«БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ КОРРЕКЦИИ ОСТРОГО ВОСПАЛЕНИЯ ЛИПИДАМИ ПЕЧЕНИ ТРЕСКИ ...»

1) активация раннего провоспалительного ответа с участием TLR2, TLR4, TLR5, TLR7, TLR9 и внутриклеточных молекул MyD88, IRAK, TRAF6, NF-kB; 2) активация противовирусного ответа и позднего провоспалительного ответа с участием TLR3, TLR4 и внутриклеточных молекул TRAM, TRIF, TBK1, IRF3, а также RIP1 (receptor interactiong protein). Для TLR3 логично развитие именно этого пути активации, так как данный рецептор взаимодействует с вирусной двухспиральной RNA. В то же время TLR4 является уникальным рецептором, одинаково эффективно участвующим в реализации обоих путей клеточной активации, что объясняет, почему именно LPS (специфический лиганд к TLR4) является таким мощным провоспалительным медиатором, вызывающим чаще других ПАМП развитие системной воспалительной реакции и септического шока Проведение активационного сигнала от разных TLR, так же, как и связывание ПАМП, может быть специфическим или, во всяком случае, имеет свои особенности приводящие к развитию разных вариантов защитных реакций.

Следовательно распознавание ПАМП любых разновидностей патогенов приводит, по крайней мере, к двум принципиально важным типам реакций врожденного иммунитета: антибактериальной защите с развитием воспалительной реакции в тканях и к противовирусному ответу, где воспаление дополняется синтезом IFN I типа – основного противовирусного медиатора врожденного иммунитета (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).

Развитие воспаления обеспечивается синтезом комплекса провоспалительных и других цитокинов, стимулирующих большинство дальнейших событий в развитии воспалительной реакции и активации различных типов клеток, участвующих в поддержании и регуляции воспаления, включая все типы лейкоцитов, дендритные клетки, Т- и B- лимфоциты, NK-клетки, эндотелиальные и эпителиальные клетки, фибробласты и др. Главные защитные механизмы, развивающиеся в результате клеточной активации через TLR, представлены в таблице 2 (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).

Функции клеток, активируемые в результате взаимодействия ПАМП c TLR Индукция синтеза провоспалительных Активация местного воспаления и цитокинов IL-1, IL-6, IL-18 и TNF системного острофазового ответа Индукция синтеза интерферонов 1-ого типа Противовирусная защита Индукция синтеза и экспрессии рецепторов Привлечение различных типов клеток в очаг IL-8 и других хемокинов воспаления и миграция в лимфоидные Синтез свободных форм кислорода Уничтожение патогенов Активация циклооксигеназы и Синтез низкомолекулярных медиаторов Индукция синтеза цитокинов семейства IL-12 Дифференцировка T-лимфоцитов Индукция дифференцировки дендритных Усиление представления антигенов и Индукция экспрессии антигенов Усиление представления антигенов и гистосовместимости и костимуляторных индукция дифференцировки Т-лимфоцитов молекул CD-40, CD-80/CD- Таким образом, Toll-подобные рецепторы отвечают за распознавание антигена, активацию антиген-презентирующих клеток, синтез медиаторов воспаления и в развитие иммунологического ответа. В настоящее время активно ведется разработка лекарственных средств и субстанций, являющихся агонистами и антагонистами различных рецепторов TLR, для лечения воспаления с вирусной, бактериальной, аллергической этиологией, таких как грипп, вирусный гепатит, сепсис, артрит, аллергический ринит, астма и другие (Connolly D., O'Neill L., 2012).

1.1.2 Роль внутриклеточных MAP-киназ в развитии воспаления Синтез провоспалительных цитокинов инициируется внутриклеточным сигналингом, одним из звеньев которого являются МАР-киназы p38 и ERK1/2.

МАР-киназы (МАРК) являются серин/треониновыми киназами, чья функция и регуляция сохранилась в процессе эволюции от одноклеточных организмов, таких как пивные дрожжи до высшего существа - человека. МАРК – регуляторные белки, они находятся в цепи передачи активационного сигнала, вызванного разнообразными внеклеточными стимулами (ростовыми факторами, медиаторами воспаления, бактериальными агентами, УФ и другими стрессами окружающей среды).

Каждая молекула активируется по определенному пути и передает сигналы независимо или координировано. По данным многочисленных исследований МАР-киназы p38 и ERK1/2 играют одну из ключевых ролей в развитии воспаления (Рисунок 2) (Huang G. et al., 2009). Во-первых, они фосфорилируют и, таким образом, активируют многие факторы транскрипции, в числе которых ядерный фактор kB (Kyriakis J., Avruch J., 2001; Saklatvala J., 2004), во-вторых, p38 и ERK1/2 обеспечивают посттранскрипционную регуляцию синтеза некоторых белков воспаления: повышают стабильность мРНК (IL-3, IL-6, IL-8, TNF, циклоксигеназы-2 и с-fos) и регулируют ее транспорт из ядра в цитоплазму (TNF) (Dumitru C., 2000; Caput D. et al., 1986; Ming X. et al., 1998; Winzen et al., 1999).

Рисунок 2 – Организация MAP-киназного каскада при иммунологическом Передача сигнала через MAP-киназный каскад происходит через различные рецепторы, участвующие в инициации и развитии воспаления, в том числе TLR, рецептор фактора некроза опухоли (TNFR), рецептор IL-1, T-клеточный рецептор (TCR) и др. (рисунок 3) (Huang G. et al., 2009).

Рисунок 3 – Роль различных рецепторов при передачи внутриклеточного терапевтическое действие на различных моделях воспаления у животных.

SB203580, SB 220025, R-130823 и FR167653 эффективно предотвращали развитие коллаген-индуцированного артрита у мышей (Gum R., 1998; Jackson J., 1998;

Wada Y., 2005; Nishikawa M., 2003). SB242235 подавлял развитие адьювантиндуцированого артрита у крыс (Badger A. et al., 2000). Помимо этого использование ингибиторов МАР-киназы р38 (в частности, SB 203580) блокировало ЛПС-индуцированную продукцию TNF у мышей и крыс и снижало ЛПС-индуцированную смертность у мышей (Badger A. et al., 1996).

На модели экспериментально-индуцированного колита у мышей Hollenbach et al показали, что SB203580 улучшает клинические симптомы, ингибирует патологические изменения тканей и снижает в них уровень мРНК провоспалительных цитокинов (Hollenbach E. et al., 2004). Ингибитор p38/JNK СNI-1493 вызвал улучшение клинической картины и оказал терапевтическое действие на слизистую оболочку пациентов, страдающих болезнью Крона (Hommes D. et al., 2002).

Таким образом, МАР-киназы непосредственно участвуют в процессах воспаления и представляют собой привлекательные мишени для поиска кандидатов в лекарственные средства.

1.1.3 Роль тучных клеток, гистамина и гистаминовых рецепторов в инициации и развитии воспаления Многочисленные данные свидетельствуют о том, что тучные клетки играют важнейшую роль при воспалительных заболеваниях (Theoharides T., 2004), таких как артрит (Woolley D., 2003), атопический дерматит и псориаз (Harvima I. et al., 1993; Ozdamar S. et al., 1996), рассеянный склероз (Theoharides T. 1990) и др. На рисунке 4 схематично продемонстирована степень вовлеченности тучных клеток при различных заболеваниях (Theoharides T., 2012).

Рисунок 4 – Вовлеченность тучных клеток в развитии различных В отличие от аллергических реакций, тучные клетки слабо дегранулируют во время воспалительного процесса. Вовлечение тучных клеток при воспалительных заболеваниях возможно только в случае их активации и селективной секреции медиаторов (Theoharides T. et al., 2007).

При активации тучные клетки секретируют множество вазоактивных и провоспалительных медиаторов (Dvorak A., 1997; Serafin W., Austen K., 1987, Schwartz L. 1987, Holgate S., 2000), которые включают в себя гистамин, серотонин, кинины и протеазы, находящихся в секреторных гранулах. При активации фосфолипазы А2 происходит синтез из арахидоновой кислоты и секреция простагландинов. В течение нескольких часов после стимуляции синтезируются цитокины (IL-1, 2, 5, 6, 8, 9, 13, and TNF) и эндотелиальный ростовой фактор VEGF (Grutzkau А. et al., 1998).

Активаторами дегрануляции тучных клеток являются IgE и антиген, анафилотоксины, гормоны и нейропептиды (субстанция P, нейротензин, хемокинин), патоген-ассоциированные молекулярные паттерны микроорганизмов, включая ЛПС бактерий и вирусные компоненты, а также некоторые цитокины, включая IL-1, IL-9 и др. (Theoharides T., 2012).

Среди важнейших и наиболее изученных медиаторов является гистамин.

Гистамин был впервые идентифицирован в качестве биологически активного вещества еще в начале 1900-х годов. Гистамин оказывает спектр биологического воздействия на многие физиологические и патологические процессы, в том числе с воспалительной этиологией (Thurmond R., 2008).

Гистамин (2-[-имидазолил]этиламин) принадлежит к группе биогенных аминов и синтезируется из аминокислоты гистидина под действием Lгистидиндекарбоксилазы в присутствии пиридоксальфосфата. Он образуется в тучных клетках, базофилах, тромбоцитах, гистаминергических нейронах и Гутов М., 2010).

Биологическое действие гистамина реализуется через 4 типа рецепторов – H1, H2, H3 и H4. Рецепторы гистамина принадлежат к группе рецепторов, 7 раз пересекающих клеточную мембрану и связывающих G-белок. В качестве вторичного посредника H1-гистаминовых рецепторов служат ионы Ca2+ (рисунок 5), H2-рецепторов сAMP. Недавно открытые H3 и H4-гистаминовые рецепторы проводят сигнал как через освобождение Ca2+ из депо, так и через синтез сAMP (MacGlashan D., 2003).

Рисунок 5 – проведение активационного сиганала через H1-гистаминовые Экспрессия гистаминовых рецепторов обнаруживается практически во всех иммунокомпетентных клетках, включая моноциты и макрофаги, лимфоциты, тучные клетки, эозинофилы, дендритные клетки, эндотелиальные и эпителиальные клетки (Thurmond R., 2008).

В частности, через Н1-гистаминовые рецепторы гистамин вызывает спазм гладкой мускулатуры бронхов и кишечника, активирует антиген-презентирующие клетки, стимулирует экспрессию молекул клеточной адгезии, индуцирует привлечение эозинофилов и нейтрофилов в очаг воспаления, повышает проницаемость капилляров, за счет чего инициирует развитие отека тканей (Nijmeijer S. et al., 2010).

Имеющиеся к настоящему времени данные о роли гистамина в генезе различных заболеваний позволили успешно внедрить в клиническую практику целый ряд препаратов, влияющих на его синтез, высвобождение из тучных Гутов М., 2010). При этом существует две стратегии для завершения воспаления:

ингибирование выброса гистамина из тучных клеток и блокада H1-гистаминовых рецепторов. При этом сочетание возможности обеих стратегий в одном препарате повышает его эффективность (Simons F., Simons K., 2011).

1.1.4 Роль эйкозаноидов в инициации и развитии воспаления.

Эйкозаноиды представляют собой целый класс липидных медиаторов, образующихся в процессе метаболизма арахидоновой кислоты. Арахидоновая кислота находится в составе фосфолипидов клеточной мембраны и отщепляется фосфолипазами (преимущественно фосфолипаза A2) в результате действия различных стимулов, включая формил пептид fMLP, IL-8, фактор активации тромбоцитов PAF, микроорганизмы, провоспалительные цитокины, неспецифические раздражители, такие как повреждение, травма и другие (Piper P., Vane J., 1971).

В цитозоле клетки арахидоновая кислота может метаболизироваться тремя основными путями до оксигенированных продуктов, в совокупности называемых эйкозаноиды, которые высвобождаются из клетки в наномолярных концентрациях и действуют по аутокринному/паракринному механизму на клетки-мишени. Это большое семейство включает в себя простагландины (PG) и тромбоксан (общее название простаноиды), образующиеся в результате действия циклооксигеназы (ЦОГ), лейкотриены и липоксины, образующиеся в результате действия липооксигеназ (ЛОГ) (Samuelsson B. et al., 1987; Serhan C. et al., 1984) и эпоксиэйкозатриеновые кислоты, образующиеся в результате действия ферментов цитохром P450 (Capdevila J. et al., 1990).

Циклооксигеназа является бифункциональным ферментом, который осуществляет комплекс свободнорадикальных реакций, действуя последовательно, как бисоксигеназа и пероксидаза. Первым этапом фермент катализирует реакции бисоксигенации и циклизации, преобразуя арахидоновую кислоту в первый метаболит PGG2 (Pagels W. et al., 1983). После чего пероксидазный элемент фермента преобразует гидропероксид углерода в положении и приводит к образованию промежуточной биологически неактивной формы PGH2 (Stables M., Gilroy D., 2011; Hamberg M, Samuelsson B., 1973;

Nugteren D., Hazelhof E., 1973) (Рисунок 6). Существуют две основные изоформы циклооксигеназы, участвующие в преобразовании арахидоновой кислоты – ЦОГи ЦОГ-2. ЦОГ-1 конститутивно экспрессируется в большинстве клеток и тканей, ЦОГ-2 индуцируется в ответ на воспалительные стимулы (Dubois R., 1998). Как известно, ЦОГ-1 – контролирует выработку ПГ, регулирующих целостность слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, функцию тромбоцитов и почечный кровоток, а ЦОГ-2 – участвует в синтезе ПГ, задействованных при воспалении (Stables M., Gilroy D., 2011).

Рисунок 6 – Биосинтез простаноидов из арахидоновой кислоты Дальнейшее формирование биологически активных простагландинов из PGH происходит за счет действия синтаз. Эти синтазы включают в себя простагландин D-синтазу (PGD) (Shimizu T. et al., 1982), простагландин Е-синтазу (PGE) (Tanaka Y., 1987), проcтагландин F синтазу (PGF) (Hayashi H. et al., 1989), простагландин I синтазу (PGI) (DeWitt D., Smith W., 1983) и тромбоксан А синтазу (TXA) (Ullrich V, Haurand M., 1983). Эти синтазы катализируют биосинтез PGЕ2, PGF2, PGI2, TXA2 (рисунок 6).

синтетический профиль и функцию. Так, например, тучные клетки главным образом продуцируют PGD2, в то время как макрофаги во время активации продуцируют PGE2 (Bezugla Y. et al., 2006). Простаноиды оказывают свое биологическое действие путем связывания со специфическими рецепторами на клеточной поверхности. На сегодняшний день известно не менее 9 различных рецепторов простаноидов – рецепторы простагландина D2 DP1 и PD2, рецепторы простагландина Е2 EP1, EP2, EP3 и EP4; FP рецептор простагландина PGF2 и TP суперсемейству G-белок связанных рецепторов (GPCR). Рецепторы IP, DP1, EP2 и EP4 проводят сигнал через Gs субъеденицу, что приводит к увеличению внутриклеточного сАMP, рецепторы EP3 проводят сигнал через Gi субъеденицу, что приводит к уменьшению внутриклеточной сAMP. Рецепторы EP1, FP и TP взаимодействуют с Gq субъеденицей и индуцируют мобилизацию кальция (Hirai H. et al., 2003; Monneret G. et al., 2001, Xue L. et al., 2005).

Простаноиды были впервые идентифицированы в середине 1930 годов как биологически активные молекулы в семенной жидкости человека (Euler U., 1936).

На сегодняшний день ясно, что простаноиды синтезируются во многих тканях и клеточных типах, модулируют такие биологические процессы как сокращение гладкой мускулатуры (Eckenfels A., Vane J., 1972), проницаемость сосудов (Williams T., Jose P., 1979), гиперальгезию (Ferreira S. et al., 1978), боль (Feldberg W., 1971), а также агрегацию тромбоцитов (Moncada S., 1976).

провоспалительными. Оба вызывают вазодилятацию сосудов (Moncada S., 1976), развитие отека за счет увеличения проницаемости сосудов вместе с гистамином и брадикином (Hata A., Breyer R., 2004). PGE2 также известен как пиретический агент, найденный в спинномозговой жидкости у пациетов с висрусной и бактериальной инфекцией (Saxena P. et al., 1979).

Простаноиды также играют важную роль в поддержании сердечно-сосудистого гомеостаза, в защите от окислительного повреждения кардиомиоцитов (Smyth E.

et al., 2009). Нормальный гомеостаз поддерживается прежде всего ЦОГ-1, при этом классические нестероидные противовоспалительные средства (НПВС) ингибируют эту изоформу, в связи с чем терапия классическими НПВС увеличивает риск развитию сердечно-сосудистиых заболеваний, включая инфаркт миокарда, тромбозы, инсульт, системную гипертензию и другие (Garcia Rodriguez L., 2008). Ниже в таблице 3 показаны основные физиологические эффекты простаноидов.

Расслабление гладкой мускулатуры сосудов PGE2, PGF2, PGI Ингибирование агрегации тромбоцитов PGI Расслабление гладкой мускулатуры бронхов PGE2, PGI Констрикция гладкой мускулатуры бронхов PGF Однако подавление нормальной физиологической фунции простаноидов приводит к развитию побочных эффектов. Часто побочные эффекты классических нестероидных противовоспалительных средств (НПВС) развиваются со стороны желудочно-кишечного тракта - гастропатии и желудочно-кишечные расстройства.

Это связано с тормозящим действием НПВС на ЦОГ-1 в слизистой оболочке и снижением синтеза гастропротективных простагландинов (в частности PGЕ2), что приводит к уменьшению секреции слизи, повышению кислотности желудочного содержимого и увеличению проницаемости клеточных мембран (Bertolini A. et al., 2001; Kumar K. et al., 2011). Ингибирование ЦОГ классическими НПВС сдвигает баланс в сторону биосинтеза лейкотриенов, что может приводить к сокращению гладкой мускулатуры и бронхоспазму (Charlier C., Michaux C., 2003; Gilroy D., 1998).

Aрахидоновая кислота также метаболизируется тремя изформами ферментов липооксигеназ 5, 12 или 15-ЛОГ лейкоцитов, тромбоцитов и эндотелиальных клеток, соответственно. Лейкоцитарная 5-ЛОГ отвечает за синтез медленно реагирующих медиаторов анафилаксии лейкотриенов LTC 4, LTD4 и LTE4 (Lewis R. et al., 1980) и LTB4, мощного хемоаттрактанта полиморфоядерных лейкоцитов (рисунок 7) (Borgeat P., 1979; Smith M., 1979).

Рисунок 7 – Биосинтез лейкотриенов из арахидоновой кислоты 5-ЛОГ с помощью белка FLAP преобразует арахидоновую кислоту в гидропероксид путем присоединения молекулярного кислорода в пятом положении (Рисунок 7). Образовавшийся 5-гидропероксиэйкозатетраеновая кислота (5-HPETE) быстро редуцируется до 5-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (5-HETE). 5-HPETE переходит в нестабильный лейкотриен LTA4. Под действием гидролазы LTA4 переходит в LTB4 (Funk C., 2001; Minami M. et al., С участием ферментов -глутамил-S-трансферазы и глутамилтранспептидазы образуется так называемые цистиинил лейкотриены LTC4, LTD4 и LTЕ4 (Lam B.et al., 1990; Leier I. et al., 1994).

Лейкотриены также как и простаноиды осуществляют свою биологическую роль путем взаимодействия со специфическими рецепторами, которых на данный момент описано четыре – рецепторы лейкотриена B4 изоформы 1 и 2 (BLT1 и BLT2), рецепторы к цистеинил лейкотриенам 1 и 2 (cysLT1 и cysLT2) (Kanaoka Y.

Boyce J., 2004; Tager A. et al., 2003). Рецептор cysLT1 отвечает за развитие бронхоспазма, секрецию слизи, аккумулицяции жидкости в дыхательные пути во время анафилактической реакции (Lynch K. et al., 1999), рецептор cysLT2 отвечает за проницаемость сосудов, фиброз ткани в дыхательных путях легких (Beller T., 2004, Hui Y., 2004). При воспалении основная роль отдается рецептору BLT1, который с высокой афинностью способен связывать лейкотриен LTB4 и отвечает прежде всего за хемотаксис лейкоцитов в зону воспаления.

В процессе острого воспаления лейкотриены играют центральную роль и синтезируются полиморфоядерными нейтрофилами, макрофагами и тучными клетками. В частности, лейкотриен B4 привлекает и активирует нейтрофилы, моноциты и лимфоциты, а лейкотриен D4 является главным хемоаттрактантом для эозинофилов. Цистеинил лейкотриены LTC4, LTD4 и LTE4 прежде всего направлены на увеличение проницаемости сосудов и, как следствие, способствуют развитию отека ткани. Лейкотриены обязательно задействованы в развитии таких патологий как ревматоидный артрит, псориаз, аллергический ринит, бронхиальная астма, атеросклероз, остеопртрит и другие (Stables M., Gilroy D., 2011).

Учитывая важнейшую роль эйкозаноидов при воспалении одним из возможных молекулярных механизмов противовоспалительного действия может быть ингибирование ферментов ЦОГ и ЛОГ и снижение синтеза простагландинов и лейкотриенов, получаемых из арахидоновой кислоты (Holgate S. et al., 2003).

1.2 НОВЫЙ КЛАСС ЛИПИДНЫХ МЕДИАТОРОВ, УЧАСТВУЮЩИХ В

РАЗРЕШЕНИИ ВОСПАЛЕНИЯ. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕХАНИЗМЫ

РАЗРЕШЕНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ С ИХ УЧАСТИЕМ

Разрешение воспаления состоит из трех основных этапов: подавление провоспалительной сигнализации, апоптоз нейтрофилов и осуществление последующей миграцией через лимфатические узлы.

Начальный этап разрешения воспаления включает в себя подавление трансформирующий фактор роста- (TGF), протеолитических ферментов и липидных медиаторов. “Противовоспалительный состав” окружающей среды способствует апоптозу нейтрофилов, которые затем удаляются макрофагами.

После фагоцитоза макрофаги начинают активно продуцировать высокие уровни противовоспалительных липидных медиаторов, после чего покидают сайт воспаления через ближайшие лимфатические узлы (Savill J., Fadok V., 2000; Van Hove C. et al., 2008; Vandivier R. et al., 2006). Накопленные данные скоординированным процессом, который жестко регулируется несколькими эндогенными противовоспалительными посредниками, включая липидные медиаторы липоксины и резолвины (Serhan C., 2007). Эти медиаторы блокируют проницаемость сосудов, вызывают апоптоз остатков нейтрофилов и содействуют лимфатические сосуды и облегчают удаление экссудата и фибрина из воспаленной ткани, что в способствует нормальному гомеостазу (Serhan C., Chiang N., 2008).

Принято разделять противовоспалительные свойства медиаторов и их свойства к разрешению воспаления (в дальнейшем разрешающие свойства). В то время как противовоспалительное действие, увеличение притока моноцитов и макрофагов связано с проявлением разрешающих свойств. Парадоксально, но усиление противовоспалительного действия может только продлить время к элиминации воспалительного процесса. Например, ингибиторы циклооксигеназ и липооксигеназ ингибируют выработку провоспалительных эйкозаноидов, в частности, классических простагландинов и лейкотриенов, но при этом они могут нарушать биосинтез медиаторов резолюции, включая резолвины и липоксины (Simopoulos A., 1999; Serhan C. et al., 2008).

1.2.2 Роль макрофагов в разрешении воспаления Полиморфоядерные нейтрофилы являются основными эффекторными клетками острых воспалительных реакций, поэтому их удаление из сайта воспаления является необходимым условием для эффективного разрешения воспаления. На поздней фазе воспаления полиморфоядерные нейтрофилы спонтанно подвергаются апоптозу, что делает их “узнаваемыми” для макрофагов.

Макрофаги являются ключевыми игроками в разрешении острого воспаления.

Кроме фагоцитирования мертвых клеток и поглощения выделяемых ими продуктов, макрофаги также способствуют инициации апоптоза соседних нейтрофилов, выбрасывая в зону поражения “цитокины смерти”, например Fas лиганд. Фагоцитоз макрофагами апоптотических нейтрофилов имеет специальное определение - эффероцитоз. Эффероцитоз стимулирует макрофаги к продукции противовоспалительных медиаторов, таких как TGF-1, которые блокируют TLRиндуцированную провоспалительную сигнализацию. TGF-1 играет две существенные роли в разрешения воспаления - подавление воспаления, а другая стимулирование восстановления тканей, секреция фактора роста эндотелия сосудов и коллагена (Voll R. et al., 1997; Golpon H. et al., 2004).

После эффероцитоза макрофаги начинают процесс ухода из воспаленных тканей до ближайших лимфатических сосудов и ткань возвращается в нормальное состояние. Если макрофаги не в состоянии мигрировать через лимфатические узлы, то они будут постоянно накапливаться в ткани, что является отличительной чертой хронического воспаления (Bellingan G. et al., 1996).

Таким образом, макрофаги играют ключевую роль как в инициации воспаления, так и в способствоваванию разрешения воспаления, заживлению ран и восстановлению поврежденных тканей. В соответствии с этим, существует концепция альтернативной активации макрофагов (Stein M. et al., 1992). В соответствии с ней макрофаги были разделены на два основных типа: классически активированные макрофаги (тип M1), которые способствуют воспалению и альтернативно активированные макрофаги (тип M2) с противовоспалительным и разрашающими свойствами. Макрофаги, которые присутствуют при резолюции острого воспаления, в основном поляризованные типа М2, экспрессируют скавенджер-рецепторы, маннозные и галактозные рецепторы, аргиназу-1 и др.

(Martinez F. et al., 2009). Макрофаги типа М2 принимают участие в ключевых процессах резолюции воспаления, в его подавлении, в удалении “мусора” и апоптозных клеток, а также в стимуляции ангиогенеза (Lopez-Castejon G. et al., 2011).

“Переключатель” поляризации макрофагов в тип M2 находится под контролем секретируемых лимфоцитами Tхелпер-2 биологически активных веществ, таких как IL-4 и IL-13, IL-10, глюкокортикоидные гормоны, биологически активные липиды или фактор транскрипции PPAR. Функциональная поляризация макрофагов в M2 может быть одной из терапевтических стратегий для лечения воспалительных заболеваний (Tabas I., 2010; Odegaard J. et al., 2007).

1.3.3 Липидные медиаторы, участвующие в разрешении воспаления Начало воспаления определяется в основном липидными медиаторами, получаемых из -6 полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК), особенно арахидоновой кислоты (AA), но разрешение воспаления преимущественно регулируется липидными медиаторами, полученных из -3 ПНЖК.

Важно отметить, что -6 и -3 ПНЖК являются конкурирующими субстратами для циклооксигеназы (ЦОГ) и липооксигеназы (ЛОГ). Так, для биосинтеза эйкозаноидов преимущественно используется арахидоновая кислота (-6), поскольку клеточные мембраны содержат в основном именно арахидоновую кислоту (Schmitz G., Ecker J., 2008).

воспалительного процесса, под действием ферментов ЦОГ и ЛОГ, опосредуют воспалительную реакцию, стимулируя расширение кровеносных сосудов и хемотаксис нейтрофилов в зону воспаления. Интересно, что эйкозаноиды могут одновременно выступать и в качестве противовоспалительных агентов. Так PGE2, один из представителей провоспалительных простагландинов, модулирует начальную фазу воспаления, стимулирует продукцию провоспалительных цитокинов. С другой стороны, PGE2 может также способствовать уменьшению продукции провоспалительных лейкотриенов 4-й серии через ингибирование 5ЛОГ. При этом, происходит субстратная нагрузка другой изоформы фермента 15ЛОГ, что способствует синтезу липидных медиаторов, участвующих в разрешении воспаления. Таким образом, сигнальные пути, ведущие к синтезу PGE2, в свою очередь, способны модулировать работу фермента 15-ЛОГ, необходимого для генерации другого класса эйкозаноидов (липоксины), а также нового семейства липидных медиаторов (резолвинов), образующихся из - ПНЖК (Bagga D. et al., 2003, Levy B. et al., 2001).

Провоспалительные медиаторы образуются в течение нескольких секунд и минут от начала процесса острого воспаления, в то время как в более поздние сроки (от часов до дней), постепенно растет количество противовоспалительных посредников и медиаторов процесса разрешения. Это реципрокное изменение липидных посредников из провоспалительных эйкозаноидов в резолвины и липоксины, обладающих противовоспалительными свойствами, имеет решающее значение для завершения воспалительного процесса (Serhan C. et al., 2008).

В разрешении воспаления, различные серии противовоспалительных и липидных медиаторов синтезируются в зависимости от субстрата. Новые биоактивные липидные медиаторы, называемые резолвины, были найдены в воспалительном экссудате (Arita M. et al., 2005). Резолвины являются эндогенными липидными медиаторами, которые образуются из -3 ПНЖК, главным образом из эйкозапентаеновой кислоты (EPA) и докозапентаеновой кислоты (DHA) (Lee H., Surh Y., 2012).

Они включают в себя резолвины E серии (RvE), полученные из EPA, и резолвины D-серии (RvD), нейропротектины/протектины, марезины и эпимеры, получаемые в результате ацетилирующего действия аспирина на ЦОГ-2.

Дополнительная серия резолвинов D образуется только в присутствии аспирина R-Резолвин D серии (Рисунок 8) (Lee H., Surh Y., 2012).

Рисунок 8 - Биосинтез липидных медиаторов, участвующих в разрешении Резолвины E-серии подразделяют на две группы: 18R и 18S резолвины серии E. Оба синтезуруются из EPA во время воспаления, когда эндотелиальные клетки взаимодействуют с лейкоцитами. В присутствии аспирина EPA может быть преобразована ферментативно в 18R и 18S гидроксиэйкозапентаеновые кислоты (или 18R-18S-HEPEs) ацетилированной ЦОГ-2 в эндотелиальных клетках. 18R и 18S-HEPES высвобождаются лейкоцитами для последующего преобразования 5ЛОГ в RvE1 и 18S-RvE1, соответственно (Arita M. et al., 2005; Oh S. et al., 2011).

RvE2/18S-RvE2 структурно отличаются от RvE1/18S-RvE1 и идентифицированы как 5S,18(R/S)-дигидрокси-EPA (Tjonahen E. et al., 2006).

DHA является предшественником двух групп резолвинов, которые называются как 17S D-резолвины и 17R D-аспирин-опосредованные (AT-RVS). DHA могут быть преобразованы ЛОГ в 17S-гидрокси резолвины, известные как RvD1 в RvD (Рисунок 8). RvD1 биосинтез включает в себя последовательное оксигенирование 15-ЛОГ и 5-ЛОГ. В присутствии аспирина, DHA преобразуется в 17R-гидроксиDHA (17R-HDHA) аспирин-ацетилированной ЦОГ-2, а затем 5-ЛОГ, в результате чего образуется AT-RvD1 (Sun Y. et al., 2007; Chiang N. et al., 2012; Hong S. et al., 2003).

В дополнение к резолвинам D-серии, DHA может быть преобразована в протектины путем ферментативного гидролиза и эпоксидирования.

Представитель члена протектинов - протектин D1, известный как нейропротектин D1, генерируются в нервных тканях, отличается наличием сопряженной триенсодержащей структуры. Биосинтез протектинов происходит под действием 15ЛОГ (Sun Y. et al., 2007; Hong S. et al., 2003).

Недавно было открыто новое семейсто производных жирных кислот DHA, называемых марезинами (медиаторы макрофагов, участвующих в регуляции воспаления). Эти новые молекулы продуцируются макрофагами и действуют непосредственно на фагоциты (Serhan C. et al., 2009).

Накопленные данные демонстрируют, что резолвины и протектины обладают противовоспалительным действием и разрешающими свойствами. Среди резолвинов E-серии, биологические функции RvE1 освещены в литературе наиболее подробно. При низких наномолярных концентрациях, RvE1 подавляет воспаление, блокируя трансэндотелиальную миграцию нейтрофилов, провоспалительных сигнальных (например, NF-kB активацию) и высвобождение провоспалительных цитокинов, включая TNF, IL-1 и IL-6 (Gronert K. et al., 2004;

Arita M. et al., 2007). Он также известен как мощный контррегулятор накопления супероксиданион радикала, тем самым предотвращая разрушение ткани в результате свободно-радикального окисления (Hasturk H. et al., 2006). В дополнение к этому противовоспалительному действию, RvE1 привлекает неактивированные моноциты и макрофаги, а также способствует фагоцитозу нейтрофилов макрофагами (Schwab J. et al., 2007). Кроме того, было обнаружено, что RvE1 способствует удалению хемокинов. RvE1 регулирует экспрессию рецептора хемокинов типа 5 (CCR5) во время апоптоза PMNs, увеличивает связывание этого рецептора с CCR5 хемокинами CCL3 и CCL5, участвующих в воспалении и аутоиммунных заболеваниях. Макрофаги, поглощают PMNs, на поверхности которых находятся хемокины (Ariel A. et al., 2006).

Рисунок 9 - Двойное действие липидных медиаторов в резолюции Резолвины E серии, D серии и протектины также терминируют инфильтрацию нейтрофилов, ингибируют секрецию провоспалительных цитокинов и экспериментальных моделей воспалительных заболеваний, включая перитонит, пародонтит, бронхиальную астму, колит, аллергические воспаления дыхательных путей, артритах, сухость глаз, воспалительные боли (таблица 4).

RvE Перитонит Стимуляция продукции противовоспалительных Перитонит Ограничение инфильтрации нейтрофилов Перитонит Ограничение инфильтрации нейтрофилов Протектин Марезин 1 Перитонит Ограничение инфильтрации нейтрофилов (Serhan C. et al., 2012) Таким образом, воспаление может быть пролонгировано во времени из-за недостаточного синтеза противовоспалительных медиаторов и медиаторов разрешения, постоянной стимуляции провоспалительных сигналов, отсутствия измененения фенотипа макрофагов и Т-клеточных популяций в сайте воспаления, а также при неконтролируемом проникновении миелоидных клеток-супрессоров (Nathan C., Ding A., 2010).

1.3 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ МОДЕЛИ ДЛЯ ОЦЕНКИ ИНИЦИАЦИИ И

РАЗРЕШЕНИЯ ВОСПАЛЕНИЯ

Мешочек состоит главным образом из макрофагов и фибробластов, хорошо васкуляризирован, и имеет сходство с синовиальной сумкой (Taylor G., 2003).

Каррагенин представляет собой группу неразветвленных сульфатированных полисахаридов, молекулы которых построены из остатков производных Dгалактопиранозы со строгим чередованием -1,3- и -1,4 связей между ними.

Каррагенин получают из красных морских водорослей. Различия между отдельными представителями каррагенинов обусловлены тем, что в качестве 4-Озамещенного моносахаридного остатка может выступать не только D-галактоза, но и 3,6-ангидро-D-галактоза, при этом гидроксильные группы могут быть сульфатированы, изредка метилированы, а в качестве 3-О-замещенного остатка в молекуле иногда содержится 4,6-О-(1'-карбокси) этилиденовое производное Dгалактозы (Tsuji R. et al., 2003).

Каррагенин взаимодействует с рецепторами TLR4 на поверхности макрофагов, выстилающих внутрикапсульную область мешочка, что вызывает их активацию и последующий синтез провоспалительных медиаторов (IL-1; IL-6; TNF, IL-8, простагландинов и лейкотриенов, NO, активных форм кислорода) (Tsuji R. et al., 2003).

вазодилятацию сосудов. Вазодилятация способствует инфильтрации клеток и медиаторов воспаления и опосредуется в ответ на действие NO и некоторых простагландинов. NO образуется из L-аргинина вследствие активации NOсинтазы (NOS) (Рисунок 10) (Sherwood E., Toliver-Kinsky T., 2004).

Рисунок 10 - Образование NO вследствии активации NО-синтазы Другой признак воспалительного процесса, вызванного введением раствора каррагенина, это экссудация жидкости. Экссудат в мешочке образуется в результате накопления богатой белками жидкости во внутритканевое пространство под действием гистамина, брадикинина, лейкотриенов, компонентов комплемента, субстанции P и тромбоцит-активирующего фактора PAF. Все эти факторы заметно изменяют барьерную функцию малых кровеносных сосудов и увеличивают проницаемость капилляров и венул как для воды, так и для белков (Friedl H. et al. 1989; Denzlinger C. et al. 1985).

Вазодилятация и экссудация жидкости сопровождается миграцией лейкоцитов.

Нейтрофилы первыми среди лейкоцитов мигрируют в зону воспаления. Процесс трансмиграции нейтрофилов можно разделить на несколько стадий: роллинг, адгезия, диапедез (трансмиграция) и хемотаксис (Sherwood E., Toliver-Kinsky T., 2004) (Рисунок 11).

Рисунок 11 - Хематаксис нейтрофилов через эндотелий сосудов В результате через 6 часов после введения раствора каррагенина наблюдается резкое увеличение в экссудате лейкоцитов (до 10-20х106 кл/мл). Из них 80-90% составляют нейтрофилы. Значительно повышается уровень провоспалительных медиаторов, включая TNF, IL-1, IL-6, лейкотриенов и простагландинов (Martin S.

et al., 1994).

Таким образом, ограниченное воспаление в мешочке характеризуется инфильтрацией клеток в эксудат и образованием биохимических медиаторов.

(Edwards J. et al., 1981). Модель широко используется для исследования процессов разрешения воспаления (Ariel A., Serhan C. 2007; Serhan C. et al. 2011).

1.3.2 Модель контактного дерматита у мышей характеризующаяся повреждением кожи и эритемой, вызванными контактом кожи с аллергеном, в роли которого чаще всего выступает химическое вещество.

Контактный дерматит возникает как минимум при двукратном контакте кожи с химическим аллергеном (стадии сенсибилизации и разрешения). По Gell and Coombs реакцию классифицируют как клеточно-опосредованный 4 тип (Gell P., Coombs R., 1975).

В отличие от других типов аллергических реакций, аллергические реакции замедленного типа являются не гуморальными, а клеточными реакциями. Эти реакции обусловлены взаимодействием сенсибилизированных T-лимфоцитов с антигенами. Гиперчувствительность замедленного типа (ГЗТ) обозначает группу аллергических реакций, развивающихся в сенсибилизированном организме через 24– сенсибилизации и стадию разрешения. При первичном контакте кожи с химическим аллергеном (стадия сенсибилизации) последний проникает в роговой слой эпидермиса, где контактирует с клетками Лангерганса (антигенпрезентирующие клетки), образуя комплекс, который мигрирует в региональные лимфатические узлы, где в паракортикальной зоне происходит дифференцировка CD8+ и CD4+ популяции Т-лимфоцитов. Образуются клетки памяти (TDTH ). TDTH пролифирируют и мигрируют из лимфатических узлов в кровь, где циркулируют между лимфатическими сосудами и дермальным слоем кожи (рисунок 12) (Marzulli F., Maibach H., 2008).

Рисунок 12 - Схема развития реакции ГЗТ (контактного дерматита) Процесс распознавания химического аллергена схож с процессом узнавания естественных патогенов (грибов, бактерий и вирусов). Для разных химических аллергенов этот процесс может проходить либо прямо через взаимодействие с TLR рецепторами либо опосредовано. Например, Ni взаимодействует напрямую через TLR4 рецептор, а химический аллерген ДНХБ сначала способствует разрушению гиалуроновой кислоты. Процесс распознавания химического аллергена необходим как на стадии разрешения, так и сенсибилизации. На стадии сенсибилизации он приводит к презентации антигена Т-лимфоцитам, а на стадии разрешения к началу воспалительного патологического процесса (рисунок 13) (Martin S. et al., 2011).

Рисунок 13 - Процесс распознавания химического аллергена и внутриклеточный При повторном контакте эпидермиса с химическим аллергеном (стадия разрешения) происходит активация Т-лимфоцитов и синтез провоспалительных медиаторов клетками эпедермального слоя кожи, что приводит к развитию воспалительной реакции в месте контакта (Marzulli F., Maibach H., 2008).

На следующем рисунке показана схема событий, происходящих в течении первых 4 часов после контакта с аллергеном (рисунок 14).

Рисунок 14 - Схема событий, происходящих в течение первых четырех часов Как видно из рисунка, в процесс инициации развития воспаления в коже задействованы разные типы клеток, включая кератиноциты (KC), клетки Лангерганса, дендритные клетки (макрофаги тканей), тучные клетки, B- и Тлимфоциты, натуральные киллеры NKT cell). В первые часы происходит активный выброс медиаторов воспаления – вазоактивных аминов, продуктов арахидоновой кислоты, широкого спектра цитокинов, активных форм кислорода.

Главной задачей этих медиаторов является подготовка окружения для элиминации аллергена за счет привлечения новых иммунокомпетентных клеток – моноцитов, нейтрофилов и лимфоцитов разных популяций.

На рисунке 15 описан процесс развития реакции в интервале от 12-48 часов. В этот промежуток времени воспаление достигает своего максимума, и характеризуется клеточной инфильтрацией и разрушением близлежайших тканей.

Рисунок 15 - Воспалительный процесс в период от 12-48 часов после За время от 48 - 120 часов после повторной встречи с аллергеном запускаются механизмы, приводящие к элименации клеточного инфильтрата и устранению повреждений (Johansen J. et al., 2011).

Для фармакологических исследований используются разные модели аллергического контактного дерматита на мышах и морских свинках (Polak L.

Rinck C., 1977; Zhang E. et al., 2009). Чаще всего контактный дерматит вызывают у мышей химическими аллергенами, такими как ДНХБ или ДНФБ. Существуют разные схемы сенсибилизации и разрешения. Классическим методом является однократное нанесение раствора ДНФБ или ДНХБ для сенсибилизации на выбритый участок спины или живота мышей и однократное нанесение разрешающей дозы аллергена на дорсальную поверхность уха. Такая схема была использована в первом эксперименте.

Были рассмотрены разные схемы индукции контактного дермататита (Zhang E.

et al., 2009). Максимально выраженные патологические изменения наблюдались при трехкратном воздействии 2% спиртового раствора ДНХБ на выбритый участок спины мышей (сенсибилизация на 0,7 и 13 день эксперимента) и двукратным нанесением с интервалом в 1 час на 17 день эксперимента разрешающей дозы аллергена на дорсальную поверхность уха (схема эксперимента была выбрана для второго исследования). При такой схеме наблюдается ярко выраженное воспаление. При этом, только при такой схеме, в организме животных вырабатываются специфические к ДНХБ IgE. Фактически второе нанесение ДНХБ, это уже стадия разрешения, которая приводит к воспалению на коже спины.

Наиболее широко используемыми показателями для оценки патологии и противовоспалительной активности являются разница веса пораженного (“опытного”) и контрольного (интактного) уха, толщина уха, гистологически выявленное воспаление, уровень IgE в сыворотке крови, уровни различных цитокинов в тканях уха (Daisuke H. et al., 2006).

Важно отметить, что модель контактного дерматита представляет собой воспалительный процесс кожи, при котором важную роль играют тучные клетки и гистамин.

1.4 ГИДРОБИОНТЫ КАК ИСТОЧНИК ПОЛУЧЕНИЯ КАНДИДАТОВ В

ЛЕКАРСТВЕННЫЕ СРЕДСТВА

Миллионы лет развития и генетического разнообразия делают морских обиталей золотой жилой для поиска новых вторичных метаболитов. По ряду причин, а именно, недоступность среды их обитания и очень низкий выход биологически активных метаболитов, систематические исследования этих объектов несколько десятилетий назад не пользовались большой популярностью. Тем не менее, последние достижения в области подводных исследований, химии природных продуктов и их получения привели к существенному расширению поиска новых биомолекул из гидробионтов.

Биологически активные вещества (БАВ) морского происхождения могут использоваться в качестве фармацевтических субстанций и служить исходными соединениями (синтонами) для получения лекарств с новыми или улучшенными фармакологическими характеристиками. Эти вещества являются вторичными метаболитами, то есть природными соединениями, не имеющими всеобщего распространения и присутствующими только у представителей отдельных таксонов или даже одного вида (Стоник В.А., Толстиков Г.А., 2008).

О важности морских организмов и их метаболитов свидетельствует тот факт, что около 50% утвержденных FDA препаратов в течение 1981-2002 были созданы либо из морских метаболитов или из их синтетических аналогов. На рынке фармацевтических препаратов находятся -3 полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), Ara-C (Цитарабин, противоопухолевая активность), Ара-A (противовирусная активность), Ziconotide (анальгетик), Trabectidin (противоопухолевая активность) и другие. Кроме того, еще несколько соединений, таких как бриостатин, дидегидродидемнин, ерибулин мезилат, доластатины, кахалалид F, KRN 7000, скваламин и другие находятся на разных стадиях клинических испытаний (Mayer A. et al., 2010).

Последние собранные статистические данные вплоть до начала 2008 года в области достижений в изучении метаболитов морских организмов выявили самые разнообразные биологические свойства (Mayer A. et al., 2011). На рисунке представлена классификация веществ в зависимости от вида биологической активности.

Рисунок 16 - Классификация веществ на основании их биологической активности Результаты исследований по выделению биологически активных веществ из гидробионтов, обитающих в различных водных ресурсах, показывают, что основными классами биологически активных соединений являются полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК), полисахариды, витамины и минералы, антиоксиданты, ферменты и пептиды (Kobayashi M., Satari R. 1998;

Kim S., Mendis E., 2006).

Представители рыб являются источниками незначительного числа вторичных метаболитов. Рыбные жиры, обогащенные -3 полиненасыщенными жирными кислотами (главным образом эйкозапентаеновой и докозагексаеновой), составляют основу биологически активных добавок к пище и лекарственных препаратов, предназначенных для лечения и профилактики сердечно-сосудистых заболеваний, кожных болезней, заболеваний суставов и злокачественных новообразований. Заслуживают внимания и другие компоненты морских жиров, в частности, алкилглицерины и этаноламиды жирных кислот (N-ацилэтаноламины).

встречаются в продуктах животного происхождения, но наиболее богаты ими морские рыбы и млекопитающие. Алкилглицерины могут найти применение при нарушениях жирового обмена и в качестве иммуномодуляторов. Морская ихтиофауна насчитывает примерно 500 видов токсичных рыб, среди которых наиболее известна рыба фугу и ее тетродотоксин. Токсины рыб рассматриваются как потенциальный источник высокоактивных соединений (Watters M., 2005).

Новый класс соединений, скваламинов, полученных из акулы Squalus acanthias, обладает широким спектром антибиотической активности (Moore K. et al., 1993).

Филе, обрезки и хребет, получаемые в процессе филетирования рыбы, содержат значительное количество протеинов, которые характеризуются высокой питательной ценностью и хорошо сбалансированным аминокислотным составом (Venugopal V. et al., 1996). В результате ферментативного гидролиза филе, рыбных обрезков и скелета могут быть получены биологически активные антигипертензивным, противотромботическим, иммуномодулирующим, антиоксидантным т.д. (Benkajul S., Morrissey M., 1997).

Кожа рыб является потенциальным источником выделения коллагена и желатина. Коллаген и желатин – уникальные протеины, схожие с мышечными протеинами рыб по аминокислотному составу, которые на 80% содержат такие неполярные аминокислоты, как: глицин, аланин, валин и пролин. Желатин – это продукт частичного гидролиза коллагена.

В медицинской и фармацевтической промышленностях коллаген обычно используют в качестве носителя действующих веществ (Lee H. et al., 2001).

Особенно микрофибриллы коллагена считаются перспективным носителями противораковых веществ. Коллаген может входить в состав систем доставки направленного действия, например, гена, стимулирующего образование кости и предположению, что прием внутрь гидролизатов коллагена/желатина уменьшают боль у пациентов, страдающих от остеоартритов; гидролизованный коллаген участвует в процессе синтеза хрящевого матрикса (Moskowitz R., 2000).

Желатин, выделенный в результате ферментативного гидролиза кожи рыбы, проявил даже несколько бльшую антиоксидантную и антигипертензивную активности, чем пептиды из протеиновых гидролизатов рыб. Пептиды, выделенные из желатина, характеризуются наличием в своей структуре повторяющейся последовательностью аминокислот глицин-пролин-аланин.

Предположительно, обнаруженные активности пептидов желатина могут быть связаны с их уникальным аминокислотным составом (Kim S. et al., 2001).

В мировой практике имеется множество примеров обнаружения и выделения из печени водных организмов различных биологически активных веществ. Так, в печени и других органах японской камбалы Paralichtys olivaceus был обнаружен богатый цистеином пептид, проявляющий высокую антимикробную активность и получивший название гепсидин (Hirono I. et al., 2005). В печени атлантического лосося Salmo salar был выделен белок, обладающий антимикробным действием (Richards R., 2001).

Наиболее изученными пептидами из внутренних органов являются пептиды, выделенные из гидролизатов кишечника и печени рыбы бонито (тунец-бонито, скумбриевидный тунец). Последовательный двухступенчатый гидролиз печени тунца позволил установить, что выделенный экстракт оказывал значительный антиоксидантный эффект в отношении DPPH-радикала, ОН-радикала, перокисид водорода, а также оказывал ингибирующее действие в отношении ангиотензин превращающего фермента (Je J. et al., 2009; Ahn C. et al., 2010).

Таким образом, морские организмы, в частности рыба и особенно печень низкомолекулярных веществ, так и целого набора высокомолекулярных соединений, которые можно применять для изготовления препаратов.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1.2 Химический анализ субстанции Методом ВЭЖХ-ELSD установлено, что ЛК содержит фосфолипиды, эфиры холестерина, холестерин, моноглицериды и др. вещества, при этом основным фосфолипидом является фосфатидилхолин, содержание которого составляет не менее 40 мг/г (4%). Таким образом, субстанция является производным глицерофосфолипидов.

Жирнокислотный состав был определен методом ГХ-МС и представлен миристиновой, пальмитолеиновой, пальмитиновой, стеариновой, гондоиновой (11-эйкозеновой), линолевой кислотами, олеиновой и 11-цис/транс-октадекановой (цис/транс-вакценовой) кислотами. Сделано заключение, что фосфатидилхолин содержит остатки пальмитиновой (23,0%), эйкозапентаеновой (14,5%) и олеиновой кислоты (11,9%); в фосфатидилэтаноламине основными кислотами являются эйкозапентаеновая (14,0%), олеиновая (12,8%) и пальмитиновая (10,2%) кислоты, в фосфатидилинозитоле – стеариновая (17,8%), олеиновая (15,7%), эйкозапентаеновая (10,9%) и пальмитиновая кислоты (10,8%).

Мыши, крысы и морские свинки для исследований были получены из Российской академии медицинских наук Питомник лабораторных животных «Рапполово». Характеристика животных указана в таблицах 5-7.

Характеристика животных для проведения исследования на модели контактного Источник получения:

Вес животных к началу исследования:

Характеристика животных для проведения исследования на модели каррагенинового воздушного мешочка у крыс Источник получения:

Вес животных к началу исследования:

Характеристика животных для проведения теста ex vivo c использованием подвздошной кишки морской свинки (анализ взаимодействия с H1гистаминовыми рецепторами) Источник получения:

Вес животных к началу исследования:

Лабораторные животные содержались в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009.

Лабораторные мыши размещались в поликарбонатных клетках Charles River laboratories Inc тип 3H, S=1126,25 см2, группами по 15 особей одного пола, на подстиле; клетки покрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением. Площадь пола в клетке содержания для одного животного составила 75 см2 (минимально допустимая площадь 150 см 2). Уборка клеток и смена подстила производилась минимум 2 раза в неделю.

В период акклиматизации и эксперимента лабораторные крысы были размещены в поликарбонатных клетках Charles River laboratories Inc тип 4H, S=1800 см2, группами по 10 особей одного пола, на подстиле. Площадь пола в клетке содержания для одного животного составила 180 см 2 (минимально допустимая площадь 150 см2).

В период акклиматизации и эксперимента морские свинки были размещены в поликарбонатных клетках BENEX a.c. (Чешская республика) тип Т4А, S= см2, группами по 5 особей одного пола, на подстиле; клетки покрыты стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением. Площадь пола в клетке содержания для одного животного составила 438,8 см 2 (минимально допустимая площадь 150 см2).

Лабораторных животных кормили комбикормом «Корм для содержания лабораторных животных» ПК-120-1, приготовленным по ГОСТ Р 50258-92 в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.

Лабораторные животные получали воду, соответствующую ГОСТу «Вода питьевая» 2874-82. Корм и вода довались ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки.

В качестве подстила использовали древесные гранулы (ООО «Биосфера», Санкт-Петербург, Россия).

Лабораторные животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (20-22°C и относительной влажности воздуха 60-70%).

Световой режим составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Воздухообмен в помещении контролировался с помощью анемометра и путем измерения содержания в воздухе углекислого газа и аммиака. Устанавливали режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO2 не более 0,15 объемных %, аммиака — не более 0,001 мг/л.

Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. Никаких существенных отклонений этих параметров в период акклиматизации и в ходе эксперимента не произошло.

Лабораторные животные до начала исследования содержались 14 дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных каждый день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра. Лабораторные животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальные группы включены не были.

Перед началом исследования лабораторные животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы методом блочной рандомизации.

2.3 МЕТОДЫ ОЦЕНКИ ВЛИЯНИЯ ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА НА

ЭНЗИМАТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ 5-ЛОГ И ЦОГ-2 В УСЛОВИЯХ IN VITRO

С помощью тест-системы оценивали количество гидропероксидов, продуцируемых в реакции липооксигенации. Образцы исследовали в четырех повторностях. Реакцию проводили при комнатной температуре на орбитальном шейкере (Immochem 1100, США). Время инкубации неселективного ингибитора NDGA/ЛК с 5-ЛОГ (фермент) и линоленовой кислотой (субстрат) составляло минут. Энзиматический катализ останавливали внесением хромогена. Через минут инкубации проводили измерение оптической плотности при длине волны 490 нм на планшетном спектрофотометре xMark (BioRad, США). После регистрации оптической плотности вычисляли % ингибирования фермента.

2.3.2 Анализ влияния липидного комплекса на энзиматическую активность ЦОГ- Исследование влияния субстанции ЛК на энзиматическую активность ЦОГ- проводили с использованием набора COX inhibitor screening assay kit (Cayman Chemicals, США) в соответствии с инструкцией производителя. Тест-система включает человеческую рекомбинантную ЦОГ-2. ЛК исследовали в концентрациях 25, 20, 15, 10 и 1 мкг/мл. В качестве позитивного контроля для ЦОГ-2 использовали селективный ингибитор нифлумовую кислоту (Cayman Chemicals, США) в концентрации 0,1 мкМ. В качестве отрицательного контроля энзиматической реакции циклооксигеназы и арахидоновой кислоты формируется определяли количество простагландина F2 (PGF2), который образуется после редукции хлоридом олова (SnCl2) нестабильного простагландина PGH2.

Оптической плотность измеряли при длине волны 405 нм на планшетном спектрофотометре xMark (BioRad, США). После снятия оптической плотности вычисляли % ингибирования фермента.

2.4 ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА НА ПРОДУКЦИЮ

ГИСТАМИНА В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Перед проведением исследования клетки линии RBL-1 осаждали на центрифуге при 270 g в течение 5 мин и ресуспендировали в среде MEM без сыворотки, доведя концентрацию клеток до 106 клеток/мл. Полученную суспензию вносили в 24-луночные культуральные планшеты по 900 мкл/лунка. В лунки вносили растворы (в объеме 50 мкл) субстанции ЛК и кетотифена в конечной концентрации 1, 2, 4, 16 мкг/мл и 16 мкг/мл, соответственно. В лунки контроля и интактных вносили среду MEM. Экспозиция клеток с субстанциями длилась 15 минут при 37Со и 5% СO2. Далее в культуру вносили индуктор дегрануляции - раствор Сompound 48/80 (Sigma, США) в конечной концентрации 100 мкг/мл и выдерживали в тех же условиях в течение 60 минут.

По истечении указанного срока культуральную жидкость переносили в стерильные пробирки, клетки осаждали на центрифуге в течение 7 мин при 270 g и +5°С. Все манипуляции с культуральной жидкостью проводили на льду. 50 мкл надосадка переносили в стерильные пробирки и проводили ацилирование образцов. В ацилированных образцах определяли концентрацию гистамина методом твердофазного-иммуноферментого анализа (ИФА). Ацилирование и ИФА осуществлялми с использованием набора Histamine ELISA (IBL International GMBH).

2.5 АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА НА

ФОСФОРИЛИРОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ MAP-КИНАЗ

В УСЛОВИЯХ IN VITRO

Перед опытом клетки, достигшие нужной концентрации, ресуспендировали в культуральной среде и, без дополнительного концентрирования центрифугированием, раскапывали в 12-луночные платы по 1 мл на лунку. ЛК в концентрации 10 мкг/мл вносили в культуру в объеме 50 мкл/лунка. Из препарата сравнения ловастатина (Tocris, США) готовили 20-кратный сток (80 мкг/мл) и добавляли в культуру клеток в том же объеме. С препаратами клетки инкубировали 2 часа при 37 0С и атмосфере 5 % СО2. По истечении указанного времени в культуру добавляли 20-кратный сток ЛПС (20 мкг/мл, эндотоксин из Escherichia coli серотипа 0111:B4; Fluka) в объеме 50 мкг/лунка и инкубировали час при 37 0С и атмосфере 5 % СО2.

После окончания инкубации клетки переносили в эппендорфы, помещали на лед и все дальнейшие процедуры проводили при 0 С. Клетки осаждали центрифугированием (5 мин, 500g, 4 0С), ресуспендировали в 1 мл холодного фосфатно-солевого буфера (PBS, 8 мМ Na2HPO4, 150 мМ NaCl, 1.5 мМ KH2PO4, 3 мМ KCl, pH 7.4), повторно осаждали центрифугированием (5 мин, 500g, 4 оС), добавляли по 50 мкл лизирующего буфера (50 мМ Трис-HCl (рН 7.5), 150 мМ NaCl, 1% Тритона Х-100, 1 мМ Na3VO4, 1 мМ NaF, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ PMSF, коктейль протеазных ингибиторов (Protease inhibitor coctail, Sigma) в разведении 1:300 и выдерживали на льду в течение 10 мин. Затем клеточный лизат центрифугировали (10 мин, 16000g), к супернатанту добавляли 1/4 часть буфера для электрофоретических проб (буфер Лэммли: 300 мМ Трис (рН 6.8), 10 % SDS, 25 % 2-меркаптоэтанола и 50 % глицерина) и кипятили при 1000С в течение мин. Концентрацию белка определяли по методу Бредфорда, используя овальбумин для построения калибровочной кривой (Bradford M., 1976).

Для специфического выявления белков на иммуноблоте использовали поликлональные кроличьи антитела против фосфорилированных по триптофану и тирозину (Thr202/Tyr204) ERK1/2 и (Thr180/Tyr182) p38 (Cell Signaling Technology, США). В качестве вторичных антител применяли козьи антитела, выработанные против иммуноглобулинов кролика и конъюгированные с пероксидазой хрена (GAR-HRP, Cell Signaling Technology, США).

Электрофоретическое разделение белков проводили методом дискэлектрофореза в полиакриламидном геле в присутствии SDS (SDS-PAGE) (Mauer H., 1971). Концентрирующий гель (рН 6,8) содержал 4% полиакриламида, разделяющий гель (рН 8,8) - 10 %. Полимеризацию гелей вызывали последовательным добавлением TEMED и 10% р-ра персульфата аммония.

Разделение белков проводили в блоках геля площадью 20х20х1,5 мм при силе тока 20 мА на пластину в течение 16-18 часов.

нитроцеллюлозную мембрану (BioRad) в камере для "мокрого" переноса (BioRad) в соответствии с инструкциями производителя. Электроперенос проводили при напряжении 100 В и силе тока не более 300 мА в течение 2,5 часов в буфере для "мокрого" переноса (48 мМ Трис, 39 мМ глицин, 0,037% SDS, 15% метанола). Для визуализации белковых полос использовали Ponceau S (Sigma).

Иммуноблотинг проводили в соответствии с методикой ECL (Western blotting protocols (Amersham), соблюдая указания производителя антител. Сразу после переноса мембрану промывали несколько раз буфером TTBS (20 мМ Трис-HCl (pH 7,5), 150 мМ NaCl, 0,1 % Tween-20). Затем мембрану инкубировали в 5 % растворе сухого обезжиренного молока (Valio), приготовленного на буфере TTBS в течение 1 ч при комнатной температуре. По истечении указанного срока мембрану отмывали от остатков молока буфером TTBS (3 раза по 2-3 минуты) и добавляли раствор первичных антител в 1-3 % растворе BSA в TTBS. Все инкубации с первичными антителами против фосфорилированных MAP-киназ проводили при +4 0С в течение ночи. Все остальные процедуры осуществляли при комнатной температуре.

После инкубации с первичными антителами мембрану промывали TTBS ( раза по 5 мин). Далее мембрану помещали на 1 ч в раствор вторичных антител в 5 % растворе молока в TTBS, после чего также промывали TTBS (3 раза по мин). Белки, связавшиеся с антителами, выявляли с помощью метода усиленной хемилюминесценции (ECL). Для этого нитроцеллюлозную мембрану промывали один раз водой (10-15 сек.) после чего инкубировали в растворе ECL в течение мин и закладывали мембрану между двумя слоями полиэтиленовой пленки.

Хемилюминесцентное излучение регистрировали экспонированием на рентгеновскую плёнку CEA RP NEW (CEA AB, Швеция).

Оценку полученных результатов производили путем сканирования рентгеновской пленки на сканере Samsung SCX-4220 и последующего измерения относительной плотности проявленных полос с использованием программного обеспечения Scion Image.

Полученное значение плотности полосы, характеризующей контрольную пробу, принимали за 100%, значения плотности остальных полос выражались в проценте от контроля.

2.6 ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА С TOLLПОДОБНЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В УСЛОВИЯХ IN VITRO

В качестве тест-системы для оценки взаимодействия с парами рецепторов TLR 1/2, 2/2, 2/6 были выбраны адгезионные клеточные линии HEK-Blue-hTLR (InvivoGen, США), полученные производителем трасфекцией плазмиды, кодирующей рецептор hTLR2. Клеточная линия HEK-Blue-hTLR2 также экспрессирует эндогенный высокий уровень рецепторов hTLR1 и hTLR6, которые работают в паре с hTLR2. Таким образом, клеточная линия hTLR позволяет исследовать взаимодействие с тремя парами рецепторов hTLR1/2, hTLR2/6, hTLR2/2.

В качестве тест-системы для оценки взаимодействия с hTLR4 были выбраны адгезионные клеточные линии HEK-Blue-hTLR4 и HEK-Blue-hTLR5, полученные производителем трасфекцией плазмиды, кодирующей только один отдельный рецептор.

В клеточные линии также производителем трансфецирована плазмида, несущая ген секретируемого фермента эмбриональной щелочной фосфатазы (SEAP, embryonic alkaline phosphatase). Стимуляция соответствующего рецептора агонистом приводит к активации транскрипционных факторов NF-kB и AP1 и последующей выработке фермента SEAP. Уровень стимуляции рецепторов детектируется по ферментативной цветной реакции после добавления реагента QUANTI-Blue (InvivoGen, США), содержащего субстрат для фермента SEAP.

Измеряли оптическую плотность на длине волны 630 нм (пурпурно-синяя окраска) с помощью планшетного спектрофотометра xMark (BioRad, США).

Адгезионные клетки HEK-Blue-hTLRs растили в среде DMEM c добавлением L-глутамина, 10% фетальной телячьей сыворотки (HyClone, Англия), антибиотика предотвращающего заражение микоплазмой Normocin (100 мкг/мл, InvivoGen).

Для клеточной линии hTLR5, начиная со второго пассажа использовали селектирующие антибиотики Zeocin (100 мкг/мл) и Blasticidin (30 мкг/мл) (InvivoGen). Для культивирования клеточных линий hTLR4 и 5, начиная со второго пассажа использовали коммерческий набор селективных антибиотиков HEK-Blue-Selection (200X, InvivoGen).

Культивирование клеток проводили в CO2-инкубаторе (Shellab, США) при 37°С в атмосфере 5% CO2. Клетки растили во флаконах площадью 25 см2 с вентилируемыми крышками (Nunc, Дания), добавляя по 5 мл культуральной среды на флакон. Клетки, достигшие монослойного состояния, пересевали каждые 2-3 дня. Для этого убирали кондиционную среду, клетки снимали со дна флакона тщательным пипетированием в 5 мл свежей ростовой среде. К полученной суспензии добавляли 1 мл культуральной среды и снова тщательно пипетировали. Определяли концентрацию клеток в суспензии и пересевали в новый флакон в концентрации 300-400 тыс. клеток/см2.

Перед проведением эксперимента старая культуральная среда сливалась и добавлялось 5 мл новой среды Test Medium (TM), содержащей 10% FBS и мкг/мл антибиотика Normocine (100 мкг/мл) и без добавления селектирующих антибиотиков. Подсчитывали количество клеток в камере горяева и доводили концентрацию до 156 250 кл/мл TM (25000 клеток на лунку).

Стимуляцию рецепторов проводили специфическими агонистами производства Invivogen в следующих рабочих концентрациях:

1) TLR1/2 – Pamp3CSK (InvivoGen, США), 1 нг/мл 2) TLR2/2 – HKLM (InvivoGen, США), 108 клеток/мл 3) TLR2/6 – FSL1 (InvivoGen, США), 1 нг/мл 4) TLR5 – Flagellin (InvivoGen, США), 1 нг/мл 5) TLR4 - LPS (InvivoGen, США), 10 нг/мл Для нейтрализации рецепторов и определения специфичности стимуляции использовали соответствующие поликлональные антитела:

1) TLR1 Anti-hTLR1-IgG (InvivoGen, США) в концентрации 1 мкг/мл;

2) TLR2 Anti-hTLR2-lgA (InvivoGen, США) в концентрации 1 мкг/мл;

3) TLR6 Anti-hTLR6-lgG (InvivoGen, США) в концентрации 1 мкг/мл;

4) TLR4 Anti-hTLR4-IgA (InvivoGen, США) в концентрации 1 мкг/мл;

5) TLR5 Anti-hTLR5-lgA (InvivoGen, США) в концентрации 1 мкг/мл.

2.7 МЕТОД ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ЛИПИДНОГО КОМПЛЕКСА С H1ГИСТАМИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ

Использовали взрослых самцов беспородных морских свинок массой 250-350 г (питомник лабораторных животных РАМН «Рапполово», Лен. область).

Экспериментальных животных наркотизировали ветеринарным препаратом «Золетил 100», извлекали подвздошную кишку и помещали в емкость с охлажденным до +4°С раствором Кребса-Хенселейта (КХС). Фрагменты кишки длинной около 1 см закрепляли металлическими крючками в проточных камерах установки для изолированных тканей и начинали перфузировать оксигенированным раствором КХС при температуре +30С. Для получения стандартного натяжения во всех фрагментах создавали преднагрузку в 1 грамм.

После 60 минутной адаптации к условиям перфузии поток перфузата останавливали, и проточные камеры заполняли 80 mM KCl, который вызывал сильное сокращение сегментов кишки. Это позволяло оценить жизнеспособность фрагментов и их способность к сокращению. Полученные результаты в дальнейшем принимались за 100% сокращения. Затем снова возобновляли перфузию для отмывки тканей и восстановления их способности к сокращению.

По прошествии 60 минут отмывки начинали перфузию исследуемым веществом.

Через 30 минут растворы сливали, а проточные камеры заполняли водным раствором гистамина (10 -6М). В течение 10 минут осуществляли регистрацию силы сокращения.

Во время всего опыта регистрировали кривую изометрической силы сокращения, учитывали амплитуду сокращения и время наступления максимального сокращения, используя программное обеспечение «PhysExp»

(ООО «Кардиопротект», Россия)

2.8 ИЗУЧЕНИЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ СВОЙСТВ ЛИПИДНОГО

КОМПЛЕКСА НА МОДЕЛИ КОНТАКТНОГО ДЕРМАТИТА У МЫШЕЙ

Исследуемое лекарственное средство, препарат сравнения и плацебо вводили по лечебной схеме, начиная с 8 по 20 день эксперимента внутримышечно один раз в сутки.

На 21 сутки эксперимента животных эвтаназировали в CO2 - камере.

“Опытное” и “контрольное” ухо забирали для гистологической оценки поражения и степени отека.

2.8.2 Тестируемые вещества и выбор доз ЛК в форме 0,1% раствора для инъекций вводили внутримышечно в дозах 2, и 8 мг/кг. В качестве препарата сравнения был выбран противогистаминный препарат из группы блокаторов H1-рецепторов Супрастин (20 мг/мл хлоропирамина гидрохлорид, EGIS PHARMACEUTICALS, Венгрия). Супрастин вводили внутримышечно в дозе 22 мг/кг, эквивалентной терапевтической для человека.

С интактной группой животных манипуляций не проводилось. У животных контрольной группы была вызвана патология, лечения и введения веществ не проводилось. Группе плацебо вводили растворитель исследуемого препарата (физиологической раствор, 0,9% NaCl).

2.8.3 Оценка степени отека пораженного уха Для оценки степени отека после эвтаназии определялась масса «опытного» и «контрольного» уха. Вычислялся индекс реакции (ИР), который для каждого «опытного» и «контрольного» уха, соответственно.