«ФИЗИКО-ХИМИЧКСКИЕ СВОЙСТВА КРИСТАЛЛОВ И РАСТВОРОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ 1,2,4 – ТИАДИАЗОЛА ...»

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ

"ИВАНОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ХИМИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ"

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ

ИНСТИТУТ ХИМИИ РАСТВОРОВ ИМ. Г.А. КРЕСТОВА

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

Буи Конг Чинь

ФИЗИКО-ХИМИЧКСКИЕ СВОЙСТВА КРИСТАЛЛОВ И

РАСТВОРОВ НЕЙРОПРОТЕКТОРЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ

СОЕДИНЕНИЙ НА ОСНОВЕ 1,2,4 – ТИАДИАЗОЛА 02.00.04 – «Физическая химия»

Диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель:

д.х.н., проф. Перлович Г.Л.

Иваново – Оглавление Стр.

Список обозначений ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ

I.1. Принципы действия препаратов для лечения болезни Альцгеймера I.2. Основные подходы к созданию многоцелевых препаратов для лечения нейродегенеративных заболеваний I.3. Применение и перспективы развития препаратов, содержащих фрагмент 1,2,4–тиадиазола I.3.1. Новые препараты на основе 1,2,4–тиадиазола, применяемые для лечения болезни Альцгеймера I.3.2. Краткий обзор препаратов на основе 1,2,4–тиадиазола, применяемых при заболеваниях, не носящих нейродегенеративный характер I.4. Свойства некоторые производных 1,2,4-тиадиазола I.4.1. Свойства, определяющие биологическую активность Процессы распределения соединений между парами I.4.2.

несмешивающихся растворителей 1-октанол/буфер (pH 7.4) и н- гексан/буфер (pH 7.4) I.4.3. Мембранная проницаемость производных 1,2,4-тиадиазола I.4.4. Корреляции между параметрами распределения I.4.5. Взаимосвязь между коэффициентами мембранной проницаемости и биологической активностью I.4.6. Поиск алгоритмов для прогнозирования молекулярных структур с оптимальной биодоступностью I.5 Подход к синтезу производных 1,2,4-тиадиазола I.6. Подходы к описанию топологии сеток водородных связей I.7 Некоторые методы для вычисления энергий кристаллических решеток I.7.1 Ван–дер–Ваальсовские взаимодействия I.7.2 Кулоновские (электростатические) взаимодействия I.7.3 Энергия водородных связей I.8 Основные понятия об энантиомерах

ГЛАВА II. ОПИСАНИЕ РАСТВОРИТЕЛЕЙ, МОДЕЛИРУЮЩИХ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ

II.1. Водные буферные растворы с физиологическими значениями pH II.2. 1-Октанол II.3. н–Гексан II.4. Коэффициенты распределения 1–октанол/вода, н–гексан/вода II.4.1. Коэффициент распределения 1–октанол/вода II.4.2. Коэффициент распределения н–гексан/вода

ГЛАВА III. ОПИСАНИЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК

III.1. Метод переноса вещества инертным газом– носителем III.1.1. Установка для измерения давления насыщенного пара молекулярных кристаллов III.1.2. Расчет давления насыщенного пара и термодинамических параметров сублимации III.1.3. Процедура пересчета экспериментальных значений энтальпий сублимации III.2. Определение растворимости методом изотермического насыщения III.2.2. Спектрофотометрический метод определения растворимости III.2.3. Определение термодинамических параметров процесса растворения III.4. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК)

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА IV. АНАЛИЗ КРИСТАЛЛИЧЕСКОГО СОСТОЯНИЯ 1,2,4ТИАДИАЗОЛОВ

IV.1. Анализ конформационных состояний молекул 1,2,4–тиадиазолов в кристаллах IV.2. Анализ водородных связей и кристаллической структуры 1,2,4тиадиазолов IV.3. Оценка конформационных напряжений в молекулах производных 1,2,4-тиадиазола IV.4. Термодинамика сублимации и термофизические характеристики кристаллов производных 1,2,4-тиадиазола

ГЛАВА V. ТЕРМОДИНАМИКА РАСТВОРЕНИЯ, СОЛЬВАТАЦИИ И

ПЕРЕНОСОВ ПРОИЗВОДНЫХ 1,2,4–ТИАДИАЗОЛА V.1. Процессы растворения и сольватации исследуемых соединений в растворителях, моделирующих биологические среды V.1.1. Процессы растворения и гидратации в буферном растворе V.1.2. Процессы растворения и сольватации в 1-октаноле V.1.3. Процессы растворения и сольватации в н-гексане V.2. Термодинамика процессов переноса молекул 1,2,4-тиадиазолов из буферной среды в 1-октанол и н-гексан

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ВЫВОДЫ

Кристаллографические и структурные параметры Vcell объем элементарной ячейки Vmol Ваальсовских объемов молекулы Расчетные параметры электростатическая (кулоновская) Ecoul энергия образования водородных энергия кристаллической решетки Ван-дер-Ваальсовская энергия Evdw bond энергия напряжения связей angle torsion Дескрипторы HYBOT (Cad ) способности атомов в молекуле к образованию водородных связей поляризуемость молекулы Термодинамические и термохимические

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы: 1,2,4-тиадиазолы представляют важный класс гетероциклических соединений и вызывают огромный интерес благодаря их высокой специфической активности в широком диапазоне концентраций.

Тиадиазольные фрагменты являются основной целого ряда синтетических препаратов, обладающих биологической активностью к рецепторам, определяющим нейродегенеративные заболевания и расстройства центральной нервной системы, что позволяет их использовать при разработке новых лекарственных соединений для лечения и профилактики болезни Альцгеймера (БА). К сожалению, многие из данных веществ плохо растворимы в водных средах, что существенно снижает биодоступность препаратов и ограничивает область их применения. Проблема выбора оптимальной растворимости и мембранной проницаемости определяется отсутствием четкого понимания закономерностей влияния кристаллической структуры вещества и строения молекулы на термодинамические характеристики процессов растворения, сублимации, сольватации и распределения. В связи с этим, изучение влияния упаковки молекул в кристалле, их конформационного состояния и топологии сеток водородных связей на процессы сублимации и растворения в биологических средах, а также структуры молекул на процессы распределения и сольватации является актуальной задачей современной физической химии. Решение поставленных задач позволит создать лекарственные препараты нового поколения с малыми терапевтическими дозами и отсутствием побочных эффектов.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с научным направлением Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института химии растворов им. Г.А. Крестова Российской академии наук «Разработка противовоспалительных лекарственных соединений и форм с высокой растворимостью и мембранной проницаемостью» (номер гос. регистрации 01200950827). Проведенные исследования поддержаны Программой Президиума РАН №21 П «Фундаментальные науки – медицине», Грантами РФФИ № 09-03а, № 12-03-00019-а, № 13-03-00348-а, 7-ой Рамочной Программой Евросоюза, FP7-PEOPLE-2009-IRSES, код проекта 247500, Грантом Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых и ведущих научных школ РФ № МК-7097.2012.3.

Цель работы: целью работы явилось выявление основных закономерностей изменения физико-химических свойств кристаллов и растворов производных 1,2,4-тиадиазола в зависимости от структуры вещества и его кристаллического строения для получения растворимых и биодоступных лекарственных соединений.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

вырастить монокристаллы производных 1,2,4-тиадиазола, провести их рентгеноструктурный анализ, проанализировать упаковку молекул в кристаллах и топологию сеток водородных связей, описать конформационные состояния молекул в кристалле и сравнить их с газовой фазой;

получить термодинамические характеристики процессов сублимации и плавления молекулярных кристаллов, исследуемых соединений;

изучить процессы растворения и сольватации 1,2,4-тиадиазов в растворителях, имитирующих биологические среды, охарактеризовать процессы переноса в системах (буфер рН 7.4 / 1-октанол), (буфер рН 7.4 / н-гексан) и проанализировать их термодинамические характеристики;

найти закономерности изменения термодинамических характеристик процессов сублимации, плавления, растворения и переноса от физико-химических и структурных дескрипторов.

Научная новизна: впервые выращены монокристаллы производных 1,2,4тиадиазола, проведен их рентгеноструктурный анализ и полностью расшифрована структура кристаллических решеток. Осуществлен сравнительный анализ кристаллических структур, конформационных состояний молекул 1,2,4тиадиазолов, геометрии и топологии сеток водородных связей. Построены энергетические профили для торсионных углов.

Получены термодинамические характеристики процессов сублимации и плавления исследуемых соединений. Выявлены закономерности их изменения от структуры кристаллов 1,2,4-тиадиазолов.

Впервые получены термодинамические характеристики процессов растворения, сольватации и переносов производных 1,2,4-тиадиазолов в растворителях, моделирующих биологические среды. Выявлены закономерности изменения термодинамических функций процессов распределения в зависимости от физико-химических дескрипторов.

Практическая значимость: полученные в работе экспериментальные данные дают возможность описания термодинамического состояния изучаемых соединений в кристаллах и растворах. Высокая точность экспериментальных значений позволяет использовать их как справочный материал. Результаты сублимационных экспериментов могут быть использованы для разработки новых и усовершенствования уже существующих алгоритмов теоретической оценки энергий кристаллических решеток. Результаты по растворимости и распределению в биологических средах 1,2,4-тиадиазолов могут быть использованы для целенаправленного отбора биодоступных соединенийкандидатов для лечения болезни Альцгеймера.

Рентгеноструктурные данные внесены в Cambridge Crystallographyc Data Center. Копии этих данных могут быть получены в качестве свободного обмена при обращении в CCDC, 12 Union Road, Cambridge CB2 1EZ, UK (Fax: +44E-mail: [email protected]).

Личный вклад автора состоит в непосредственном получении и обработке экспериментальных данных, анализе литературы. Обсуждение результатов проведено автором при участии соавторов публикаций и научного руководителя.

Автор считает своим долгом выразить благодарность руководителю д.х.н., проф. Перловичу Г.Л., к.х.н. Сурову А.О. и к.х.н. Волковой Т.В. (ИХР РАН) за помощь на всех этапах работы. Автор также благодарен к.ф.-м.н. Ткачёву В.В.

(ИПХФ РАН) и Русселю П. (Университет науки и технологии, Лиль, Франция) за проведение рентгеноструктурных экспериментов.

оборудовании центра коллективного пользования "Верхневолжский региональный центр физико-химических исследований".

Апробация работы: основные положения, результаты и выводы, содержащиеся в диссертации, докладывались на 14th International Symposium on Solubility Phenomena (Leoben, Austria, 2010); International conference “Drug Transport and Delivery” (Gothenburg, Sweden, 2010); VI, VII Международной научной конференции «Кинетика и механизм кристаллизации» Иваново, 2010, 2012); XIX, ХX Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2012, 2013); Всероссийской научной конференции «Химия и Медицина, Орхимед-2009» (Уфа, 2009); VII, VIII Всероссийской школеконференции молодых ученых “Теоретическая и экспериментальная химия жидкофазных систем” (Крестовские чтения) (Иваново, 2012, 2013); IX Всероссийской конференции «Химия и медицина» (Уфа, 2013); Студенческой научной конференции «Фундаментальные науки – специалисту нового века»

(Иваново, 2009, 2010, 2011).

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 3 статьи в журналах, включенных в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК Российской Федерации для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата наук, и тезисы 14 докладов на Международных, Всероссийских и Региональных конференциях.

Структура и объем диссертации: диссертация содержит 166 страниц и состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, основных выводов, списка цитируемой литературы ( источника).

Работа содержит 50 рисунков и 12 таблиц.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ

ЗАБОЛЕВАНИЙ

I.1. Принципы действия препаратов для лечения болезни Альцгеймера В настоящее время для лечения болезни Альцгеймера (БА) используется целый ряд препаратов. Основной фармакологический эффект этих соединений направлен на улучшение когнитивных способностей, сниженных при данном заболевании за счет гипофункции холинэргической нейромедиаторной системы, а их нейропротективные свойства выражены довольно слабо. Вместе с тем, особый интерес в настоящее время уделяется подходам, которые опираются на представления о молекулярных механизмах развития БА и позволяют направленно создавать препараты, сочетающие в себе когнитивно– стимулирующие и нейропротекторные свойства [1].

Принцип направленного поиска препаратов для лечения БА и сходных с ней нейродегенеративных расстройств подразумевает изучение биохимических и структурных закономерностей взаимодействия физиологически активных веществ с биологическим аппаратом нервной системы, участвующим в развитии этих патологий. В соответствии с этим принципом по своему действию препараты подразделяются на группы.

1) Холиномиметические средства, направленные на прямую компенсацию гипофункций холинэргической системы при лечении БА. Для улучшения когнитивных функций у больных БА к настоящему времени предложен целый спектр подходов, основной целью которых является компенсация дефицита активности холинэргической нейромедиаторной системы в центральной нервной системе (ЦНС).

2) Средства, воздействующие на процессы образования и свойства бета– амилоидного пептида. Анти–амилоидная стратегия поиска новых препаратов и способов коррекции болезни Альцгеймера рассматривается как наиболее перспективная и обоснованная [2,3]. Поиск высокоэффективных средств для лечения и предупреждения болезни Альцгеймера в ряду лигандов глутаматэргической системы, обладающих оптимальным соотношением нейропротекторных и когнитивно–стимулирующих свойств рассматривается в настоящее время в качестве одного из перспективных направлений фармакотерапии болезни Альцгеймера.

3) Средства, активирующие другие нейромедиаторные системы и опосредованно компенсирующие дефицит холинэргических функций. Существуют препараты, характеризующиеся комплексным действием на ЦНС, обладающие ноотропными, нейромодулирующими и нейротрофическими свойствами, способные регулировать метаболические процессы в нервных клетках и сочетать когнитивно–стимулирующее и нейропротекторное действие.

4) Ингибиторы нейрофибриллярных образований. Наряду с образованием амилоидных бляшек важнейшей патоморфологической чертой болезни Альцгеймера является наличие в мозге характерных нейрофибрилярных образований, которые состоят из парных филаментов, представляющих собой специфические ассоциированные тау–белки. Это дает право рассматривать поиск препаратов, действие которых направлено на уменьшение и стабилизацию нормального уровня фосфорилированных тау–белков, как обоснованную стратегию поиска анти–альцгеймеровских препаратов [4].

5) Противовоспалительные средства, действие которых направлено на купирование негативного ответа нервных клеток на патологический процесс.

Известно, что нейродегенеративные изменеия в мозге в ходе развития БА сопровождаются воспалительной реакцией ЦНС. В литературе имеются работы, посвященные подробному изучению нейровоспалительных процессов при БА и способов их коррекции [5].

Таким образом, обзор сведений показал, что многообразие причин, вызывающих нарушения, приводящие к возникновению и прогрессированию БА, создает настоятельную необходимость разработки широкого спектра лекарственных средств для ее терапии.

I.2. Основные подходы к созданию многоцелевых препаратов для лечения Большое количество сведений о возможных механизмах развития патологии типа болезни Альцгеймера, создает очень широкий спектр подходов к фармакологической коррекции подобных нейродегенеративных заболеваний, что объясняется комплексным характером самой патологии. Действительно, подобные заболевания развиваются с участием широкого круга различных внутри- и экстра- клеточных биологических систем, которые могут являться объектом фармакологического воздействия потенциальных лекарственных препаратов. Помимо подобного «прямого» вмешательства в патогенез нейродегенеративных заболеваний существует возможность коррекции развившейся патологии за счет активации компенсаторных механизмов ЦНС, что значительно увеличивает общий набор потенциальных способов в сфере их терапии. В рамках формализованных представлений потенциальные лекарственные препараты можно разделить на следующие основные группы (по направлению фармакологического действия): 1) протекторы, блокирующие на различных стадиях развитие нейропатологии; 2) препараты, компенсирующие (прямым и опосредованным образом) возникший дефицит функций дегенерированных нейрональных систем; 3) иммунные вакцины и, возможно, трофические факторы, которые стимулировали бы функциональное восстановление (реабилитацию) пораженных нервных клеток.

Однако реальные препараты действуют, как правило, не на одну биологическую мишень, а сам биологический объект участвует в регуляции целого комплекса взаимосвязанных процессов, что, во многих случаях, приводит к формированию целого комплекса нейрофармакологических свойств у каждого конкретного вещества.

В последние годы значительно возросло понимание патогенеза заболеваний.

Как следствие, изобретение лекарственных препаратов постепенно движется по пути достижения ими конкретных молекулярных мишеней, при этом осуществляется переход от живых объектов к клеточным моделям [6]. Огромные усилия прилагаются для достижения селективности разрабатываемых объектов, и это отражается в том, что сегодня уже существует целый набор лигандов, обладающих высокой селективностью in vitro. Принцип «одна молекула – одна мишень» привел к открытию многих успешно применяющихся лекарственных препаратов. Однако следует отметить, что лиганд с высокой селективностью к определенной мишени не всегда превращается в клинически эффективное лекарство. Это происходит по следующим причинам: а) лиганд не распознает мишень б) лиганд не достигает биологических ловушек, в) взаимодействие препарата с соответствующей мишенью не оказывает достаточного воздействия на систему с нарушением, чтобы эффективно ее восстановить [7,8]. Медицинские химики часто сталкиваются с отмеченными нежелательными аспектами в разработке лекарственных препаратов. Преодоление сложностей, возникающих из пунктов (а) и (б) может быть отнесено к хорошо известным подходам рациональной модификации лигандов. Но пункт (в) представляет серьезную проблему и требует более тщательного анализа.

неудовлетворительными для применения при заболеваниях типа нейродегенеративных синдромов, диабетов, сердечнососудистых, и раковых, которые содержат множественные патогенные факторы [9]. Достижения фармакологии предлагают возможные пути решения проблем, возникающих при использовании таких препаратов [10]. Когда одного препарата недостаточно для эффективного лечения, может быть использована мульти–препаратная терапия (также представляющая собой «коктейль» или «сочетание лекарств»). Обычно она состоит из двух или трех различных лекарственных препаратов, которые объединяют различные механизмы терапевтического действия. Но этот подход может быть неблагоприятен для пациентов с определенными проблемами здоровья. Поэтому возможно применение другого подхода, в основе которого лежит объединение различных лекарственных препаратов в одну композицию для упрощения режима дозирования и удобства пациента. Наконец, в настоящее время развивается третий подход, основанный на предположении о способности одного препарата достигать несколько мишеней. Понятно, что терапия с помощью одного лекарства, имеющего разнообразные биологические свойства, будет иметь неоспоримые преимущества над двумя первыми. При работе с многокомпонентными образцами возникают сложности, так как каждый лекарственный препарат в образце может иметь различное бионакопление, фармакокинетику и метаболизм. Однако, в сфере фармакокинетики клинические испытания препарата, способного достигать многочисленные мишени, не должны, в принципе, отличаться от любого другого, мономолекулярного. Кроме этого, в данном случае исключается риск возможного взаимодействия нескольких лекарственных препаратов и значительно упрощается терапевтический режим применения. Все эти преимущества имеют огромное значение для разработки основных стратегических путей создания лекарственных препаратов нового поколения [11]. Таким образом, получение соединений, способных достигать нейродегенеративных заболеваний. В работах [12-14] подробно обсужден данный подход в связи с заболеваниями, носящими не только нейродегенеративный характер. Определение «лиганды многоцелевой направленности» [11] наиболее полно описывает соединения, которые эффективны при воздействии на комплексные заболевания, вследствие их способности взаимодействовать с несколькими мишенями (рис. I.1).

Рис. I.1. Пути, приводящие к открытию новых препаратов: (а) Моноцелевой подход к разработке, а именно, принцип одна молекула – одна мишень. (б) Подход, предполагающий использование «лигандов многоцелевой направленности [14].

В работе [15] представлены многообещающие перспективы важнейших аспектов стратегии создания лигандов многоцелевой направленности для различных областей медицины (в том числе посвященных нейродегенеративным заболеваниям). Особое внимание уделено сфере изучения допаминэргических рецепторов, ангиотензивной системы, киназ и коньюгатов высвобождения окиси азота. Однако, литературных источников, описывающих комплексные заболевания нейродегенеративного характера не так много. Поэтому особенно важно проанализировать исследования, иллюстрирующие попытки медицинских химиков создать лиганды многоцелевой направленности для борьбы с нейродегенеративными заболеваниями, имеющими полифакториальную природу (т.е. основанную на генетических, экологических и внутренних факторах).

Нейродегенеративные заболевания всегда рассматривались в ряду наиболее сложных и проблематичных в биомедицине [16]. По мере того, как исследования в области этих заболеваний продвигались к механистическому анализу, становилось ясно, что основные происходящие процессы полифакториальны по своей природе. По патогенному полифакториальному механизму нейродегенеративные заболевания подразделяются на болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона и амиотропные латеральные склерозы. Хотя каждое заболевание имеет собственный молекулярный механизм и клиническую картину, можно распознать некоторые общие пути развития различных патогенных ступеней. Они включают плохое свертывание и агрегацию протеина, окислительный стресс и образование свободных радикалов, дисфункцию метахондрий и ухудшение фосфорилирования, причем все эти процессы часто происходят одновременно (рис. I.2) [17].

Рис. I.2. Схематические пути развития полифакториальных заболеваний, приводящие к нейрональной гибели [14].

Плохое свертывание протеина, сопровождающееся самоассоциацией и дальнейшим осаждением агрегированных протеинов, отражается на тканях мозга пациентов, пораженных такими заболеваниями. Мономерные частицы в начальной стадии образуют малые олигомеры, ступенчато перерастающие в фибриллярные структуры [18,19]. Действительно, растворимые протеины различных рядов могут свертываться в устойчивые плоские конформации. Это открытие предполагает, что конгломераты, получающиеся из различных амилоидогенных протеинов, могут инициировать соответствующий нейротоксический механизм. Несмотря на присутствие широко распространенных первичных и вторичных структур, все протеины, при образовании амилоидных фибрилл заимствуют перекрестное окружение на оси пептида, ориентированное перпендикулярно оси фибрилл [20]. Конечные белковые агрегаты, образующиеся в результате патологических процессов, являются частью структурных и гистологических морфологий. Их биологические воздействия, однако, различны и зависят от таких факторов, как виды тканей, вовлекаемых в процессы, и внутри– и внеклеточных вкладов. [20-22]. Биофизическое поведение таких протеинов, приводящее к их плохому свертыванию, агрегации и осаждению, подтолкнуло ученых к мысли об объединении рассматриваемых видов нейрологических заболеваний под общим названием «конформационных расстройств».

Следует отметить, что олигомеры амилоида (такие как амилоид– (А) и – синуклеин) подробно описаны с точки зрения проницаемости как через клетки, так и через мембраны митохондрий [23,24]. Следовательно, они могут определять такие функции, как нарушение кальциевого обмена, деполяризацию мембран и ухудшение митохондриальных функций, которые считаются наиболее частыми признаками нейродегенеративных заболеваний [25]. Существенную роль в нейродегенеративных заболеваниях играет химически активный кислород [26] Сегодня установлено, что окислительный стресс и дисбаланс внутриклеточного процесса окисления является одной из основных причин возникновения такого рода заболеваний. Более того, аномальное митохондриальное функционирование провоцирует возникновение окислительного стресса в нейронах [27]. Очевидно, что морфологические, биохимические и молекулярные аномалии в митохондрии различных органов влияют на ход нейродегенеративных заболеваний [28].

Следует отметить, что не совсем понятна хронология и первопричины нейродегенеративных расстройств в отношении митохондриальной дисфункции и окислительного стресса. Несомненно, что один из этих факторов может провоцировать возникновение другого, который впоследствии становится самостоятельным и продолжает цикл, который, в конце концов, дает толч ок активации процесса гибели нейронов [29].

Таким образом, в качестве вывода хотелось бы подчеркнуть, что ни один из механизмов в отдельности не может объяснить огромное количество биохимических и патологических аномалий, развивающихся на фоне нейродегенеративного заболевания, включающего множество взаимосвязанных клеточных и биохимических изменений. Поэтому, подходу, основывающемуся на принципе «одна молекула – одна мишень», закономерно приходит на смену применение концепции «лигандов многоцелевой направленности», которая особенно актуальна в свете терапии такого широко распространенного нейродегенеративного заболевания, как БА.

I.3. Применение и перспективы развития препаратов, содержащих фрагмент I.3.1. Новые препараты на основе 1,2,4–тиадиазола, применяемые для Соединения, имеющие в своем составе фрагмент 1,2,4–тиадиазола подробно описаны в литературе в качестве препаратов, которые уже используются и имеют хорошие перспективы в плане применения для лечения болезни Альцгеймера.

Фермент гликоген–синтаза–киназа–3 играет важную роль в возникновении болезни Альцгеймера. Известно, что селективные ингибиторы, которые подавляют гиперфосфорилирование -белка, дают возможность применить нейродегенеративных заболеваний. Нейрофибриллярные узлы являются одним из характерных патологий при болезни Альцгеймера. Они состоят из сильно фосфорилированных форм -белка, ассоциированного в микротрубки.

Обнаружено, что в мозге взрослого человека расположен ряд из шести изоформ белка, способность которых к скручиванию в микротрубки может моделироваться гиперфосфорилирование является начальным этапом в развитии нейрофибриллярной патологии. Таким образом, блокирование этой ступени при помощи ингибиторов может считаться первоначальной задачей в торможении патогенных процессов [30,31]. Авторами [32] описан синтез и биологическое действие для малых гетероциклических тиадиазолидонов, имеющих в составе молекулы фрагмент 1,2,4–тиадиазола в качестве ингибиторов гликоген–синтазы– киназы–3, потенциал и селективность которых позволяют использовать их для эффективного лечения заболеваний, в которых задействован -белок, особенно болезни Альцгеймера. Позднее (в другой работе этих же авторов [33]) были рассмотрены различные структурные модификации кольца гетероцикла с целью изучения влияния каждого гетероатома на биологические свойства соединения и его эффективность в качестве ингибитора гликоген–синтазы–киназы–3.

Расширенное исследование соотношения между структурой и активностью различных рядов гетероциклов показало влияние, оказываемое ароматическими заместителями у атомов азота тиадиазольного кольца. Кроме этого была доказана активность тиадиазолидонов in vivo в подавлении гиперфосфорилирования белка. Недавно, в продолжение данной темы, были предложены новые модификации гетероциклических тиадиазолидонов [34]. С одной стороны, в них сохранены основной скелет 1,2,4–тиадиазола и одна карбонильная группа, а с другой – внесены изменения в положениях 3 и 5 (рис. I.3).

Рис. I.3. Предполагаемые заместители в положениях 3 и 5 кольца 1,2,4–тиадиазола [35].

Таким образом, был получен ряд 5–амино–3–оксо–2,3–дигидро–1,2,4– тиадиазол (I), 5–имино–3–оксо–2,3,4,5–тетрагидро–1,2,4–тиадиазол (II), и 5– оксо–4,5–дигидро–1,2,4–тиадиазол (III). С другой стороны, было проведено замещение двух карбонильных групп кольца тиадиазолидона таким образом, что амино–и алкил–или арильная группы разместились в положениях 3 и 5 кольца 1,2,4–тиадиазола (рис. I.3) с получением производных 3,5–диамино–1,2,4– тиадиазола (IV) и 3,5–диарил/диалкил–1,2,4–тиадиазола (V). Была исследована биологическая активность полученных соединений. Результаты показали, что для сохранения биологически необходимых свойств достаточно одной карбонильной группы. Карбонил в положении 3 в структуре тиадиазолидона обязателен для сохранения биологической активности, тогда как фрагменты алкил/арил или амино допустимы в положении 5.

необходимости компенсировать дефицит холинэргической иннервации, характерный для БА и некоторых других заболеваний, связанных с нарушением психической деятельности. Однако клинические испытания мускариновых агонистов прямого действия имели неудовлетворительный результат, в отличие от ингибиторов холинэстеразы [36,37]. В литературе имеются данные [38] о производных 1,2,4–тиадиазола, которые проявляют высокую рецепторную способность в отношении мускариновых рецепторов. Молекулы этих соединений содержат моно- или бициклический амин у пятого атома углерода и их связывающие свойства определяются как конформационной энергией вращения вокруг связи С3–С5’, так и стерическими особенностями моно- и бициклического амина. Кроме этого, была синтезирована целая серия оригинальных высокоэффективных мускариновых агонистов, не имеющих четвертичного амина эндогенных и классических лигандов, которые легко могут проникать через гематоэнцефалический (BBB) барьер с достижением значительных концентраций в центральной нервной системе [39]. В общем случае, в отношении эндогенных лигандов, метильная группа имеет предпочтительный размер в качестве липофильного заместителя для высоко эффективного связывания рецептора. Для выше описанной группы замещенных производных 1,2,4–тиадиазола сложно определить точную конформацию, необходимую для оптимального связывания с рецептором, хотя некоторые пространственные особенности могут быть предпочтительными. Потенциальные возможности этих лигандов определяются как стерическими требованиями амин содержащих частей, так и ротационной свободой гетероароматического кольца. Не так давно была получена серия высокоселективных мускариновых агонистов для различных подтипов мускариновых рецепторов, способных воздействовать на широкий спектр нейродегенеративных и психических заболеваний, таких как шизофрения, II стадия БА и некоторые другие [40]. Представленные агонисты являются аналогами тетра(этилен гликоль)(3–метокси–1,2,5–тиадиазол–4–ил) [3–(1–метил– 1,2,5,6–тетрагидропирид–3–ил)–1,2,5–тиадиазол–4–ил] эфира (рис. I.4).

Рис. I.4. Тетра (этилен гликоль) (3–метокси–1,2,5–тиадиазол–4–ил) [3–(1–метил–1,2,5,6– тетрагидропирид–3–ил)–1,2,5–тиадиазол–4–ил] эфир.

Аналоги были синтезированы с участием промежуточных гидрофильных частей ди–, три–, тетра–, пента(этилен гликоль) и три(пропилен гликоль) отделяющих 1,2,5,6–тетрагидропиридиновое кольцо от основного гетероцикла, представляющего или 1,2,5–тиадиазольное кольцо или 1,2,4–тиадиазольное кольцо. Был проведен полный анализ рецепторных функций данных соединений.

Результаты показали, что изменение расстояния концевого тиадиазола и положение метокси группы может увеличивать связывающую способность определенных видов рецепторов.

Тесная взаимосвязь болезни Альцгеймера и феномена накопления свободно–радикальных метаболитов в клетках ЦНС отмечена уже давно и является основанием для теории окислительного стресса БА. Известно, что свободно–радикальные метаболиты образуются как в результате прямого действия амилоидного пептида на клетки ЦСН, так и в результате активации нейрофибрилярных клубков. При этом происходит образование целого ряда кислород–содержащих радикальных метаболитов, таких как пероксидные и нитроксидные радикалы, а также продуктов перекисного окисления липидов.

Значительную роль в этих процессах играет внутриклеточный кальций, который активирует метаболические реакции в митохондриях, приводящие к образованию радикалов кислорода, а в форме комплекса с кальмодулином активирует NO– синтазу генерирующую радикалы оксида азота. Продукт взаимодействия этих радикалов–пероксинитрит ион (NО 3–) способен индуцировать продукты перекисного окисления липидов, а также инициировать деградацию внутриклеточных белков и нуклеиновых кислот.

Защита нейронов и областей их контакта с тканями от повреждения и гибели и сохранение их функций предотвращает развитие нейродегенеративных патологий мозга [41-43].

Мозг является особенно чувствительным к окислительному повреждению органом, вследствие высокой скорости расходования кислорода и большого содержания легко окисляемых полиненасыщенных жирных кислот и ионов переходных металлов (участвующих в процессах окисления–восстановления), которые могут провоцировать образование свободных радикалов. Более того, выход из строя защитных механизмов регулирования концентрации свободных радикалов делает центральную систему особенно легко подверженной окислительному повреждению. Известно, что оксидативный стресс увеличивается с возрастом и недавние исследования подтвердили его важную роль в зарождении и развитии болезни Альцгеймера. Поэтому, лекарственные препараты, способные прямым образом удалять свободные радикалы или подавлять энзимы, участвующие в их образовании, представляют огромный интерес в плане терапии болезни Альцгеймера [44]. Одним из таких энзимов является синтаза оксида азота, которая способствует образованию оксида азота. Избыточное производство активированными нейроглиальными клетками приводит к вспышке нейродегенеративного процесса. В действительности, повышенная активность NO–синтазы играет важную роль в образовании, росте и процессе высвобождения NO в нейронах, что делает ее важным объектом воздействия нейропротекторных агентов [45]. Поиск и клиническое исследование ингибиторов синтазы оксида азота предполагает изучение их специфичности и способности к эффективному воздействию. Основное количество этих ингибиторов, существующих на данный момент, является аналогами эндогенного субстрата L–аргинина. Однако, в исследовании авторов [46] представлены новые соединения на основе фрагмента тиадиазола с арильными заместителями, конформационные аналоги селективного ингибитора синтазы оксида азота S–этил N–фенилизотиомочевины. Для достижения цели была создана нейрональная клеточная модель на основе известных ингибиторов для более точного предсказания их активности.

В работе [47] в качестве нейропротекторных агентов синтезированы и проверены на биологическую активность новые серии тиадиазолилнитронов и фуроксанилнитронов. Эти соединения показали отличную свободно-радикальную акцепторную емкость для различных типов свободных радикалов (например, •OH, CH3•CHOH, SO3•–) и хорошие нейропротекторные свойства в плане предотвращения гибели клеток, вызываемой оксидативным стрессом и повреждением при полном отсутствии токсичности.

I.3.2. Краткий обзор препаратов на основе 1,2,4–тиадиазола, применяемых при заболеваниях, не носящих нейродегенеративный характер Широкое использование 1,2,4–тиадиазолов в качестве фармакофоров в различных областях медицинской химии привело к получению целого ряда их производных и дальнейшему усовершенствованию их свойств.

Представляют несомненный интерес новые соединения на основе тиадиазола, применяемые в качестве аллостерических модуляторов широкого спектра G–протеиновых рецепторов, включая –, – и –опиоидный, – и – адренергический, мускариновые М1 и М2 и допаминэргические D1 и D2 рецепторы [48,49]. Принимая во внимание, что рецепторы данного вида являются семейством родственных по структуре мембрано–связанных протеинов, что играет главную роль в распознавании и сигнальной трансдукции гормонов и нейромедиаторов, аллостерическая модуляция аденозиновых рецепторов является важным фармакологическим направлением, относительно новым и неизученным.

Внеклеточный аденозин регулирует ряд физиологических функций путем активации этих специфических рецепторов клеточной мембраны. Некоторые из новых препаратов модулируют также аденозиновые А1, А2А и А3 рецепторы [50], тогда как другие оказались более активным в качестве аллостерических ингибиторов агонистического связывания с человеческими А1 рецепторами [51].

Недавно были синтезированы новые серии препаратов с различными N–имино заместителями и результаты экспериментов по связыванию рецептор–лиганд и изучению устойчивости показали, что эти соединения являются высоко реакционноспособными. Более того, было показано, что аденозин А3 рецептор играет важную роль в физиологических системах и антагонисты могут использоваться для лечения воспалительных заболеваний, таких как астма и глаукома. Благодаря тому, что производные тиадиазолобензамида используются в качестве новых антагонистов рецепторов аденозина, были разработаны новые аналоги этих соединений с еще большей активностью и высокой селективностью к человеческим аденозин А3 рецепторам [52].

Известно, что нестероидные противовоспалительные препараты являются важными терапевтическими средствами для лечения болевого синдрома и воспалительных процессов. Однако их использование часто ограничивается побочными эффектами в отношении желудочно–кишечного тракта. Механизм их действия основан на понижении образования простогландина путем подавления циклооксигеназы (COX). Этот ключевой энзим в биосинтезе простагландина существует в виде двух изомерных форм: COX–1 и COX–2. Их регулируемое действие предполагает, что селективное подавление COX–2 должно вызывать противовоспалительное действие и не иметь побочных эффектов в отношении желудочно–кишечного тракта. Авторами [53] был выделен ряд 1,2,4–тиадиазолов, содержащих заместитель 2,6–ди–трет–бутилфенол, и являющихся ингибиторами циклооксигеназы и 5–липоксигеназы одновременно. В дальнейшем было исследовано возможное применение этих соединений в качестве селективных ингибиторов и показано, что некоторые члены серии 1,2,4–тиадиазолов активны и селективны относительно COX–2 [54].

В литературе имеются данные о применении соединений тиадиазолов в качестве кардиопротекторных средств, оказывающих действие, как на кровеносные сосуды, так и на само сердце. В работе [55] были оценены 5–оксо– 1,2,4–тиадиазолы (рис. I.5 (а)), которые показали in vitro и in vivo хорошую активность в качестве антагонистов рецептора ангиотензин II и, кроме этого, достаточную усваиваемость в организме при оральном применении. А препарат, структура которого представлена на рис. I.5 (б), проявил кардиопротекторное действие вследствие ингибирования потенциалозависимых Na+–каналов.

Замедление развития вызванных недостаточным кровоснабжением органов Na+– патологий, вызываемое данным препаратом носит кардиопротекторный характер вследствие реперфузии на структурном, метаболическом и функциональном уровне [56,57].

Рис. I.5. Производные 1,2,4–тиадиазола, проявляющие активность в отношении сердечно– сосудистой системы.

гетероциклических соединений на основе тиадиазолов. Известно, что препараты ряда цефалоспоринов широкого спектра действия успешно используются для лечения различных инфекционных заболеваний. Однако они неактивны против бактерии Methicilin–resistant, проникающей через кожные поры и вызывающей сепсис и Pseudomonas aeruginosa–бактерии, живущей в почве и разрушающей органические ткани. С целью усовершенствования цефалоспоринов широкого спектра действия были получены новые –лактамы, на основе различных конденсированных гетероциклов. Эффект достигался введением фрагмента 5– амино–1,2,4–тиадиазол–3–ил и гидроксииминогруппы как заместителя при С–7, и таким образом был получен новый цефалоспорин (рис. I.6 (а)), который проявил чрезвычайную активность против грам–положительных бактерий, включая Methicilin–resistant и грам–отрицательных, включая Pseudomonas aeruginosa.

[58,59].

Рис. I.6. Новые соединения 1,2,4–тиадиазола антибиотического действия.

Кроме этого, представляют интерес тиадиазолидинодионы, являющиеся сильнодействующими и селективными ингибиторами важного энзима дигидрооротат дегидрогеназы (рис. I.6 (б)) [60].

Из обзора литературных данных, очевидно, что лекарственные препараты, основанные на гетероциклических соединениях, содержащих фрагмент 1,2,4– тиадиазола, широко применяются для терапии самых различных заболеваний, среди которых не последнее место занимают нейродегенеративные, в том числе болезнь Альгеймера.

I.4. Свойства некоторых производных 1,2,4-тиадиазола I.4.1. Свойства, определяющие биологическую активность Взаимодействие молекулы лекарственного соединения с рецепторами мишени является ключевым моментом при разработке новых структур молекул фармацевтических препаратов. Однако транспортные свойства играют не менее важную роль в создании биодоступных лекарств. Следовательно, параметры скрининга, характеризующие растворимость, распределение и проницаемость через мембрану являются существенной частью процесса разработки. Исходя из этого, огромную ценность представляет создание корреляционных зависимостей между свойствами сродства к биологическим рецепторам и параметрами, определяющими транспортные характеристики потенциальных лекарственных препаратов. В работе [61] предложены новые методики начального скрининга потенциальных нейропротекторов в широком спектре GluR-лигандов. Авторами были проанализированы свойства новых соединений, имеющих одинаковый фрагмент 1,2,4-тиадиазола и различные функциональные группы в качестве заместителей (рис. I.7) для ингибирования специфического стимулируемого глютаматом захвата ионов кальция в синаптосомах головного мозга крыс.

Главной целью являлась разработка нового подхода для прогнозирования биодоступных препаратов с максимальной специфической активностью.

Чтобы определить степень ингибирования стимулируемого глютаматом захвата ионов кальция была рассчитана величина K43/21, по следующему уравнению:

где Ca1 – приток Ca2+ в холостом опыте (без глутамата и исследуемых соединений); Ca2 – приток Ca2+ в присутствии только глутамата (Glu-Ca-захват);

Ca3 – приток Ca2+ в присутствии только исследуемых соединений (без Glu-Caзахвата)); Ca4 – приток Ca2+ в присутствии Glu-Ca-захвата и соединений.

В случае, когда величина K43/21 составляла 50% и больше, выполнялись дальнейшие исследования.

SN SN SN SN

(VIII) H3C Рис. 1.7. Структурные формулы производных 1,2,4-тиадиазола, исследование которых приведено в работе [61]. В скобках пронумерованы соединения, которые выбраны в качестве объектов исследований представленной диссертации.

Результаты экспериментов для 31 исследуемого соединения суммированы в таблице I. Биологическая активность, описывающая способность к ингибированию глютаматиндуцированного захвата кальция (K 43/21 ), коэффициенты распределения 1-октанол/буфер (pH 7.4) (Dокт/буф) и н-гексан/буфер (pH7.4) (Dгек/буф ), кажущиеся коэффициенты проницаемости (Papp ) для производных 1,2,4-тиадиазола аНе удалось измерить в связи с низкой растворимостью.

соединений с рецепторами не ограничивается влиянием свойств доставки лекарственных соединений, а связано непосредственно с геометрией, топологией, и природой заместителей в молекулах соединения. Дизамещеные изомеры по активности располагаются в следующем порядке: 2-CH3-3-Cl- (30%) и 3-CH3-4-СlС другой стороны, соединения с теми же самыми заместителями, расположенными в различных положениях (3-Cl-4-CH3- и 3-Cl-5-CH3-) имеют приблизительно одинаковые активности (88%), но по сравнению с самым активным веществом - в 2 раза ниже. Таким образом, изученные рецепторы чувствительны к топологии исследуемых молекул. Интересно отметить, что монофенил замещенные соединения 4-СH3- и 4-Cl- имеют приблизительно одинаковую активность (89%), которая сопоставима с активностями дизамещенных изомеров. Следовательно, активность соединения с 4-Clзаместителем существенно увеличивается при введении метильной группы в метаположении кольца фенила (3-CH3-4-Cl-), и значение активности становится сопоставимым с активностью моно-Cl замешенного изомера. CH3 группа в ортоположении 3-Cl-фенил замещенных изомеров улучшает биологическую активность молекулы на 30%, тогда как, соединение с данным заместителем в положениях 4- или 5- приводит к ослаблению данного свойства на 88%. Введение дополнительного Cl-атома в пара- положение наиболее биологически активного изомера изомера моно-Cl (3-Cl-(20)) в пара- положение с образованием соединения 3-Cl-4-Cl-(9)) почти не изменяет активность, и тот же самый эффект проявляется при наличии CH3 -группы в 3-м положении. CF 3-группа в параположении фенильного кольца приводит к максимальному увеличению биологической активности (66%) по сравнению с другими изученными заместителями: CH3- (85%); OC2H5- (110%); Cl- (89%); OHCHCH3- (108%); Fи OCH3- (108%). В свою очередь, биологическая активность 2-Cl- (14) увеличивается почти в 2 раза при введении CF 3- группы в 5- положение с образованием соединения 2-Cl-5-CF3- (11) и со значением K43/21=52%. Кроме того, мембранная проницаемость молекулы увеличивается в 12 раз: с 94.710 7 смс - для (11) до 7.6107 смс 1 для (14), соответственно. Таким образом, наблюдается эффект синхронного улучшения не только биологической активности, но и мембранной проницаемости. Сравнение Сl- и F- фенильных изомеров показало, что 2-F - (15) изомер более активен (79%), чем 2-Cl- (14) (112%). Тогда как, параизомеры имеют приблизительно одинаковые активности: 4-F (10) (88%) и 4-ClВведение дополнительного F-атома в пара- положение изомера 3-Clс образованием 3-Cl-4-F- (4)) приводит к уменьшению активности с 47% до 75%, соответственно.

I.4.2. Процессы распределения соединений между парами несмешивающихся растворителей 1-октанол/буфер (pH 7.4) и н-гексан/буфер (pH 7.4) Так как представленный класс соединений предназначен для орального введения, интересно изучить процессы распределения, происходящие в основных типах мембран, которые соединения преодолевают при достижении мишеней в коре головного мозга. В качестве модельных систем были выбраны пары несмешивающихся растворителей: 1–октанол/буфер (pH 7.4), (описывающая мембраны желудочно-кишечного тракта) и н–гексан/буфер(pH 7.4) (описывающая гематоэнцефалический барьер). При помощи дескрипторов HYBOT были найдены соотношения между физико–химическими характеристиками и коэффициентами распределения. Была построена зависимость log Dокт / буф от дескрипторов, описывающих отношение суммы акцепторного и донорного факторов к поляризуемости ( (C ad / ) ) молекулы.

Очевидно, что коэффициент корреляции данной зависимости низкий. Чтобы улучшить модель, была использована концепция ближайших соседей. Для каждого соединения были сформированы группы, основанные на индексах подобия T с от 0.7 до 1. Значение Dокт/буф было оценено по линейной зависимости, полученной в результате сглаживания экспериментальных точек в пределах группы. Результаты вычисления могут быть описаны уравнением:

log(Dокт/буф)exp = ( – 0.1 ± 0.5) + (1.0 ± 0.2) log(Dокт/буф)cal (I.3) коэффициенты распределения данного класса соединений. Примерно 90% этих следует, что большинство соединений липофильны и, как следствие, они предпочтут липофильные пути доставки для преодоления мембран желудочнокишечного тракта.

Процесс распределения в системе н–гексан/буфер(pH 7.4) был исследован так же, как в предыдущей системе. Для этой цели были получены коэффициенты для 23 производных 1,2,4–тиадиазола и проанализированы корреляции между Dг ек/буф и физико–химическими дескрипторами HYBOT [62]. Анализ показал, что лучшее описание дает дескриптор (Cad/).

Чтобы улучшить прогнозирующую силу модели, была использована концепция ближайших соседей. Результаты вычисления могут быть описаны уравнением:

свидетельствует, что большинство соединений будут предпочитать водные пути доставки для преодоления гематоэнцефалического барьера.

I.4.3. Мембранная проницаемость производных 1,2,4-тиадиазола Значения кажущихся коэффициентов проницаемости для производных 1,2,4–тиадиазола фосфолипидных мембран (таблица 1). Для нахождения корреляции между Papp и независимыми параметрами были использованы дескрипторы HYBOT [62] и концепция ближайших соседей (с анализом индексов подобия Tc) [63]). Анализ показал, что функция log Papp может быть описана дескриптором, отражающим сумму положительных зарядов на атомах молекулы (Q(+)). На следующем этапе было проведено разделение экспериментальных данных на кластеры, включая соединения с индексом Танимото (Tc) от 0.7 до 1. Необходимо отметить, что число элементов в кластерах существенно различается друг от друга.

Сравнительный анализ рассчитанного и экспериментального значения Papp может быть описан уравнением:

log(Papp)exp = (0.04 ± 0.82) + (0.99 ± 0.13) log(Papp)cal (I.6) Таким образом, знание только структурной формулы вещества и числа ближайших соседей в группах дает возможность предсказать значение P app.

Нужно отметить, что только для 21 соединения удалось включить Papp (приблизительно 67% от общего количества изучаемых соединений), и этот факт ограничивает предсказательную силу предложенного подхода, потому что в некоторых кластерах существует только несколько структурно–подобных соседей. Однако уже имеющаяся база данных может быть вполне использована для надежного предсказания значений кажущихся значений коэффициентов экспериментальных данных будет улучшаться и эффективность работы предложенных алгоритмов.

I.4.4. Корреляции между параметрами распределения Как уже было сказано, коэффициенты распределения Dокт/буф и Dгек/буф несут важную информацию о взаимодействии лекарственных соединений с биологическими барьерами. В связи с этим, было проанализировано влияние природы и положения различных заместителей в фенильном кольце 1,2,4тиадиазола на коэффициенты распределения.

На рис. I.8 показана взаимосвязь между коэффициентами распределения производных 1,2,4-тиадиазола в парах несмешивающихся растворителей в логарифмических координатах.

Рис. I.8. Экспериментальные данные в координатах log(Dгек/буф) от log(Dокт/буф) [61].

Пересечение горизонтальной и вертикальной линии обозначает величины log Dокт/буф и log Dгек/буф для «реперного»/незамещенного соединения (1). Каждый сектор описывает влияние заместителя на значения коэффициента распределения по сравнению с незамещенной молекулой (1). Например, верхний правый сектор соответствует увеличению значений Dокт/буф и Dгек/буф. Этот факт означает, что для большинства соединений введение заместителя в фенильное кольцо приводит к одновременному увеличению коэффициентов распределения. Исключение составляют несколько соединений: для 3-SCH3 (16) наблюдаются уменьшение Dокт/буф и увеличение Dгек/буф, тогда как для 2-F (15), 3-Cl- (20), 4-OC2H5- (3), и (28) наоборот: Dокт/буф увеличиваются, а Dгек/буф уменьшаются. Кроме того, для 4OHCH2CH3- (6) и 3-OCH3- (19) значение Dгек/буф растет по сравнению с увеличивается для (19).

Изучая положение заместителя в фенильном кольце, можно сделать приблизительно равны для 2-F- (14) и 4-Cl- (5) изомеров. В свою очередь, для мета- изомера (20), наблюдается существенное увеличение значения Dокт/буф и резкое повышение значения Dгек/буф. Экспериментальные точки, соответствующие 3,4-Cl (9), лежат вдоль прямой линии, соединяющей значения 4-Cl- и 3-Clизомеров. Другими словами, свойства этих изомеров аддитивны. Значительное отличие коэффициентов распределения мета- изомера может быть обусловлено существенными изменениями структуры молекулы в процессе переноса из одной фазы в другую по сравнению с другими изомерами. В то же время, это может быть связано с особенностями мета- изомера, которые отчасти определяют высокую биологическую активность (K43/21) соединений с атомом Cl в метаположении в качестве заместителя: (9), (18), и (4). При анализе результатов для ди- изомеров Cl- и CH3- (2-CH3-3-Cl- (18), 3-CH3-4-Cl- (17), 3-Cl-4-CH3- (8), и 3-ClCH3- (31)) было выявлено следующее: соединения (8), (17), и (31) по значениям Dокт/буф близки к 3-Cl- изомеру. В то время как для соединения (18) коэффициент распределения на порядок ниже. Значения Dгек/буф для (8) и (31) различаются в три раза, в то время как для (17) и (18) это различие незначительное. Метил- изомеры 3-СH3- (12) и 4-СH3- (2) близки и лежат вдоль линии, соединяющей Cl- изомеры.

Кроме того, соединение 2-CH3-3-Cl- (18) также находятся на этой линии (на рис.

I.8 - черный пунктир), что доказывает аддитивность свойств хлор- и метилизомеров. Изомеры фтора (2-F- (15), 4-F3- (7), и 4-F- (10)), так же как дизамещеный фенил с атомами фтора ((4) и (11)) лежат в координатах (Dгек/буф) / (Dокт/буф) на линии, отмеченной синим пунктиром. Коэффициенты распределения значительно повышаются при замене 2-F- на 4-F- изомер. Замена фтора в параположении на CF 3-группу также приводит к существенному увеличению значений Dокт/буф и Dгек/буф. Анализируя две линии можно сделать вывод, что возможно целенаправленно изменять липофильные и гидрофильньные свойства данного класса соединений. Сравнение свойств 4-СH3- (2) и 4-ОCH3- (13) соединений показало, что введение дополнительного гидрофильного атома кислорода в метильную группу приводит к уменьшению Dокт/буф и увеличению Dгек/буф. В свою очередь, замена CH3- группы на метокси- заместитель с образованием 4-C2H5- (3)) приводит к увеличению Dокт/буф и существенному уменьшению Dгек/буф. Интересно отметить, что наличие метокси- заместителя в мета- положении приводит к значительному уменьшению Dгек/буф и небольшому повышению Dокт/буф по отношению к пара- положению данного заместителя. Введение кислородного атома в 3-СH3- (12) с образованием 3-OCH3- (19)) слабо уменьшает липофильность и значительно - Dгек/буф, тогда как замена кислорода на атом серы в 3-SCH3- (16) приводит к незначительному изменению Dгек/буф, и сушественному уменьшению Dокт/буф. И, наконец, переход от заместителя 4-ОC2H5- (3) к 4ОHCH2CH3- (6), ведет к резкому уменьшению липофильности, в то время как значение Dгек/буф остается тем же.

I.4.5. Взаимосвязь между коэффициентами мембранной проницаемости и Чтобы проанализировать соотношение между параметрами мембранной проницаемости ( Papp ) и специфической биологической активностью ( K 43 / 21 ), экспериментальные данные исследуемых соединений были представлены в координатах зависимости log K 43 / 21 от log( Papp ) (рис. I.9).

Рис. I.9. Экспериментальные данные в координатах log(Papp ) от K 43/21 [61].

Все соединения могут быть условно разделены на 4 группы: I – с высокой проницаемостью и высокой активностью (110–6 < Papp (см·с -1); 0 < K 43 / 21 < 100%);

II – с высокой проницаемостью и низкой активностью (110–6 < Papp ; 100 < K 43 / 21 );

III – с низкой проницаемостью и высокой активностью (Papp < 110–6; 0 < K 43 / 21 < 100); IV – с низкой проницаемостью и низкой активностью (Papp < 110–6; 100 < K 43 / 21 ).

Соединения в классах I и III являются перспективными с точки зрения их дальнейшего тестирования. Кроме того, соединения группы I предпочтительнее соединений группы III. В свою очередь, соединения в группах II и IV не подходят для дальнейших исследований и должны быть структурно изменены в направлении улучшения необходимых свойств “проницаемость–активность”, чтобы перейти в «перспективные» группы. Самыми оптимальными свойствами “проницаемость–активность” обладают CF 3–фенильные производные 1,2,4– тиадиазола (7, 11), которые могут быть рекомендованы как вещества для дальнейших биологических и предклинических тестов.

Анализ хлор– производных 1,2,4–тиадиазола (пара- (5); мета– (20) и орто– (14)) приводит к следующим выводам. Особенности проницаемости соединений (5) и (14) близки между собой, однако значения активности отличаются:

соединение (5) принадлежит группе III, тогда как (14) – группе IV. Изомер (20) намного более активен, чем соединения (5) и (14). Однако, значение проницаемости для (20) в 4 раза ниже, чем проницаемости изомеров (5) и (14).

Трудно принять решение однозначно, относительно рекомендации для дальнейшего тестирования вещества (20). Но если принимать во внимание максимальный биологический эффект, то это соединение может быть предложено для последующих исследований.

F– изомеры 1,2,4–тиадиазола (пара- (10) и орто- (15)) примерно расположены в пограничной области групп I и III. Этот факт подтверждает незначительные преимущественные различия между данными молекулами и молекулами, расположенными в этих областях. Однако, пара–изомер (10) обладает более высокой проницаемостью, тогда как у орто-изомера (15) есть лучшее сродство к биологическим рецептором.

Для метил- изомеров 1,2,4–тиадиазола (пара- (2) и мета- (12)), замена метана пара- положение приводит к повышению биологической активности, тогда как мембранная проницаемость при этом уменьшается. Соединение (12) принадлежит группе IV, тогда как соединение (2) – к группе III.

Для этокси–изомеров 1,2,4– тиадиазола (пара- (13) и мета- (19)), подобная замена, приводит к противоположному эффекту. Действие на рецепторы снижается, тогда как мембранная проницаемость остается приблизительно такой же.

Было проанализировано влияние природы заместителей в пара– положении фенильного кольца на свойства “проницаемость–активность”. Результаты анализа представлены на рис. I.9 (красные линии), а экспериментальные значения могут быть описаны уравнением:

Таким образом, используя данное уравнение, по экспериментальным значения K43/21 для пара– производных 1,2,4–тиадиазола. Было рассмотрено комбинированное воздействие двух заместителей в фенильном кольце 1,2,4– тиадиазола на свойства “проницаемость–активность” в сравнении с моно– производными. Из сопоставления свойств соединений (17) (пара– Сl- и мета– CH3-), (5) (пара– Сl-) и (12) (мета– CH3-) следует, что мембранная проницаемость существенно. В случае сравнения соединений (4) (пара– F- и мета– Сl-), (10) (пара– F-) и (20) (мета– Сl-), наблюдается абсолютно противоположный эффект.

Аномально низкое значение K43/21 для (20) (47 %) и высокое - для (10) (88 %) дает среднее значение для (4) (75 %). Аналогичная закономерность (но с противоположным эффектом) наблюдается для мембранной проницаемости.

Таким образом, имеет место противоположный эффект F- и Сl- заместителей на свойства “проницаемость–активность”.

I.4.6. Поиск алгоритмов для прогнозирования молекулярных структур с Важнейшее значение имеет разработка алгоритма для прогнозирования соединений, имеющих как высокое сродство к биологическим рецепторам, так и хорошие транспортные свойства мембранной проницаемости. Разработка такого алгоритма может осуществляться по двум направлениям. Первое - заключается в сочетании корреляционных уравнений: log( Papp ) - Q(+) и log( K 43 / 21 ) - log D с использованием метода ближайших соседей. Таким образом, зная структурную формулу молекулы, мы можем прогнозировать мембранную проницаемость. С другой стороны, знание коэффициентов распределения изучаемых молекул в системе 1-октанол/буфер(pH 7.4) и н-гексан/буфер(pH 7.4) позволяет нам предсказать специфическую биологическую активность. Второй путь требует знания только структурной формулы молекулы без проведения дополнительных экспериментов. В данном случае возможно определить коэффициенты распределения 1-октанол/буфер(pH 7.4) и н-гексан/буфер(pH 7.4) при помощи корреляционных уравнений с применением физико-химических дескрипторов.

Далее специфическая биологическая активность нового соединения может быть установлена по разнице коэффициентов распределения.

I.5 Подход к синтезу производных 1,2,4-тиадиазола Все исследуемые в данной работе соединения были синтезированы в Институте физиологически активных веществ РАН (Московская область, г.

Черноголовка), согласно схеме, представленой на рис. I.10.

Рис. I.10. Схема синтеза новых 1,2,4-тиадиазолов [64].

N,N-дизамещенные 5-амино-3-(2-оксипропил)-1,2,4-тиадиазолы (5) были получены в две стадии. Первая стадия — реакция 5-метил-изоксазолил-3изотиоцианата (1) [65] с вторичными аминами (2) в апротонных растворителях (ДМСО, СН3СN), при которой происходит рециклизация промежуточных тиомочевин (3) в тиадиазольное кольцо за счет атаки нуклеофильной тиокарбонильной группой связи NO изоксазольного цикла. Вторая стадия — взаимодействие N,N-дизамещенных 5-амино-3-(2-оксопропил)-1,2,4-тиадиазолов (4) с боргидридом натрия в метаноле, при которой происходит восстановление кетогруппы до гидроксильной.

I.6. Подходы к описанию топологии сеток водородных связей Водородные связи играют важную роль в процессах зародышеобразования и роста молекулярных кристаллов. Причем существенным является не только сила водородного связывания, но и топология образующихся сеток (одномерные, двумерные и трехмерные). На сегодняшний день одним из признанных подходов для описания сеток водородных связей является подход, разработанный Эттер [66] и в дальнейшем расширенный Бернштейном [67], который основан на использовании теории графов.

Целью использования топологических графов является описание топологии сеток водородных связей и выделение общих закономерностей образования молекулярных агрегатов в кристаллах. Наборы графов описывают топологическую структуру водородно-связанных образований/кластеров и число вовлечённых доноров и акцепторов водородных связей. Граф водородных связей, в общем случае, обозначается как Gda (r ), где G определяет тип системы водородных связей, a и d – число акцепторов и доноров, участвующих в образовании водородной связи, r – общее число атомов, вовлеченных в данную систему. Символ графа G описывает структуру водородного связывания и может быть одним из четырёх типов: S, C, R и D.

Рис. I.11. Различные типы графов водородной связи.

Внутримолекулярная водородная связь обозначается S. Бесконечным Межмолекулярные кольца обозначаются R. Символу D соответствуют конечные нециклические межмолекулярные водородные связи (диады). Нижний и верхний индексы опускают в тех случаях, когда оба значения равны единице, как, например, для S, C и D. Число атомов, вовлеченных в систему водородных связей, также опускают в том случае, если данная система состоит только из двух атомов – донора и акцептора, что соответствует D. Граф, содержащий один единственный тип водородной связи, называется мотивом (или диагональным элементом матрицы водородных связей) [68]. Перечень всех мотивов, представленных в кристалле, определяет сетку водородных связей. Если кристаллическая структура содержит два различных мотива из водородных связей типа a и b, то в этом случае возможно образование сетки водородных связей типа ab, или сетки водородных связей второго уровня. Три различных типа водородных связей образуют сетки водородных связей третьего уровня и т.д.

I.7 Некоторые методы для вычисления энергий кристаллических решеток Межмолекулярные взаимодействия – это взаимодействия молекул между собой, не приводящие к разрыву или образованию новых химических связей.

Несмотря на то, что природа межмолекулярных сил в конденсированных фазах хорошо известна, количественное теоретическое описание этих сил затруднено, сопоставимы с размерами самих молекул. Приближенные формулы, выведенные для газов при нормальных условиях и справедливые при значительных расстояниях между молекулами (порядка десяти молекулярных диаметров), теряют свое значение в конденсированной фазе.

взаимодействующих друг с другом при помощи межмолекулярных несвязанных взаимодействий. Энергия кристаллической решетки (энергия несвязанных взаймодействий), Elatt, включает в себя три основных вклада: Ван–дер– Вальсовскую (Evdw), электростатическую (Ecoul) энергию и энергию образования водородных связей (EHB):

Эти взаимодействия определяются суммированием межатомных энергий между парами несвязанных атомов, то есть атом – атомных потенциалов [69].

Основными допущениями, лежащими в основе этих вычислений, являются:

сферическая симметрия потенциалов, их аддитивность и независимость длин ковалентных связей от состояния вещества. Исходя из этого, типы несвязных взаимодействий могут быть параметризованы, независимо от структуры и топологии молекулы.

Математическим выражением энергии решётки является уравнение I.7.2:

где индекс i соответствует номеру атома в реперной молекуле, относительно которой рассматриваются соседние молекулы; j – номер атома, соответствующий молекулам, находящимся в соседстве с реперной молекулой.

Для каждой пары атомов энергия Eij рассчитывается из потенциальных функций и параметров подходящего силового поля.

Главный вклад в энергию притяжения в молекулярных кристаллах вносят пропорциональны шестой степени межатомных расстояний. Кроме того, Энергия отталкивания является одной из важных энергетических составляющих в уменьшением межатомного расстояния, ri,j, может быть описано членом rijn (с n, выбранным в результате оптимальной подгонки с экспериментальными данными) или экспоненциальным членом exp(– Cri,j) (с С, подогнанным аналогичным образом, что и n) Некоторые исследователи (Китайгородский [70], Крэйг (Craig) [71]) показали, что вклад в энергию кристаллической решетки от электростатических дипольных и квадрупольных взаимодействий для типичных молекулярных кристаллов мал.

I.7.1 Ван–дер–Вальсовские взаимодействия Наиболее широко используемой потенциальной функцией для Ван-дерВаальсовского вклада EvdW являются потенциалы Ленарда – Джонса 12 – 6 [72]:

Или Бэкинга (6 – exp) [73] где А, В и С являются эмпирическими параметрами, а rij – межатомное расстояние между атомами i и j.

отталкивания, тогда как отрицательный (r–6) вклад относится к силам притяжения.

В молекулярной механике суммирование двух данных вкладов рассматривается как Ван–дер–Вальсовское взаимодействие.

I.7.2 Кулоновские (электростатические) взаимодействия Вклад кулоновских взаимодействий рассчитывается согласно модели атомных точечных зарядов:

проницаемость.

Следует подчеркнуть, что для органических молекул вычисление данного вклада становится весьма сложной задачей, поскольку трудно определить точечное расположение атомного заряда легко поляризуемых атомов. Поэтому ряд авторов (например, Гавезотти [74]) считает, что более правильной процедурой является включение электростатического вклада в расчет Ван–дер–Вальсовской энергии, где предварительно уже внесены поправки в равновесные межатомные расстояния за счет статистической обработки экспериментальных значений, полученных из рентгеноструктурных данных. Но даже и в таком приближении расчёт электростатических вкладов остаётся всё ещё проблематичным [75].

Особым случаем специфического взаимодействия является водородная связь. Эта связь образуется между атомом водорода, химически связанным в молекуле с некоторым электроотрицательным атомом D, и электроотрицательным атомом A другой молекулы (межмолекулярная водородная связь) или той же самой молекулы (внутримолекулярная водородная связь).

Энергия водородных связей включает в себя два вклада: энергию кулоновских взаимодействий и энергию несвязанных Ван–дер–Вальсовских взаимодействий. Кроме того, энергия такого связывания существенно зависит от угла связи. Следовательно, потенциал Леннард–Джонса 12–6 в данном случае оказывается не пригодным для расчета EHB. Для оценки данного параметра наиболее часто используется выражение силового поля CHARMM [77]:

где – угол водородной связи, С и D – эмпирические константы.

Использование 10–ой степени в уравнении I.13 объясняется поправкой на расстояние между донором и акцептором водородной связи.

Энантиомерами являются пары оптических антиподов - веществ, характеризующихся противоположными по знаку и одинаковыми по величине вращениями плоскости поляризации света. Необходимая и достаточная причина возникновения оптических антиподов - принадлежность молекулы к одной из следующих точечных групп симметрии C n, Dn, T, O или I. Чаще всего речь идет об асимметрическом атоме углерода, то есть об атоме, связанном с четырьмя разными заместителями. Процесс взаимопревращения энантиомеров называется рацемизацией, которая приводит к исчезновению оптической активности в результате образования эквимолярной смеси ()- и (+)-форм, то есть рацемата.

Одним из случаев рацематов является рацемическое соединение, в элементарной ячейке кристаллической решетки которого содержится одинаковое число энантиомеров. Взаимопревращение диастереомеров приводит к образованию смеси, в которой преобладает термодинамически более устойчивая форма.

Механизм действия большинства биологически активных веществ заключается в их взаимодействии со специфическими рецепторами. Эти рецепторы обладают определенной пространственной структурой, поэтому избирательное действие соединений, отличающихся биологической активностью, действующих посредством рецепторных механизмов, зависит от их пространственного строения (оптической и геометрической изомерии). У большинства лекарственных соединений существует взаимосвязь между пространственной структурой и фармакологической активностью, т.е.

стереоспецифичность действия. При взаимодействии с хиральными компонентами организма (белки, ферменты, рецепторы), биологическую активность проявляет лишь один энантиомер лекарства, в то время как другой энантиомер активности не проявляет или вызвает совершенно нежелательный эффект. Например, антиаритмическое средство S(–)-анаприлин действует в раз сильнее, чем R(+)-форма. В случае верапамила оба энантиомера обладают сходным эффектом, однако его R(+)-форма обладает значительно менее сильным побочным кардиодепрессивным эффектом. Применяющийся для наркоза кетамин может у 50% пациентов вызвать побочные эффекты в виде возбуждения, бреда и т.п., причем это присуще, в основном, только R(–)-изомеру, а также рацемату. У антигельминтного препарата левамизола активен в основном в S(–)-изомер, тогда как его R(+)-антипод вызывает тошноту, поэтому в свое время рацемический левамизол был заменен одним из энантиомеров.

Исходя из вышеизложенного, требования к оптической чистоте препаратов постоянно растут. Например, в США уже сейчас хиральные медпрепараты могут быть допущены к продаже только в виде чистых энантиомеров, а не в виде рацемических смесей, как это было ещё несколько лет назад и как это продолжает оставаться в Российской Федерации. В связи с этим, производителям приходится существенно модифицировать многие технологические процессы, а также разрабатывать новые эффективные методы разделения энантиомеров.

Наиболее часто используемыми для решения таких задач методиками являются рентгеноструктурный анализ и ДСК. Однако, в силу сложности экспериментального исследования различий в свойствах хиральных соединений, особое место в последнее время стало уделяться компьютерному моделированию, как одному из альтернативных путей изучения этой задачи [76-78]. Понимание межмолекулярных взаимодействий, ответственных за распознавание хиральных форм в кристаллах лекарственных соединений, может, несомненно, привести к их оптимальному (рациональному) дизайну с использованием направленной кристаллизации.

Промышленное производство чистых энантиомеров включает в себя либо разделение, либо стереоселективный синтез. Процесс разделения может быть проведен в несколько стадий, каждая из которых представляет собой сложный синтез. Наиболее желательно разделение на первых ступенях, поскольку это дает возможность для более эффективного построения технологических цепочек.

Вопреки достижениям, полученным в энзиматическом разделении и асимметрическом каталитическом синтезе, классическая кристаллизационная методика по-прежнему продолжает играть главную роль в промышленном производстве чистых энантиомеров, поскольку она включает в себя огромный потенциал и реальную важность, связанную с разделением больших объемов продукции. Однако следует отметить, что направление, связанное с кристаллизационными методиками, разрабатывалось на основе проб и ошибок в отсутствие фундаментального понимания термодинамики и кинетики происходящих процессов. Поэтому, для оптимизации техники разделения, необходимо определить факторы, контролирующие зародышеобразование, а также рост энантиомеров и рацемических соединений, как в объеме, так и на молекулярном уровне.

ГЛАВА II. ОПИСАНИЕ РАСТВОРИТЕЛЕЙ, МОДЕЛИРУЮЩИХ

БИОЛОГИЧЕСКИЕ СРЕДЫ

II.1. Водные буферные растворы с физиологическими значениями pH Биологическая активность во многих случаях является ключевым моментом для отбора потенциальных кандидатов лекарственных соединений, тем не менее, другие факторы, такие как растворимость, распределение в несмешивающихся фазах, абсорбционные свойства, характеристики активного и пассивного транспорта не менее значимы для in vivo процессов.

Проблемы, связанные со свойствами ионизации и липофильности соединений, вносят существенные ограничения в процесс проникновения веществ через различные типы мембран в организме [79]. Большинство молекул лекарственных веществ являются слабыми кислотами или основаниями. Поэтому в зависимости от pH водной среды, они могут существовать в ионизированном или неионизированном состоянии. Степень ионизации молекулы определяется величиной десятичного логарифма константы диссоциации, pKa. При этом растворимость вещества при данном значении рН рассчитывается по уравнению [80]:

где S0 – растворимость вещества в нейтральной форме.

Таким образом, общая растворимость вещества находится как сумма растворимостей заряженных и нейтральных частиц. Доля ионизированных молекул при данном значении рН (f(D-) или f(D+) в %) определяется как:

Большинство биохимических реакций протекают в строго определённых интервалах pH. Одной из важных, с точки зрения пассивного транспорта, является среда плазмы крови с рН 7.4. Отклонение данного значения всего лишь на 0. единицы приводит порой к необратимым патологическим изменениям [81].

Поддержание кислотно–щелочного равновесия крови обусловлено гидрокарбонатной, фосфатной, гемоглобиновой буферными системами, а также белками плазмы.

В нашей работе изучение растворимости молекулярных кристаллов 1,2,4– тидиазолов проводилось в фосфатном буферном растворе со значением pH 7.4.

Рассмотрим механизм действия фосфатного буфера на основании кислотно – основных равновесий:

Донором протона является ион H 2 PO4, акцептором протона – ион HPO 4.

При добавлении сильного основания к буферной системе равновесие (II.5) смещается вправо, то есть ионы H 2 PO4 диссоциируют до восстановления первоначальной концентрации протонов. Следовательно, pH системы не изменяется. При добавлении сильной кислоты к буферной системе, сопряжённое основание HPO 4 (II.5) связывает избыток протонов, превращаясь в слабую кислоту H 2 PO4. Таким образом, в системе поддерживается постоянная концентрация протонов.

Следует отметить, что состав буферного раствора был максимально приближен к составу соответствующей биологической среды и содержал фосфатные соли калия и натрия (КH2PO4 и Na2HPO4). Концентрации используемых солей были взяты таким образом, чтобы значения ионной силы полученных растворов соответствовали 0.15 (физиологическое значение).

1-Октанол (октанол), как индивидуальный, так и насыщенный водой является удобным растворителем для моделирования липидного слоя клеточной мембраны. В фармакологии коэффициент распределения в системе (вода– октанол) используется для прогнозирования фармакокинетических свойств лекарственных молекул. Коэффициенты распределения (вода–октанол) часто используются в виде дескрипторов корреляционных уравнений для прогнозирования биологической активности лекарственных соединений. 1Октанол достаточно хорошо имитирует основные свойства биологически важных липидов, хотя и не может образовывать типичные липидные структуры, такие как бислои и мицеллы.

Как отмечалось в литературе [82], структуру 1-октанола и его смесей с водой однозначно определить сложно. Большинство разнообразных спектральных методов позволяет анализировать только косвенные данные [83,84].

Дифракционные методики хоть и позволяют получать прямую структурную информацию [85,86], тем не менее задача создания подходящей модели на основе дифракционных данных особенно сложна для жидкофазных систем. Подробное изучение структуры чистого и гидратированного октанола методами молекулярной динамики [87] показало, что внутренняя структура среды жидкого 1–октанола может быть разделена на четыре уровня структурной классификации:

1) индивидуальные молекулы; 2) связанные водородными связями агрегаты или кластеры; 3) области, содержащие относительно повышенную или пониженную концентрацию полярных групп; 4) инвертированные мицеллярные образования.

В работе Стефена с соавторами [88] показано, что с повышением температуры увеличивается общее количество кластеров, при этом среднее количество молекул 1–октанола в одном кластере уменьшается с 10.4 при 400 С до 7.4 при 750 С. Повышение температуры приводит к уменьшению относительного количества циклических структур и повышению доли линейных и разветвленных цепей, а также к росту количества мономеров. Хотя в чистом 1– октаноле могут существовать агрегаты очень большого размера (порядка молекул при 400 С и 40 молекул при 750 С), однако выявлена тенденция к преимущественному образованию четырех–, пяти– и шестичленных кластеров и заметен дефицит двух– и трехчленных ассоциатов.

В 1-октаноле обнаружены области, содержащие относительно повышенную или пониженную концентрацию полярных групп. Гидрофильные группы ассоциируются с другими гидрофильными группами, находящимися в непосредственной близости. В свою очередь, гидрофобные группы также имеют тенденцию к скоплению.

Оптимальное расположение и ассоциацию «похожих» (подобных) групп посредством образования агрегатов, имеющих сходство с инвертированными мицеллами, облегчается вследствие амфифильного характера строения молекулы 1–октанола. При этом наблюдается тенденция к образованиию областей с небольшими инвертированными мицеллообразными частицами, которые преобладают во всех составах, от инвидуального октанола до октанола, насыщенного водой. Такие агрегаты называют минимицеллами. Средний диаметр области полярного ядра, образуемого при агрегации чистого 1–октанола в инвертированные минимицеллы, оценивается в 7.75, максимальный мицеллярный диаметр составляет 17.8 – 18.6, что дает 11.0 – 12.7 молекул на одну минимицеллу. Углеводородная цепная часть молекулы октанола может удлиняться примерно на 9.5, и значительная часть цепей полностью выпрямлена. Диаметры соседних минимицелл способны частично перекрываться в результате взаимного проникновения цепей, а также других эффектов упаковки.

Полярные ядра имеют тенденцию к образованию вытянутых эллипсоидов. С увеличением содержания воды в октаноле полярные области увеличиваются в диаметре и принимают сферическую форму. Хотя размер кластера с увеличением степени гидратации растет, его общая форма остается практически постоянной, образуя при этом вытянутый эллипсоид. С увеличением в системе содержания воды, распределение кластеров по размерам становится более однородным, приобретая тенденцию к образованию более крупных агрегатов. Это смещение отражается в среднем количестве молекул, приходящихся на один кластер, которое примерно в четыре раза больше в октаноле, насыщенном водой, чем в индивидуальном. Распределение кластеров по размеру в гидратированных системах также выявляет относительный дефицит двух- и трехчленных кластеров и, наоборот, обогащение кластерами, содержащими от 4 до 7 молекул, хотя это выражено не так явно. Таким образом, Жюстин с соавторами [82,87] сделали вывод, что при добавлении воды модель 1–октанола мало изменяется. При некотором изменении формы и размера молекулярных кластеров общая структура жидкости остается относительно неизменной, что подтверждается данными спектроскопических [89–92] и дифракционных [85] экспериментов.

Представленный анализ особенностей внутренней структуры среды индивидуального и гидратированного 1–октанола помогает выяснить механизм, определяющий его способность к удачному моделированию клеточной мембраны.

Насыщенный водой 1–октанол имеет в своем составе водные – полярные (представленные полярными ядрами инвертированных мицеллярных тел) и неполярные алкильные «хвосты» молекул, которые группируются вне этих полярных областей. Молекула лекарства может распределяться между этими противоположными областями, избирательно мигрировать аналогично тому, как происходит распределение лекарственного соединения в аналогичных водных или липидных частях биологических мембран. Очевидно, что гидрофильные фрагменты будут преимущественно располагаться рядом или внутри полярного ядра инвертированной минимицеллярной области. Подобно этому, гидрофобные фрагменты будут преимущественно мигрировать к областям с преобладающим содержанием углеводородных алкильных «хвостов». Амфифильное вещество, каковыми является большинство лекарств и метаболитов, как можно ожидать, выберет некий компромисс, вероятно, путем распределения на границах ядра и периферии инвертированных мицеллярных агрегатов.

Результаты изучения влияния на структуру 1–октанола различных растворенных веществ расчетными и экспериментальными методами [93] показывают, что введение, например, гидрофобного растворенного вещества, не образующего водородные связи, может сдвигать равновесие образования комплексов с растворителем в сторону преимущественного образования комплексов с более низкими числами ассоциации и будет вызывать образование более полярных комплексов растворенное (вещество–растворитель). Молекулы растворенных веществ определенной формы и размера могут препятствовать упаковке цепей и трехмерных молекулярных каркасов, образованных молекулами октанола, или свободе движения таких ассоциатов растворителя.

Для соединений, проявляющих биологическую активность к рецепторам, находящимся в головном мозге (к которым и относятся препараты для терапии болезни Альцгеймера), широко применяется система (н-гексан/буфер) для моделирования гематоэнцефалического барьера. н-Гексан в данном случае (способный только к неспецифическим взаимодействиям) имитирует неполярные области головного мозга, тогда как буфер – кровеносную систему.

По способности к специфическому взаимодействию с растворенным веществом н–гексан (наряду с циклогесаном, четыреххлористым углеродом, бензолом и др.) относится к аполярным апротонным растворителям и обычно используется в качестве инертного растворителя, вследствие неспособности его молекул к участию в образовании водородной связи ни в качестве доноров, ни в качестве акцепторов протонов [93]. Взаимодействие молекулы н-гексана с молекулами растворенного вещества происходит исключительно за счет Ван– дер–Вальсовского взаимодействия. Поэтому, исследование процессов растворения и сольватации изучаемых соединений в н–гексане и дальнейший количественный анализ термодинамических параметров переноса из н–гексана в специфических/неспецифических взаимодействий в общую энергию сольватационных процессов.

II.4. Коэффициенты распределения 1–октанол/вода, н–гексан/вода II.4.1. Коэффициент распределения 1–октанол/вода Принимая во внимание то, что наряду с растворимостью в воде важнейшим свойством, определяющим процесс прохождения молекул через клеточные мембраны, является липофильность, особое значение приобретает изучение имитирующими стенки биологических мембран. Простой и в то же время информативной моделью для получения необходимых параметров распределения является системы (1-октанол/вода) и (н-гексан/вода). Коэффициент распределения (1-октанол/вода) (P или logP), является одним из наиболее часто применяемых параметров в процессе разработки новых лекарств. Данный параметр широко используется для оценки проницаемости через различные биологические барьеры, в том числе и гематоэнцефалический, что является существенным фактом при создании нейродегенеративных препаратов [80]. Кроме этого, logP является мерой липофильности соединения – свойства, оказывающего значительное влияние на ADME (абсорбция, распределение, метаболизм и выделение) параметры и в целом на фармакологическую активность [94].

Коэффициент распределения определяется как отношение концентраций вещества в 1–октаноле ( С HA ) и водной фазе ( С HA ):

Равенство (II.6) справедливо лишь в том случае, если в равновесии находится неионизированная (молекулярная) форма вещества. При диссоциации молекулы в водной фазе в системе устанавливается новое равновесие (рис. II.1):

Рис. II.1. Схема, описывающая различные равновесия в водной и октаноловой фазах.

В этом случае коэффициент распределения обозначается как D и определяется следующим уравнением:

где С HA и C A концентрации молекулярной и диссоциированной форм в воде. Связь между коэффициентами распределения Р и D можно представить в следующем виде:

где K a константа диссоциации молекулы ЛС. Однако чаще уравнение (II.9) записывают в логарифмической форме:

Таким образом, зная logP и pK a соединения, можно предсказать logD при любом значении рН. Известно, что ионизированные молекулы обладают большим сродством к полярной водной фазе. Поэтому, молекулы в нейтральном состоянии будут проникать через биологические мембраны быстрее их заряженных форм.

Для слабых кислот это означает, что их абсорбция наиболее эффективна при низких значениях pH, например, в желудке, где поддерживается кислая среда. Эта теория носит название гипотезы рН распределения [95]. Значение величины logD при этом будет зависеть от соотношения нейтральных и заряженных молекул в растворе. Как было показано выше (уравнение II.9), доля ионизированных молекул слабой кислоты увеличивается с ростом значения рН, что, в свою очередь, будет причиной уменьшения logD.

Комер [96] приводит эмпирические зависимости между величиной коэффициента распределения при рН 7.4 (logD7.4) и некоторыми физико– химическими и биологическими свойствами лекарственных соединений:

logD7.4 < 1. Вещества имеют хорошую растворимость, но низкую абсорбцию и проницаемость. Для молекул данного класса с низкой молекулярной массой характерен трансклеточный механизм распределения;

1 < logD7.4 < 3. Этот интервал является наиболее благоприятным.

Вещества данного класса имеют высокую абсорбцию, благодаря хорошему балансу между растворимостью и проницаемостью путем пассивной диффузии;

3 < logD7.4 < 5. Соединения имеют хорошую проницаемость, но низкую абсорбцию вследствие плохой растворимости;

logD7.4 > 5. Вещества данного класса обладают низкой абсорбцией и биодоступностью вследствие плохой растворимости и имеют длительный период выведения, т.к. долго задерживаются в тканях человеческого организма.

II.4.2. Коэффициент распределения н–гексан/вода Наряду с коэффициентом распределения (1–октанол/вода), важную роль при оценке проницаемости биологических мембран играет коэффициент распределения (н–гексан/вода) [80]. Проницаемость соединения через гематоэнцефалический барьер обусловлена неспецифическими взаимодействиями. Для прогнозирования проницаемости через данный барьер используется параметр logP, равный:

где logPow – коэффициент распределения (1-октанол/вода), logPhw – коэффициент распределения (н–гексан/вода). По данному параметру судят о вкладе водородных связей в процесс распределения. В ряду соединений увеличение logP обычно свидетельствует об уменьшении их проницаемости через гематоэнцефалический барьер.

ГЛАВА III. ОПИСАНИЕ ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В РАБОТЕ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ МЕТОДИК

III.1. Метод переноса вещества инертным газом– носителем Для определения давления насыщенного пара (p) молекулярных кристаллов лекарственных соединений, использовался метод переноса вещества инертным газом– носителем. Суть его заключается в измерении концентрации исследуемого вещества, находящегося в газовой фазе при термодинамическом равновесии с твердой фазой.

III.1.1. Установка для измерения давления насыщенного пара На рис. III.1 представлена схема установки для измерения давления насыщенного пара. Инертный газ–носитель из баллона поступает в колонку с активированным силикагелем, с целью осушения. Затем газ проходит через контроллер потока (mass flow controller) MKS марки 1259CC– 00050SU, который предназначен для регулирования скорости подачи газа с точностью ± 0.01%. На следующем этапе газ поступает в трубчатую печь длиной L = 1000 мм и диаметром рабочего отверстия d = 30 мм (L/d = 33.3). Такой выбор геометрии печи позволяет поддерживать температуру в рабочей зоне, длина которой составляет l = 150 мм, с точностью ± 0.01К. Контроль температуры осуществляется с помощью регулятора ВРТ– 2. В качестве инертного газаносителя был использован азот.

В соответствии с выполняемой функцией печь можно условно разделить на три зоны. Зона A служит для достижения газом температуры эксперимента.

Данный участок трубчатой печи заполняется шариками из пирекса диаметром 2– 3 мм, для более эффективного прогревания газа до рабочей температуры. В средней зоне Б происходит медленная сублимация исследуемого вещества.

Вещество наносится на такие же шарики, что существенно увеличивает площадь соприкосновения «газ–вещество» и, соответственно, повышает эффективность насыщения инертного газа парами изучаемого соединения. В зоне C расположен горизонтальный участок конденсатора, необходимый для осаждения унесённого газом вещества. В отдельных случаях для более эффективной кристаллизации к конденсатору присоединяли U– образную трубку, помещённую в сосуд Дюара с жидким азотом. Чтобы предотвратить попадание влаги в конденсатор, в его свободный конец вставляли затвор с CaCl2.

Калибровка установки проводилась по бензойной кислоте с энтальпией сгорания H comb = –3228.07 кДжмоль-1и энтальпией плавления H fus = 18. кДжмоль-1 [97]. Полученное значение энтальпии сублимации в температурном интервале 34.2 81.3С составляет H sub = 90.5 0.3 кДжмоль-1 и находится в хорошем соответствии с рекомендованным ИЮПАК значением H sub = 89.7 0. кДжмоль-1.

Рис. III.1. Схема установки для определения давления насыщенного пара методом переноса вещества инертным газом–носителем.

III.1.2. Расчет давления насыщенного пара и термодинамических Количество унесенного газом – носителем вещества определяется спектрофотометрически. Производится измерение оптической плотности раствора, который образуется при промывке конденсатора растворителем. Зная коэффициент поглощения [лмоль–1см–1] данного соединения в растворителе рассчитывается концентрация раствора с [мольл–1] по закону Бугера Ламберта Бера:

где l – величина оптического пути. Масса унесенного вещества g [г] определяется как:

где M – молекулярная масса вещества, Vsol – объем растворителя, используемого при промывке [л].

Поскольку давление насыщенного пара p [Па] мало, то делается допущение, что паровая фаза подчиняется законам идеального газа:

где V* – суммарный объём газа–носителя при температуре эксперимента T [K] с учетом его теплового расширения; R – универсальная газовая постоянная; n = g/M – количество моль унесенного вещества; M – молярная масса;

где Tr – температура в жидкостном термостате Tr=298.15 K; V [л] – объем газа–носителя, измеренный при Tr; h [лчас -1] – скорость газа– носителя, замеренная MKS при Tr; t [час] – время проведения эксперимента.

Учитывая уравнения (III.2–III.5) получаем конечную формулу:

Скорость газа–носителя при прохождении через измерительную ячейку должна быть такой, чтобы успевало устанавливаться термодинамическое равновесие между исследуемым веществом и его парами. При слишком низких значениях h возникают ошибки в определении равновесного значения p за счет влияния самодиффузии вещества в паровой фазе. При слишком же высоких значениях скорости газа– носителя термодинамическое равновесие «пар– вещество» не успевает установиться. Для того чтобы убедиться, что система находится в термодинамическом равновесии, мы каждый раз строили зависимости p = f(h). Для работы выбирается такая скорость газа, которая соответствует «плато» на этом графике Рис. III.2. График зависимости давления насыщенного пара от скорости потока газа–носителя при двух температурах.

Оптимальная скорость потока газа–носителя, при которой устанавливается термодинамическое равновесие между исследуемым веществом и его парами, составляет 1.2– 1.8 лчас -1.