«ОБРАЗОВАНИЕ КОМПЛЕКСОВ КРАСИТЕЛЕЙ С ДНК И ИХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ С НАНОЧАСТИЦАМИ ЗОЛОТА ...»

Одним из важнейших применений порфириновых производных является фотодинамическая терапия (ФДТ) раковых заболеваний и бактериальных фотосенсибилизаторов (ФС) [22]. Одним из механизмов данной терапии является взаимодействие ФС с ДНК при локализации в ядре клетки и фоторазрушение ДНК под действием света [23].

В отличие от лазерной хирургии, где энергия света используется в виде термического лазера, ФС, активированный светом, претерпевает химическое превращение, в результате которого появляется цитотоксичный агент, который впоследствии и уничтожает клетку. Идеальный сенсибилизатор должен хорошо локализовываться в или вокруг раковой опухоли, быть нетоксичным для нормальных тканей, возбуждаться светом, который может глубоко проникать в сенсибилизатор отдельно не способны к образованию активных агентов, и нормальные и злокачественные ткани могут быть облучены вместе одним и тем же светом. В раковых клетках происходит накопление сенсибилизатора в концентрациях значительно больших, чем в здоровых клетках, поэтому фотооблучение одним и тем же светом должно рождать больше цитотоксичных агентов в раковых клетках.

бифункциональных соединений, которые сильно связываются с ДНК и фотодинамически модифицируют прицельную область молекулы ДНК по механизму подобному механизму противораковых антибиотиков, таких как блеомицин и дауномицин, основанному на разрыве ДНК [24]. Взаимодействие катионных порфиринов с синтетичеcкими и природными ДНК были широко исследованы с применением спектроскопии поглощения в видимой области, кругового дихроизма, флуоресценции, Раман-спектроскопии, ЯМР, ЭСР, вискозиметрии, футпринтинга, кинетических методов и рентгеноструктурной кристаллографии.

Существует ряд преимуществ исследования взаимодействий связывания ДНК с катионными порфиринами. Во-первых, данные молекулы связываются с лекарственным средствам, т.е. интеркаляционным или внешним типами связывания. Это делает подобные порфирины яркими образцами взаимодействий лекарственное средство-ДНК, а также структуры ДНК. Во-вторых, их высокая растворимость и слабая склонность к агрегации в воде (за исключением очень высоких концентраций порфирина), делает их подходящими для исследований при широком многообразии условий раствора. В-третьих, посредством варьирования металлического центра и периферических заместителей тип связывания порфирина с дуплексами нуклеиновой кислоты может быть интеркаляционным или внешним (бороздочным). Например, квадратные, металлопорфирины не связывают молекулы H2O при их вакантных аксиальных пространственно сближенными парами оснований [25].

Для связывания порфиринов с ДНК было предложено три основных модели связывания: интеркаляция, внешнее связывание по малой бороздке и внешнее связывание с самостэкингом, при котором порфирины выстраиваются вдоль спирали ДНК. В лаборатории Пастернака были установлены эмпирически достоверные критерии для различения интеркаляционного и внешнего типов связывания порфиринов с различными синтетическими и природными ДНК [26].

Исследование показало, что интеркалирующие порфирины характеризуются: (i) большим красным сдвигом ( 15нм) и гипохромными сдвигами (H 35%) их полосы Соре, (ii) отрицательной активностью индуцированного КД в полосе Соре и (iii) высокой селективностью к GC-обогащенным последовательностям ДНК. Напротив, внешнее связывание показывает: (i) намного меньшие красные сдвиги ( 8 нм) и небольшие гипохромные сдвиги (H 10%, а иногда гиперхромные) полосы Соре, (ii) положительную активность индуцированного КД в области Соре и (iii) ярко выраженное предпочтение к AT-обогащенным сегментам малой бороздки. Взаимодействие порфиринов с ДНК тимуса теленка были изучены на основе их спектральных изменений полосы Соре и индуцированного КД в видимой области, а также спектров флуоресценции и измерения вязкости. Было выяснено, что TPyPP связывает ДНК посредством самостэкингового внешнего связывания и электростатического взаимодействия.

Тогда как TPyPP(Ni) имеет в центре Ni, который не связывает молекулы H2O при их вакантных аксиальных областях, но он связывает ДНК посредством внешнего типа связывания и электростатического взаимодействия.

В работе [27] авторы исследовали порфирины (3). Способность соединений к фотоокислению и связыванию с ДНК проверяли методами УФ-спектроскопии, флуоресценции, кругового дихроизма и электрофореза.

существенно влияет на степень и характер взаимодействия с ДНК, при этом увеличение числа зарядов усиливает взаимодействие с ДНК.

В работе [28] были исследованы порфирины (4), которые предполагают применять в качестве реагентов для качественной реакции на однонитевую ДНК, благодаря уникальным спектроскопическим сигналам, которые возникают при связывании с ней.

Была отмечена зависимость, при которой платиновый тетракатионный комплекс связывался только с двухцепочечной ДНК, что приводило к батохромному сдвигу полосы Соре на 18 нм, а для медного тетракатионного комплекса было характерно сильное устойчивое изменение спектра кругового дихроизма в области полосы Соре. Как заявляют авторы, именно медный однонитевой ДНК в сложной смеси различных нуклеиновых кислот.

Авторов работы [29] привлекла серия катионных бис-порфиринов (5) с различной длиной диаминоалкильного спейсера.

Исследования показали, что при связывании с ДНК происходило изменение спектра кругового дихроизма в области полосы Соре, поэтому авторы предполагают, что связывание происходит по принципу внешней самоупаковки на поверхности ДНК. В ряду с увеличением длины диаминоалкильного спейсера происходило уменьшение фотонуклеазной активности по отношении к ДНК, что соотносится с тенденцией к димеризации бис-порфиринов. Также в работе было показано, что азид анион N3– обладает ингибирующим эффектом для расщепления ДНК, а D2О обладает стимулирующим эффектом, что дает возможность предположить, что в реакции фоторасщепления ДНК участвует синглетный кислород.

В работе [30] исследовали свойства трикатионного порфирина (6) с метильным заместителем на периферии и его димера, конъюгированного с гидрофильным триэтиленгликолем.

В ходе исследований, которые проводили с помощью поляризационной связывании с полинуклеотидами исследуемые порфирины вели себя так же, как и порфирин без периферических заместителей, из чего можно сделать вывод о том, что заместители на периферии пиридиниевого кольца не меняют характер отрицательный пик в спектрах КД и ЛД в области полосы Соре заменяется пиком с высотой гораздо меньше, чем при связывании с ДНК. После стабилизации комплекса через некоторое время интенсивность отрицательного пика КД и ЛД увеличилась. Такие изменения показывают, что первично связывается одна часть димера, а через несколько часов вторая [31].

1.3 Цианиновые красители соответствующим образом кватернизованных гетероароматических систем, которые связаны между собой метиновым (полиметиновым) мостиком, при этом их максимумы поглощения и флуоресценции лежат в диапазоне от 500 до 750 нм или более [32, 33]. Цианиновые красители обычно обладают высокими квантовыми выходами флуоресценции (0,1 0,4 в этаноле), высокими коэффициентами экстинкции (достигающими или превышающими 105 M–1 см–1) и умеренной фотостабильностью [32-34].

фотографии [35], а затем в высокоэнергетических лазерах и устройствах для хранения цифровых изображений. Однако наибольшее внимание привлекает биологическое и биомедицинское применение ЦК в качестве молекулярных зондов [36]. В настоящее время большинство флуоресцентных красителей, обычно применяемых для анализов визуализации ДНК, принадлежат цианиновому семейству, поскольку данные молекулы проявляют высокое сродство к двойной спирали нуклеиновой кислоты, сильное поглощение в видимом диапазоне спектра и резкое увеличение флуоресценции при взаимодействии с ДНК [37-41]. Основным применением данных красителей стало определение последовательности ДНК и применение во флуоресцентной микроскопии, но цианиновые красители также можно с пользой применять для конформационных исследований при помощи флуоресцентного переноса энергии [42, 43], для окрашивания в электрофорезе на агарозном геле и капиллярном электрофорезе [44], для анализа ДНК при помощи ПЦР [45, 46], и в проточной цитометрии [47], или в качестве флуоресцентных зондов в исследовании текучести мембран [48] и в исследованиях потенциала мембран [49].

В работе [50] описаны цианиновые красители оксазоловый желтый (YO) и тиазоловый оранжевый (TO), представленные на рисунке 1.3. Благодаря превосходным фотофизическим свойствам и высокому сродству к ДНК флуоресцентные ЦК применяют для детекции ДНК в различных методиках, таких как ПЦР [45, 51], определение размеров фрагментов рестрикции [52] и проточная цитометрия [47].

Рисунок 1.3. Общие химические структуры мономерных хинолиновых цианиновых красителей.

Одним из двух типов взаимодействия ЦК с ДНК является интеркаляция между парами оснований, которая является предпочтительной при низких концентрациях красителя сравнимых с концентрацией пар оснований ДНК.

Ограниченное вращение относительно мостиковой связи между ароматическими кольцами цианинового красителя (при интеркаляции в ДНК) объясняет существенное различие в спектрах поглощения и флуоресценции связанной и несвязанной формы красителя, которое в свою очень является основой для многочисленных методов визуализации нуклеиновых кислот [36, 53].

В работе [54] описаны диметинцианиновые красители (рисунок 1.4), которые также проявляют более высокие квантовые выходы флуоресценции в комплексе с биомакромолекулами, чем в несвязанной форме, и могут применяться в качестве флуоресцентных зондов.

Рисунок 1.4. Диметинцианиновые красители, где R: a H; b 6-CH3; c 6-Cl; d 6-Br; e 7-CH3; f 7-Cl; g 7-Br.

Еще одним подклассом цианиновых красителей, которые представляют интерес в качестве флуоресцентных зондов, являются димерные цианиновые красители, например, TOTO и YOYO (рисунок 1.5). В работе [36] проведено сравнение данных димерных цианиновых красителей и их мономерных аналогов и установлено, что все они практически не флуоресцируют в растворе в отсутствие нуклеиновых кислот, тогда как в комплексе с ДНК красители TOTO и YOYO обладают более высокими коэффициентами экстинкции (105 M–1 см–1) относительно мономерных ЦК TO и YO (7,5 104 M–1 см–1). Таким образом, при флуоресценции резко возрастает, благодаря чему сильно увеличивается чувствительность флуоресцентного метода определения. Дополнительным

TOTO YOYO

Рисунок 1.5. Формулы димерных цианиновых красителей TOTO и YOYO.

1.3.1 Взаимодействие цианиновых красителей с ДНК Цианиновые красители могут взаимодействовать с ДНК по механизму интеркаляции, а также по механизму связывания с бороздкой ДНК [55-57].

Eriksson и сотрудники [57] проводили исследование скоростей диссоциации как неинтеркалирующих, так и интеркалирующих ЦК, исходя из утверждения, что красители, связывающиеся по малой бороздке, более чувствительны к солям, чем интеркаляторы с таким же зарядом. Авторы предположили, что по анализу эффекта солей можно было бы различать два типа связывания.

Цианиновые красители могут также взаимодействовать между собой при высоких уровнях заполнения ДНК, а также в конденсированных структурах ДНК, когда расстояние между ними сокращается и становится подходящим для осуществления переноса энергии по механизму homo-FRET. В этом случае в качестве донора и акцептора выступают молекулы одного и того же соединения, что является возможным, если соединение имеет небольшой стоксов сдвиг спектра флуоресценции относительно спектра возбуждения, таким образом, имеет место хорошее перекрывание данных спектров (условие резонанса) [58].

1.3.2 Агрегация цианиновых красителей на матрице ДНК Известно, что цианиновые красители могут не только взаимодействовать с ДНК в виде мономера и, соответственно, применяться в качестве флуоресцентного зонда для определения биомакромолекулы, но некоторые цианиновые красители могут также образовывать димеры и спирально закрученные агрегаты, для которых матрицей служит молекула дц-ДНК.

Схематическое изображение структуры H- и J-агрегатов, которые могут образовываться в малой бороздке ДНК, представлено на рисунке 1.6 [59].

Рисунок 1.6. Иллюстрация H- и J-агрегации в узкой бороздке ДНК [59].

В работе [60] авторы обнаружили способность цианиновых красителей (DiSC3+(5)) образовывать сразу два типа агрегатов (H- и J-типы) при взаимодействии с ДНК. Образование агрегатов сопровождалось появлением в спектрах поглощения двух полос, одна из которых в области более коротких волн (H-тип) по сравнению с поглощением мономера, вторая в области более длинных волн (J-тип). Данные полосы обусловлены стэкинг-взаимодействиями между красителями, составляющими димеры. Кроме того, авторы показали, что ширина агрегатов ограничивается шириной малой бороздки ДНК, тогда как длина агрегатов может быть значительной и простираться на всю длину молекулы двухцепочечной ДНК. В другой работе сообщается, что аналогичный цианиновый краситель с нейтральным зарядом молекулы (DiSC2(5)) образует только спирально закрученный H-агрегат на матрице ДНК [61].

Еще один краситель цианинового ряда YOYO-1 может образовывать Hдимеры или агрегаты в малой бороздке ДНК при достаточно высоких концентрациях красителя. Это свойство красителя лежит в основе его применения в качестве флуоресцентного детектора конденсации молекул ДНК.

Агрегация красителя приводит к резкому уменьшению квантового выхода флуоресценции в результате самотушения красителя, которое обусловлено резонансным переносом энергии на нефлуоресцирующие Hдимеры. Однако в неконденсированной форме ДНК расстояние между красителем в мономерной и агрегированной формах, по-видимому, не достаточно для осуществления переноса энергии [62].

Таким, образом, димеризация и агрегация в малой бороздке ДНК является распространенным явлением среди цианиновых красителей, и в большой степени определяется структурой и зарядом молекул красителей.

1.3.3 SYBRGreen I свойствами, одним из которых является достаточно высокий коэффициент поглощения (~7,3 104 M–1 см–1 в TE буфере, pH 7,5). Кроме того, SG имеет высокий квантовый выход флуоресценции в комплексе с дц-ДНК по сравнению с практически отсутствующей флуоресценцией в водных растворах. Эти свойства обусловили широкое применение красителя для обнаружения и количественного флуоресцентного анализа двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот в различных биохимических жидкостях различными методами, такими как флуоресцентные методы визуализации, ПЦР, проточная цитометрия и тому подобное [63-67].

Максимум поглощения SG наблюдается при 494 нм в несвязанном состоянии и батохромно сдвигается до 497 нм при комплексообразовании с дцДНК. Кроме того, в спектре красителя имеются два небольших дополнительных максимума поглощения – при 290 нм и 380 нм. Максимум флуоресценции красителя, связанного с ДНК, соответствует длине волны 520 нм [63].

Структура красителя В работе [63] определены структуры цианиновых красителей SYBRGreen (SG) и PicoGreen (PG) при помощи масс-спектрометрии. Эти два красителя имеют одинаковую структуру ядра, состоящую из бензтиазоловой и хинолиновой частей, связанных метиновым мостиком, и различаются одним заместителем в положении 2 хинолина. SG имеет N-(3-диметиламинопропил)-Nпропиламиногруппу, а – Рисунок 1.7. Химическая структура красителей SYBRGreen (SG) и PicoGreen (PG).

На основании структурных формул красителей был сделан вывод о том, что краситель SG несет два положительных заряда в стандартных условиях, тогда как PG имеет три положительных заряда. Один положительный заряд обусловлен распределением электронной плотности между сопряженными гетероциклическими группами, связанными метиновым мостиком. Один или два дополнительных заряда в SG и PG, соответственно, образуются в результате Положительные заряды, очевидно, способствуют эффективному связыванию красителей с дц-ДНК.

Связывание SYBRGreen I с двухцепочечной ДНК В работе [64] авторы обнаружили, что краситель SG образует прочный комплекс с дц-ДНК в буферном растворе с равновесной константой комплексообразования Ka = 3,2 ± 0,2 108 M–1. Было также показано, что прочность взаимодействия уменьшается по мере увеличения концентрации NaCl в растворе, а, соответственно, большой вклад в энергию взаимодействия вносит энергия электростатического взаимодействия. В той же работе авторы заявляют, что SG образует с ДНК более одного типа комплексов, а именно интеркаляционный при низких концентрациях красителя, внешние типы комплексов (электростатический и с малой бороздкой ДНК). Кроме того, было показано, что ароматическая сопряженная система из бензотиазола и хинолина интеркалирует между основаниями ДНК, тогда как диметиламинопропиловая и пропиловая цепи располагаются в малой бороздке ДНК. Такое расположение красителя и определяет размер сайта связывания 3,5 пары оснований, который был посчитан из зависимости МакГи – фон Хиппеля.

Другие авторы выявили, что SG проявляет AT-специфичность при относительно высоких соотношениях краситель/ДНК [63]. Те же авторы обнаружили, что SG также эффективно связывается с одноцепочечными ДНК (оц-ДНК), однако интенсивности флуоресценции при таком взаимодействии гораздо ниже, что имеет большое значения для применения красителя в ПЦР анализе.

1.4 Круговой дихроизм молекулярно организованных структур ДНК – метод определения типа комплекса, образующегося между лигандом и ДНК 1.4.1 Упорядочение низкомолекулярных двухцепочечных ДНК Одним из способов конденсации двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот (НК) является способ «энтропийной конденсации», т.е. процесс, который реализуется при фазовом «исключении» молекул НК из водно-солевых растворов при добавлении к ним некоторых водорастворимых полимеров, в частности полиэтиленгликоля (ПЭГ) (расстояние между молекулами ДНК в квазинематическом слое зависит от осмотического давления растворителя). В результате этого процесса, при соблюдении определенных условий, создаваемых при высокой концентрации добавляемого полимера, молекулы НК низкой жидкокристаллических дисперсий ДНК (жкд-ДНК). Размер частицы жкд-ДНК, оцениваемый теоретически, близок к 500 нм; в состав частицы входит около молекул НК.

Для частиц, формируемых из двухцепочечных молекул НК таким способом конденсации, является характерным то, что полимер не входит в состав образующихся частиц дисперсии. Кроме того, для таких частиц жкд-ДНК характерна высокая (в пределах от 160 до 600 мг/мл) локальная концентрация НК. Расстояние d между соседними молекулами НК в частицах можно регулировать в пределах 2,5–5,0 нм, меняя осмотическое давление раствора.

Молекулы НК, в силу присущей им геометрической и оптической анизотропии, образуют, в основном, холестерические жкд-ДНК (хжкд-ДНК), характеристикой которых является наличие аномальной полосы в спектре КД в области поглощения хромофоров (азотистых оснований) НК. Упаковка молекул НК в частицах хжкд-ДНК имеет не только упорядоченный, но и «жидкостной»

характер, поскольку молекулы НК в каждом квазинематическом слое способны как вращаться вокруг своей оси, так и испытывать латеральное смещение. В силу жидкостного характера упаковки молекул НК в квазинематических слоях различные соединения могут легко диффундировать внутрь частиц хжкд-ДНК.

Таким образом, для образующихся частиц дисперсии НК характерны как свойства кристаллических тел, так и свойства жидкостей [68].

1.4.2 Круговой дихроизм дисперсий нуклеиновых кислот Круговой дихроизм является методом, доказывающим холестерическую упаковку молекул нуклеиновых кислот в частицах дисперсий, а также методом анализа их свойств.

Форма полосы в спектре КД фазы ДНК аналогична форме спектра поглощения, хотя максимум полосы в спектре КД заметно смещен в область больших длин волн (~300 нм). Сопоставление кривых 1 и 2 на рисунке 1. показывает, что образование холестерической фазы ДНК сопровождается появлением интенсивной полосы в спектре КД [68]. Эта полоса имеет отрицательный знак и расположена в области поглощения азотистых оснований ДНК. Оцениваемая для этой полосы величина молярного кругового дихроизма дисперсии ДНК во много раз превышает величину (около 2 ед.), которая отражает свойства изолированных «хромофоров» (азотистых оснований, поглощающих в УФ-области спектра) или азотистых оснований в составе исходных линейных молекул ДНК.

Наличие аномальной полосы обусловлено коллективными эффектами, возникающими при прохождении света через холестерическую фазу, для которой характерна не только плотная спиральная упаковка соседних молекул ДНК, но и упорядоченное расположение поглощающих диполей этой макромолекулы.

Отрицательный знак полосы в спектре КД холестерической фазы означает, что соседние молекулы ДНК в этой фазе имеют левую закрутку. Такой вывод основан на следующем факте. Круговой дихроизм (КД) может быть описан при помощи уравнения 1.1:

где AL и AR – поглощение лево- и правополяризованного света.

Интенсивность прошедшего света и поглощающая способность A связаны классическим законом Ламберта-Бера (уравнение 1.2):

Например, если вдоль оси холестерика распространяется электромагнитная волна с правой круговой поляризацией, то мгновенное распределение направлений вектора напряженности электрического поля в ней образует левозакрученную спираль, в большей степени соответствующую направлениям поглощающих диполей перехода в молекуле, чем для левой круговой поляризации излучения. Следовательно, в таком случае для поглощающих элементов выполняется соотношение AR > AL, и круговой дихроизм имеет отрицательный знак [68].

Если частицы хжкд-ДНК сформированы из двухцепочечных молекул ДНК, которые связаны с соединением, жестко фиксированным по отношению к длинной оси этой молекулы («внешним хромофором», имеющим полосу поглощения, не совпадающую с полосой поглощения азотистых оснований ДНК), то в спектре КД появляются две аномальные полосы. При этом при малой концентрации «внешнего» хромофора, вводимого в структуру частиц хжкд-ДНК, упаковка молекул ДНК в частицах хжкд-ДНК не будет меняться. Такая ситуация возможна, в частности, при интеркаляции (встраивании) между парами оснований ДНК окрашенных биологически активных соединений, в частности антибиотиков антрациклинового ряда, которые взаимодействуют с молекулами ДНК, образующими частицы хжкд-ДНК. Поскольку все положения теории КД распространяются как на хромофоры ДНК, так и на «внешние» хромофоры, вводимые в структуру частиц хжкд-ДНК, то в данном случае появляется две полосы, расположенные в разных областях спектра КД.

Совпадение знаков полос (рисунок 1.9, [68]) свидетельствует о том, что молекулы антибиотиков расположены по отношению к длинной оси молекулы ДНК точно так же, как расположены пары оснований, т.е. угол между плоскостью молекул «внешних хромофоров» и длинной осью молекулы ДНК близок к 90°. Такое совпадение знаков двух аномальных полос в спектрах частиц хжкд-ДНК, расположенных в разных областях спектра, возможно лишь в том случае, если молекулы «внешнего хромофора» встраиваются (интеркалируют) между парами азотистых оснований ДНК.

Если «внешний хромофор» располагается на молекуле ДНК таким способом, при котором угол наклона плоскости его хромофора по отношению к длинной оси молекулы ДНК находится в пределах от 0 до 54 о, интенсивная полоса в спектре КД в области поглощения этого хромофора будет иметь знак, противоположный знаку полосы, характерной для азотистых оснований ДНК, т.е. будет положительным [69].

Амплитуда аномальной полосы в спектрах КД хжкд-ДНК представляет собой простой легко детектируемый критерий, отражающий как формирование частиц жкд-ДНК из жестких двухцепочечных линейных молекул ДНК, так и изменение свойств жкд-ДНК при действии различных факторов на исходные молекулы ДНК и сформированные частицы хжкд-ДНК.

1.5 Наночастицы золота исследователей уже в течение нескольких десятков лет, поскольку НЧ золота обладают уникальными свойствами – электронными, химическими оптическими и магнитными, которые могут найти различные практические применения, например, для обнаружения биомакромолекул [70-73], доставки лекарственных препаратов [74-77], фототермической терапии опухолей [78-80], а также в нанолитографии [81] и катализе [82, 83].

Известны различные типы наноразмерных частиц золота, такие как сферические наночастицы, наностержни, нанооболочки или частицы, состоящие из ядра и золотой оболочки, а также золотые наноклетки [84]. Свойства наноструктур на основе золота разных форм существенно различаются, как показано на рисунке 1.10.

Существует множество способов синтеза сферических наночастиц золота, большинство из которых основано на восстановлении коммерчески доступной золотохлористоводородной кислоты (HAuCl 4) различными способами, например цитратное восстановление Туркевича [85] или восстановление хлоридом тетракисгидроксиметилфосфония в щелочной среде по Даффу [86]. Также известен метод Бруста-Шифрина, который представляет собой синтез в двухфазных водно-органических средах с применением тиоловых лигандов для стабилизации частиц [87], и рост наночастиц, стимулируемый внесением «затравки» в раствор соли металла в присутствии мягкого восстановителя [88].

1.5.1 Фотофизические свойства наночастиц золота При облучении светом наночастиц золота может происходить ряд процессов, таких как, поглощение света, рассеивание света с такой же частотой, как падающий свет, испускание поглощенного света (флуоресценция), усиление электромагнитного поля падающего на образец света, и, таким образом, усиление всех спектральных сигналов молекул, находящихся на поверхности НЧ золота [89].

Уникальным свойством наноразмерных частиц металлов является поверхностный плазмонный резонанс (ППР). Данное свойство проявляется под воздействием светового излучения на наночастицы, при котором электромагнитное поле света заставляет электроны проводимости когерентно осциллировать. При совпадении частоты внешнего поля и собственной частоты колебаний электронов наступает резонансный эффект. Данный эффект проявляется в спектре поглощения наличием полосы ППР. Ширина полосы плазмонного поглощения и положение ее максимума сильно зависят от размера частиц. Так для золотых наносфер со средним диаметром 20 нм резонансный эффект наступает в видимой области длин волн, ~ 520 нм, благодаря чему раствор коллоидных частиц золота имеет красный цвет [89, 90]. При увеличении размера частиц пик ППР уширяется и сдвигается в красную область спектра [91] (рисунок 1.11, [92]).

Полоса плазмонного резонанса также является очень чувствительным параметром к уменьшению расстояния между наночастицами в коллоидном растворе с образованием мелких агрегатов [93]. В результате агрегации цвет раствора меняется от красного до фиолетового, и этот эффект является основой колориметрического метода определения веществ [94-96].

Однако наночастицы золота небольшого диаметра < 3 нм проявляют полупроводниковые свойства, а не металлические, и не имеют отчетливой полосы ППР в спектре поглощения [97].

1.5.2 Взаимодействие наночастиц золота с ДНК Возможность потенциального применения НЧ золота в медицине повлекла за собой необходимость исследовать их токсичность по отношению к клеточным компонентам, самым важным из которых является ДНК.

При связывании НЧ с биомолекулярной структурой важную роль играет поверхность частицы, так как на ее поверхности располагаются электрические заряды. Положительно или отрицательно заряженные поверхности могут вести себя по-разному. Например, в работе [96] представлен метод определения гибридизации олигонуклеотидов при помощи наночастиц золота. В основе данного метода лежит электростатическое взаимодействие НЧ золота (d ~ 13 нм) с ДНК, и различие электростатических свойств оц- и дц-ДНК.

Представляется важным изучение взаимодействия небольших НЧ золота размером 1–4 нм с ДНК, поскольку они сопоставимы по размерам с размером бороздок ДНК. Структурные исследования комплексов ДНК с НЧ выявили существование нескольких типов комплексообразования в зависимости от размера частиц по отношению к длине ДНК: адсорбция, намотка и агрегация [98]. Независимо от типа комплексообразования взаимодействие НЧ с ДНК приводит к обратимым конформационным изменениям структуры ДНК с увеличением степени ее компактизации, что подтверждено методом КД и флуоресценции [98, 99]. Однако механизм процесса компактизации до сих пор не объяснен.

В работе [100] авторы провели кинетическое исследование взаимодействия ДНК и НЧ золота, стабилизированных N-(2-меркаптопропионил)глицином, в водных и водно-солевых растворах. Был предложен трехстадийный механизм взаимодействия НЧ с ДНК, в котором первая стадия соответствует очень быстрому процессу образования первичного комплекса. Вторая стадия включает образование более прочного комплекса за счет взаимодействия гидрофильных интерпретирована, как последовательное изменение конформации комплекса, образовавшегося на второй стадии, в более компактную структуру.

Другими авторами было заявлено, что маленькие НЧ золота (d ~ 1,4 нм) координируются в большой бороздке ДНК, которая хорошо соответствует по размеру данным кластерам золота [101]. В обзорной статье [102] подобное взаимодействие объясняется электростатическими взаимодействиями, а именно заменой монодентатных фосфиновых лигандов, стабилизирующих НЧ золота, полидентатными отрицательно заряженными группами бороздки.

Li и соавторы провели исследование взаимодействия серии различных наночастиц золота с ДНК и определили параметры связывания. Оказалось, что НЧ золота, которые имеют самую высокую аффинность к ДНК, эффективно ингибируют репликацию ДНК [103].

взаимодействия НЧ золота с ДНК и их влияние на структуру ДНК и степень ее компактизации.

1.5.3 Взаимодействие наночастиц золота с флуорофорами применяется в биосенсорике, поскольку флуоресценция многих флуорофоров эффективно тушится в присутствии НЧ золота [104-109]. Существует две принципиальные схемы работы сенсоров (рисунок 1.12, [110]).

Рисунок. 1.12. Принципиальные схемы работы сенсоров на основе пар флуорофор-тушитель. содержащими флуоресцентный зонд.

Таким образом, флуорофор находится вблизи НЧ золота, и флуоресценция потушена. При добавлении в раствор определяемого вещества оно конкурирует со своим флуоресцентно меченым аналогом за сайты связывания лиганда и вытесняет его, в результате чего флуорофор покидает сферу действия НЧ золота, и флуоресценция разгорается. Для осуществления второй схемы (рисунок 1.12, b2) необходима молекула, конформация которой изменяется при связывании с определяемым веществом. Эта молекула выступает спейсером между НЧ золота и флуорофором. В отсутствие определяемого вещества данный спейсер вытянут, и обеспечивается достаточно большое расстояние между флуорофором и тушителем, в системе наблюдается флуоресценция. Однако при связывании с определяемым веществом молекула-спейсер меняет свою конформацию, что приводит к сближению НЧ золота и флуорофора, сопровождающемуся тушением флуоресценции.

В литературе описано два основных механизма тушения флуоресценции:

резонансный перенос энергии (RET) и перенос электрона [107, 111]. Однако, процесс переноса электрона в системе краситель/золотая наночастица изучен гораздо меньше чем перенос энергии. Лишь в нескольких работах подтвержден перенос электрона в системах порфирин/НЧ золота, который сопровождался тушением флуоресценции порфиринов [112, 113].

Напротив, множество работ за последние десять лет посвящено перспективным системам для биосенсорики, основанным на резонансном переносе энергии RET, в которых акцептором энергии являются металлические наночастицы.

Классическая теория переноса энергии, впервые сформулированная Теодором Фёрстером в 1949 году, говорит о том, что перенос энергии представляет собой совокупность безызлучательных процессов в веществе, при которых энергия электронного возбуждения передаётся от возбуждённой частицы (молекулы, атома, иона) к невозбуждённой, находящейся от первой на расстоянии, меньшем длины волны возбуждающего излучения [114].

Необходимыми условиями переноса энергии являются: 1) расстояние между молекулами донора и акцептора, достаточное для осуществления процесса; 2) перекрывание спектров флуоресценции донора и возбуждения акцептора (рисунок 1.13).

Рисунок 1.13. Схематическое изображение необходимых условий для переноса энергии.

Эффективность диполь-дипольного переноса энергии выражается формулой 1.3:

где r – расстояние между донором и акцептором, R0 – фёрстеровский радиус, т. е.

расстояние, на котором эффективность переноса энергии составляет 50%. Такая зависимость эффективности переноса от расстояния привела к многочисленным применениям переноса энергии в биохимических исследованиях, в особенности потому, что фёрстеровский радиус находится в пределах 20 – 50. Этот диапазон расстояний сравним с диаметром большинства белков и толщиной биологических мембран. Любые явления, которые оказывают влияние на расстояние между донором и акцептором, будут влиять на скорость переноса энергии, что позволяет их количественно охарактеризовать [115, 116].

Расстояния ( 1000 раз.

поглощение Краситель SG имеет небольшой Стоксов сдвиг ( 30 нм), что обусловливает перекрывание спектров поглощения и флуоресценции красителя (рисунок 4.1) и при повышении его концентрации приводит к сближению молекул красителя в образце на достаточное расстояние для осуществления переноса энергии по механизму homo-FRET. Для исследуемой пары SG-SG был рассчитан ферстеровский радиус – 4,68 нм [131].

4.1 Концентрационное тушение красителя SYBRGreen I в комплексе с ДНК в растворе и в составе жидкокристаллических дисперсий ДНК При смешивании красителя SG с дц-ДНК в буферном растворе (pH 7) происходит сильное увеличение квантового выхода флуоресценции SG, которое обусловлено образованием жестких интеркаляционных комплексов красителя с молекулами дц-ДНК. При увеличении концентрации SG в растворе дц-ДНК наблюдается пропорциональное увеличение флуоресценции до концентрации красителя 4 10–6 М, после которой зависимость интенсивности флуоресценции отклоняется от линейной, что, вероятно, обусловлено процессом насыщения молекул ДНК молекулами красителя (рисунок 4.2, ромб), а не процессами самотушения [131].

Рисунок 4.2. Зависимости интенсивности флуоресценции красителя SG от его концентрации: круг – в растворе ДМСО; ромб – в растворе дц-ДНК; квадрат – в хжкд-ДНК; треугольник – в гжкд-ДНК; [ДНК] = 1,5 10 –5 М п. о.

В качестве контроля было проведено флуоресцентное титрование SG в растворе ДМСО и обнаружено отсутствие концентрационного тушения красителя, как и в комплексе с дц-ДНК в буферном растворе. Наблюдаемое возрастание интенсивности флуоресценции при увеличении количества SG в том же диапазоне концентраций, что и для комплексов с дц-ДНК, является линейным (рисунок 4.2, круг). Интенсивность флуоресценции красителя в ДМСО на порядок меньше, чем интенсивность флуоресценции SG в дц-ДНК, что вероятно обусловлено возможностью свободного вращения красителя в растворителе и, соответственно, высокой скоростью безызлучательной диссипации энергии возбужденных состояний красителя [64].

При взаимодействии красителя SG с молекулярно организованными системами на основе ДНК, такими как холестерическая и гексагональная жкдДНК, наблюдается нелинейное возрастание интенсивности флуоресценции при увеличении количества SG, начиная с очень низких концентраций красителя ( 10–7 M) (рисунок 4.2, квадрат и треугольник). Интенсивность флуоресценции красителя в системах жкд-ДНК примерно на порядок меньше, чем интенсивность флуоресценции SG в дц-ДНК (рисунок 4.2, ромб) [131]. Нелинейность данных зависимостей и низкие интенсивности флуоресценции для комплексов SG с хжкд-ДНК и с гжкд-ДНК при концентрациях красителя в том же диапазоне, что и для экспериментов с дц-ДНК, могут свидетельствовать о наличии квазинематическими слоями при переходе от хжкд-ДНК к гжкд-ДНК сокращается от d 3,4 нм до d 2,6 нм, соответственно, обусловливая увеличение плотности упаковки молекул ДНК в структуре [68]. Уменьшение интенсивности флуоресценции при увеличении концентрации SG в гексагональной структуре происходит более эффективно, чем в холестерической структуре, в силу более компактной организованной структуры молекул ДНК в составе гжкд-ДНК по сравнению с хжкд-ДНК (рисунок 4.2, квадрат и треугольник, соответственно).

Таким образом, непропорциональное возрастание флуоресценции красителя с увеличением количества красителя в различных системах на основе дц-ДНК, очевидно, свидетельствует о наличии процессов самотушения (концентрационного тушения) флуоресценции SG, которое проявляется более эффективно при более плотной упаковке в гексагональной системе, по сравнению с холестерической системой и свободным расположением молекул дц-ДНК в растворе. В органическом растворителе ДМСО самотушение SG в исследуемом диапазоне концентраций ((0,05–10) 10–6 M) не проявляется [131].

4.2 Деполяризация флуоресценции красителя SYBRGreen I – доказательство миграции энергии между мономерами красителя, интеркалированными в ДНК Миграция энергии или перенос энергии по механизму homo-FRET между одинаковыми хромофорами SG также может происходить в системах на основе ДНК, описанных в параграфе 4.1. Для осуществления резонансного переноса энергии критическими параметрами являются: перекрывание спектров поглощения и флуоресценции акцептора и донора, соответственно, и расстояние между донором и акцептором. При условии, что первое условие выполняется, как отмечено выше, в комплексах SG с ДНК может обеспечиваться достаточно близкое расположение хромофоров друг к другу с увеличением концентрации красителя, приводя к миграции энергии.

Известно, что при осуществлении переноса энергии между одинаковыми молекулами или миграции энергии происходит деполяризация флуоресценции возбужденных молекул [58, 132, 133], таким образом, позволяя использовать измерения анизотропии флуоресценции для выявления и доказательства осуществления процесса homo-FRET.

добавлении увеличивающихся концентраций красителя как к раствору дц-ДНК, так и к дц-ДНК в составе упорядоченных структур жкд-ДНК, что является доказательством осуществления переноса энергии по механизму homo-FRET в обеих системах (рисунок 4.3, А, Б). В жкд-ДНК эффект деполяризации проявляется более ярко (рисунок 4.3, красный квадрат и зеленый треугольник), чем в растворе дц-ДНК (рисунок 4.3, синий ромб), что объясняется более высокими локальными концентрациями красителя SG в молекулярно организованных структурах, а, соответственно, уменьшением расстояния между молекулами, в результате чего миграция энергии между молекулами SG становится более эффективной.

Зависимости анизотропии флуоресценции (r) красителя SG от его концентрации в логарифмической шкале представляют собой сигмоидные кривые (рисунок 4.3, Б), которые имеют плато при малых концентрациях красителя (0,5–1) 10–7 M, при которых расстояние между молекулами SG еще не достаточно близкое для осуществления переноса энергии.

Рисунок 4.3. A – Зависимость анизотропии флуоресценции красителя SG от его концентрации в растворе дц-ДНК (синий ромб), хжкд-ДНК (красный квадрат) и гжкд-ДНК (зеленый треугольник), [ДНК] = 1,5 10–5 M п. о. Б – Та же зависимость с осью абсцисс, представленной в логарифмических координатах.

Миграция энергии между мономерами SG в комплексе с дц-ДНК, как в составе жкд-ДНК, так и в растворе, была подтверждена уменьшением анизотропии флуоресценции хромофора.

4.3 Анализ времен жизни флуоресценции красителя SYBRGreen I при концентрационном тушении в присутствии ДНК в растворе и в составе упорядоченных структур жидкокристаллических дисперсий Для получения дополнительной информации о поведении красителя SG в различных системах (ДМСО, дц-ДНК, жкд-ДНК), описанных в параграфе 4.1 и 4.2, были измерены времена жизни флуоресценции (таблицы 4.1, 4.2).

Показано, что даже при самой большой концентрации SG в ДМСО (1 10– флуоресценции SG остается неизменным в большом интервале концентраций (3,3 ± 0,15 нс, (таблица 4.1) [131]). В водно-солевом буферном растворе время жизни флуоресценции красителя SG не удалось зафиксировать в наносекундном диапазоне, что согласуется с литературными данными, в соответствии с которыми оно составляет ~ 3 пс в Tрис-ЭДТА буферном растворе [64]. Однако при комплексообразовании красителя SG с дц-ДНК наблюдается возрастание времени жизни флуоресценции до = 5,5 ± 0,23 нс (таблица 4.1) [131]. При добавлении увеличивающихся концентраций SG в раствор дц-ДНК время жизни флуоресценции остается постоянным и кинетики затухания флуоресценции следуют моноэкспоненциальному закону (рисунок 4.4).

Моноэкспоненциальные кинетики затухания флуоресценции вкупе с наблюдаемым постоянством времен жизни флуоресценции и уменьшением квантового выхода флуоресценции позволяют заключить о том, что эффект тушения флуоресценции с увеличением концентрации красителя в растворе дцДНК наиболее вероятно связан с насыщением молекул ДНК молекулами SG.

После достижения молекулами красителя максимального уровня заполнения ДНК избыточное количество красителя может оставаться в буферном растворе в свободном или агрегированном состоянии и, соответственно, не вносит вклад в интенсивность флуоресценции [64] или образовывать нефлуоресцирующие димеры или агрегаты в малой бороздке ДНК [59, 60].

Таблица 4.1. Времена жизни красителя SG в свободном состоянии в ДМСО и в комплексе с молекулами дц-ДНК, [ДНК]=310–5 M п. о.

Время жизни флуоресценции SG при переходе от раствора дц-ДНК к системам хжкд-ДНК и гжкд-ДНК уменьшается с увеличением концентрации красителя от 5,5 до 3,4 и 1,8 нс, соответственно, при этом сохраняется флуоресценции (таблица 4.2 [131], рисунок 4.5, А, Б).

Рисунок 4.5. Кривые затухания флуоресценции красителя SG (5 10–8 (1); 10–7 (2); 5 10–7 (3); 1 10–6 (4); 5 10–6 (5) M, IRF (6)) в комплексе c хжкд-ДНК (1,5 10–5 M п. о.) – (А). Кривые затухания флуоресценции красителя SG ( 10–8 (1); 1 10–7 (2); 5 10–7 (3); 1 10–6 (4); 5 10–6 (5); 1 10–5 (6) M, IRF (7)) в комплексе c гжкд-ДНК (1,5 10–5 M п. о.) – (Б). Оси ординат – в логарифмических координатах.

Уменьшение времени жизни флуоресценции красителя при увеличении его концентрации в упорядоченных структурах на основе ДНК является признаком процесса самотушения SG в описанных системах наряду с непропорциональным увеличением квантового выхода флуоресценции.

Таблица 4.2. Времена жизни флуоресценции SG в комплексе с ДНК в составе холестерической и гексагональной жкд-ДНК, [ДНК]=1,5 10–5 M п. о.

Ошибка измерения не превышала 5%.

Резкое уменьшение квантового выхода и времени жизни флуоресценции интеркалированного красителя SG при переходе от дц-ДНК к жкд-ДНК системам может быть обусловлено двумя причинами. Во-первых, окружение молекулы интеркалированного в дц-ДНК красителя – это водный буферный раствор с диэлектрической постоянной воды ( = 81). Окружение красителя в хжкд-ДНК и гжкд-ДНК – это квазинематические слои ДНК и высококонцентрированный раствор ПЭГ, и локальная диэлектрическая постоянная для этих систем существенно ниже, кроме того, в этих системах сильно различаются и коэффициенты преломления [69, 114]. Во-вторых, увеличение концентрации красителя обеспечивает достаточно близкое расположение молекул SG друг относительно друга, что дает возможность реализации процесса переноса энергии по механизму FRET.

В литературе описано несколько механизмов концентрационного тушения, такие как образование нефлуоресцирующих димеров, перенос энергии на нефлуоресцирующие димеры, образование эксимеров и др. [134, 135]. В исследуемой системе наиболее вероятным механизмом является перенос энергии с мономера SG в возбужденном состоянии на нефлуоресцирующий димер или агрегат красителя (FRET). Кроме того, перенос энергии на нефлуоресцирующий димер/агрегат может происходить как от непосредственно возбужденного мономера, так и от мономера, получившего энергию от другого мономера в результате миграции возбуждения (homo-FRET) [136, 137]. Данный механизм тушения может осуществляться, поскольку в молекулярно организованных жкдДНК системах создаются более высокие локальные концентрации SG, превышающие соответствующие концентрации в гомогенных растворах на несколько порядков, что увеличивает вероятность образования димеров и агрегатов SG на ДНК между квазинематическими слоями жкд-ДНК [59, 60].

Итак, самотушение красителя SG в упорядоченных системах жкд-ДНК было подтверждено уменьшением времен жизни флуоресценции красителя с увеличением его концентрации в указанных системах. В качестве механизма данного процесса предложен резонансный перенос энергии между флуоресцирующим мономером красителя и нефлуоресцирующим ассоциатом красителя (FRET), вероятно, образующимся на матрице ДНК при высоких локальных концентрациях SG, которые создаются в компактных структурах жкдДНК. Изменение характеристик среды при переходе от раствора дц-ДНК к упорядоченным жкд-ДНК системам также может вносить вклад в процессы самотушения красителя. На основании постоянства времен жизни флуоресценции SG был сделан вывод, об отсутствии самотушения красителя в системе дц-ДНК в растворе, и нелинейность зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации SG в данном случае приписывается процессам насыщения молекул ДНК молекулами красителя.

4.4 Исследование комплексообразования красителя SYBRGreen I с ДНК в составе холестерической жидкокристаллической дисперсии методом кругового дихроизма Тип комплексов, которые образует краситель SG c ДНК, определяли методом кругового дихроизма, пользуясь теорией оптических свойств жидкокристаллических дисперсий на основе ДНК [68].

При добавлении к хжкд-ДНК красителя SG в спектре КД образуется полоса индуцированного КД красителя при = 496 нм, которая имеет одинаковый (–) знак с полосой, соответствующей поглощению азотистых оснований ДНК, при = 270 нм, что говорит о комплексообразовании и интеркаляционном типе образующегося комплекса, а также подтверждает ранее известные данные. Однако при высоких концентрациях SG (1–4) 10–6 М наблюдается появление дополнительной индуцированной полосы = 535 нм, которая имеет противоположный знак и соответствует красителю, образующему с хжкд-ДНК внешний комплекс (рисунок 4.6). Дополнительная полоса = нм отсутствует при малых концентрациях красителя вплоть до (2–3) 10–7 М, что объясняется более высокой константой комплексообразования красителя с ДНК при интеркаляции, чем при образовании внешнего комплекса в малой бороздке ДНК [131]. Внешний комплекс может представлять собой мономер SG, залегающий в малой бороздке ДНК или нефлуоресцирующий димер или агрегат, как описано для цианиновых красителей в литературе [59, 60]. Однако образование второго типа комплекса мономерной формы красителя с ДНК должно было бы характеризоваться появлением второй компоненты в кривых моноэкспоненциальный характер этих кривых (рисунки 4.4, 4.5), то можно предположить, что SG образует нефлуоресцирующий ассоциат в малой бороздке.

- - - - - Образование ассоциата SG при высоких концентрациях красителя жидкокристаллических структурах ДНК. Поскольку расстояние между нефлуоресцирующими ассоциатами (акцептор энергии) сокращается в результате плотной упаковки молекул ДНК в составе жкд-ДНК, становится возможным осуществление эффективного переноса энергии по механизму heteroFRET.

Таким образом, структурным методом кругового дихроизма впервые доказана способность красителя SG образовывать больше одного типа комплексов с дц-ДНК: интеркаляционный, при малых концентрациях красителя, и внешний комплекс в малой бороздке ДНК, при высоких уровнях заполнения нуклеиновой кислоты, который может представлять собой ассоциат красителя.

4.5 Исследование образования ассоциатов красителя SYBRGreen I на матрице ДНК методом спектрофотометрии В литературе описано образование димеров и агрегатов цианиновых красителей на ДНК, однако для красителя SG подобные исследования ранее не проводились. В данной работе образование ассоциатов (димеров/агрегатов) красителя SG на матрице ДНК было изучено по спектрам поглощения.

Спектр поглощения комплекса SG с ДНК имеет максимум при = 495 нм (рисунок 4.7, 1–3), который сдвигается в коротковолновую область при добавлении более высоких концентраций красителя (> 1 10 –6 M, рисунок 4.7, 4–7). Одновременно с гипсохромным сдвигом (~ 3 нм) основного максимума в спектре появляется и растет дополнительная полоса при ~ 480 нм (рисунок 4.7, 4–7), что свидетельствует об образовании ассоциата SG, который, наиболее вероятно, представляет собой H-димер [59, 60, 62, 138].

Сравнение спектров поглощения одной и той же концентрации красителя SG в ДМСО (мономерная форма, макс = 497 нм, рисунок 4.8, 1), в комплексе с ДНК и в буферном растворе также подтвердило образование ассоциата красителя как в буферном растворе (уменьшение оптической плотности, сдвиг дополнительной полосы при ~ 480 нм, рисунок 4.8, 3), так и в среде биомакромолекулы (те же эффекты, но выражены менее ярко, рисунок 4.8, 2).

0. 0. 0. 0. 0. Согласно теории экситона образующийся ассоциат имеет H-геометрию. А поскольку не наблюдается отдельной узкой полосы в коротковолновой области спектра, характерной для H-агрегатов, то молекулярный ассоциат, наиболее вероятно, представляет собой H-димер [138].

При добавлении увеличивающихся концентраций SG в системы жкд-ДНК, как холестерическую, так и гексагональную, наблюдались изменения спектров поглощения аналогичные изменениям в растворе дц-ДНК (рисунок 4.7). Однако в жкд-ДНК системах расстояние между флуоресцирующими мономерами SG и нефлуоресцирующими ассоциатами сокращается за счет компактной упаковки молекул ДНК в квазинематических слоях, что обеспечивает возможность осуществления процесса переноса энергии hetero-FRET, как предложено ранее.

Методом спектрофотометрии показано образование ассоциатов красителя SG на матрице ДНК, которые, вероятно, образуются в малой бороздке ДНК.

Предположено, что данные ассоциаты имеют H-геометрию, что, однако, требует дополнительных исследований.

Исследовано поведение красителя SG в различных системах, таких как ДМСО, раствор дц-ДНК, молекулярно организованные структуры жкд-ДНК.

Обнаружено самотушение красителя SG в упорядоченных структурах дисперсий на основе дц-ДНК, которое проявляется более эффективно при более плотной упаковке в гексагональной системе, по сравнению с холестерической. В ДМСО и растворе дц-ДНК самотушение SG не проявляется в исследуемом диапазоне концентраций ((0,05–10) 10–6 M). В качестве механизма самотушения предложен резонансный перенос энергии (hetero-FRET) с возбужденного состояния интеркалированного в ДНК мономера SG на его нефлуоресцирующий ассоциат, образующийся в малой бороздке ДНК при высоких локальных концентрациях красителя, которые создаются между квазинематическими слоями жкд-ДНК.

Подтверждено наличие резонансного переноса энергии между мономерами SG в комплексе с дц-ДНК по механизму homo-FRET, как в составе жкд-ДНК, так и в растворе. Миграция энергии между мономерами SG (homo-FRET) не вызывает непосредственно самотушение красителя (дц-ДНК в растворе), однако может увеличивать эффективность переноса энергии с мономера SG на ассоциат SG по механизму hetero-FRET (жкд-ДНК системы) [136, 137].

Глава 5. Взаимодействие наночастиц золота с комплексами Системы флуорофор-тушитель, включающие НЧ благородных металлов в качестве тушителя и молекулы органического красителя, выступающие флуоресцентными метками, получили большое распространение в биофотонике в последнее время. Поскольку золотые НЧ способны эффективно тушить флуоресценцию и биолюминесценцию находящихся рядом органических молекул, это свойство НЧ золота может служить основой для разработки исследованиях, а также применяться в биосенсорике [105, 106].

5.1 Тушение флуоресценции органических красителей наночастицами золота на матрице ДНК В параграфе 5.1 рассматривается тушение флуоресценции органических красителей наночастицами золота (d ~ 2,5 нм) в буферном растворе.

O O O HN O NH

Показано, что при взаимодействии НЧ золота с положительно заряженным красителем родамином 6Ж происходит эффективное тушение флуоресценции уже при двукратном молярном избытке НЧ относительно красителя (рисунок 5.1, А). Однако флуоресценция отрицательно заряженного флуоресцеина тушится гораздо менее эффективно (рисунок 5.1, Б).

Рисунок 5.1. Спектры флуоресценции А – красителя родамин 6Ж (1 10–7 М) при титровании НЧ золота: 0 (1); 1,72 10–8 (2); 3,43 10–8 (3); 6,87 10–8 (4);

1,03 10–7 (5); 1,37 10–7 (6); 1,72 10–7 (7); 2,06 10–7 (8); 2,75 10–7 (9); 3, 10–7 (10); 4,12 10–7 (11) М; Б – красителя флуоресцеин (1 10–7 М) при титровании НЧ золота: 0 (1); 3,43 10–9 (2); 1,72 10–8 (3); 3,43 10–8 (4); 6, 10–8 (5); 1,03 10–7 (6); 1,37 10–7 (7); 1,72 10–7 (8); 2,06 10–7 (9); 2,75 10– (10); 3,43 10–7 (11); 4,12 10–7 (12) М. Вставки: зависимости интенсивности флуоресценции родамина 6Ж при 550 нм (А) и флуоресцеина при 512 нм (Б).

Равновесная константа комплексообразования родамина 6Ж с НЧ золота была рассчитана по методу Скетчарда по результатам тушения флуоресценции красителя [140]. В случае тушения флуоресценции флуоресцеина НЧ золота константа была рассчитана по кривой насыщения при уменьшении сигнала на 50%. Константы для взаимодействия красителей с НЧ золота составили Kb = 2, ± 0,3 108 M–1 и Kb = 2,1 ± 0,5 106 M–1 для родамина 6Ж и флуоресцеина, соответственно. Энергия Гиббса взаимодействий обоих красителей с НЧ золота дает дополнительные сведения о типе взаимодействия. Так для комплекса родамин 6Ж/НЧ золота она составляет G = –48 кДж/моль, а для комплекса флуоресцеин/НЧ золота G = –35 кДж/моль. Поскольку наночастицы золота имеют сильный отрицательный заряд (~ –12), то можно говорить о наличии электростатической компоненты взаимодействия заряженных красителей с данными НЧ наряду с неэлектростатической. Для связывания родамина 6Ж и НЧ золота энергия Гиббса выражается как G = Gnel + Gel; тогда как для связывания флуоресцеина и НЧ золота она представляет собой G = Gnel – Gel., где Gnel и Gel являются энергиями Гиббса для неэлектростатической и электростатической составляющих взаимодействия. Краситель родамин 6Ж имеет один положительный заряд, следовательно, электростатическая компонента энергии Гиббса обеспечивается одним электростатическим контактом, оценочная величина энергии Гиббса которого составляет ~ кДж/моль [141]. Таким образом, можно приблизительно рассчитать значение энергии Гиббса для неэлектростатической составляющей взаимодействия красителей, обладающих подобной структурой, с НЧ золота как Gnel = G – Gel = –48 – (–5) = –43 (кДж/моль). При сравнении полученной величины с энергией взаимодействия флуоресцеина и НЧ золота (G = –35 кДж/моль) очевидно, что отрицательные заряды флуоресцеина также вносят вклад в приблизительно соответствует наличию двух электростатических отталкиваний в системе дианион флуоресцеина/НЧ золота.

Приведенные выше данные и рассуждения позволяют заключить, что заряд красителя имеет значение при взаимодействии красителя с отрицательно заряженными наночастицами золота. Данный факт наводит на мысль о наличии вклада электростатического взаимодействия при комплексообразовании красителей с исследуемыми золотыми наночастицами.

5.2 Супертушение флуоресценции красителя SYBRGreen I наночастицами золота на матрице ДНК в растворе При введении в раствор комплекса красителя SG (1,0 10–7 М) с двухцепочечной ДНК (1,5 10–5 М п. о.) НЧ золота (d ~ 2,5 нм) наблюдается интенсивное тушение флуоресценции даже при очень низких концентрациях тушителя (НЧ золота) 1 10–7 М (рисунок 5.2, А, Б), что свидетельствует о статическом механизме тушения внутри комплекса SG/Au, образованного НЧ золота и молекулой интеркалированного в ДНК красителя [142, 143].

Рисунок 5.2. А – Спектры флуоресценции красителя SG (1,0 10–7 M) в комплексе с двухцепочечной ДНК (1,5 10–5 M п. о.) в присутствии различных концентраций НЧ золота: 0; 3,43 10–9; 1,72 10–8; 3,43 10–8; 6,87 10–8; 1, 10–7; 1,37 10–7; 1,72 10–7; 2,06 10–7; 2,75 10–7; 3,43 10–7; 4,12 10–7 М. Б – Зависимость интенсивности флуоресценции красителя SG от концентрации НЧ золота при 520 нм.

Обнаруженное эффективное тушение флуоресценции красителя SG наночастицами золота на матрице ДНК известно в литературе под названием «супертушение» [105, 106], однако природа данного явления для таких систем ранее не была установлена.

5.2.1 Модели взаимодействия красителя SYBRGreen I c наночастицами золота на матрице ДНК в растворе Некоторые авторы предприняли попытки описать подобное супертушение флуоресценции хромофоров наночастицами золота (см. 5.2) в рамках модели тушения флуоресценции Штерна-Фольмера [105, 106].

где I и I0 – интенсивности флуоресценции SG в присутствии различных концентраций тушителя и в отсутствие тушителя, соответственно, KLQ – константа равновесия комплексообразования и [Q]0 – исходная концентрация тушителя. Однако в данной работе использованы сравнимые концентрации люминофора и тушителя, следовательно, использование обычного уравнения Штерна–Фольмера (уравнение 5.1), которое справедливо лишь при [Q]0 >> [L]0, исключается. Это подтверждается также нелинейностью зависимости ШтернаФольмера для исследованного красителя (рисунок 5.3). Константа ШтернаФольмера, оцененная по начальному линейному участку данной зависимости, составляет KSV = 1,6 107 М–1 (рисунок 5.3, вставка).

Поскольку в работе использован препарат ДНК, содержащий короткие фрагменты ДНК длиной ~ 600 п. о., то можно считать их достаточно жесткими молекулами. Кроме того, способность этих молекул ДНК образовывать жидкокристаллические дисперсии также говорит в пользу их жесткой линейной структуры (см. 3.3) [68]. Таким образом, второй моделью, которая была использована для описания взаимодействия SG с НЧ золота в среде относительно жестких коротких молекул дц-ДНК (~ 600 п. о.), была модель Перрена. Для применения данной модели было сделано предположение, что специфическое взаимодействие молекул люминофора и тушителя между собой в основном электронном состоянии отсутствует (рисунок 5.3). В данном случае тушение флуоресценции описывается уравнением Перрена, соответствующим статистическому распределению молекул в растворе:

I0/I = exp(–VQ[Q]0) = exp(–(VQ[L]0)([Q]0/[L]0)), (5.2) где VQ – эффективный объем так называемой «сферы тушения» и [L]0 – исходная концентрация SG [143]. Такое же выражение получится, если рассматривать образование бесконечного ряда стехиометрических комплексов (5.3) с одинаковыми значениями констант равновесия на каждой стадии K = VQ.

Аппроксимация данных в полулогарифмических координатах Перрена (уравнение 5.2) должна представлять собой прямую линию, выходящую из 1, что не соблюдается, поскольку кривые в данных координатах имеют нелинейный вид (рисунок 5.4, А, Б). Кроме того, анализ экспериментов по тушению НЧ золота флуоресценции красителя SG при различных уровнях заполнения ДНК показал, что константа взаимодействия и объем сферы тушения зависят от концентрации SG (рисунок 5.4, Б). Уменьшение объема сферы тушения и константы взаимодействия при увеличении концентрации красителя исключает статистическое связывание между SG и НЧ золота и свидетельствует в пользу стехиометрического типа связывания [143].

Рисунок 5.4. А – Зависимость Перрена для тушения флуоресценции SG (8, 10–8 M, = 520 нм) в комплексе с дц-ДНК (1,5 10–5 M п. о.) при добавлении различных концентраций НЧ золота. Б – Зависимости Перрена для тушения флуоресценции SG: 1 – 3,3 10–8; 2 – 1,0 10–7; 3 – 3,0 10–7 М.

Поскольку модель статистического взаимодействия должным образом не описывает взаимодействие красителя SG c НЧ золота на ДНК, то для описания экспериментальных данных была предложена стехиометрическая модель Скетчарда [140], которую можно представить в виде уравнения:

где r = Cbound/[Au], Cbound – концентрация связанного SG, Cfree – концентрация свободного SG, Ka – равновесная константа комплексообразования и n – стехиометрический коэффициент. Однако при аппроксимации полученных концентраций НЧ золота в координатах Скетчарда (уравнение 5.4) была получена зависимость с максимумом (рисунок 5.5).

(r/Cfree) 10- Такая выпуклая форма кривой Скэтчарда предполагает кооперативное взаимодействие SG с НЧ золота на ДНК [144] и может быть адекватно описана уравнением Хилла (5.5):

где, = (I0 – I)/I0, Kb – суммарная константа комплексообразования. Для применения данной модели необходимо сделать допущение, согласно которому несколько золотых наночастиц могут связываться с красителем SG. Для определения усредненной константы комплексообразования для каждого комплекса, Ka, взаимодействия всех частиц с красителем считают идентичными, то есть имеющими одинаковое значение константы комплексообразования Ka.

Подобное допущение позволяет математически определить Ka из выражения Kb = (Ka)n. Однако такое допущение не имеет физического смысла. Кооперативное взаимодействие характеризуется S-образной кривой насыщения, которая была получена для исследуемой системы SG/НЧ Au в присутствии ДНК в растворе (рисунок 5.6, А).

(I0-I)/I Рисунок 5.6. S-образная кривая насыщения (А) и график Хилла (Б) для тушения флуоресценции SG (1,0 10–7 M, = 520 нм) в комплексе с двухцепочечной ДНК (1,5 10–5 M п. о.) при добавлении различных концентраций НЧ золота.

Положительная кооперативность (n > 1) характеризуется тем, что присоединение одной НЧ Au к субстрату (SG) увеличивает сродство к субстрату остальных НЧ. Из графика Хилла получено значение суммарной константы комплексообразования НЧ золота с SG Kb = 7,9 ± 0,8 10 21 M–1, а также значение Ka = 2,0 ± 0,1 107 M–1 на матрице ДНК (рисунок 5.6, Б). Такое высокое значение константы комплексообразования свидетельствует о формировании интеркалированными флуорофорами, что и обусловливает эффективное тушение свидетельствует о том, что при исследуемом взаимодействии образуются кластеры из трех НЧ золота вблизи одного красителя. Образование кластеров из нескольких НЧ золота в ДНК в присутствии и в отсутствие красителя SG также было подтверждено методом спектрофотометрии (см. 5.2.4).

Еще одним новым подходом для описания эффекта «супертушения»

флуоресценции красителя SG, наряду с моделью кооперативного связывания, является рассмотрение раствора ДНК как двухфазной системы, которая содержит объемную фазу (буферный раствор) и микрофазу (молекулы ДНК).

Локальные концентрации реагентов внутри микрофазы могут быть на несколько порядков больше, чем их действительные концентрации в общем растворе, что также может обусловливать более яркие оптические эффекты в подобных системах [143].

С учетом эффекта концентрирования реагентов в микрофазе концентрацию НЧ золота и красителя SG в микрофазе молекул ДНК можно определить как [Q]m = [Q]/ и [L]m = [L]/, где [Q], [L] и [Q]m, [L]m – концентрации тушителя и лиганда в растворе и в микрофазе ДНК, соответственно, а – объемная доля микрофазы в растворе, рассчитанная исходя из объема одной молекулы ДНК и количества молекул в растворе на основании концентрации ДНК в M пар оснований ( = 1 10–5). Применение модели Хилла с учетом микрофазного подхода дает значение суммарной константы комплексообразования НЧ золота с SG на ДНК Kb = 4,6 ± 0,5 106 M–1, а также значение Ka = 1,66 ± 0,06 102 M–1, которое почти на пять порядков меньше значения Ka = 2,0 ± 0,1 10 7 M–1, полученного для той же системы, рассматриваемой как гомогенный раствор ДНК. Таким образом, можно заключить, что эффективное тушение флуоресценции обусловлено эффектом концентрирования флуорофора и тушителя с довольно низкой константой комплексообразования и специфичностью взаимодействия между ними. Данный подход подразумевает, что все НЧ золота находятся в микрофазе, что, вероятно, свидетельствует о интеркалированным в ДНК.

Итак, показано, что модель кооперативного связывания Хилла хорошо описывает взаимодействие НЧ золота с красителем, интеркалированным в ДНК, и подразумевает образование агрегатов наночастиц золота, состоящих из трех частиц вблизи каждого красителя на матрице ДНК. Высокое значение константы комплексообразования свидетельствует о формировании высокоспецифичного прочного комплекса SG/ДНК/Aun, что и обусловливает эффективное тушение флуоресценции в системе. Однако применение микрофазного подхода позволяет предположить, что ключевую роль в исследуемых тройных системах играет высокая аффинность НЧ золота к ДНК, которая приводит к концентрированию наночастиц в микрофазе ДНК и образованию неспецифических комплексов с красителями в среде биомакромолекулы. Таким образом, образование агрегатов из трех наночастиц опосредовано в случае гомогенной модели высокой специфичностью взаимодействия НЧ золота с красителем в комплексе с ДНК, тогда как в случае микрофазного подхода высоким сродством НЧ золота к ДНК и концентрированием наночастиц в микрофазе нуклеиновой кислоты [143].

5.2.2 Механизмы тушения флуоресценции красителя SYBRGreen I наночастицами золота на матрице ДНК Тушение флуоресценции SG в комплексе с двухцепочечной ДНК при введении НЧ может быть обусловлено несколькими процессами. Статическое тушение может происходить при образовании нефлуоресцирующего комплекса SG/НЧ Au на матрице ДНК (тип 1). Также возможно осуществление резонансного переноса энергии от красителя SG на НЧ золота, не находящуюся в непосредственном контакте с молекулой красителя, а залегающую, например, в малой бороздке ДНК (тип 2), поскольку выполняется условие спектрального перекрывания флуоресценции донора (SG) и поглощения акцептора (НЧ Au).

Для подтверждения наличия в системе того или иного процесса были измерены времена жизни флуоресценции комплекса SG/ДНК в присутствии различных концентраций НЧ золота (таблица 5.1) [142, 143].

флуоресценции SG в комплексе с дц-ДНК в жизни флуоресценции растворе в присутствии различных концентраций НЧ золота, [SG] = 1 10–7 M, Ошибка измерения не превышала 5%. изменяется (таблица 5.1), что свидетельствует о преимущественно статическом механизме тушения флуоресценции. Постоянство времен жизни флуоресценции также позволяет усомниться в возможности осуществления процесса резонансного переноса энергии от возбужденного состояния красителя на НЧ золота в данной системе.

Расстояние между донором и акцептором энергии в комплексах 2 типа значительно больше, чем требуется для реализации процесса переноса энергии.

Данный факт также подтверждается постоянством анизотропии флуоресценции при различных концентрациях НЧ золота в исследуемой системе SG/ДНК (рисунок 5.7). Флуоресцируют интеркалированные в ДНК молекулы красителя, которые не образуют комплекс с золотыми наночастицами, и находятся на значительном расстоянии от НЧ [104].

Еще одним возможным процессом, обусловливающим уменьшение интенсивности флуоресценции интеркалированного в ДНК красителя в присутствии НЧ золота, является ускорение интеркомбинационной конверсии под действием внешнего тяжелого атома (атомы золота в НЧ). В присутствии тяжелого атома усиливается спин-орбитальное взаимодействие, в результате чего снимается запрет по мультиплетности для перехода в триплетное состояние, и происходит ускорение интеркомбинационной конверсии.

На основании анализа литературы и свойств наночастиц золота была предположена возможность осуществления переноса электрона с красителя на НЧ золота [113]. Были сделаны попытки зафиксировать перенос электрона с SG на НЧ золота на матрице ДНК, который, по-видимому, может происходить, в силу более высокой электроотрицательности наночастиц металлов по сравнению электроотрицательности маленьких (d ~ 2,5 нм) частиц, которые использованы в данном исследовании, по сравнению с частицами больших размеров [145].

Однако зафиксировать перенос электрона при помощи микросекундного импульсного фотолиза и наносекундного лазерного фотолиза не удалось, что может говорить в пользу сверхбыстрого обратимого переноса электрона в фемтосекундной шкале времен. Экспериментальное доказательство этой гипотезы требует дополнительных исследований.

Суммируя приведенные выше экспериментальные и литературные данные, в качестве основного механизма уменьшения флуоресценции красителя SG, интеркалированного в ДНК, в присутствии НЧ золота предложено статическое тушение с образованием нефлуоресцирующего комплекса. Не исключен также вклад в тушение флуоресценции красителя таких процессов, как сверхбыстрый перенос электрона в системе SG/Au и ускорение интеркомбинационной конверсии под действием тяжелого атома.

5.2.3 Анализ кинетических кривых уменьшения флуоресценции красителя SYBRGreen I в комплексе c ДНК в растворе под действием наночастиц золота На рисунке 5.8 (А) представлены кривые уменьшения флуоресценции красителя SG в комплексе c ДНК при добавлении увеличивающихся концентраций НЧ золота. Установлена зависимость наблюдаемой константы скорости взаимодействия НЧ золота с красителем (1/) от добавляемой концентрации НЧ золота. Данная зависимость позволяет определить кинетическую константу бимолекулярной реакции взаимодействия SG с наночастицами золота на матрице ДНК, k1 = 1,8 106 M–1 с–1 (рисунок 5.8, Б) [142]. На основании той же зависимости можно заключить, что в данном равновесии константа скорости обратной реакции (k–1) много меньше константы скорости прямой реакции k1, и, следовательно, образуется очень прочный комплекс SG/НЧ Au на матрице дц-ДНК.

Рисунок 5.8. А – Кинетические кривые уменьшения флуоресценции красителя SG (1,1 10–7 М) в комплексе с дц-ДНК (1,5 10–5 М) при добавлении различных концентраций НЧ золота: 0 (1); 8,8 10–9 (2); 1,76 10–8 (3); 3,5 10–8 (4); 10–8 (5) М. Б – Зависимость наблюдаемой константы скорости взаимодействия НЧ золота с SG в комплексе с дц-ДНК, рассчитанной по моноэкспоненциальной модели, от добавляемой концентрации НЧ золота, k1 = 1,8 106 M–1с–1.

константы (~ 4,1 109 M–1с–1 [146]), что говорит о диффузионном контроле данной реакции со стерическим фактором f = k1/kdiff = 4,4 10–4, обусловленным константы бимолекулярного взаимодействия SG/НЧ Au от концентрации дцДНК в растворе, т. е. от вязкости раствора (рисунок 5.9, А, Б).

Рисунок 5.9. А – Зависимости наблюдаемой константы скорости взаимодействия НЧ золота с SG в комплексе с дц-ДНК (5 10–7 (1); 5 10–6 (2); 1,5 10–5 (3); 10–5 (4); 2,5 10–4 (5) M п. о.), рассчитанной по моноэкспоненциальной модели, от добавляемой концентрации НЧ золота. Б – Зависимость константы тушения k красителя SG (1,1 10–7 М) различными количествами наночастиц золота от концентрации ДНК.

Таким образом, доказано, что взаимодействие между SG и НЧ золота на матрице ДНК ограничивается вязкостью среды, опосредованной наличием ДНК процессом.

5.2.4 Образование ассоциатов наночастиц золота в присутствии комплекса красителя SYBRGreen I с ДНК На рисунке 5.10 представлены спектры поглощения НЧ золота в воде (кривая 1), в присутствии дц-ДНК (кривая 2) и в присутствии комплекса SG/дцДНК (кривая 3). При добавлении НЧ золота к дц-ДНК происходит образование кластеров из нескольких НЧ золота, что сопровождается появлением слабо выраженного максимума плазмонной полосы при 507 нм в спектре поглощения НЧ золота. Полоса плазмонного резонанса становится более ярко выраженной в присутствии комплексов SG с дц-ДНК и смещается в длинноволновую область ( = 531 нм) по сравнению с соответствующим спектром в отсутствии красителя SG, что соответствует увеличению размера образующегося кластера.

Рисунок 5.10. Спектры поглощения НЧ золота (1,8 10–7 M) в воде – 1, в присутствии дц-ДНК (1,5 10–5 М) – 2 и в присутствии комплексов SG (1 10– М) с дц-ДНК (1,5 10–5 М) – 3.