материалы и методы) различной этнической и расовой принадлежности.
Частоты гена DRB1 были рассчитаны программой “Arlequin”, версия 2.1. ((URL:http ://anthro.unige.ch/arlequin). Результаты типирования этого гена в разных группах трех славянских популяций – русских, белорусов и украинцев, представлены в таблице 3.1, в остальных исследованных группах – в таблице 3.2.
На основании типирования генов DRB1, DQA1 и DQB1 при помощи программы “Arlequin” методом максимального правдоподобия (maximum likelihood) были рассчитаны частоты трехлокусных гаплотипов DRB1-DQA1DQB1. Частоты этих гаплотипов во всех исследованных популяционных группах представлены в таблицах 3.3 и 3.4.
Частоты гена DRB1 и трехлокусных гаплотипов DRB1-DQA1-DQB были использованы для расчета генетических расстояний между популяциями по Нею [340]. Расчеты генетических расстояний и построение соответствующих матриц генетических расстояний были произведены при Е.В.Балановская). Полученные матрицы были использованы для проведения кластерного анализа и многомерного шкалирования при помощи компьютерной программы «Статистика» (версия 6.0).
Распределение гена DRB1 среди популяций русских, белорусов и украинцев
РУССКИЕ БЕЛОРУСЫ УКРАИНЦЫ
DRB1- Архангельс Костром- Смоленс- Вологод- Витебская Брестская Гомельская Хмельниц- Львовская Распределение гена DRB1 среди разных популяций, населяющих Евразию Распределение DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов среди популяций русских, белорусов и украинцевРУССКИЕ БЕЛОРУСЫ УКРАИНЦЫ
DRB1-DQA1-DQB1 Архангельс Костромс Смоленс Вологод- Витебская Брестская Гомельская Хмельниц- Львовская 13-0102-0602(-8) 0,013 0,004 0,012 0,029 0,075 0,005 0,007 0,022 0, 15-0102-0602(-8) 0,154 0,127 0,128 0,141 0,17 0,113 0,121 0,08 0, 16-0102-0502/4 0,019 0,028 0,035 0,017 0,045 0,067 0,079 0,08 0, Распределение DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов среди популяций русских, белорусов и украинцев гаплотипы 13-0102-0602(-8) 0,013 0,015 0,034 0,02 0,012 0,011 0,033 0,039 0,041 0,046 0, 13-0103-0602(-8) 0,062 0,074 0,098 0,04 0,036 0,076 0,047 0,05 0,033 0,079 0, 15-0102-0602(-8) 0,101 0,143 0,086 0,038 0,066 0,065 0,051 0,053 0,07 0,095 0, Результаты кластерного анализа в виде дендрограмм представлены на рисунках 3.1, 3.2, 3.5, 3.6, 3.7 в виде двухмерных графиков многомерного шкалирования - на рисунках 3.3, 3.4, 3.8.Для определения, что лучше отражает генетическое родство всех исследованных популяций необходимо было сравнить данные, полученные на основании частот одного гена DRB1 (рис 3.1) и трехлокусных гаплотипов трех генов, DRB1, DQA1, DQB1 (рис 3.2).
Рис.3.1. Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот гена DRB1- для 20 популяций России и стран СНГ. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.
Рис.3.2 Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов для 20 популяций России и стран СНГ. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.
Дендрограммы, представленные на рис 3.1 и 3.2 демонстрируют, что при использовании для построения матриц генетических расстояний частот гена DRB1 также, как и частот DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов, все исследованные популяционные группы образуют три кластера.
В один кластер вошли генетически близкие друг другу популяции, живущие на территориях, относящихся к центральной и южной частям Восточной Европы: три группы белорусов из Гомельской, Брестской и Витебской областей, две группы украинцев из Львовской и Хмельницкой областей и русские из Смоленской области. Белорусы из Витебской области (север Белоруссии) отличались от генетически более близких друг другу белорусов из Брестской и Гомельской областей.
Если на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1, белорусы из Витебской области образуют с белорусами из южных районов республик единый «белорусский» кластер, тем не менее отличаясь от двух, очень генетически близких друг другу групп белорусов из южных районов республики, то на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 белорусы с севера республики уже примыкают к кластеру, состоящему из украинцев, белорусов из Брестской и Гомельской областей и русских из Смоленской области. Положение украинцев из Хмельницкой и Львовской областей и русских из Смоленской области не различаются на обеих дендрограммах.
На обеих дендрограммах белорусы из южных областей республики (Гомельской и Брестской областей), а также украинцы из центральной (Хмельницкая область) и западной части (Львовская область) страны оказались попарно близки между собой. Русские из Смоленской области были генетически ближе к украинскому кластеру, чем к белорусскому. В этот же кластер вошли генетически сильно отличающиеся от славянских популяций - Гагаузы из республики Молдова и армяне из республики Армения. Но, если на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 (рис.3.1.) эти две популяционные группы образуют отдельный кластер, то на дендрограмме на основе частот DRB1-DQA1-DQB1 (рис.3.2) гаплотипов гагаузы и армяне последовательно примыкают к кластеру «славянских» популяций. Следующий кластер образовали популяции, проживающие в северном и северо-западном регионах европейской части России. Однако дендрограммы, построенные на основе частот гена DRB (рис.3.1) и DRB1-DQA1-DQB1(рис.3.2) гаплотипов несколько различны. В обоих случаях русские из Костромской и Вологодской областей являются наиболее близкими друг другу популяционными группами. Однако, если на дендрограмме, построенной на основе частот гена DRB1 (рис.3.1) этим двум группам русских наиболее близкими являются русские из Архангельской области, а затем уже марийцы, то на дендрограмме, построенной на основе частот гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 (рис.3.2) наоборот, генетически более близкими русским из Костромской и Вологодской областей являются марийцы, а затем уже русские из Архангельской области. Еще одно отличие двух дендрограмм касается удмуртов и татар, образовавших отдельный кластер. Если на дендрограмме гена DRB1 (рис 3.1.) этот кластер примыкает к популяциям, северо-западных областей России, то на дендрограмме гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1(рис 3.2) этот кластер уже примыкает к популяциям с азиатской генетической основой. Однако в обоих случаях кластер удмуртов и татар довольно сильно отличается от большинства популяций, входящих с ними в более крупный кластер. Это может, вероятно, свидетельствовать о том, что удмурты и татары занимают промежуточное положение между европейским и азиатским генофондом. Следует отметить также, что и различия между ними весьма существенны. Ненцы и саамы, наоборот, на дендрограмме гена DRB1(рис 3.1) примыкают к «азиатскому»
кластеру, в то же время сильно от них отличаясь (особенно саамы), в то время как на дендрограмме гаплотипа DRB1-DQA1-DQB1 (рис 3.2) примыкают к европеоидным популяциям севера, северо-запада восточной Европы, в то же время, также сильно от них отличаясь, что также говорит о наличиии в их генофонде как северо-европейских, так и азиатских генов.
На дендрограмме гена DRB1 все популяции с азиатской генетической основой или имеющие смешанное евро-азиатское происхождение.
образовали кластер, в который вошли попарно более близкие друг другу казахи и калмыки, а также буряты и тувинцы. К ним примыкают ненцы, и затем генетически более далекие от этих групп – саамы. На дендрограмме гаплотипов DRB1-DQA1-DQB1 (рис. 3.2.) в один кластер также вошли попарно генетически близкие казахи и калмыки, и тувинцы и буряты. Но, в отличие от дендрограммы гена DRB1, к указанной группе примыкают не ненцы и саамы, а близкие друг другу удмурты и татары.
Измерение Рис 3.3. Расположение 20 популяций России и стран СНГ в рамках многомерного шкалирования на основе генетических расстояний по частотам гена DRB1. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.
Взаиморасположение исследованных популяций, представленное на основании частот гена DRB1 (рис.3.3) и DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов (3.4) принципиально не отличается от соответствующих дендрограмм, хотя демонстрирует генетические различия между популяциями.
Измерение Рис 3.4. Расположение 20 популяций России и стран СНГ в рамках многомерного шкалирования на основе генетических расстояний по частотам DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты.
графиках многомерного шкалирования и дендрограммах, построенных и на основе частот гена DRB1 и DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов в целом соответствует их этногенезу (см материалы и методы) и географическому взаиморасположению, что подтверждает возможность использования как отдельных генов HLA класса II, в частности наиболее полиморфного гена DRB1, так и гаплотипов нескольких генов, в частности DRB1-DQA1-DQB1, для изучения генетической истории формирования различных народов.
Основные генетические различия между исследованными популяциями улавливаются уже при использовании только гена DRB1, хотя исследование DRB1-DQA1-DQB1 гаплотипов, позволяет выявить более тонкие различия между популяционными группами, то есть более предпочтительно для генетического анализа. Такой вывод совпадает с мнением Begovich A.B. с соавт. [69], который считает, что гаплотипы генов HLA являются «подразделением» аллелей, что еще более увеличивает полиморфизм HLA.
3.2.2. Исследование генетического родства 20 исследованных популяций и популяций из разных стран мира на основании полиморфизма гена HLA II DRB1.
К сожалению, для проведения сравнения собственных данных с данными литературы по распределению частот генов HLA среди представителей народов разных стран, с целью определения генетической связи между ними нам не удалось найти достаточного количества сведений о распределении частот гаплотипов генов HLA класса II, что было бы предпочтительнее, поэтому дальнейший анализ был проведен с использованием данных о частотах распределения только гена DRB1.
Из доступных литературных источников были выбраны частотные данные популяций, представляющих, насколько это возможно, коренное население различных стран Европы, Азии, Австралии, Новой Зеландии и Америки. Европейское население представлено жителями Норвегии [20], Оркнейских островов [79], Уэльса [131], Северной Ирландии [317], Англии [202], Дании [244], Финляндии [366], северной Германии [164], Швеции [287], Бельгии [225], Австрии [166], юго-восточной Франции [324], Швейцарии [464], Чехии [146], Венгрии [193], Хорватии [250], Болгарии [339], Италии [163], о.Сардинии [119], Греции [279]. Кроме того, для анализа были использованы данные по HLA типированию евреев из Израиля [305], японцев [172], корейцев [199], жителей Южного Китая [179], Тайваня [280], Таиланда [103], а также аборигенов Австралии [284], маори, коренных жителей Новой Зеландии [506], индейцев из Аргентины [63], Бразилии [328], Мексики [355], эскимосов Гренландии [191]. Результаты этого анализа представлены на рисунках 3.5, 3.6, 3.7, 3.8.
На дендрограмме (рис.3.5.) представлены все популяции, взятые в анализ. Эти популяции образовали два кластера, очень сильно отстоящих друг от друга в генетическом отношении: один - «европейский», другой – «азиатский». В европейский кластер попало большинство популяционных групп населяющих Европу, в том числе все группы русских, белорусов, украинцев, а также удмурты, татары, марийцы, гагаузы и армяне. В азиатский кластер вошли все популяции азиатского происхождения, а также казахи, калмыки, тувинцы, буряты, ненцы и саамы.
Дендрограмма, представляющая только «европейский» кластер», представлена на рис.3.6. Этот большой кластер состоит, в свою очередь, из нескольких кластеров – «южно-европейский» и два более близких друг другу - «центрально-европейский» и «северо-европейский».
«Южно-европейский» кластер в свою очередь на два. В один попали попарно более близкие друг другу болгары с греками и итальянцы с гагаузами, а в другой - евреи, армяне и довольно сильно от них отличающиеся жители о.Сардиния.
В «северо-европейский» кластер разделился на два. Один состоит из из очень генетически близких друг другу уэльсцев, ирландцев и англичан, а также близких друг другу норвежцев и жителей Оркнейских островов, расположенных в Северном море недалеко от Великобритании.
Генетические расстояния Рис.3.5 Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот гена DRB1 для 20 популяций России и стран СНГ и ряда стран Евразии, Австралии, Новой Зеландии, Америки. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты, Сар – жители о.Сардиния, Гре – греки, Бол – болгары, Ита – итальянцы, Гаг – гагаузы, Евр – евреи, Нор – норвежцы, Орк – оркнейцы, Уэл – уэльсцы, СИр – североирландцы, Анг – англичане, Фин – финны, Нем – немцы, Дат – датчане, Чех – чехи, Блг – бельгийцы, Авс – австрийцы, Фра – французы, Шве – шведы, Швц – швейцарцы, Вен – венгры, Хор – хорваты, Таил – таиландцы, Тайв – китайцы из Тайваня, ЮКит – китайцы из южного Китая, Кор – корейцы, Япо – японцы, ИнА – индейцы из Аргентины, ИнМ – индейцы из Мексики, ИнБ – индейцы из Бразилии, Эск – эскимосы Гренландии, Авл – аборигены Австралии, Мао – маори из Новой Зеландии, друг другу русские из Архангельской области и датчане, к ним примыкают немцы из северных районов Германии.
Рис.3.6. Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот гена для популяций России, стран СНГ и ряда стран Евразии. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Сар – жители о.Сардиния, Гре – греки, Бол – болгары, Ита – итальянцы, Гаг – гагаузы, Евр – евреи, Нор – норвежцы, Орк – оркнейцы, Уэл – уэльсцы, СИр – североирландцы, Анг – англичане, Фин – финны, Нем – немцы, Дат – датчане, Чех – чехи, Блг – бельгийцы, Авс – австрийцы, Фра – французы, Шве – шведы, Швц – швейцарцы, Вен – венгры, Хор – хорваты.
Следующая группа генетически близкая к вышеописанной - это близкие друг другу русские из Костромской и Вологодской областей. К кластеру, состоящему из трех групп северных русских, северных немцев и датчан примыкают отличающиеся от них финны, вероятно за счет уралоидной примеси.
«Центрально-европейский» кластер в свою очередь состоит из трех.
Один кластер образовали белорусы из южных (Гомельской и Брестской) областей и хорваты, другую его часть - украинцы из Хмельницкой и Львовской областей и отличающиеся от них – венгры с вероятной примесью уралоидного компонента, которые, тем не менее попали в один кластер с западными славянами. Другой кластер состоит из центрально-европейских популяций, генетически близких друг к другу: чехи, бельгийцы, австрийцы, французы, шведы, также жители Швейцарии и русские из Смоленской области. От них отличаются северные белорусы, вероятно, за счет балтских примесей. В отдельный кластер выделились сильно отличающиеся от остальных популяций, вошедших в «центральноевропейский» кластер, более близкие друг другу татары и удмурты, а также марийцы. Такие существенные различия, вероятно, можно объяснить присутствием у них заметного уралоидного компонента.
«Азиатский» кластер, отдельно представленный на рис.3.7, в свою очередь состоит из нескольких кластеров. В один вошли очень сильно отстоящие друг от друга, попарно более близкие индейцы из Бразилии и австралийские аборигены, в другой - индейцы из Мексики и эскимосы Гренландии. Другой кластер составили популяции, также сильно отличающиеся от других групп – жители Южного Китая, Тайваня и Таиланда. И, наконец, третий кластер представляет довольно разнородную группу, в которую вошли довольно близкие, особенно попарно бурятытувинцы и калмыки- казахи. Кроме того, к этому кластеру примыкает группа, в которую вошли довольно сильно отличающиеся друг от друга ненцы, живущие на северном побережье России и маори, аборигены из Новой Зеландии. И, наконец, последний кластер, также включающий довольно разные и географически удаленные друг от друга группы – более близкие друг другу японцы и корейцы, а затем – индейцы из Аргентины и саамы с Кольского полуострова России.
Тайв Таил Рис.3.7. Дендрограмма генетических расстояний, построенная на основании частот гена DRB1 для населения ряда стран Евразии, Австралии, Новой Зеландии, Америки. Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты, Таил – таиландцы, Тайв – китайцы из Тайваня, ЮКит – китайцы из южного Китая, Кор – корейцы, Япо – японцы, ИнА – индейцы из Аргентины, ИнМ – индейцы из Мексики, ИнБ – индейцы из Бразилии, Эск – эскимосы Гренландии, Авл – аборигены Австралии, Мао – маори из Новой Зеландии, Матрицы генетических расстояний, построенные на основе частот гена DRB1 среди всех упоминавшихся популяций были также использованы для построения двухмерного графика многомерного шкалирования для уточнения взаиморасположения различных популяций (рис 3.8). Плотное «ядро», состоящее из большинства взятых в анализ европейских популяций, вытянуто с юга на север. К этому «европейскому ядру» с одной стороны примыкают удмурты, татары и мари – европеоиды с примесью уралоидного компонента, причем у марийцев в большей мере, чем у удмуртов и татар, проявляется присутствие «северо-европейских» генов.
Направление Рис 3.8. Расположение 20 исследованных популяций России, стран СНГ и ряда стран Евразии, Австралии, Новой Зеландии, Америки в рамках многомерного шкалирования на основе генетических расстояний по частотам гена DRB1. РАр – русские из Архангельской обл., РКо – русские из Костромской обл., РСм – русские из Смоленской обл., РВо – русские из Вологодской обл., БеВ – белорусы из Витебской обл., БеБ – белорусы из Брестской обл., БеГ – белорусы из Гомельской обл., УкЛ – украинцы из Львовской обл., УкХ – украинцы их Хмельницкой обл., Мар – марийцы, Удм – удмурты, Тат – татары, Гаг – гагаузы, Арм – армяне, Нен – ненцы, Саа – саамы, Каз – казахи, Кал – калмыки, Тув – тувинцы, Бур – буряты, Сар – жители о.Сардиния, Гре – греки, Бол – болгары, Ита – итальянцы, Гаг – гагаузы, Евр – евреи, Нор – норвежцы, Орк – оркнейцы, Уэл – уэльсцы, СИр – североирландцы, Анг – англичане, Фин – финны, Нем – немцы, Дат – датчане, Чех – чехи, Блг – бельгийцы, Авс – австрийцы, Фра – французы, Шве – шведы, Швц – швейцарцы, Вен – венгры, Хор – хорваты, Таил – таиландцы, Тайв – китайцы из Тайваня, ЮКит – китайцы из южного Китая, Кор – корейцы, Япо – японцы, ИнА – индейцы из Аргентины, ИнМ – индейцы из Мексики, ИнБ – индейцы из Бразилии, Эск – эскимосы Гренландии, Авл – аборигены Австралии, Мао – маори из Новой Зеландии, Из исследованных азиатских популяций России и стран СНГ ближе всего к европейцам оказались казахи и калмыки. Основу генофонда тувинцев и, особенно, бурят составляют гены центрально-азиатского происхождения.
Особенно удивительно, что саамы, живущие на Кольском полуострове, по составу HLA генов класса II ближе всего оказались к индейцам из Аргентины и бурятам. Положение ненцев на графике многомерного шкалирования с одной стороны свидетельствует о своеобразии указанной популяционной группы, сочетающей «северо-европейские» гены с уралоидными и сильной примесью генов азиатского происхождения, а с другой - о недостаточности сведений об HLA генетическом профиле различных популяционных групп, в взаиморасположение популяций и не позволяют более определенно судить о происхождении и их генетическом родстве.
Таким образом, взаимоположение популяций на графиках, полученных на основании расчета генетических расстояний генов HLA класса II (гена географическое положение и генетические связи различных популяционных групп, в том числе и 20 популяционных групп из России и стран, граничащих с Россией, что совпадает с современными представлениями о том, что полиморфизм генов HLA, в частности генов II класса, предоставляет почти уникальные возможности для исследований в области популяционной геномики [154]. Особенно большие возможности предоставляет еще более выраженный, чем аллельный, гаплотипический полиморфизм генов HLA, который позволяет определять более тонкие различия между популяциями, что также совпадает с представлениями сегодняшнего дня [69].
3.3. Селекция HLA полиморфизма.
сиквенсов в HLA локусах происходит в результате мутаций, конверсии генов и внутригенной возвратной рекомбинации. Механизмы, лежащие в основе процесса изменения сиквенса, вместе с межгенной рекомбинацией привели и к широчайшему гаплотипическому разнообразию генов HLA. Очевидно, что такое огромное число аллелей HLA класса I и II, которое наблюдается практически во всех человеческих популяциях, поддерживается селекцией, хотя многие доказательства действия естественного отбора являются непрямыми и выводятся из распределения аллельных частот [154].
Для доказательства действия селективных сил на генетические системы Ewens-Watterson был предложен тест на нейтральность [158, 493] или гомозиготность. Модель Ewens-Watterson прогнозировала значение гомозиготности (вычисленного из распределения аллельных частот) для популяции определенного размера с определенным количеством аллелей и находящихся в нейтральных условиях (при отсутствии селекции).
Этот тест был применен разными учеными для исследования распределения как аллельных частот, так и частот HLA серогрупп с целью выявления влияния на систему HLA потенциальных селективных сил [69, 263, 296, 412, 463]. Низкие значения гомозиготности в этом тесте связывают с действием на популяцию балансирующей селекции. В течение ряда лет такие значимо низкие значения гомозиготности были определены для HLADRB1, DQA1 и DQB1 локусов во многих популяциях и поэтому для этих локусов было сделано заключение о влиянии на них балансирующей селекции [263, 296, 412, 463].
«