«СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСНОВЫ НАРУШЕНИЙ ПОВЕДЕНИЯ НА МОДЕЛИ ПОСТТРАВМАТИЧЕСКОГО СТРЕССОВОГО РАССТРОЙСТВА У КРЫС ...»

PCNA — консервативный белок массой 36 кДа (Bravo R. et al., 1981), имеющийся у всех животных и растений. Он является вспомогательным белком для ДНК-полимераз и, которые участвуют в репликативном синтезе отстающей цепи ДНК, синтезе фрагментов Оказаки, а также в эксцизионном репаративном ресинтезе ДНК (Levin D. S. et al., 1997; Yuzhakov A. et al., 1999;

Maga G. et al., 2001). PCNA обнаруживается в ядрах клеток в S-фазе цикла (Takasaki Y. et al., 1981; Bravo R., Macdonald-Bravo H., 1985, 1987). В интерфазных клетках, подвергшихся воздействию ультрафиолетового излучения, PCNA появляется при репаративном синтезе ДНК (Celis J. E., Madsen P., 1986;

Toschi L., Bravo R., 1988). PCNA является основным компонентом репликативного комплекса, он помогает ДНК-полимеразе удерживаться на цепи ДНК:

три молекулы PCNA образуют кольцевой тример с отверстием для двунитевой ДНК в центральной части, который представляет собой перемещающуюся по ДНК подвижную платформу, или «скользящую скрепку» (sliding clamp), удерживающую ДНК-полимеразу в ходе полимеризации на матрице и обеспечивающую высокопроцессивный синтез ДНК (в 10–100 раз выше, чем в отсутствие PCNA) (Cox L. S., 1997; Schurtenberger P. et al., 1998). PCNA образует связи и с другими белками: RF-C, FEN-1, Gadd45, p21, циклинами группы D (Matsuoka S. et al., 1994; Waga S. et al., 1994; Smith M. L. et al., 1994;

Hall P. A. et al., 1995; Li X. et al., 1995; Kelman Z., 1997; Gary R. et al., 1997).

Относительным недостатком PCNA является его медленный катаболизм после завершения S-фазы цикла (Bravo R., Macdonald-Bravo H., 1987). Однако эта особенность может быть использована для более полного выявления пролиферирующих клеток в медленно обновляющихся тканях, в частности, — в нервной ткани. Наиболее часто для выявления антигена PCNA используются антитела клона РС10. Проведение иммуноцитохимической реакции на PCNA, как правило, не требует протеолитической или тепловой демаскировки антигена, что позволяет получать препараты высокого качества (Омельченко Н. В. и др., 1998;

Коржевский Д. Э. 1999, 2000). Таким образом, именно от PCNA можно ожидать наиболее интересных результатов при изучении пролиферативной активности клеток головного мозга у животных на модели ПТСР.

При изучении дифференцировки нейральных стволовых прогениторных клеток и других стволовых клеток в течение последнего десятилетия в качестве универсального нейронспецифичного маркера широко используется ядерный белок нервных клеток NeuN (neuronal nuclei) (Tanvig M. et al., 2009).

NeuN является растворимым белком и имеет молекулярную массу 46–48 кДа.

Он обладает способностью связываться с ДНК in vitro (Mullen R. J. et al., 1992).

Нуклеотидная последовательность, кодирующая этот белок, была неизвестна до недавнего времени. В 2009 г. было показано, что белок NeuN является продуктом гена Fox-3, относящегося к семейству генов Fox-1, выполняющих функцию регуляторов сплайсинга (Kim K. K. et al., 2009). Однако сведения, имеющиеся о белке NeuN, не позволяют вполне судить о его функциях в нервной клетке.

Белок NeuN локализуется в ядрах и перинуклеарной цитоплазме большинства нейронов ЦНС млекопитающих. Этот маркёр позволяет выявлять нейроны, но не обнаруживается в глиальных клетках. В других тканях, помимо нервной, его наличия установлено не было. Положительная иммуноцитохимическая реакция на NeuN в ядре нервной клетки свидетельствует о её функциональной целостности (Коржевский Д. Э. и др., 2006b).

Синтез белка NeuN начинается в постмитотических нейробластах на достаточно поздних стадиях дифференцировки (Коржевский Д. Э. и др., 2008). Следует отметить, что этот белок обнаруживается не во всех нейронах. Известен ряд типов нервных клеток в ЦНС и периферической нервной системе, где NeuN не выявляется. Так, к нейронам, в норме не синтезирующим этот белок, относят клетки Кахаля – Ретциуса в неокортексе, ряд клеток мозжечка (Mullen R. J. et al., 1992; Weyer A., Schilling K., 2003), нейроны нижних олив, митральные клетки обонятельных луковиц (Mullen R. J. et al., 1992), клетки внутреннего ядерного слоя сетчатки (Mullen R. J. et al., 1992; Wolf H. K. et al., 1996), -мотонейроны в спинном мозге (Friese A. et al., 2009; Shneider N. A. et al., 2009) и клетки ганглиев симпатического ствола (Wolf H. K. et al., 1996). Имеются противоречивые данные об особенностях экспрессии NeuN в клетках чёрного вещества (Kumar S. S., Buckmaster P. S., 2007; Cannon J. R., Greenamyre J. T., 2009).

В ряде исследований сообщается о различных патологических состояниях, при которых можно наблюдать ослабление или исчезновение иммуноцитохимической реакции на NeuN в нервных клетках. Среди таких случаев отмечают ишемическое повреждение нейронов стриатума (Кирик О. В. и др., 2009) и болезнь Хантингтона, при которой наблюдают прекращение синтеза NeuN нейронами отдельных участков стриатума (Tippett L. J. et al., 2007). Кроме того, исчезновение реакции на NeuN наблюдается при эксайтотоксическом повреждении нервных клеток, когда имеет место селективное поражение пирамидных нейронов поля CA1 гиппокампа при чрезмерной стимуляции NMDA(N-methyl-D-aspartate;

N-метил-D-аспартат)-рецепторов (Butler T. R. et al., 2010).

С использованием маркёра NeuN в нейрогистологических исследованиях появилась возможность проведения оценки функциональной целостности отдельных структур мозга и определения характера их повреждения при различных патологических процессах, в частности, — при воздействии витального стресса.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Формирование экспериментальных групп, Эксперименты выполнены на 126 лабораторных крысах линии Wistar массой 200–250 г, возрастом 4–5 мес. Животные содержались в стандартных условиях вивария (12-часовой световой день, свободный доступ к пище и воде, температура воздуха 20 ± 2 °C). Контрольные группы состояли из животных тех же партий, содержавшихся в аналогичных условиях. Проведение исследований согласовано с Локальным этическим комитетом ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН;

исследования соответствуют основным требованиям биомедицинской этики (European convention for the protection of vertebrate animals…, 1986).

Использовали модель ПТСР у крыс, в которой психотравмирующим фактором является переживание ситуации угрозы жизни (Цикунов С. Г. и др., 2000, 2005a, 2006; Tsikunov S. G. et al., 2003). При моделировании острого витального стресса крысы становились свидетелями гибели сородича от действий хищника — удава (тигровый питон; Python molurus). Экспериментальную группу крыс помещали в террариум к удаву, предварительно отделив его прозрачной перегородкой.

Дожидались угасания у крыс ориентировочной реакции и убирали перегородку, позволяя удаву атаковать и заглотить одну или двух особей. Через 20–25 мин переживания ситуации угрозы жизни в замкнутом пространстве крыс изымали из террариума и рассаживали в те же клетки, в которых они содержались до опыта.

2.3. Методы регистрации и оценки поведения животных Регистрацию поведения животных проводили в тестах «Открытое поле», «Крестообразный приподнятый лабиринт», «Интрудер – резидент» и тесте Порсолта (принудительного плавания). В тесте ОП оценивали уровни локомоторной активности, исследовательской деятельности, тревожности. Тест КПЛ также использовали для оценки уровня тревожности животных. Тест ИР показывал уровень коммуникативности животных и позволял оценить агрессивное поведение. В тесте Порсолта регистрировали наличие и степень «депрессивности» крыс.

В применявшихся тестах регистрировали такие показатели как общее количество поведенческих актов, вероятность (частота возникновения) и длительность поведенческих паттернов или поведенческих состояний, оценивали суммарную длительность отдельных компонентов поведения, составляемых из нескольких паттернов одного типа. Также у крыс регистрировали графологическую структуру поведения, что позволяло оценить общий характер их поведенческих реакций и выявить наиболее высоковероятные переходы между различными паттернами — составляющими поведения.

Метод исследования индивидуального поведения животных Установка для проведения теста «Открытое поле» (Hall C. S., 1934) представляла собой круглую площадку диаметром 80 см, ограниченную непрозрачными бортами высотой 30 см. На площадке равномерно располагались 16 отверстий («норок») диаметром 3 см каждое. Животное помещали в центр «поля» и в течение 3 мин регистрировали путём нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, длительность и последовательность всех демонстрируемых животным поведенческих актов.

Идентификацию отдельных поведенческих единиц (актов, состояний), выделяемых для регистрации этограмм в тесте ОП, проводили на основе классификации индивидуального поведения, предложенной В. П. Пошиваловым (Пошивалов В. П., 1986), с поправками В. В. Шабаева и Е. С. Петрова (Петров Е. С., 1988). Согласно этой классификации, в индивидуальном поведении различают:

а) акты, ориентированные к окружающим предметам, — локомоция с принюхиванием, подъёмы на задние лапы (свободные и пристеночные), заглядывание в отверстия;

б) поведение, ориентированное к собственному телу, — аутогруминг;

в) индивидуальное поведение, не ориентированное к физическому окружению, — статичные формы поведения, когда животное сидит, лежит, либо динамичные — в виде целенаправленных прыжков или неориентированных пробежек.

В проводимых нами исследованиях данная классификация была принята в качестве основной.

Целостное поведение в тесте ОП включало в себя следующие дискретные акты: локомоция, обнюхивание, движение на месте, вертикальная стойка, стойка с упором на стенку, груминг, заглядывание в «норку», фризинг, покой.

Показатели, характеризующие поведение животных в тесте ОП, рассчитывали с помощью компьютерной программы, специально разработанной сотрудниками Физиологического отдела им. И. П. Павлова. При оценке поведения в тесте ОП учитывалось, что горизонтальный и вертикальный компоненты двигательной активности находятся в определённой зависимости от эмоциональности животных и отражают уровень их ориентировочно-исследовательской деятельности (Миронов А. А., Чкалов А. В., 2005).

в тесте «Крестообразный приподнятый лабиринт»

Для оценки уровня тревожности крыс исследовали их поведение в тесте «Крестообразный приподнятый лабиринт» (Pellow S. еt al., 1985).

Лабиринт состоял из двух открытых «рукавов» 50 10 см и двух закрытых непрозрачными стенками «рукавов» 50 10 см с открытым верхом, пересекающихся крестообразно. Высота лабиринта над полом составляла 1 м. В начале теста животное помещали в центр лабиринта, после чего, путём нажатия соответствующих клавиш этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания животного в закрытых и на открытых «рукавах», а также число и время актов свешивания с открытых «рукавов» и выглядывания из закрытых.

Продолжительность тестирования составляла 5 мин.

Метод исследования зоосоциального поведения животных Для анализа особенностей внутривидового поведения животных использовали тест «Интрудер – резидент» (Пошивалов В. П., 1986). Крысу-резидента помещали в обычную жилую клетку размерами 20 25 17 см с опилками на дне, где животное находилось в течение 1 ч. После этого в клетку подсаживали взрослую крысу-интрудера того же пола, но заведомо меньшего размера.

В течение 5 мин регистрировали полную этограмму поведения крысы-резидента.

Регистрация производилась экспериментатором путём последовательной записи каждого поведенческого акта или позы животного.

Внутривидовая коммуникация включала в себя следование за партнёром, обнюхивание партнёра, обнюхивание его генитальной области, груминг тела партнёра, наползание или подползание под него. Агрессия включала в себя угрозу в виде вертикальных или боковых стоек, атаку, укус, полную агрессивную позу.

Защита включала в себя избегание партнёра (убегание), защитную стойку (при угрозе или атаке), позу подчинения «на спине». Индивидуальное, то есть не связанное с партнёром, поведение включало в себя локомоцию, обнюхивание, движение на месте, аутогруминг, вертикальные стойки, фризинг, покой. Классификация приведена согласно этологическим атласам поведения лабораторных грызунов (Grant E. C., Mackintosh J. H., 1963; Пошивалов В. П., 1986). Уровни агрессивности, коммуникативности и защитного поведения оценивали по вероятности появления элементов, образующих эти формы внутривидового поведения, во время проведения теста. На основании матрицы одношаговых переходных вероятностей определяли графологическую структуру агрессивного поведения.

Метод исследования поведения животных в тесте Порсолта Оценку поведения животных в тесте Порсолта (принудительного плавания) осуществляли на основе классического метода Р. Д. Порсолта для мышей (Porsolt R. D. et al., 1977) с незначительными модификациями, учитывающими большие размеры животных, использованных в настоящем исследовании.

Каждое животное отдельно помещали на 10 мин в стеклянный цилиндрический сосуд высотой 50 см и диаметром 30 см, заполненный тёплой водой (28–29 °С) до отметки на высоте 35 см. На протяжении опыта путём нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, регистрировали актограмму, визуально контролируя движения крысы. Это позволяло оценивать в реальном времени изменение различных слагаемых плавания. Учитывали продолжительность активного (энергичные движения всеми лапами) и пассивного (слабые гребки задними лапами) типов плавания, а также длительность состояния неподвижности (иммобильности) животного. В соответствии со значениями, регистрируемыми, главным образом, по показателю иммобильности животных, оценивали наличие и степень депрессивноподобных отклонений в поведении (состояния «поведенческого отчаяния»).

Оценка результатов и статистическая обработка данных, полученных при тестировании поведения животных Обработку данных, полученных при тестировании поведения животных, и Microsoft Excel 2010 (Microsoft, США). Статистический анализ проводили с использованием параметрического t-критерия Стьюдента для нормальных распределений и непараметрического U-теста Манна – Уитни для ненормальных распределений выборок в группах.

2.4. Гистологическое исследование головного мозга После завершения поведенческой части исследования животных декапитировали. Затем извлекали и фиксировали их головной мозг. Фиксацию мозга проводили на раннем (через 9 дней) и на позднем (через 25 дней) сроках после воздействия витального стресса.

Готовили серийные парафиновые срезы головного мозга. Окрашивали их по методу Ниссля (с применением красителя толуидинового синего), а также иммуноцитохимическим методом — проводили выявление на срезах маркёров NeuN и PCNA.

Маркёр NeuN использовался в настоящем исследовании для оценки функциональной целостности структур мозга и выявления возможных повреждений нервной ткани, поскольку он позволяет с высокой точностью определять характер структурных и цитохимических нарушений в ЦНС на различных экспериментальных моделях патологии (Коржевский Д. Э. и др., 2006b).

Маркёр PCNA использовался в настоящем исследовании для оценки пролиферативной активности в головном мозге, так как он достаточно информативен и прост в применении, не требует проведения дополнительных процедур, облегчающих выявление антигена, а также соблюдения специальных мер радиационной безопасности (Коржевский Д. Э. и др., 2012).

Окрашивание гистологического материала с использованием указанных маркёров происходит в короткие сроки, а получаемые препараты обладают высоким качеством.

Помимо основной иммуноцитохимической обработки срезов были поставлены общепринятые контрольные реакции (рис. 2.1, 2.2). Позитивным контролем для реакции на NeuN считали срезы мозга взрослых интактных животных.

В качестве дополнительного позитивного контроля для реакции на PCNA были использованы срезы головного мозга крысы первого дня постнатального развития (высокая активность пролиферативных процессов). Для постановки реакции негативного контроля вместо первичных антител на срезы наносили только раствор для разведения антител (Dako, Дания).

Для определения анатомических областей мозга крысы пользовались специальным стереотаксическим атласом (Paxinos G., Watson C., 2007).

Взятие, фиксация и обезвоживание материала Головной мозг извлекали из черепной коробки сразу после умерщвления животного и фиксировали погружением в цинк-этанол-формальдегид. Материал находился в фиксаторе в течение 1 сут. Для отмывки от формальдегида и продолжения процесса дегидратации материал помещали в две последовательные порции 96%-го этанола на 1 сут в каждую. Для завершения дегидратации материал помещали на 1 сут в абсолютный этанол.

Фиксатор готовили из 96%-го этанола, 35–40%-го формальдегида (Electrolux, Швеция) и цинка хлористого «Ч» (Вектон, Россия) в соотношении 100 мл : 10 мл : 1 г (Коржевский Д. Э. и др., 2006a).

Вытеснение этанола из тканей осуществляли погружением материала в смесь петролейного эфира лёгкой фракции (Tкип. = 40–70 °C) (Вектон, Россия) и абсолютного этанола в соотношении 1 : 1 на 30 мин и последующим погружением в три порции чистого петролейного эфира на 30 мин в каждую.

После нахождения в первой порции чистого петролейного эфира для облегчения иммерсии мозг поперечно разрезали по линии, соответствующей зрительному перекрёсту. Для перевода в парафиновую среду материал оставляли на ночь в смеси парафина и петролейного эфира в соотношении 1 : 1 в термостате при температуре 37 °C. Затем проводили материал через две последовательные порции чистого парафина в термостате при температуре 58 °C по 1 ч в каждой.

После пропитывания парафином материал заливали в форму с использованием заливочной среды Histomix Extra (БиоВитрум, Россия) и помещали для ускорения застывания в холодильник при температуре +4 °C.

Рис. 2.1. Гиппокамп, зубчатая фасция. Контрольные реакции на NeuN.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN (А), докраска астровым синим (А, Б), 100.

А — позитивный контроль, интактное животное (в коричневый цвет окрашены ядра нейронов); Б — негативный контроль, нанесение раствора для разведения антител вместо первичных антител (ядра нейронов не окрашены).

Стрелками указаны места неспецифического связывания вторичных антител (периваскулярные области).

Рис. 2.2. Кора больших полушарий. Контрольные реакции на NeuN.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN (А), докраска астровым синим (А, Б), 100.

А — позитивный контроль, интактное животное (в коричневый цвет окрашены ядра нейронов); Б — негативный контроль, нанесение раствора для разведения антител вместо первичных антител (ядра нейронов не окрашены).

На ротационном микротоме Spencer 820 (American Optical Corporation, США) из парафиновых блоков приготовляли серийные срезы толщиной 7 мкм, ориентированные фронтально, на участке мозга от 2 до 4,5 мм кзади от брегмы.

Наклеивали их на предметные стёкла (Menzel-Glser, Германия) с использованием дистиллированной воды и покрытия для предметных стёкол на основе бычьего сывороточного альбумина (патент № 2386137 RU) (Коржевский Д. Э., Кирик О. В., 2010). Высушивали препараты на предметном столике с подогревом.

Папки с препаратами оставляли на ночь в термостате при температуре 37 °C.

Перед окраской срезы подвергали депарафинизации и регидратации в стандартной гистологической батарее спиртов нисходящей крепости: о-ксилол «Ч»

(Вектон, Россия) 96%-й этанол 80%-й этанол. Завершали регидратацию срезов в дистиллированной воде.

Для окраски препаратов по Нисслю использовали краситель толуидиновый синий (Toluidine Blue O zinc chloride double salt; Acros Organics, Бельгия) и дифференцировочный раствор, который готовили из 100 мл 96%-го этанола и 1 кап. ледяной уксусной кислоты «ЧДА» (Вектон, Россия).

Иммуноцитохимические реакции с использованием антител к NeuN (моноклональные мышиные, клон A60) (Chemicon /Millipore/, США) и PCNA (моноклональные мышиные, клон PC10) (Dako, Дания) проводили следующим образом.

После регидратации препараты помещали в 3%-й раствор перекиси водорода на 5–10 мин для блокировки эндогенной пероксидазы. Затем препараты помещали на 5 мин в фосфатно-солевой буфер (0,01 М; pH 7,4) (БиолоТ, Россия). Далее срезы инкубировали с первичными антителами во влажной камере в термостате при температуре 40 °C в течение 40 мин. После инкубации с первичными антителами препараты промывали в течение 5 мин в фосфатно-солевом буфере.

Затем проводили инкубацию с вторичными антителами системы EnVision+ (мышиные, HRP) (Dako, Дания) во влажной камере в термостате при температуре 27 °C в течение 35 мин. От вторичных антител препараты также отмывали в фосфатно-солевом буфере в течение 5 мин. Далее наносили раствор хромогена DAB+ (Dako, Дания) и проводили выявление антител под контролем микроскопа.

По достижении оптимальной интенсивности окрашивания реакцию останавливали, смывая хромоген 3%-м раствором перекиси водорода. Часть срезов докрашивали астровым синим (Astrablau; Merck, Германия).

Дегидратация и заключение срезов под покровное стекло После окраски срезы подвергали дегидратации в стандартной гистологической батарее спиртов восходящей крепости: 96%-й этанол абсолютированный изопропанол (Вектон, Россия). Затем просветляли срезы в о-ксилоле и заключали их под покровное стекло с использованием среды для заключения препаратов Bio Mount (Bio-Optica, Италия).

Получение фотографий гистологических препаратов Для получения цифровых изображений срезов головного мозга использовали световой микроскоп Leica DM750, цифровую фотокамеру Leica ICC (3 Мпикс) и компьютерную программу Leica LAS EZ 2.0 (производитель указанного аппаратного и программного обеспечения — Leica Microsystems, Германия).

Снимки препаратов делали при увеличениях объектива 4, 10, 20, 40.

Для получения панорамных фотографий отдельных структур или полных фронтальных срезов мозга производили реконструкцию единых изображений из нескольких снимков, сделанных при большом увеличении, в компьютерной программе GIMP 2.6 (The GIMP Development Team).

Обработку и оценку полученных цифровых изображений производили с помощью компьютерных программ GIMP 2.6 (The GIMP Development Team) и ImageJ 1.44 (NIH, США).

Наличие и степень структурных нарушений в мозге крыс, переживших воздействие острого витального стресса, характеризовали как описательно, так и с использованием балльной системы.

На препаратах, окрашенных по Нисслю, проводили оценку морфологических характеристик и состояния хроматофильной субстанции нейронов гиппокампа, супраоптического ядра (СОЯ) гипоталамуса и КБП. На фотографиях препаратов, полученных с использованием этого метода окрашивания, оценивали количество гиперхромных и сморщенных клеток в гиппокампе. Количество повреждённых клеток в поле CA3 гиппокампа (как области наиболее выраженных нарушений) подсчитывали на участке 500 мкм латерального изгиба структуры и оценивали полуколичественным способом (Эллиниди В. Н. и др., 2002).

Для этого наносили на изображение гиппокампа масштабный отрезок, равный по количеству пикселей участку соответствующей длины. На выделенном участке точечно отмечали гиперхромные и сморщенные нейроны, затем подсчитывали их количество. Степень повреждения гиппокампа, при которой среднее количество гиперхромных и сморщенных нейронов в пересчёте на 100 мкм поля CA составляло до 15 клеток, характеризовали как слабую и выставляли значение «+».

При нахождении на данном промежутке от 16 до 25 таких клеток характеризовали степень повреждения как умеренную и присваивали значение «++». При регистрации на указанном промежутке гиппокампа от 26 повреждённых клеток и более характеризовали степень повреждения как выраженную и выставляли значение «+++». При ненахождении в гиппокампе гиперхромных и сморщенных нейронов констатировали отсутствие повреждения и выставляли значение «».

Параллельно оценивали степень и характер повреждения структур головного мозга на препаратах, обработанных с использованием антител к NeuN.

Производили учёт степени повреждения нейронов по утрате ими специфической реакции на белок NeuN. При описании выявленных участков ослабления/исчезновения реакции на NeuN на препаратах учитывали микроанатомическую область, в которой локализовались данные нарушения, а также характер нарушений и экспериментальную группу животных.

На изображениях препаратов, обработанных с использованием антител к PCNA, оценивали интенсивность пролиферации в СВЗ и гиппокампе. Подсчитывали количество PCNA+-клеток на всю длину латеральной стенки бокового желудочка, отмечая их точечно. Интенсивность пролиферации в СВЗ при регистрации в этой области в среднем от 26 и более пролиферирующих клеток характеризовали как нормальную и выставляли значение «+++». При регистрации в СВЗ от 16 до 25 таких клеток характеризовали уровень пролиферации как умеренно сниженный и выставляли значение «++». В случае нахождения в указанной области до 15 клеток, иммунопозитивных по маркёру PCNA, характеризовали пролиферативную активность как ослабленную и присваивали значение «+». Случаев полного подавления пролиферации в СВЗ не отмечали.

В гиппокампальной области ввиду малого числа пролиферирующих клеток оценку пролиферативной активности проводили описательно: характеризовали подавление нейрогенеза при ненахождении в гиппокампе PCNA+-клеток, а также, при его сохранении, указывали характер расположения пролиферирующих клеток в субгранулярном слое зубчатой фасции и других отделах гиппокампа — в виде кластеров или единично.

Для всех использованных методов выявления изменений в структурах головного мозга подсчёт клеток производили на нескольких срезах для одного животного — отдельно для левого и правого полушарий.

2.5. Фармакологическая коррекция состояния животных Ежедневно с 14 до 15 ч в течение 23 сут эксперимента осуществляли внутрибрюшинное введение животным, подвергнутым острому витальному стрессу, раствора пирибедила, — агониста D2, D3 дофаминовых рецепторов, в двух дозировках: 0,72 мг/кг и 2,14 мг/кг. Расчёт дозировок производили в соответствии с известной терапевтической дозой этого препарата для человека. Активным контролем к животным, получавшим после травмы пирибедил, являлись крысы, также пережившие острую психогенную травму, но получавшие в аналогичных объёмах и условиях физиологический раствор (ФР). Пассивным контролем ко всем группам крыс, которым производились инъекции, служили интактные крысы. На основании поведенческих методов, описанных в разделе 2.3, проводили анализ поведения животных.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В соответствии с гипотезой о том, что экстремальное психогенное воздействие (переживание психотравмирующей ситуации) может приводить к развитию стойких нарушений в поведении, а также формированию функциональных и структурных изменений в мозге, вовлечённых в развитие и долговременное поддержание постстрессовых поведенческих отклонений, проведены эксперименты, в которых животные подвергались воздействию однократного острого витального стресса. Крысы переживали ситуацию угрозы собственной жизни, становясь свидетелями гибели сородича от действий питона.

При моделировании психогенной травмы, во время переживания ситуации гибели сородича от действий хищника у всех крыс регистрировали изменённое поведение. Большая часть животных демонстрировала такие паттерны как замирание, фризинг, «поза страха» с дугообразно выгнутым хвостом, прерывистый груминг с нарушенной последовательностью действий, группирование «в кучу», подползание под партнёра. Отдельные крысы, напротив, проявляли двигательное возбуждение, бесконтрольно перемещались по террариуму, подбегали к питону, обнюхивали его, пытались его кусать. Такое поведение перемежалось фризингом и изменённым грумингом. У крыс регистрировали интенсивные уринацию и дефекацию, что является значимым показателем развития у животных реакций страха.

В ходе моделирования психогенной травмы крысам предоставлялась возможность избежать нахождения в травматической ситуации и покинуть террариум.

Однако подавляющее большинство животных не справлялось с решением этой задачи: крысы оставались сгруппированными в углу террариума при открытой его створке и приставленной к нему жилой клетке с опилками. Данное наблюдение может свидетельствовать о формировании у крыс уже во время моделирования психогенного стресса когнитивных нарушений, обусловленных развитием состояния, описываемым у человека как ужас.

Исследовали структуру эмоционального поведения животных во время моделирования психотравматической ситуации и на различных сроках после воздействия. Использовали батарею поведенческих тестов для оценки изменений в поведении животных. Проводили фармакологическую коррекцию состояния животных, применяя метод нейрофармакологического анализа поведения.

После завершения исследования животных в поведенческих тестах проводили гистологическое исследование головного мозга для выявления в нём возможных морфофункциональных нарушений и оценки эффекта фармакологической коррекции на их развитие. Фиксацию мозга животных проводили на раннем (через 9 дней) и позднем (через 25 дней) сроках после перенесения ими стрессового воздействия.

3.1. Отклонения в поведении и морфофункциональные нарушения в мозге крыс на раннем сроке (9 дней) после воздействия витального стресса 3.1.1. Изменение поведения крыс на раннем сроке На раннем сроке (3–8 дней) после воздействия острого витального стресса исследовали поведение крыс в тестах «Открытое поле», «Крестообразный приподнятый лабиринт», «Интрудер – резидент» и тесте Порсолта (принудительного плавания). Оценивали уровни общей активности животных, двигательной активности, исследовательской деятельности, тревожности, коммуникативности, агрессивности и «депрессивности». Наблюдение за животными на этом сроке показало наличие у экспериментальных крыс, в сравнении с контрольными, ряда поведенческих отклонений.

В тесте ОП (рис. 3.1, А, Б) на фоне снижения общего числа актов вероятность и длительность актов локомоции остались почти не изменёнными, тогда как представленность в поведении паттернов вертикальной активности уменьшилась, особенно, притом достоверно, по показателю вероятности (р < 0,05). Длительности актов движения на месте и груминга снизились, а вероятности их появления повысились, при этом вероятность актов груминга повысилась достоверно (р < 0,05). В тесте животные демонстрировали частые незавершённые и/или непоследовательные реакции, направленные на собственное тело и обследование территории вокруг себя. Уровень обследования «норок» снизился по обоим показателям, однако более выраженно, и достоверно, — по длительности (р < 0,01). Обследование «норок» носило поверхностный характер. Отмечали достоверное увеличение числа (вероятности) (р < 0,05) и, в большей степени, длительности (р < 0,01) актов фризинга.

Оценка поведения крыс в тесте «Открытое поле» на 3 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) Локомоция Вертикальная P Груминг Обследование P Фризинг Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: P — вероятность актов; t — длительность актов; n — суммарное количество поведенческих актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего;

nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Демонстрация животными незавершённых и/или непоследовательных поведенческих реакций наряду с тенденцией к изменению значений по показателям паттерна движения на месте и достоверным изменением вероятности паттернов груминга в тесте ОП свидетельствует о выраженном снижении комфортности в поведении животных. Достоверное увеличение представленности в поведении паттернов фризинга указывает на значимое повышение уровня тревожности данных животных. В соответствии со значениями, зарегистрированными по длительности обследования «норок», уровень исследовательской деятельности животных был существенно снижен.

В тесте КПЛ (рис. 3.1, В) экспериментальные животные проводили достоверно меньшее количество времени на открытом «рукаве» лабиринта (р < 0,01).

Время нахождения крыс в закрытом «рукаве» достоверно увеличилось (р < 0,01).

Также достоверно возросла длительность нахождения на центральной площадке лабиринта (р < 0,05).

Оценка поведения крыс в тесте «Крестообразный приподнятый лабиринт»

на 4 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: ОР — открытый «рукав»; Ц — центральная площадка;

ЗР — закрытый «рукав»; t — длительность актов; M — среднее значение;

m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Рис. 3.1. Показатели модификации поведения крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса по тестам «Открытое поле» (А, Б) и «Крестообразный приподнятый лабиринт» (В).

По оси абсцисс (А, Б): 1 — локомоция; 2 — вертикальная активность;

3 — движение на месте; 4 — груминг; 5 — обследование «норок»; 6 — фризинг;

(В): 1 — закрытый «рукав»; 2 — открытый «рукав»; 3 — центральная площадка.

По оси ординат: (А) — вероятность актов; (Б, В) — длительность актов.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: светлые столбики — значение показателей поведения для контрольных животных; заштрихованные столбики — значение показателей поведения для экспериментальных животных; p — значимость показателей.

Достоверное повышение времени нахождения животных в закрытых «рукавах» лабиринта в тесте КПЛ также указывает на значительное возрастание уровня тревожности. Увеличение времени нахождения на центральной площадке свидетельствует о наличии у животных страха и затруднённости в выборе действий.

В тесте ИР (рис. 3.2, А) выявилась модификация структуры агрессивного поведения. Появились высоковероятные переходы локомоции в атаку и наоборот — атаки в локомоцию. Изменился характер атакующих действий:

атака стала завершаться не переходом к другим действиям, а новой атакой, т. е. появился переход атаки в атаку. Достоверно возрос уровень вероятности паттернов агрессивного поведения (p < 0,01). Уровень коммуникативного поведения у животных, подвергнутых стрессу, был ниже, чем в контроле, однако достоверного снижения этого компонента поведения не отмечали.

Оценка поведения крыс в тесте «Интрудер – резидент» на 5–7 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) Ком Защ Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: Ком — коммуникативное поведение; Агр — агрессивное поведение; Защ — защитное поведение; P — вероятность актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах;

p — значимость показателей.

Изменение структуры агрессивного поведения в тесте ИР, а именно появление высоковероятного перехода паттернов атаки в атаку, вместо смены атакующего поведения на иной вид активности, свидетельствует о появлении у животных признаков патологической агрессии. Уменьшение представленности в поведении коммуникативных паттернов также указывает на наличие тенденции к ослаблению коммуникативности у переживших стресс крыс.

В тесте Порсолта (рис. 3.2, Б) достоверно увеличилась длительность состояния иммобильности (р < 0,05). Увеличение длительности активного плавания не достигало уровня достоверности, но имело место выраженное достоверное снижение длительности пассивного плавания (р < 0,01), которое в данных условиях отражает оптимальную стратегию поведения.

Оценка поведения крыс в тесте Порсолта (принудительного плавания) на 8 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) АПл Имм Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: АПл — активное плавание; ППл — пассивное плавание;

Имм — иммобильность; t — длительность актов; M — среднее значение;

m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Достоверное повышение уровня паттернов иммобильности у животных в тесте Порсолта, трактуемое как демонстрация «поведенческого отчаяния», или «отказ от борьбы», является признаком развития у них депрессивноподобных отклонений в поведении.

Рис. 3.2. Показатели модификации поведения крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса по тестам «Интрудер – резидент» (А) и Порсолта (принудительного плавания) (Б).

По оси абсцисс (А): 1 — агрессивное поведение; 2 — коммуникативное поведение; (Б): 1 — активное плавание; 2 — пассивное плавание;

3 — иммобильность.

По оси ординат: (А) — вероятность актов; (Б) — длительность актов.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: светлые столбики — значение показателей поведения для контрольных животных; заштрихованные столбики — значение показателей поведения для экспериментальных животных; p — значимость показателей.

Рис. 3.3. Графологическая структура агрессивного поведения в тесте «Интрудер – резидент» до (А) и на раннем сроке после (Б) воздействия витального стресса.

Обозначения: Угр — угроза; Ат — атака; ГП — груминг партнёра;

ОГО — обнюхивание генитальной области; Лок — локомоция; Сид — сидит;

«0,23» — вероятность перехода атаки в саму себя.

В результате поведенческого тестирования животных на раннем сроке после воздействия острого витального стресса были выявлены такие отклонения в поведении как тенденция к снижению уровня общей активности, достоверное снижение уровней исследовательской деятельности, повышение уровней тревожности, агрессивности, в т. ч. формирование патологической агрессии, а также появление в поведении животных признаков «депрессивности».

3.1.2. Морфофункциональные нарушения в головном мозге крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса На препаратах головного мозга крыс, фиксированного на раннем сроке (через 9 дней) после воздействия витального стресса, регистрировали следующие морфофункциональные нарушения.

При окраске срезов по Нисслю обнаруживали многочисленные диффузно расположенные гиперхромные и сморщенные нейроны, наиболее часто встречавшиеся в гиппокампе и супраоптическом ядре (СОЯ) гипоталамуса. Отдельные гиперхромные и сморщенные клетки локализовались в КБП. На препаратах мозга контрольных животных таких изменений не регистрировали.

Отмечали диффузное повреждение нейронов гиппокампа (рис. 3.4, Б).

Наибольшая плотность расположения гиперхромных и сморщенных клеток была характерна для поля CA3. У многих нейронов наблюдали извитые дендритные отростки. Также в области CA2 – CA3 наблюдали разреженность слоя пирамидных клеток, создававшуюся за счёт точечных «выпадений», — отсутствия одного-двух или более нейронов.

Степень повреждения гиппокампа по использовавшейся в данном исследовании балльной системе характеризовали как выраженную. У многих животных все клетки поля CA3, исключая две-три, характеризовали как гиперхромные или сморщенные. Сморщенные клетки, в пересчёте на 100 мкм поля CA3, регистрировались в количестве 5–6.

Большая часть клеток СОЯ, как и нейроны гиппокампа, была гиперхромными или сморщенными (рис. 3.6, Б), то есть подвергшимися повреждению.

В КБП регистрировали повреждённые нейроны (рис. 3.5, Б), локализовавшиеся, как правило, в сенсомоторной и теменной ассоциативной областях. Для препаратов мозга травмированных животных было характерно наличие гиперхромных и сморщенных клеток, которые располагались единично или группами до десяти, тогда как на контрольных препаратах повреждённых клеток не наблюдали или отмечали у отдельных животных единичные гиперхромные пирамидные нейроны.

При проведении иммуноцитохимической реакции на маркёр NeuN на препаратах мозга перенёсших витальный стресс животных, в отличие от контрольных, выявляли зональное ослабление реакции на данный антиген в различных областях гиппокампа и КБП.

В гиппокампе наиболее выраженное ослабление реакции на NeuN отмечали в поле CA2 (рис. 3.7, Б). На препаратах регистрировали локальное снижение интенсивности или полное «выключение» иммуноцитохимической реакции (NeuN) в единичных клетках или их группах — при видимом наличии светлой цитоплазмы. Также регистрировали точечные «выпадения», аналогичные наблюдавшимся при окраске по Нисслю, — при отсутствии видимых контуров клеток.

Рис. 3.4. Повреждение нейронов гиппокампа крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп, поле CA3.

Окраска по Нисслю, 400.

А — интактное животное; Б — через 9 дней после витального стресса.

Стрелками указаны сморщенные клетки.

Рис. 3.5. Повреждение нейронов коры больших полушарий крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса.

Кора больших полушарий, слой пирамидных нейронов.

Окраска по Нисслю, 200.

А — интактное животное; Б — через 9 дней после витального стресса.

Стрелками указаны сморщенные клетки.

Рис. 3.6. Повреждение нейронов гипоталамуса крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса.

Гипоталамус, супраоптическое ядро.

Окраска по Нисслю, 400.

А — интактное животное; Б — через 9 дней после витального стресса.

Стрелками указаны гиперхромные и сморщенные клетки.

В КБП, наряду с диффузно-градуальным снижением интенсивности реакции на NeuN, отмечали локальное снижение или отсутствие иммуноцитохимической реакции (NeuN) в клетках, по морфологическим признакам относимых к нервным, на фоне более интенсивно окрашенных нейронов. Такие нарушения регистрировали в области ретросплениальной коры и, менее выраженно, — латеральнее, в области сенсомоторной коры.

Ослабление иммуноцитохимической реакции на NeuN во всех наблюдавшихся областях носило асимметричный характер. Большая выраженность данного повреждения была характерна для левого полушария мозга.

При проведении реакции на PCNA оценивали интенсивность пролиферации в гиппокампе и СВЗ. Отмечали ослабление, в сравнении с контролем, пролиферативной активности в СВЗ, а также, в отдельных случаях, подавление пролиферации в гиппокампе.

В гиппокампе отдельных животных наблюдали полное подавление пролиферативной активности (рис. 3.8, Б) — PCNA+(пролиферирующие)-клетки отсутствовали на всей площади гиппокампа на глубине нескольких срезов.

Интенсивность пролиферации в СВЗ также была снижена (рис. 3.9, Б) — PCNA+-клетки встречались на срезах с меньшей, чем в норме, частотой. Уровень пролиферативной активности в СВЗ оценивали как умеренно сниженный.

При регистрации пролиферирующих клеток отмечали их расположение единично, а не кластерами, как это можно наблюдать в норме.

Рис. 3.7. Ослабление/исчезновение иммуноцитохимической реакции на антитела к NeuN в гиппокампе крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп, поле CA2.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN, докраска астровым синим, 200.

А — интактное животное; Б — через 9 дней после витального стресса.

Стрелками указаны области ослабления и исчезновения реакции на белок NeuN.

Рис. 3.8. Подавление нейрогенеза в гиппокампе крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп, зубчатая фасция.

Иммуноцитохимическая реакция на PCNA, докраска астровым синим, 400.

А — интактное животное; Б — через 9 дней после витального стресса.

Стрелками указаны пролиферирующие клетки.

На изображении Б указана PCNA+-клетка, расположенная вне субгранулярного слоя зубчатой фасции.

Рис. 3.9. Снижение интенсивности нейрогенеза в стенках боковых желудочков головного мозга крыс на раннем сроке после воздействия витального стресса.

Латеральная стенка бокового желудочка мозга, субвентрикулярная зона.

Иммуноцитохимическая реакция на PCNA, докраска астровым синим, 400.

А — интактное животное; Б — через 9 дней после витального стресса.

Стрелками указаны пролиферирующие клетки.

В результате гистологического исследования головного мозга животных на раннем сроке после воздействия витального стресса были выявлены такие морфофункциональные изменения, как гиперхромия/сморщивание нейронов гиппокампа, СОЯ, КБП, ослабление реакции на NeuN в гиппокампе, КБП, снижение интенсивности (подавление) пролиферации в СВЗ и субгранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа.

Таким образом, на раннем сроке после воздействия витального стресса у крыс регистрировали проявления общего постстрессового дискомфорта и страха, снижение уровня исследовательской деятельности, возрастание уровня тревожности и появление депрессивноподобных отклонений поведения в тесте Порсолта.

Вместе с тем, психотравмирующее воздействие, которому были подвергнуты экспериментальные животные, приводило к увеличению уровня агрессивности и у ряда животных выражалось в продолжении атакующих действий при полной позе подчинения противника, что не характерно для обычного поведения крыс.

Указанный комплекс нарушений трактуется нами как состояние общей депрессии поведения с характерными для ПТСР отклонениями в сфере агрессивности, и свидетельствует о развитии у животных данного расстройства.

Отклонения, наблюдавшиеся в поведении крыс, перенёсших воздействие витального стресса, сопровождались рядом морфофункциональных нарушений в головном мозге, зарегистрированных у тех же животных. Среди таких нарушений отмечали повреждение нейронов гиппокампа, КБП и СОЯ, характеризовавшееся гиперхромией и сморщиванием. Также регистрировали ослабление иммуноцитохимической реакции на NeuN в гиппокампе и КБП. Кроме этого, на препаратах мозга травмированных животных отмечали снижение интенсивности, а в некоторых случаях подавление пролиферации/нейрогенеза.

3.2. Отклонения в поведении и морфофункциональные нарушения в мозге крыс на позднем сроке (25 дней) после воздействия витального стресса 3.2.1. Изменение поведения крыс на позднем сроке На позднем сроке (19–24 дня) после воздействия острого витального стресса исследовали поведение крыс в тех же тестах, которые использовались для регистрации поведенческих изменений на раннем сроке. Аналогичным образом оценивали уровни общей активности, двигательной активности, исследовательской деятельности, тревожности, коммуникативности, агрессивности и «депрессивности». Наблюдение за животными на этом сроке также показало наличие ряда поведенческих отклонений.

По данным теста ОП (рис. 3.10, А, Б), значение по показателю вероятности обследования «норок» у экспериментальных животных, в сравнении с контролем, было достоверно ниже (р 0,05), а также возрос уровень представленности в поведении паттернов фризинга (достоверно — по показателю длительности:

р 0,05; по вероятности этого паттерна значимых отличий не отмечали). В ходе тестирования регистрировали проявление животными менее частого, но более длительного груминга, однако достоверных различий по соответствующим показателям получено не было. Вместе с тем, крысы, как и на раннем сроке наблюдения, демонстрировали груминг с нарушенной последовательностью фаз.

Таблица 5.

Оценка поведения крыс в тесте «Открытое поле» на 19 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) Локомоция Вертикальная P активность t, с Груминг Обследование P Фризинг Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: P — вероятность актов; t — длительность актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах;

p — значимость показателей.

Сниженная вероятность паттерна обследования «норок» в поведении животных в тесте ОП на позднем сроке после витального стресса свидетельствует о стойком нарушении у переживших стресс крыс исследовательского компонента поведения. Большая представленность в поведении травмированных крыс, в сравнении с контролем, актов фризинга (по показателю длительности), а также нарушение структуры актов груминга являются признаками долговременного поддержания у этих животных высокотревожного состояния.

В тесте КПЛ (рис. 3.10, В) отмечали меньшую, по отношению к интактным крысам, длительность нахождения животных на открытом «рукаве» лабиринта, однако в связи с большой вариабельностью поведения это изменение являлось недостоверным.

Оценка поведения крыс в тесте «Крестообразный приподнятый лабиринт»

на 20 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: ОР — открытый «рукав»; Ц — центральная площадка;

ЗР — закрытый «рукав»; t — длительность актов; M — среднее значение;

m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Отклонение поведения в тесте КПЛ в сторону уменьшения длительности нахождения на открытом «рукаве» лабиринта, наряду с результатами теста ОП, указывает на сохранение у крыс, переживших психогенную травму, повышенного уровня тревожности.

Рис. 3.10. Показатели модификации поведения крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса по тестам «Открытое поле» (А, Б) и «Крестообразный приподнятый лабиринт» (В).

По оси абсцисс (А, Б): 1 — локомоция; 2 — вертикальная активность;

3 — движение на месте; 4 — груминг; 5 — обследование «норок»; 6 — фризинг;

(В): 1 — закрытый «рукав»; 2 — открытый «рукав»; 3 — центральная площадка.

По оси ординат: (А) — вероятность актов; (Б, В) — длительность актов.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: светлые столбики — значение показателей поведения для контрольных животных; заштрихованные столбики — значение показателей поведения для экспериментальных животных; p — значимость показателей.

В тесте ИР (рис. 3.11, А, Б) у экспериментальных животных регистрировали повышенную представленность в поведении паттернов агрессивного поведения (р 0,05) и сниженный уровень коммуникативных паттернов (р 0,05).

Оценка поведения крыс в тесте «Интрудер – резидент» на 21–23 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) Ком Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: Ком — коммуникативное поведение; Агр — агрессивное поведение; Защ — защитное поведение; P — вероятность актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах;

p — значимость показателей.

Высокая представленность в тесте ИР паттернов агрессивного поведения в позднем периоде после воздействия витального стресса свидетельствует о наличии у животных нарушения, аналогичного тому, которое наблюдалось на раннем сроке после витального стресса, и характеризующегося стабильным повышением общего уровня агрессивности. Признаки патологической агрессии у животных на позднем сроке после переживания психогенной травмы не регистрировались либо регистрировались в меньшей степени, не указывающей на достоверность данных изменений в поведении травмированных крыс. Снижение вероятности, в сравнении с контрольными животными, появления коммуникативных паттернов в поведении стрессированных крыс указывает на ослабление у этих животных реакций нормальной коммуникативности.

В тесте Порсолта (рис. 3.11, В) регистрировали достоверно большую длительность состояния иммобильности (р 0,05), а также более низкий по длительности уровень пассивного плавания (р 0,01).

Оценка поведения крыс в тесте Порсолта (принудительного плавания) на 24 сутки после воздействия витального стресса.

Паттерны Показатели Значения показателей по группам (M ± m) АПл Имм Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: АПл — активное плавание; ППл — пассивное плавание;

Имм — иммобильность; t — длительность актов; M — среднее значение;

m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Достоверное повышение длительности состояния иммобильности в тесте Порсолта, как и в наблюдениях, полученных на раннем сроке после витального стресса, свидетельствует о развитии у животных «поведенческого отчаяния», или «депрессивности». Кроме того, понижение представленности в поведении паттернов пассивного плавания показывает длительно сохраняющуюся после переживания стресса дезорганизацию структуры поведения.

Рис. 3.11. Показатели модификации поведения крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса по тестам «Интрудер – резидент» (А, Б) и Порсолта (принудительного плавания) (В).

По оси абсцисс (А) — агрессивное поведение; (Б) — коммуникативное поведение;

(В): 1 — активное плавание; 2 — пассивное плавание; 3 — иммобильность.

По оси ординат: (А, Б) — вероятность актов; (В) — длительность актов.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01.

Обозначения: светлые столбики — значение показателей поведения для контрольных животных; заштрихованные столбики — значение показателей поведения для экспериментальных животных; p — значимость показателей.

Рис. 3.12. Графологическая структура агрессивного поведения в тесте «Интрудер – резидент» до (А) и на позднем сроке после (Б) воздействия витального стресса.

Обозначения: Угр — угроза; Ат — атака; ГП — груминг партнёра;

ОГО — обнюхивание генитальной области; Лок — локомоция; Сид — сидит;

— подползание и наползание; «0,05» — вероятность перехода атаки в саму себя.

Оценка поведения животных на позднем сроке после витального стресса, аналогично данным, полученным на раннем сроке наблюдения, показала снижение уровня коммуникативности, повышение уровней тревожности и агрессивности, а также появление в поведении признаков «депрессивности». Регистрация указанных поведенческих отклонений на позднем сроке после травмы свидетельствует о развитии у животных устойчивого постстрессового состояния. Отличия характеристик поведенческих изменений, зарегистрированных на позднем сроке наблюдения, от данных, полученных на раннем сроке, состояли в существенно более низком уровне актов патологической агрессии.

3.2.2. Морфофункциональные нарушения в головном мозге крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса На препаратах головного мозга, фиксированного на позднем сроке (через дней) после воздействия витального стресса, регистрировали следующие морфофункциональные изменения.

При окраске по Нисслю в гиппокампе травмированных животных, как и на раннем сроке после стресса, регистрировали большое количество повреждённых клеток (рис. 3.13, Б). Наблюдали значительное распространение в гиппокампе сморщенных нейронов с извитыми отростками. Наибольшее скопление гиперхромных и сморщенных клеток было характерно для поля CA3. Доля сморщенных нейронов среди всех повреждённых клеток была существенно выше — регистрировали, в пересчёте на 100 мкм поля CA3, более 20 таких клеток. Также регистрировали повреждённые нейроны в поле CA1. При подсчёте количества повреждённых нейронов в гиппокампе отмечали асимметричность повреждения — большая плотность расположения повреждённых клеток была характерна для левого полушария мозга. Наблюдали некоторую дезорганизацию слоя пирамидных клеток, однако нарушения цитоархитектоники гиппокампа не отмечали.

Степень нарушений, выявленную при окраске по Нисслю, характеризовали как выраженную.

В КБП также отмечали наличие гиперхромных и сморщенных клеток, располагавшихся единично или группами до десяти. Локализовались такие клетки, как и на раннем сроке наблюдения, наиболее часто в сенсомоторной и теменной ассоциативной областях КБП. На препаратах мозга интактных животных повреждённых клеток в КБП не регистрировали или отмечали единичные гиперхромные нейроны.

Кроме того, практически все нейросекреторные клетки СОЯ были повреждёнными (гиперхромными или сморщенными).

При проведении иммуноцитохимической реакции на NeuN у животных, подвергнутых воздействию витального стресса, в отличие от контрольных животных, выявляли области снижения интенсивности реакции на данный белок в гиппокампе и КБП.

Рис. 3.13. Повреждение нейронов гиппокампа крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп, поля CA1 – CA2.

Окраска по Нисслю, 200.

А — интактное животное; Б — через 25 дней после витального стресса.

Стрелками указаны гиперхромные и сморщенные клетки.

В гиппокампе выявляли анатомически чёткую зону «выключения» реакции на белок NeuN, ограниченную следующими областями: поле CA1, субикулюм, ленточная извилина (рис. 3.14, Б; 3.15, Б; 3.16). На данном участке гиппокампа, аналогично наблюдениям, выполненным при фиксации мозга на раннем сроке после травмы, располагались «пустые» (NeuN) контуры клеток — отмечали наличие светлой цитоплазмы при отсутствии иммуноцитохимической реакции на NeuN. Контуры NeuN-клеток, располагавшихся в пирамидном слое поля CA1, имели как нормальную, так и характерную для сморщенных нейронов форму.

Принципиальное отличие от изменений, зарегистрированных при проведении реакции на NeuN на раннем сроке после витального стресса, состояло в том, что на позднем сроке в указанных областях иммунопозитивных по NeuN клеток (NeuN+) не регистрировали вообще или регистрировали в количестве до нескольких на срез.

Также отмечали снижение интенсивности реакции на NeuN в КБП. Области коры, в которых отсутствовала или была существенно ослаблена реакция на этот антиген, включали в себя главным образом ретросплениальную кору, и в меньшей степени — сенсомоторную кору. Для этих областей, наряду с диффузным ослаблением реакции, были характерны единичные либо групповые «выключения»

экспрессии маркёра в клетках. Наблюдали отчётливое ослабление иммуноцитохимической реакции на NeuN в тех участках указанных областей КБП, на которые проецировались соответствующие им пучки мозолистого тела. Наибольшая интенсивность этого нарушения была характерна для более глубоких зон коры — находившихся в большей близости к подходящим от мозолистого тела пучкам волокон.

Описанное цитохимическое нарушение во всех наблюдаемых областях, как и на раннем сроке, носило асимметричный характер; у большинства животных преобладало повреждение структур левого полушария.

Рис. 3.14. Ослабление/исчезновение иммуноцитохимической реакции на NeuN в гиппокампе крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп, область CA1 – ленточная извилина.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN, докраска астровым синим, 200.

А — интактное животное; Б — через 25 дней после психической травмы.

Красным указана область ослабления и исчезновения реакции на белок NeuN.

Рис. 3.15. Ослабление/исчезновение иммуноцитохимической реакции на NeuN в гиппокампе крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп, поле CA3.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN, докраска астровым синим, 400.

А — интактное животное; Б — через 25 дней после психической травмы.

Рис. 3.16. Ослабление/исчезновение иммуноцитохимической реакции на NeuN в гиппокампе и лимбической коре крыс на позднем сроке после воздействия витального стресса.

Гиппокамп и лимбическая часть коры больших полушарий.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN, докраска астровым синим, 40.

Через 25 дней после психической травмы.

Красным цветом выделены зоны «выключения» реакции на маркёр NeuN.

При проведении иммуноцитохимической реакции на PCNA оценивали пролиферативную активность в мозге. Так же, как и на срезах мозга, фиксированного на раннем сроке после переживания стресса, пролиферация в нейрогенных зонах, в сравнении с контрольными животными, была снижена или полностью подавлена.

В зубчатой фасции гиппокампа и в гиппокампе в целом отмечали почти полное подавление пролиферативной активности — PCNA+-клеток в большинстве случаев не наблюдали.

В СВЗ отмечали уменьшение числа PCNA+-клеток — регистрировали ослабление, но не полное подавление пролиферативной активности.

Интенсивность пролиферации в СВЗ характеризовали как ослабленную.

Кроме того, наблюдали PCNA+-клетки в областях мозга, не характерных для локализации пролиферирующих клеток у интактных животных: таламус, гипоталамус, стриатум.

В результате гистологического исследования головного мозга животных на позднем сроке после воздействия витального стресса были выявлены такие морфофункциональные изменения, как гиперхромия/сморщивание нейронов гиппокампа, КБП, СОЯ, ослабление реакции на NeuN в гиппокампе, КБП, снижение интенсивности (подавление) пролиферации в субгранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа и СВЗ. Нарушения в структурах мозга, выявленные на позднем сроке после стресса, имели более выраженный характер, чем регистрировавшиеся на раннем сроке.

Результаты, полученные при исследовании поведения животных на позднем сроке после воздействия острого витального стресса, отражают снижение исследовательской деятельности, коммуникативности, развитие состояния «депрессивности», или «поведенческого отчаяния», что подтверждает факт формирования постстрессового расстройства у переживших психогенную травму крыс. Однако достоверного снижения общей активности, как и достоверного снижения уровня тревожности, не отмечалось. При этом, наряду с остальными поведенческими проявлениями, характерными для постстрессового расстройства, животные демонстрировали, как и на раннем сроке наблюдения, высокий уровень агрессивности. Вместе с тем, патологическая агрессия на позднем сроке после витального стресса проявлялась в значительно меньшей степени. Это отличие в поведенческих проявлениях, в совокупности с данными по оценке общей активности и тревожности на позднем сроке после витального стресса, может говорить о частичной компенсации поведенческих нарушений, наступающей к более позднему сроку наблюдения. Тем не менее, поведенческие признаки посттравматического расстройства, вызванного острым стрессом угрозы жизни, сохранялись у экспериментальных животных, хотя и в меньшей степени, чем это было отмечено на раннем сроке, в течение почти одного месяца после переживания ими психогенной травмы.

В результате гистологического исследования, проведённого на том же сроке после воздействия витального стресса, показано, что длительно сохраняющиеся отклонения в поведении крыс сопровождаются прогрессирующими морфофункциональными нарушениями в головном мозге. Как и на раннем сроке наблюдения, в мозге травмированных животных регистрировали массовые повреждение и гибель клеток, однако в большей степени. Ослабление иммуноцитохимической реакции на NeuN носило ярко выраженный характер, имело значительное распространение в мозге и чёткую анатомическую очерченность. На препаратах мозга стрессированных крыс наблюдали снижение, а во многих случаях (в гиппокампе) полное подавление пролиферативной активности. Кроме того, у животных, подвергнутых витальному стрессу, обнаруживали на позднем сроке после травмы пролиферирующие клетки в нехарактерных для локализации пролиферативных зон областях мозга. Таким образом, на позднем сроке наблюдения не только не происходило компенсации ранних постстрессовых структурно-функциональных нарушений в мозге, но наблюдалась их большая выраженность и отмечалось появление качественных отличий в характере изменений.

3.3. Фармакологическая коррекция отклонений в поведении и морфофункциональных нарушений в мозге крыс агонистом дофаминовых рецепторов пирибедилом после воздействия витального стресса Для выявления вовлечённости дофаминергической нейромедиаторной системы в патогенез ПТСР использовали известный и применяемый в медицинской практике препарат пирибедил. В эксперименте на животных, подвергавшихся воздействию острого витального стресса, осуществляли курсовое введение пирибедила — агониста D2, D3 дофаминовых рецепторов. Данный препарат вводили животным в двух дозировках, что позволяло оценивать его дозозависимый эффект в отношении посттравматических поведенческих отклонений и структурных изменений в ЦНС. Введение препаратов, включая ФР, начинали с первых суток, следующих после дня, когда у животных моделировали стрессовую ситуацию.

В период с 5 по 10 дни эксперимента исследовали поведение крыс в тех же тестах, которые применялись для оценки посттравматических поведенческих отклонений на раннем и позднем сроках после психогенной травмы. Препараты вводили животным за 30 мин до начала поведенческого тестирования. Декапитацию животных и фиксацию головного мозга производили через 25 дней после моделирования витального стресса. Гистологическое исследование выполняли на животных, получавших пирибедил исключительно в низкой дозировке (0,72 мг/кг).

3.3.1. Коррекция отклонений в поведении крыс В тесте ОП (рис. 3.17) поведение животных, получавших пирибедил, характеризовалось достоверно большими значениями по суммарному количеству актов (p < 0,005) (рис. 3.17, А) и количеству пересечённых квадратов (p < 0,05; в группе низкой дозировки) (рис. 3.17, Б) в сравнении с животными, получавшими после травмы ФР. Значения по данным показателям в обеих группах коррекции достигали уровня интактных животных. При этом суммарное количество актов в группе активного контроля было достоверно ниже (p < 0,005), чем у интактных крыс.

У животных, которым в постстрессовом периоде вводили пирибедил, регистрировали более высокие значения по длительности актов локомоции; в группе животных, получавших коррекцию в низкой дозировке, различие по этому показателю было достоверным — в сравнении с обеими контрольными группами (p < 0, и p < 0,01, соответственно). Вероятность обследования «норок» в обеих группах коррекции была достоверно выше (p < 0,01), чем у животных из группы активного контроля (рис. 3.17, В). Вероятность появления паттернов фризинга у животных, получавших пирибедил в дозировке 0,72 мг/кг, была достоверно меньшей (p < 0,05) по отношению к животным, получавшим ФР (рис. 3.17, Г). Тогда как животные из группы активного контроля характеризовались достоверно большей, по отношению к пассивному контролю, вероятностью появления актов фризинга (p < 0,01) (рис. 3.17, Г). В случае введения высокой дозы пирибедила (2,14 мг/кг) достоверных отличий по этому показателю, в сравнении с животными, получавшими после стресса ФР, не наблюдали.

Оценка поведения крыс в тесте «Открытое поле» на 5 сутки после витального стресса при введении в постстрессовый период пирибедила.

Локомоция Вертикальная P активность t, с Движение P Груминг Обследование P Фризинг Акты Квадраты Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05;

** — p < 0,01; *** — p < 0,005 (в отличие от группы пассивного контроля); # — p < 0,05; ## — p < 0,01;

### — p < 0,005 (в отличие от группы активного контроля).

Обозначения: P — вероятность актов; t — длительность актов; n — суммарное количество актов/пересечённых квадратов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Рис. 3.17. Показатели модификации и коррекции поведения крыс после воздействия витального стресса по тесту «Открытое поле».

По оси абсцисс: 1 — интактный контроль; 2 — введение физиологического раствора; 3 — введение пирибедила в дозе 0,72 мг/кг; 4 — введение пирибедила в дозе 2,14 мг/кг.

По оси ординат: (А) — общее количество актов; (Б) — количество пересечённых квадратов; (В) — вероятность актов обследования «норок»; (Г) — вероятность актов фризинга.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05; ** — p < 0,01; *** — p < 0,005 (в отличие от ### — p < 0,005 (в отличие от группы животных, которым вводили физиологический раствор).

Обозначения: p — значимость показателей.

Достоверно большее, чем в группе активного контроля, суммарное количество актов в тесте ОП у крыс, получавших пирибедил, свидетельствует о более высоком уровне общей активности у этих животных. Достоверно большая, чем у животных из группы активного контроля, вероятность обследования «норок»

крысами, получавшими коррекцию, свидетельствует о большей интенсивности у этих животных исследовательской деятельности. Достоверно более низкая вероятность паттернов фризинга является признаком значительно меньшего уровня тревожности у животных, получавших пирибедил в низкой дозировке. Тогда как достоверно более высокая вероятность актов фризинга, наблюдавшаяся у крыс, получавших после травмы ФР, указывает на значительно большую тревожность этих животных, в сравнении с интактными. При этом в случае введения крысам, пережившим психогенную травму, высокой дозы пирибедила не отмечалось достаточной нормализации повышенного уровня тревожности.

В тесте КПЛ (рис. 3.18) среди животных, получавших пирибедил, не было выявлено достоверных различий по длительности нахождения на открытых «рукавах» лабиринта по отношению к обеим контрольным группам (рис. 3.18, А). В группе активного контроля, в сравнении с интактными крысами, отмечали достоверное меньшую длительность нахождения на открытых «рукавах» (p < 0,05) (рис. 3.18, А). Длительность нахождения на центральной площадке лабиринта у животных, получавших после стресса пирибедил в дозировке 0,72 мг/кг, была достоверно выше (p < 0,05), чем у интактных крыс (рис. 3.18, Б). Тогда как длительность нахождения на центральной площадке у крыс, получавших пирибедил в дозировке 2,14 мг/кг, достигала уровня интактного контроля (рис. 3.18, Б).

Оценка поведения крыс в тесте «Крестообразный приподнятый лабиринт» на 6 сутки после витального стресса при введении в постстрессовый период пирибедила.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровне: * — p < 0, (в отличие от группы пассивного контроля).

Обозначения: ОР — открытый «рукав»; Ц — центральная площадка; ЗР — закрытый «рукав»; t — длительность актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Рис. 3.18. Показатели модификации и коррекции поведения крыс после воздействия витального стресса по тесту «Крестообразный приподнятый лабиринт».

По оси абсцисс: 1 — интактный контроль; 2 — введение физиологического раствора; 3 — введение пирибедила в дозе 0,72 мг/кг; 4 — введение пирибедила в дозе 2,14 мг/кг.

По оси ординат: (А) — длительность нахождения на открытых «рукавах»;

(Б) — длительность нахождения на центральной площадке.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05 (в отличие от группы интактного контроля).

Обозначения: p — значимость показателей.

Высокие значения по длительности нахождения на открытом «рукаве» лабиринта в тесте КПЛ у животных, получавших пирибедил, в сравнении с группой активного контроля, близкие к аналогичным значениям у интактных животных, могут свидетельствовать о сохранении, в результате введения пирибедила, у животных, перенёсших витальный стресс, уровня тревожности, близкого к норме.

Однако в соответствии со значительно более высокой, чем у интактных животных, длительностью нахождения крыс, получавших коррекцию в низкой дозировке, на центральной площадке лабиринта, что может указывать на развитие у них фрустрированности и затруднённости в принятии решений, уровень тревожности этих крыс нормализовался не в полной мере.

В тесте ИР (рис. 3.19) крысы-резиденты, подвергнутые переживанию психогенной травмы и получавшие ФР, демонстрировали паттерны агрессии с частотой, более чем в два раза превышавшей значение аналогичного показателя у интактных животных (p < 0,05) (рис. 3.19, А). Поведение животных, получавших после перенесения витального стресса пирибедил в дозировке 0,72 мг/кг, характеризовалось достоверно более низкой, чем в группе активного контроля, вероятностью паттернов агрессии (p < 0,05). Значения по данному показателю достигали уровня интактных животных. У животных, получавших в посттравматический период пирибедил в дозировке 2,14 мг/кг, регистрировали значительно меньшую, по сравнению с обеими контрольными группами, частоту актов коммуникации (p < 0,05) (рис. 3.19, Б).

Оценка поведения крыс в тесте «Интрудер – резидент» на 7–9 сутки после витального стресса при введении в постстрессовый период пирибедила.

Ком Защ Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0, (в отличие от группы пассивного контроля); # — p < 0,05 (в отличие от группы активного контроля).

Обозначения: Ком — коммуникативное поведение; Агр — агрессивное поведение; Защ — защитное поведение;

P — вероятность актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах;

p — значимость показателей.

0, 0, 0, Рис. 3.19. Показатели модификации и коррекции поведения крыс после воздействия витального стресса по тесту «Интрудер – резидент».

По оси абсцисс: 1 — интактный контроль; 2 — введение физиологического раствора; 3 — введение пирибедила в дозе 0,72 мг/кг; 4 — введение пирибедила в дозе 2,14 мг/кг.

По оси ординат: (А) — вероятность актов агрессивного поведения; (Б) — вероятность актов коммуникативного поведения.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05 (в отличие от группы интактного контроля); # — p < 0,05 (в отличие от группы животных, которым вводили физиологический раствор).

Обозначения: p — значимость показателей.

Достоверно более высокая вероятность проявления паттернов агрессии в тесте ИР у крыс из группы активного контроля свидетельствует о существенно более высоком уровне агрессивности этих животных, сформировавшемся в результате перенесения витального стресса. При этом достоверно меньшая, в сравнении с группой активного контроля, вероятность актов агрессии у крыс, получавших после травмы пирибедил в низкой дозировке, близкая к значениям аналогичных показателей у интактных животных, указывает на существенно более низкий уровень агрессивности животных, получавших коррекцию в низкой дозировке, и свидетельствует о сохранении уровня агрессивности этих животных на нормальном уровне. Зарегистрированная у крыс, перенёсших витальный стресс и получавших пирибедил в высокой дозировке, достоверно меньшая, чем в обеих контрольных группах, частота появления коммуникативных паттернов является признаком значимо более низкого уровня коммуникативности у этих животных.

В тесте Порсолта (рис. 3.20) животные, получавшие после травмы пирибедил в дозировке 2,14 мг/кг, демонстрировали достоверно более низкие значения по длительности состояния иммобильности (p < 0,05), чем животные, получавшие пирибедил в дозировке 0,72 мг/кг. Поведение животных, получавших пирибедил в дозировке 2,14 мг/кг, характеризовалось достоверно более высоким, чем у животных, получавших после стресса ФР, уровнем активного плавания (p < 0,05).

Оценка поведения крыс в тесте Порсолта (принудительного плавания) на 10 сутки после витального стресса при введении в постстрессовый период пирибедила.

АПл Имм Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05 (между группами животных, получавших пирибедил в разных дозировках); # — p < 0,05 (в отличие от группы активного контроля).

Обозначения: АПл — активное плавание; ППл — пассивное плавание; Имм — иммобильность; t — длительность актов; M — среднее значение; m — ошибка среднего; nжив. — количество животных в группах; p — значимость показателей.

Рис. 3.20. Показатели модификации и коррекции поведения крыс после воздействия витального стресса по тесту Порсолта (принудительного плавания).

По оси абсцисс: 1 — активное плавание; 2 — пассивное плавание; 3 — иммобильность.

По оси ординат — длительность поведенческих актов.

Примечание. Достоверность различий по средним значениям показателей поведения на уровнях: * — p < 0,05 (различие между группами животных, получавших пирибедил в разных дозировках); # — p < 0,05 (в отличие от группы животных, которым вводили физиологический раствор).

Обозначения: — интактный контроль; — введение физиологического раствора; — введение пирибедила в дозе 0,72 мг/кг; — введение пирибедила в дозе 2,14 мг/кг; p — значимость показателей.

Достоверно более низкие значения по показателю иммобильности в тесте Порсолта у животных, получавших после травмы пирибедил в высокой дозировке, по сравнению с животными, получавшими пирибедил в низкой дозировке, указывают на значительно более низкий уровень «депрессивности» первой группы крыс.

Выявленные у крыс, получавших после травмы пирибедил в высокой дозировке, достоверно большие, чем у животных, получавших ФР, значения по длительности активного плавания также свидетельствуют о существенно меньшем уровне «депрессивности» у животных из данной экспериментальной группы.

В результате тестирования поведения животных, получавших после психогенной травмы пирибедил, были выявлены следующие изменения. Поведение животных, получавших фармакологическую коррекцию, характеризовалось более высоким, в сравнении с группой активного контроля, уровнем общей активности, близким к уровню интактных животных. Отмечали более высокий уровень исследовательской деятельности. Также регистрировали более низкий уровень тревожности, который был достоверно нормализован только в группе животных, получавших коррекцию в низкой дозировке. Регистрировали более низкий уровень агрессивности, причём различие было достоверным также только в группе крыс, которым вводили пирибедил в низкой дозировке. Тогда как у животных, получавших пирибедил в высокой дозировке, отмечали достоверно более низкий уровень коммуникативности. Также для животных, получавших коррекцию в низкой дозировке, был характерен достоверно более низкий уровень «депрессивности».

3.3.2. Коррекция морфофункциональных нарушений в головном мозге крыс Проводили оценку гистологических изменений в головном мозге крыс, однократно подвергавшихся действию острого витального стресса и получавших в экспериментальной группе в постстрессовый период пирибедил, а в группе активного контроля — ФР. Соотносили полученные наблюдения с результатами гистологического исследования мозга крыс из группы интактного контроля.

На гистологических препаратах регистрировали следующие структурные и цитохимические изменения.

При окраске по Нисслю на срезах мозга животных, перенёсших психогенную травму и получавших в постстрессовом периоде пирибедил, выявляли повреждённые клетки в гиппокампе, однако в меньшем количестве, чем у животных, подвергнутых действию стресса, но не получавших коррекции. Расположение нейронов в пирамидном слое гиппокампа, а также морфология и ориентация их дендритных отростков характеризовались большей приближенностью к интактному контролю. Локальные «выпадения» (отсутствие одного или нескольких пирамидных нейронов в слое) у животных, получавших пирибедил, отмечали реже.

Линия пирамидного слоя клеток на протяжении всех полей гиппокампа у животных, получавших после травмы пирибедил, также была более ровной, чем у крыс, подвергнутых стрессу, но не получавших коррекции.

Степень повреждения гиппокампа в группе коррекции при окраске по Нисслю характеризовали как умеренную.

В КБП у животных, получавших фармакологическую коррекцию после витального стресса, в отличие от группы, получавшей после травмы ФР, повреждённых клеток не наблюдали или регистрировали их единично.

Протективного эффекта в отношении структурных нарушений в СОЯ у травмированных животных, получавших после травмы пирибедил, отмечено не было. Так же, как и в группе активного контроля, большая часть клеток СОЯ являлась гиперхромными и сморщенными нейронами.

При проведении иммуноцитохимической реакции на NeuN (рис. 3.21) у крыс, которым после воздействия стресса вводили пирибедил, в большинстве случаев не отмечали изменения интенсивности или исчезновения данной реакции, наблюдавшихся в группе активного контроля, или отмечали их в меньшей степени.

Реакция была интенсивна, распределение хромогена в клетке — равномерно, — как в ядре, так и в перинуклеарной цитоплазме. По морфологическим и цитохимическим характеристикам клетки, выявленные с помощью реакции на NeuN, у животных из группы коррекции были близки к интактным.

Рис. 3.21. Ослабление/исчезновение иммуноцитохимической реакции на NeuN в гиппокампе крыс на позднем сроке (через 25 дней) после воздействия витального стресса и предотвращение развития выявленного цитохимического нарушения в группе фармакологической коррекции.

Гиппокамп, поле CA3.

Иммуноцитохимическая реакция на NeuN, докраска астровым синим, 400.

А — животное через 25 дней после психической травмы; Б — животное, получавшее пирибедил в дозе 0,72 мг/кг в течение 23 сут эксперимента (материал взят через 25 дней после психогенной травмы).

В гиппокампе слой пирамидных нейронов, за редкими исключениями, был неповреждённым и не имел «изломов». Расположение пирамидных клеток в слое было равномерным. На некоторых препаратах отмечалось повышение интенсивности иммуноцитохимической реакции — «яркости» и контурированности выявляемых нейронов.

В КБП ослабления иммуноцитохимической реакции на NeuN в группе коррекции в большинстве случаев не наблюдали. Выявляемые с помощью этой реакции нейроны были идентичны наблюдавшимся у интактных животных.

При проведении реакции на PCNA в гиппокампе животных из группы фармакологической коррекции регистрировали отдельные пролиферирующие клетки.

Таким образом, у животных, получавших после травмы пирибедил, не происходило полного подавления пролиферации в этой структуре, в отличие от группы активного контроля.

Оценка пролиферативной активности в СВЗ показала, что фармакологическая коррекция в большинстве случаев не оказывала значимого эффекта на интенсивность пролиферации в этой области. Тем не менее, у отдельных животных наблюдали сохранение пролиферативной активности в СВЗ на интактном уровне.

В среднем уровень пролиферативной активности в СВЗ у животных, получавших фармакологическую коррекцию, характеризовали как умеренно сниженный.

В нехарактерных для локализации пролиферирующих клеток областях мозга у крыс, получавших после воздействия витального стресса пирибедил, в отличие от животных группы активного контроля, PCNA+-клеток не регистрировали.

В результате гистологического исследования головного мозга животных, получавших фармакологическую коррекцию после воздействия витального стресса, были выявлены такие морфофункциональные изменения в мозге, как гиперхромия/сморщивание нейронов гиппокампа, КБП (единичные клетки), СОЯ, ослабление реакции на NeuN (у отдельных животных) в гиппокампе, КБП, снижение интенсивности пролиферации в субгранулярном слое зубчатой фасции гиппокампа и СВЗ. Отличия наблюдавшихся у животных, получавших в постстрессовом периоде пирибедил, структурно-функциональных нарушений в мозге от таковых у животных, не получавших коррекции, состояли в меньшей степени выраженности этих нарушений, за исключением повреждений, зарегистрированных в СОЯ гипоталамуса. Также у животных, получавших фармакологическую коррекцию после стресса, не наблюдалось появления пролиферирующих клеток в не характерных для этого областях мозга.

В результате проведения курсовой фармакологической коррекции, крысы, подвергнутые однократному витальному стрессу, демонстрировали в тех же поведенческих тестах, в которых исследовали поведение контрольных животных, более приближенные к норме показатели. Так, внутрибрюшинное введение пирибедила в течение 23 сут после воздействия психогенного стресса предотвращало развитие у стрессированных животных посттравматических поведенческих и эмоциональных отклонений. Уровни двигательной активности, тревожности, коммуникативности, исследовательской деятельности, агрессивности и «депрессивности» достоверно отличались от аналогичных показателей у травмированных животных, не получавших коррекции, и были приближены к показателям поведения у интактных животных.

Данные характеристики поведения, зарегистрированные у животных, получавших после психогенной травмы пирибедил, сопровождались следующими структурными и функциональными изменениями в головном мозге. Отмечали повреждение клеток гиппокампа, гипоталамуса и КБП по типу гиперхромии и сморщивания, а также нарушение расположения и морфологии пирамидных нейронов и их отростков в гиппокампе. Однако выраженность этих проявлений (в отношении КБП и гиппокампа) была меньше, чем у животных из группы активного контроля, — получавших после витального стресса инъекции ФР. Положительного эффекта введения пирибедила в отношении повреждения нейронов СОЯ не наблюдали. При этом оценка результатов иммуноцитохимической реакции на NeuN показала выраженный нейропротективный эффект пирибедила в отношении цитохимических нарушений, выявленных в гиппокампе и КБП травмированных животных. У большинства животных, получавших фармакологическую коррекцию, не наблюдалось ослабления или исчезновения реакции на NeuN в гиппокампе и КБП. При оценке реакции на PCNA также отмечали протективный эффект введения пирибедила в посттравматический период после витального стресса. В гиппокампе экспериментальных животных не происходило полного подавления нейрогенеза: введение пирибедила обеспечивало сохранение в этой структуре протекания пролиферативных процессов. Выраженного эффекта пирибедила в отношении пролиферативной активности в СВЗ выявлено не было, однако у некоторых животных, получавших фармакологическую коррекцию, отмечали сохранение пролиферации в данной зоне на уровне интактных крыс.

ОБСУЖДЕНИЕ

Современные клинические исследования, посвящённые изучению механизмов развития постстрессовой патологии, демонстрируют факт формирования психических и поведенческих отклонений у людей, подвергшихся воздействию экстремальных стрессогенных стимулов (Грачева Л. В., 2012). Одно из наиболее тяжёлых последствий переживания психотравмирующих ситуаций у человека — ПТСР. Данное расстройство формируется в результате переживания чрезмерных, выходящих за рамки повседневной жизни стрессовых воздействий, каковыми являются участие в боевых действиях, ситуации захвата заложников, утрата близких, а также техногенные катастрофы и стихийные бедствия. В клинической картине ПТСР доминирующую роль играет депрессивный синдром. Среди прочих проявлений этого расстройства выделяют нарушения в сфере агрессивности, тревожности, социальной коммуникации, а также специфические отклонения в работе памяти. Психоэмоциональные нарушения, наблюдающиеся у людей при ПТСР, характеризуются длительным протеканием и отсутствием тенденции к полной спонтанной нормализации. К возможным механизмам развития таких нарушений относят различные функциональные, в том числе молекулярно-клеточные, а также структурные изменения в мозге (Tsikunov S. G. et al., 2003, 2010; Heim C., Nemeroff C. B., 2009; Skelton K. et al., 2012).

Имеющиеся литературные сведения по проблеме постстрессовых расстройств, касающиеся в основном человека, дают основание предполагать вовлечённость структурно-функциональных нарушений в мозге в реализацию и поддержание долговременных психических и поведенческих отклонений, наблюдающихся при ПТСР. Известно, что основным этиологическим фактором развития ПТСР является психическая травма (витальный стресс). Экспериментальные работы по ПТСР встречаются в литературе редко, т. к. изучение этого вида патологии осложнено отсутствием валидных моделей постстрессовых расстройств на животных. В настоящем исследовании использована экспериментальная модель ПТСР на крысах, разработанная в Физиологическом отделе им. И. П. Павлова ФГБУ «НИИЭМ» СЗО РАМН (Цикунов С. Г. и др., 2000, 2005a, 2003, 2006), и соответствующая международному стандарту по критериям валидности моделей психопатологии. Поведенческие и биохимические изменения, формируемые у животных в данной модели, развиваются вследствие однократного переживания острого витального стресса, не связанного с физическим воздействием, — данное воздействие сопоставимо с явлением острой психической травмы у человека. Отклонения в поведении крыс, переживших воздействие витального стресса, обладают чертами сходства с симптоматикой ПТСР у человека: повышенным уровнем тревожности и наличием реакций страха в сочетании с «депрессивностью», повышенной агрессивностью и проявлениями патологической агрессии. Биохимические изменения, регистрируемые у животных в данной модели, также обладают чертами сходства с нарушениями метаболизма, наблюдаемыми при постстрессовой патологии в клинике: резким возрастанием уровня триглицеридов в сочетании с падением уровня липопротеинов высокой плотности и общего уровня холестерина в плазме крови (Пятибрат Е. Д. и др., 2012; Цикунов С. Г. и др., 2012b). Указанные нарушения у животных подвергаются коррекции при введении им в постстрессовый период антидепрессантов различных групп, что свидетельствует о чувствительности данной модели к действию специфических препаратов и косвенно указывает на общность нейрофизиологического субстрата, вовлечённого в формирование перечисленных экспериментальных нарушений и обусловливающего развитие соответствующих клинических проявлений данного заболевания (Tsikunov S. G. et al., 2010; Пшеничная А. Г. и др., 2010).

В настоящей работе проведена оценка поведенческих изменений, возникающих у крыс в результате воздействия острого витального стресса, вызванного переживанием ситуации угрозы жизни, в динамике от одной недели до месяца.

Выполнены исследования, направленные на выявление и характеризацию структурных, цитохимических и функциональных нарушений в мозге стрессированных животных и соотнесение этих нарушений с наблюдающимися у переживших стресс крыс поведенческими отклонениями.

Переживание крысами витального стресса в опыте сопровождалось проявлением изменённого поведения. Животные группировались, демонстрировали паттерны, свидетельствующие о повышении уровня тревожности, развитии реакций страха, ужаса (фризинг). В отдельных случаях поведение животных характеризовалось ажитированностью. Кроме того, крысы, в большинстве своём, не решали предложенную им задачу по избеганию нахождения в травматической ситуации, тогда как им предоставлялась возможность покинуть террариум во время моделирования витального стресса. Это может указывать на развитие у данных животных транзиторных когнитивных нарушений, т. к. типичное поведение крыс состоит во врождённом стремлении избегать открытых пространств и уходить в более тёмное место.

Для оценки поведенческих изменений, вызванных у крыс переживанием психотравмирующей ситуации, осуществлялась регистрация поведения животных с использованием специализированных тестов. Оценка поведения проводилась на раннем (до 9 дней) и на позднем (до 25 дней) сроках после психогенного стресса.

В результате исследования поведения крыс, подвергнутых воздействию витального стресса, были выявлены следующие нарушения. У животных отмечали, как на раннем, так и на позднем сроке после указанного воздействия, снижение, в сравнении с интактными группами, уровней общей двигательной активности (депрессия поведения) и исследовательской деятельности и повышение уровня тревожности в тесте ОП. Также регистрировали повышение уровня тревожности в тесте КПЛ. Наблюдали снижение уровня коммуникативности и возрастание уровня агрессивности в тесте ИР, в том числе демонстрацию животными патологической агрессии (продолжение атакующих действий при полной позе подчинения у противника). Кроме того, было отмечено появление и возрастание представленности в поведении признаков «депрессивности» в тесте Порсолта — развитие состояния «поведенческого отчаяния». Помимо указанных нарушений, поведение травмированных крыс характеризовалось наличием незавершённых или изменённых поведенческих актов и последовательностей актов, что является признаком высокого уровня тревожности животных и, возможно, демонстрацией состояния дискомфорта (фрустрированности). Различия в поведенческих изменениях, наблюдавшихся на раннем и позднем сроках после воздействия витального стресса, состояли в том, что на позднем сроке наблюдения уровень агрессивности животных в тесте ИР, в особенности представленность в поведении реакций патологической агрессии, был ниже, чем у животных, поведение которых оценивалось на раннем сроке после стресса. Кроме того, отмечалось некоторое снижение, в сравнении с наблюдениями на раннем сроке, повышенного в результате стресса уровня тревожности (главным образом, по количеству паттернов фризинга в тесте ОП). Однако нормализации поведения к позднему сроку наблюдения не происходило ни по одной из характеристик.

Таким образом, поведение животных, как на раннем, так и на позднем сроке после витального стресса, носило характер постстрессового расстройства. Комплексная оценка наблюдавшихся у животных поведенческих нарушений позволила выявить их сходство с клиническими характеристиками ПТСР. Выявленные нарушения формировались вследствие воздействия на животных однократного острого витального стресса, сопоставимого у человека с феноменом психической травмы, — основного этиологического фактора развития ПТСР. Наблюдавшееся снижение общей активности и исследовательской деятельности животных (т. н.