«ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА ...»

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ

ЦЕНТР ЭКОЛОГИЧЕСКОЙ БЕЗОПАСНОСТИ

(НИЦЭБ РАН)

На правах рукописи

Орлова Ольга Геннадьевна

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ С

ПРОДУКТАМИ ГИДРОЛИЗА ИПРИТА

Специальность 03.00.07 - микробиология

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель:

д.т.н. Медведева Н.Г.

Научный консультант:

к.б.н.Зайцева Т.Б.

Санкт-Петербург

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ…………………………………..……………………………………… Глава 1. Обзор литературы………….…………………………………………. 1.1.Физико-химические и биологические свойства иприта и продуктов его гидролиза……………………………………………….…….. 1.2.Влияние иприта и продуктов его гидролиза на живые организмы………… 1.2.1.Влияние иприта и продуктов его гидролиза на макроорганизмы…. 1.2.2.Влияние иприта и продуктов его гидролиза на микроорганизмы…. 1.3. Способы уничтожения иприта и продуктов его гидролиза………………… 1.3.1.Физико-химические способы уничтожения иприта и продуктов его гидролиза…………………………………………………… 1.3.2.Биологическая деструкция иприта и продуктов его гидролиза…… 1.4. Влияние продуктов гидролиза иприта на биологическую активность почв ………………………………………..…………………….. Глава 2. Объекты и методы исследования……………………..…………. 2.1. Объекты исследования……………………………………………………..… 2.2. Методы исследования морфологических и физиологобиохимических признаков микроорганизмов………………..…..…………. 2.2.1. Определение морфологических признаков…………………..…….. 2.2.2. Определение физиолого-биохимических признаков…………...….. 2.3. Выделение микроорганизмов-деструкторов продуктов гидролиза иприта из почвенных образцов…………..……………….…...…. 2.4. Изучение морфолого-культуральных и физиологобиохимических признаков выделенной культуры-деструктора…………… 2.5. Токсикологическая оценка выделенной культуры-деструктора ………………………………….……………………. 2.6. Хранение и культивирование бактерий, методы контроля за процессом культивирования……..…….………………………………….. 2.7. Определение тиодигликоля, хлорорганических соединений, продуктов трансформации продуктов гидролиза иприта бактериями………………... 2.8. Исследование почвенных образцов………………..…………….…………... 2.9. Математическая обработка результатов……………………...……………... Глава 3. Влияние продуктов гидролиза иприта на рост и физиолого-биохимические признаки микроорганизмов…….………. 3.1. Рост актиномицетов, бактерий, микромицетов и дрожжей на средах, содержащих продукты гидролиза иприта……………….……… 3.2. Действие продуктов гидролиза иприта на некоторые морфологические и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов………………….. 3.2.1. Влияние продуктов гидролиза иприта на морфологические признаки микромицетов………….………………………………………… 3.2.2. Изменение клеточной проницаемости и жирнокислотного состава липидов микромицетов под действием продуктов гидролиза иприта………………………………………………………….... 3.2.3. Влияние продуктов гидролиза иприта на физиологобиохимические признаки микромицетов…………………………………. 3.2.3.1.Влияние продуктов гидролиза иприта на активность ферментов ………………………….…………………… 3.2.3.2.Влияние продуктов гидролиза иприта на образование пигментов и полисахаридов ………………………… Глава 4. Выделение и отбор бактериальных культур-деструкторов продуктов гидролиза иприта………………………………………………… 4.1. Выделение и отбор высокоактивных деструкторов продуктов гидролиза иприта……………………………….………………… 4.2.Морфолого-культуральные и физиолого-биохимические признаки выделенной культуры ……………………..………………………...……….... 4.3. Определение патогенности культуры Pseudomonas sp. Y-13………………. Глава 5. Изучение процесса деструкции и потребления продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13…………………. 5.1. Влияние условий культивирования на деструкцию и потребление продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13………...…. 5.2. Образование и потребление промежуточных продуктов деструкции тиодигликоля культурой Pseudomonas sp. Y-13……………..………...….… Глава 6. Деструкция смеси продуктов гидролиза иприта культурой Pseudomonas sp. Y-13 в почвенных образцах……………… ВЫВОДЫ……………………………………………………….……….……..... Список литературы………………………………..………………...….

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы К числу хлорорганических соединений, представляющих собой устойчивые поллютанты, относится иприт и продукты его гидролиза.

В силу повышенной токсичности иприта и продуктов его гидролиза они длительное время сохраняются в экосистемах без снижения ингибиторного действия на живые организмы. В природную среду они попадают в результате несовершенных способов хранения, при транспортировке, авариях и других ситуациях. И если проблема уничтожения запасов иприта в значительной степени решена, способы очистки природных экосистем – почв и водоемов от иприта и продуктов его гидролиза находятся только на стадии разработки.

экологически чистых технологий защиты природной среды, является биоремедиация, как наиболее щадящий метод сохранения биоразнообразия и обеспечения устойчивости очищенных биоценозов.

По мнению большинства исследователей этой проблемы, использование для этой цели активных штаммов микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к загрязнителям, является наиболее перспективным способом биоремедиации почв и водоемов.

Сообщения в доступной литературе о характере действия иприта и продуктов его гидролиза на морфологические и физиологические свойства различных микроорганизмов, равно как о механизмах деструкции этих загрязнителей весьма ограничены и представляют собой единичные и разрозненные сообщения.

Цель исследований – провести сравнительное изучение чувствительности микроорганизмов различных таксономических групп к продуктам гидролиза иприта; из числа наиболее устойчивых выделить культуру высокоактивного деструктора этих продуктов; определить возможный механизм их биодеструкции.

В соответствии с целью исследования в работе были поставлены следующие задачи:

гидролиза иприта (ПГИ) и основного из них – тиодигликоля (ТДГ) на микроорганизмы различных таксономических групп.

• Изучить характер действия ПГИ на морфолого-культуральные и физиолого-биохимические свойства микроорганизмов, наиболее чувствительных к этим продуктам.

• Выделить культуры-деструкторы ПГИ, определить наиболее активную культуру по способности потреблять ТДГ из смеси ПГИ и изучить ее основные морфолого-культуральные и физиологобиохимические свойства.

деструкции ПГИ выделенной культурой и определить возможный механизм деструкции.

деструктора ПГИ в условиях почвы.

Научная новизна полученных результатов Впервые изучен характер и степень воздействия смеси продуктов гидролиза иприта на рост микроорганизмов различных таксономических групп.

Показано, что повышенная чувствительность к этому загрязнителю характерна для микромицетов и актиномицетов и в меньшей степени для дрожжей.

Наиболее устойчивыми являются бактерии.

С использованием микромицетов показано, что действие на них смеси ПГИ весьма многообразно и касается как морфолого-культуральных, так и многих физиолого-биохимических свойств, что в конечном итоге может являться причиной фунгицидного эффекта.

В результате скрининга толерантных к смеси ПГИ бактерий выделена культура, отличающаяся способностью к полному их потреблению при достаточно высоких концентрациях в среде 2,3 г/л ХОС и 20 г/л ТДГ и идентифицирована как Pseudomonas sp. Y-13. Установлено, что выделенная культура отличается отсутствием патогенных свойств по отношению к теплокровным животным.

Показано, что основным путем деструкции ТДГ культурой Pseudomonas sp.

Y-13 является окисление его первичных спиртовых групп с образованием тиодигликолевой кислоты (ТДГК) и тиогликолевой кислоты (ТГК), последующая трансформация которых сопровождается образованием ацетата.

В продуктах трансформации ТДГ культурой Pseudomonas sp. Y-13 впервые обнаружен -меркаптоэтанол, который в дальнейшем также трансформируется в ТГК. Все образующиеся продукты деструкции используются выделенной культурой в качестве единственных источников углерода.

Практическая значимость полученных результатов Показано, что поиск и выделение деструкторов ПГИ целесообразно проводить среди бактерий, отличающихся от микроорганизмов других таксономических групп повышенной толерантностью к этим продуктам и способностью использовать их в качестве источника углерода.

На модельных испытаниях показано, что внесение в почву, загрязненную смесью ПГИ, клеток культуры Pseudomonas sp. Y-13 в значительной степени ускоряет очистку почв и способствует снижению их фитотоксичности.

активность, толерантность к такому типу загрязнителей, как продукты гидролиза иприта, безопасность для теплокровных животных и растений свидетельствуют о целесообразности использования Pseudomonas sp. Y-13 для разработки биопрепаратов с целью детоксикации ПГИ в природных экосистемах – почвах и водоемах.

Апробация работы Результаты работы доложены: на 13-м международном симпозиуме по биоповреждениям и биодеградации (Испания, Мадрид, 4-9 сентября 2005г.); на международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 14-16сентября 2005г.); на международной конференции ConSoil 2005 (Франция, Бордо, 3-7 октября 2005г.); на 10-м международном симпозиуме «Генетика промышленных микроорганизмов» (Прага, 24-28 июня 2006г.); на VIII международной конференции «

Защита и восстановление окружающей среды» (Греция, 3- июля 2006г.); обсуждены на заседании лаборатории микологии и микробиологии НИЦЭБ РАН.

Публикации По теме диссертации опубликованы 2 статьи и 5 тезисов.

Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и списка литературы.

Работа изложена на 115 страницах машинописного текста, содержит таблиц, 21 рисунок, из них 8 фотографий. Библиография включает источника.

Работа выполнена в рамках проекта МНТЦ # 2488 «Разработка технологии микробиологической биоремедиации почв, загрязненных отравляющим веществом ипритом».

Список принятых сокращений: ХОС – хлорорганические соединения;

ПГИ – продукты гидролиза иприта; ТДГ – тиодигликоль; ТДГК – тиодигликолевая кислота; ТГК – тиогликолевая кислота; а.с.б. – абсолютно сухая биомасса; а.с.п. – абсолютно сухая почва.

1.1. Физико-химические и биологические свойства иприта и Значительную опасность для всех живых организмов представляют целенаправленно синтезируемые вещества с повышенной токсичностью. К их числу относится иприт (2,2-дихлордиэтилсульфид, HD) - отравляющее вещество кожно-нарывного действия.

До недавнего времени во многих странах, в том числе и в России, имелись значительные запасы иприта [Александров и др., 1989; Умяров и др., 1993].

Способы хранения иприта не столь совершенны, чтобы обеспечить полную защиту окружающей среды от различного рода утечек. Загрязнение почв и водоемов ипритом могло происходить в процессе его хранения, при транспортировке, при аварийных ситуациях и др.

Попадая в окружающую среду, иприт в силу своей токсичности и устойчивости длительное время сохраняется в ней и оказывает губительное действие на все живое. Проблема обеззараживания, очистки почв и водоемов, загрязненных ипритом и продуктами его гидролиза, еще не решена из-за отсутствия для этого эффективных и безопасных способов. Разработка таких способов объективно представляет собой очень сложную задачу, и для ее решения потребуются усилия специалистов во многих областях науки.

Учитывая повышенную устойчивость иприта в природных условиях можно предположить, что эта проблема еще долго будет оставаться актуальной.

неспецифическим действием, может быть представлен в виде двух основных форм: технического иприта (Н) и химически чистого иприта (HD).

Технический иприт – маслянистая темно-коричневая жидкость, с запахом чеснока или горчицы. Минимальное количество вещества, при котором ощутим запах - 0,001-0,002 мг/л [Франке, 1973]. Основным компонентом Н (80% от общего количества веществ) составляет 2,2–дихлордиэтилбисульфид.

Остальные 20% содержат 1,4-дитиол, бис-(2-хлорпропил)дисульфид, бис-(2хлорэтил)трисульфид, 1,2–бис–(2хлорэтилтио)этан, дихлорэтан, сера, хлористый водород [Франке, 1973; Трофимов и др., 1994].

жидкость, запахом практически не обладает. Температура кипения +217°С, температура замерзания +14°С, удельный вес – 1,3.

Структурная формула иприта [Франке, 1973]:

CH2 CH2Cl HD обладает рядом свойств способствующих его повышенной опасности для всего живого. Так, при распространении паров иприта (в 5,4 раз тяжелее воздуха), они концентрируются, в основном, по низинам, достигая максимальной концентрации до 0,6 мг/л при 20°С. При попадании иприта в воду наблюдается сходная картина, HD оседает на дно водоема (из-за низкой растворимости - 0,8 г/л при 20°С) и обволакивает любые, в том числе вертикальные, поверхности (из-за повышенной вязкости, превышающей вязкость воды) [National Toxicology Program, 2002]. Наряду с этим, HD хорошо растворим в органических растворителях, растительных или животных жирах, маслах.

Вследствие своей высокой диффузионной способности иприт быстро проникает через ткани, кожу, картон, бумагу и тонкую резину. Он быстро впитывается в пористые неоднородные материалы, такие как кирпич, бетон, необработанная древесина. По материалам с однородной поверхностью (стекло, кафель, масляные покрытия) он растекается [Франке, 1973].

По отношению к металлам при обычной температуре иприт инертен, он почти не действует на свинец, латунь, цинк, сталь, алюминий; при повышении температуры сталь разрушается. Загрязненный иприт вызывает коррозию стали.

Гидролиз. В водной среде происходит растворение иприта. Реакция протекает очень медленно, в связи с чем, рассматривается как лимитирующая стадия в дальнейшем процессе химического преобразования иприта.

Растворившаяся часть HD подвергается реакции гидролиза (в присутствии избытка соляной кислоты реакция обратима) [Yang et. аl., 1988; Yang et. аl., 1992]:

Конечным и основным продуктом гидролиза иприта в воде является менее токсичное вещество - тиодигликоль. С увеличением температуры скорость гидролиза растворенного в воде HD возрастает: при 0,6°С половина ОВ разлагается за 3 часа, при 20°С за 9 минут, а при 37°С – за 3 мин. Полный гидролиз HD в кипящей воде происходит за 20-30 мин. Кроме того, на скорость химического гидролиза значительно влияет рН среды (рНoptim 6,5) [Савин и др., 1995].

В среде, содержащей галогены, гидролиз HD идет с образованием продуктов, не только препятствующих дальнейшему растворению иприта, но и вступающих во взаимодействие с ипритом и между собой, образуя ряд токсичных сульфониевых соединений, превышающих в несколько раз по токсичности сам иприт [Александров, Емельянов, 1990].

Более того, при отсутствии в воде акцепторов хлористого водорода может наступить равновесие, способствующее длительному сохранению иприта в воде в значительных концентрациях [De Ley, Kersters, 1964].

Подробное изучение путей гидролиза HD подтвердило, что механизм невысоких концентрациях (не более 0,001М), в условиях предварительного растворения субстрата в органическом растворителе реализуется схема гидролиза представленная на рисунке 1.

При высоких концентрациях субстрата возможно образование димерных сульфониевых соединений, вследствие чего процесс приобретает более сложный характер.

Промежуточное соединение реакции гидролиза - хлористый сульфоний – относительно стабильное соединение. В процессе его распада происходит образование циклического сульфониевого катиона, который затем может вступить в реакцию с водой (с образованием гидроксиэтил сульфида), или вернуться в исходное состояние в результате обратной реакции [Yang et. аl., 1988].

Обратимая реакция образования исходного вещества является возможным объяснением рецидивов токсичности иприта, как в организме человека, так и в окружающей среде. В присутствии сильного нуклеофила, каким является тиосульфат, может происходить эффективное связывание неустойчивого иона этилсульфония – промежуточного соединения, образующегося на начальном этапе гидролиза. Все димерные сульфониевые соединения элиминируются из раствора в присутствии аниона тиосульфата. Скорость реакции при концентрации субстрата 0,1 – 0,2 М соответствует скорости реакции, происходящей по механизму, наблюдаемому при концентрациях субстрата ниже 0,001 М. (рис.1).

Описанная выше схема гидролиза иприта реализуется при любой локализации токсиканта (вода, почва, организм человека и животных), в тех или иных вариантах. Основным продуктом гидролиза иприта является тиодигликоль, а остальные производные образуются в значительно меньших количествах.

Как указано выше, основным продуктом гидролиза иприта в воде является тиодигликоль [ТДГ] – 2,2-тиодиэтанол:

Тиодигликоль – бесцветная жидкость с температурой кипения 130С, теплотой плавления 16°С, плотностью – d420 – 1,1817. Хорошо растворим в воде, этаноле, хлороформе, плохо растворим в бензоле, эфире [Химический энциклопедический словарь, 1983]. В сравнении с ипритом ТДГ мало токсичен, однако он тоже входит в список ОВ, которые, согласно Международной Конвенции по уничтожению химического оружия, должны быть уничтожены наряду с самими отравляющими веществами.

В силу этого, вопрос о детоксикации и деструкции ТДГ тесно связан с проблемой уничтожения запасов иприта, очистки почв и водоемов, загрязненных этим экосупертоксикантом.

Загрязнение среды ТДГ происходит также в результате широкого использования его в промышленности, главным образом, в химической (изготовление типографских красителей), текстильной и др. [Garcia-Ruiz et. аl., 2002].

1.2. Влияние иприта и продуктов его гидролиза на 1.2.1. Влияние иприта и продуктов его гидролиза на макроорганизмы Иприт, как отравляющее вещество кожно-нарывного действия, обладает многосторонним поражающим действием на все живые организмы, и, прежде всего, на макроорганизмы [Александров и др., 1989].

Так, поражение глаз наступает при концентрации иприта 0,001 мг/л и экспозиции 30 мин., результатом которого могут быть хронические заболевания той или иной степени тяжести или потеря зрения [Javadi et. аl., 2005].

Под действием паров иприта наблюдаются значительные патологические изменения в легких и дыхательных путях, которые также могут привести к летальному исходу [Александров и др., 1989; McClintock et. аl., 2005].

Смертельная концентрация при действии через органы дыхания в течение 1,5 ч - около 0,015 мг/л [Dacre, Goldman, 1996].

Особенно тяжело протекает отравление ипритом при попадании его в желудочно-кишечный тракт [Франке, 1973; Dacre, Goldman, 1996;

Vijayaraghavan et. аl., 2005].

В капельно-жидком и парообразном состоянии HD поражает кожу уже в концентрации 0,1 мг/см2, смертельная доза составляет 70 мг/кг [Wormser et.

аl., 2005]. В результате своей высокой проникающей способности, иприт может быть обнаружен в крови уже через 15-20 минут, в зависимости от дозы заражения.

Таким образом, при любом местном поражении иприт вызывает общее отравление организма, вследствие высокой растворимости HD в липидах и его высокой проникающей способности [Debouzy et. аl., 2002].

Действие иприта на клеточном уровне также многообразно и выражается в повреждении или остановке различного рода процессов, происходящих в клетке, что приводит к сильным изменениям в метаболизме и чаще всего - к гибели клетки [Mahmoudi et. аl., 2005].

Цитоплазматическая мембрана клетки, являясь барьером между цитоплазмой и внешней средой, первая вступает во взаимодействие с ипритом.

Как известно, основой мембраны является двойной слой, образованный фосфолипидами, кроме того, в мембране широко представлены белки.

Фосфолипиды, в качестве основных структурных компонентов, определяют строение и проницаемость клеточных мембран, а также активность ряда локализованных в мембранах ферментов. Именно, фосфолипиды являются основной мишенью действия для молекул иприта [Debouzy et. аl., 2002]. В ответ на действие токсиканта изменяется состав фосфолипидов мембраны. Так, количество арахидоновой кислоты (важнейшего из метаболитов линолевой кислоты), под действием иприта (0.3 мМоль/л) резко уменьшается (на 60-80%) [Ray et. аl., 1995].

Кроме того, в составе фосфолипидов наблюдается увеличение содержания ненасыщенных жирных кислот [DeLong, Yayanos, 1985; Rock, Cronan, 1985], повышается текучесть мембран [Debouzy et. аl., 2002]. Это обусловливает нарушение конформации их липопротеидных комплексов и связанное с этим снижение активности белков и ферментных систем [Богач и др., 1981].

Кроме того, изменяется ряд физико-химических параметров мембраны клеток макроорганизмов - нарушается ее текучесть и проницаемость [Naghii, 2002]. Подобные нарушения связаны с изменениями, происходящими в результате присоединения молекул иприта к цепочкам метиленовых групп, которые входят в состав фосфолипидов [Debouzy et. аl., 2002].

Изменение текучести мембран связано еще и с активацией процесса перекисного окисления мембранных липидов [Naghii, 2002]. Пусковым механизмом процесса окисления является атака ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов мембран свободными гидроксильными радикалами, причиной появления которых также является иприт.

Сходное действие иприт оказывает и на мембраны внутриклеточных органелл. Так, обнаружено, что HD вызывает нарушение целостности и дисфункцию ядерной мембраны, нарушает мембранный потенциал митохондрий [Han Suhua et. аl., 2004]. Под действием иприта происходит резкий выброс ионов [Ca2+] (до 30%) из специфических ион-связывающих центров, расположенных в составе эндоплазматического ретикулюма и митохондрий, что приводит к их разбуханию и нарушению нормального функционирования [Ray et. аl., 1995]. Авторы объясняют это нарушением работы Ca2+-АТФ–аз, которые регулируют выброс [Ca2+], и являются очень чувствительными к поражению свободными радикалами.

Состояние мембран имеет решающее значение в жизнеспособности клетки, так как оказывает влияние на активность связанных с ней ферментов.

протеолитических ферментов [Cowan et. аl., 1991; Cowan et. аl., 1992; Sklyar et.

аl., 1999]. Обнаружено, что в присутствии иприта происходит увеличение протеазной активности в клетках периферических лимфоцитов человека [Cowan et. аl., 1992]. Для нейтрализации негативного действия токсиканта авторы предлагают снизить протеазную активность в клетках с помощью специфических ингибиторов протеазной активности [Cowan et. аl., 1991].

Увеличение защитных свойств клеток обнаружено, также, при действии ингибиторов протеазной активности на пораженные ипритом эпидермальные кератиноциты [Chakrabarti et. аl., 1998].

Иприт оказывает ингибирующее действие на н-нитрофенилфосфатазу [Brimfield, 1995], серин/треонин фосфатазу и гексокиназу [Brimfield, 1995;

Brimfield et. аl., 1998], что приводит к нарушению углеводного и биоэнергетического процессов. Так, гексокиназу (фермент, переносящий остаток фосфорной кислоты с АТФ на глюкозу с образованием глюкозо-6фосфата) иприт алкилирует по атому азота. В итоге фермент утрачивает каталитическую активность, нарушаются процессы переноса и потребления энергии.

В дозах меньших, чем сублетальная иприт вызывает активацию ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, каталазы, глютатион пероксидазы) [Kopff et. аl., 1994; Husain et. аl., 1996; Elsayed Nabil, Stanley, 2004], что свидетельствует о том, что клетка переживает окислительный стресс [Han Suhua et. аl., 2004]. Кроме того, иприт вызывает увеличение уровня активных форм кислорода, в частности, свободных гидроксильных радикалов.

Избыток, которых приводит, в частности, к активации процесса перекисного окисления ненасыщенных жирных кислот, входящих в состав мембранных фосфолипидов [Debouzy et. аl., 2002].

Многочисленные исследования, направленные на изучение защитных свойств различных антиоксидантов в борьбе с токсическим действием иприта на макроорганизмы, показывают хорошие результаты в опытах как in vitro, так и in vivo [Husain et. аl., 1996; Lachance et. аl., 1999; Kumar et. аl., 2001]. Так инсталляция липосом, содержащих ферменты супероксиддисмутазу, каталазу в легкие крыс, зараженных азотистым аналогом иприта – 2-хлорэтил сульфидом, уменьшает наносимый им вред на 80% [McClintock et. аl., 2005]. В тех же экспериментах обнаружено, что роль защиты от неблагоприятного действия токсиканта выполняют так же N-ацетилцистеин и глютатион (субстрат, используемый пероксидазой для окисления его перекисью водорода), истощение запасов последнего характерный признак клеток, подвергшихся действию иприта [Amir et. аl., 1998; McClintock et. аl., 2005].

Кроме иприта, негативное действие на живые организмы оказывают и продукты его гидролиза, основным из которых является - тиодигликоль. ТДГ также обладает токсическим действием [Sklyar et. аl., 1999]. Однако, в отличие от иприта, тиодигликоль является веществом менее токсичным и более персистентным [Munro et. аl., 1999].

При поражении тиодигликолем молекулы токсиканта обнаруживают во всех органах и тканях пораженного животного (наибольшая концентрация отмечается в составе крови и моче) [Black, Read, 1988; Black et. аl., 1993;

Graham et. аl., 2000; Capacio et. аl., 2004]. По данным одних авторов, около 90% введенного в организм тиодигликоля выводится с мочой в первые 24ч после заражения [Roberts, Warwick, 1963; Black et. аl., 1993], по данным других авторов высокий уровень ТДГ поддерживается в моче в течение 24-96 часов с момента заражения [Graham et. аl., 2000], а следовые количества токсиканта обнаруживают и через 45 суток после первичного поражения [Capacio et. аl., 2004].

Очищение организма от ТДГ происходит не только благодаря работе выделительной системы. Ряд авторов сообщают о наличии естественного защитного механизма от токсического действия иприта – деградации с помощью алкогольдегидрогеназ [Brimfield et. аl., 1998; Dudley et. аl., 2000;

D’Agostino et. аl., 2004]. А участие NAD+ зависимых алкогольдегидрогеназ в процессе окисления ТДГ у макроорганизмов подтверждено экспериментально [Brimfield et. аl., 1998; Dudley et. аl., 2000; Lee et. аl., 2000]. Тиодигликоль, как и алкогольдегидрогеназами, содержащимися во многих тканях и органах животных (глаза, ротовая полость, легкие, кожа и т.д.). Установлено, что деградация ТДГ происходит во всех перечисленных выше локализациях с помощью присутствующих там алкогольдегидрогеназ, но с разной скоростью.

Скорость разрушения токсиканта напрямую зависит от активности фермента [Dudley et. аl., 2000; D’Agostino et. аl., 2004].

Действие, которое оказывает ТДГ на живую клетку на биохимическом уровне, сходно с действием самого HD. Так, мишенью действия тиодигликоля также оказывается ферментная система (ингибирующее действие на серинтреонин фосфотазу). Присутствие ТДГ влияет на уровень НАД, его количество уменьшается. В конечном итоге это приводит к ингибированию фосфотазной активности в клетке [Brimfield et. аl., 1998; D’Agostino et. аl., 2004]. Кроме того, ТДГ оказывает негативное влияние на процессы энергетического метаболизма, нарушает нормальный режим трансляции и транскрипции [Kan et. аl., 2003].

1.2.2. Влияние иприта и продуктов его гидролиза на микроорганизмы Жизнедеятельность микроорганизмов тесно связана с условиями их обитания. При изменении этих условий, в том числе и под воздействием веществ, обладающих токсическими свойствами, в клетке возможны нарушения, ведущие к изменению ее структуры и/или функций [Авцин, Шахламов, 1979]. Иприт и продукты его гидролиза могут оказывать на микробную клетку преимущественно неспецифическое действие и влияют на многие стороны метаболизма.

К сожалению, в доступной литературе сведения о влиянии иприта или продуктов его гидролиза на микроорганизмы носят эпизодический характер, что не позволяет оценить характер этого действия. Остается предполагать, что действие иприта и продуктов его гидролиза, как токсикантов неспецифического макроорганизмов и приводит к расстройству механизмов регуляции функций микробной клетки.

Изучено негативное воздействие со стороны HD на генетический аппарат микроорганизмов. Так алкилирование ипритом пуриновых оснований является причиной изменения наследственных признаков [Kircher et. аl., 1979; Lodhi et.

аl., 2001]. В экспериментах, проведенных с гаплоидными дрожжами рода Saccharomyces было показано, что иприт оказывает на них летальное или мутагенное действие: в его присутствии, количество межнитевых поперечных сшивок в ДНК возрастает пропорционально количеству иприта [Kircher et.

аl.,1979; Kircher, Brendel, 1983]. При изучении действия аналога иприта 2хлорэтилэтил сульфида (CEES) на работу генетического аппарата клеток Escherichia coli, было показано, что в присутствии изучаемого вещества происходит ингибирование таких процессов как транскрипция, трансляция и пост-трансляционная модификация [Venitt, 1968; Ichinotsubo et. аl., 1977]. В молекуле ДНК Salmonella typhimurium в результате действия иприта, резко возрастает количество генных мутаций [Ichinotsubo et. аl., 1977]. В пораженных клетках микроорганизмов нарушается нормальная работа генов, препятствующих спонтанному аппоптозу, в результате чего наблюдается их ускоренная гибель [Hur et. аl., 1998].

1.3. Способы уничтожения иприта и продуктов его гидролиза 1.3.1. Физико-химические способы уничтожения иприта и продуктов Уничтожение запасов иприта, очистка почв и водоемов, загрязненных ипритом, представляют собой очень важную и сложную для решения проблему [Удальцова и др., 1993; DeFrank et. аl., 1995; Mulbry, Rainina, 1998].

До недавнего времени под понятием “уничтожение” иприта, как химического оружия, подразумевалось лишь его захоронение. Наиболее быстрыми и дешевыми способами являлись - захоронение в землю, затопление в море [Бекер и др., 1993; Луганский и др., 1994]. Кроме того, был предложен метод сжигания иприта на открытом воздухе, однако, этот процесс сопровождается образованием большого количества твердых и газообразных отходов – потенциальных источников загрязнения окружающей среды [Боронин и др., 1999]. В настоящее время использование этих способов, как экологически опасных, запрещено Женевской конвенцией [Бекер и др., 1993].

Современные экологические требования предопределяют необходимость создания способа и технологий деструкции иприта до экологически безопасных продуктов.

Проблема осложняется еще и тем, что в результате длительного хранения запасов иприта содержание в них основного вещества снижается, а количество вязких, смолообразных масс увеличивается, что в определенной мере затрудняет процесс его уничтожения, биодеструкции [Умяров и др., 1993].

Существует ряд требований к разработке технологии уничтожения химического оружия: обеспечение безопасности в процессе реализации технологии, невысокую стоимость технологии и обеспечение надежного контроля при осуществлении технологического процесса. Кроме того, условия хранения и возможность транспортировки запасов токсичных веществ к местам уничтожения акцентирует внимание на разработке технологий, позволяющих проводить работы по детоксикации, как в стационарных заводских условиях, так и непосредственно в местах захоронения оружия [Боронин и др., 1996].

В основу известных технологий уничтожения запасов HD положены химические, термические, каталитические и энергетические способы [Умяров и др., 1993; Савин и др., 1995; Lois Ember, 1993].

К числу химических способов относятся:

1. Химическая нейтрализация иприта, при которой образуются соединения менее токсичные, чем исходное вещество. Среди этих методов выделяют два основных - водный или водно-щелочной гидролиз и нейтрализация с использованием водноспиртовых растворов щелочей. Общими недостатками указанных способов являются низкая скорость процесса, большой объем дегазирующего раствора. По мнению некоторых авторов, щелочной гидролиз иприта сопровождается образованием в значительных количествах полимеризованных продуктов, биодеградация которых затруднительна [Yang et. аl., 1988].

2. Метод окислительного хлорирования суспензиями хлорной извести или растворами гипохлорита кальция. Существенным недостатком этого метода является образование токсичных хлорорганических соединений и большого количества отходов.

В России разработан двухступенчатый способ уничтожения иприта, заключающийся в его детоксикации (I ступень) и последующем сжигании реакционных масс (II ступень) [Боронин и др., 1996]. Детоксикация проводится с использованием смеси моноэтаноламина и этиленгликоля в массовом соотношении 9:1 [Луганский и др., 1994]. Недостатком этого метода является накопление на I ступени в реакционной смеси продуктов конденсации фрагментов иприта, этиленгликоля и моноэтаноламина, а на второй – выделение токсичных газов при сжигании реакционных масс.

Обращает на себя внимание исследование [Боронин и др., 1999], в котором разработаны научные основы комплексной экологически безопасной технологии уничтожения запасов иприта, включающей 3 основных стадии.

На первой стадии проводится химическая детоксикация иприта с использованием смеси щелочи, соды, сульфанола (алкилбензолсульфаната Na моноэтаноламина и воды в соотношении 1: 1: 0,02: 1: 20 при температуре 80°С в течение 2 ч. Основным компонентом реакционных масс, образующихся при этом, является ТДГ. Для окисления ТДГ реакционные массы подвергают электролизу, а затем направляют на биоочистку, в биосорбере, где процесс очистки от органических продуктов электрохимической деструкции ТДГ осуществляется спонтанным сообществом микроорганизмов, иммобилизированных на поверхности взвешенного слоя гранулированного активированного угля.

Другой способ гидролиза и окисления продукта гидролиза иприта - ТДГ предложен Lachance с соавт. В соответствии с этим методом ТДГ подвергали деградации при температуре 400-525С под давлением в присутствии окислителей либо без них [Lachance et. аl., 1999]. В результате этой реакции происходила деструкция ТДГ. Однако продукты подобного физикохимического воздействия не являются экологически безопасными и требуют дальнейшей утилизации.

использования его в качестве исходного сырья для получения продуктов, которые возможно использовать в промышленности.

комплексообразователей, катализаторов межфазного переноса, пластификаторов, полисульфидных полимеров и др. Однако, практическая реализация этого, несомненно, интересного направления осложняется наличием в техническом, длительно хранящемся иприте смолообразных продуктов [Евстафьев и др., 1991; Умяров и др., 1993].

Таким образом, известные физико-химические способы уничтожения иприта сложны, длительны, неэкономичны, а часто и неприемлемы с позиций экологии, так как их реализация связана с образованием больших количеств газообразных, жидких и твердых отходов, неблагоприятных для окружающей среды.

1.3.2. Биологическая деструкция иприта и продуктов его гидролиза С целью решения проблемы обезвреживания ксенобиотиков в природных условиях изучается возможность использования селекционированных микроорганизмов для детоксикации иприта и продуктов его гидролиза [Боронин и др., 1999; Ермакова и др., 2002; Медведева и др., 1998; Медведева и др., 2000; Медведева и др., 2006]. Показано, что благодаря чрезвычайно высокой гетерогенности природных популяций микроорганизмов, а также их способности адаптироваться к неблагоприятным условиям существования, многие ксенобиотики (в т.ч. хлорорганические соединения), могут в той или иной степени ими усваиваться [Мицевич и др., 2000; Ogawa et. аl., 2003]. С большой долей вероятности обнаружить микроорганизмы-деструкторы можно в местах, длительное время загрязненных соответствующим токсикантом, ксенобиотиком [Мицевич и др., 2000; Ermakova et. аl., 2002].

Сообщений о микробиологической деструкции иприта в доступной литературе мало, что свидетельствует о недостаточном уровне изученности этой проблемы. Тем не менее, из результатов известных исследований следует, что биодеструкция иприта микроорганизмами возможна. С целью решения данной задачи предлагается использование комбинированного двух стадийного способа, на первой стадии которого проводится гидролиз иприта, а на второй – биопотребление продуктов гидролиза, основным из которых является ТДГ [Петров и др., 1995]. Lee с соавторами предложил метод минерализации иприта, включающий химический гидролиз иприта и биологическую утилизацию образующегося при этом ТДГ как источника углерода и энергии. В качестве биологического агента использовали различные штаммы бактерий рода Alcaligenes. Биодеструкцию ТДГ проводили в лабораторном реакторе резервуарного типа при содержании ТДГ в среде в концентрации, не превышающей 30 мМоль/л (18,3 г/л) [Lee et. аl., 1997].

Другой двустадийный способ уничтожения ТДГ, разработанный Российскими учеными, основан на применении физико-химической обработки ТДГ с последующим использованием микроорганизмов, способных потреблять образующиеся при этом продукты [Боронин и др., 1999].

Особый интерес, с научной и практической позиций, представляют исследования процессов детоксикации иприта микроорганизмами как с прокариотным, так и с эукариотным типом строения.

Так, учитывая способность базидиомицетов подвергать метаболитической деструкции тринитротолуен (или тринитротолуол), хлорфенолы, серосодержащие гетероциклические соединения и другие токсические вещества [Rozmiarek et. аl., 1973; Takeshima et. аl., 1994] японские ученые провели исследования с использованием этих грибов для детоксикации иприта [Itoh et.

аl., 1997]. Показано, что две культуры: Coriolus versicolor и Tyromyces palustris трансформируют аналог иприта (бис(2-бромэтил) сульфид) с образованием ТДГ и бензил сульфида. При этом ТДГ, в концентрации 0,5мМ (0,061г/л), подвергается быстрой, за 50 часов, биодеструкции (схема деструкции не приведена). Второе соединение - бензилсульфид, подвергается гидролизному дегалогенизированию. Эти данные позволили авторам предположить возможность использования базидиомицетов для детоксикации иприта.

Среди изучаемых штаммов бактерий, проявляющих способность к деструкции иприта и продуктов его гидролиза, основная масса выделена из природных источников с помощью метода накопительных культур. В основе метода лежит инкубирование загрязненных продуктами гидролиза иприта почв в течение нескольких месяцев. Подобные условия, позволяют развиваться в почве только тем микроорганизмам, которые обладают толерантностью по отношению к ПГИ или могут использовать их в качестве единственного источника углерода и энергии [Тихонова и др., 2002; Medvedeva et. аl., 2000].

Так, выделенные из почвы штаммы Pseudomonas sp.8-2 и Micrococcus sp.6использовали продукты гидролиза иприта в качестве источника углерода и энергии. Выделенные микроорганизмы проявляли способность осуществлять полную (на 100%) трансформацию ТДГ в концентрации 7,8 г/л из смеси ПГИ (0,50 г ХОС/л). При увеличении концентрации ПГИ до 0,80 г ХОС/л (15,4 г/л ТДГ) обе культуры осуществляют утилизацию ТДГ лишь на 53-63%. Увеличить активность процесса удалось лишь в случае его ведения в две стадии (при дополнительном внесении культуры-деструктора на второй стадии).

Максимальная концентрация токсиканта, при которой наблюдалось полное потребление ТДГ при 2-х стадийном культивировании, достигала 1,52 г ХОС/л (23,2 г/л ТДГ) [Медведева и др., 2000]. Следует отметить, что авторы не приводят схемы трансформации ТДГ выделенными микроорганизмами, и не уточняют, до каких именно конечных продуктов происходит процесс трансформации.

Другие бактериальные штаммы Pseudomonas pikettii (SH18) и Alcaligenes xylosoxydans (ssp. xylosoxydans SH42) были выделены из почвенных образцов, трансформировать 84% (SH18) и 97% (SH42) ТДГ в концентрации 160 г/л и 20г/л (соответственно). Конечным продуктом трансформации ТДГ у обеих культур является тиодигликоль сульфоксид [Yang Y.C. et. all 1992].

Образующийся продукт не подвергается дальнейшей микробиологической деструкции и является тупиковым, что приводит к его накоплению и не позволяет рассматривать эти культуры в качестве перспективных для создания технологий по очистке открытых экосистем от ПГИ [Harvey S.P. et. all 1993].

В основной массе научных трудов по изучению процесса деградации иприта в качестве изучаемого вещества используется ТДГ, как основной продукт его гидролиза. Как и иприт, ТДГ является труднодоступным субстратом для микроорганизмов, и долгое время может сохраняться в различного рода экосистемах (почва, вода) в неизменном виде [Lee et. аl., 1997;

Munro et. аl., 1999].

В процессе разработки способов деструкции и детоксикации ТДГ, были обнаружены штаммы бактерий, использующие ТДГ в качестве источника углерода. При изучении промежуточных продуктов, образуемых Alcaligenes xylosoxydans (ssp. xylosoxydans SH91), в процессе утилизации ТДГ (в концентрации 25мМ или 0,3%) было обнаружено, что основными реакциями метаболизма ТДГ культурой Alcaligenes xylosoxydans являются окисление ТДГ образовавшихся продуктах (ТДГК и ТГК). Образующийся в результате ацетат, вовлекается в реакции центрального метаболизма и является для клетки источником углерода и энергии [Lee et. аl., 1997; Pham et. аl., 1996].

Как следует из приведенной на рисунке 2 схемы идентифицированными промежуточными продуктами утилизации ТДГ в данном случае являются:

дигликольсульфоксид (ДГСО), S-(2-гидроксиэтилтио)уксусная кислота (НЕТА) и тиодигликолевая кислота (ТДГК) [Lee et. аl., 1997]. При увеличении концентрации ТДГ до 40-100мМ (4,8-12 г/л) потребление ТДГ прекращается.

Тиодигликоль S-(2-гидроксиэтилтио) Тиодигликолевая O=S Дигликольсульфоксид (ДГСО) Рис.2. Схема метаболизма ТДГ культурой Alcaligenes xylosoxydans (ssp.

xylosoxydans SH91) Изучение возможности ассимиляции промежуточных продуктов окисления ТДГ показало, что дигликольсульфоксид (ДГСО) в концентрации от 0,5 г/л до 1,5 г/л не используется культурой Alcaligenes xylosoxydans в качестве источника дигликольсульфоксида накапливается в период активного роста культуры и практически отсутствует при окислении ТДГ интактными клетками. Авторы считают, что окисление ТДГ с образованием ДГСО является тупиковой ветвью метаболизма и осуществляется за счет широкой субстратной специфичности различных оксигеназ [Ермакова и др., 2002].

В отличие от ДГСО тиодигликолевая кислота (ТДГК) используется культурой Alcaligenes xylosoxydans (ssp. xylosoxydans SH91) как источник углерода для роста [Lee et. аl., 1997; Lee et. аl., 2000]. Кроме того, эта кислота активно окисляется интактными клетками бактерий до тиогликолевой кислоты, ацетата и ионов SO42-.

Иммобилизированные на криогеле клетки Alcaligenes xylosoxydans (ssp.

xylosoxydans SH91) могут трансформировать ТДГ в концентрациях, не превышающих 200 мМ (24 г/л) и сохраняют активность в течение 3 месяцев [Kim et. аl., 1997]. Однако авторы предлагают использование этой культуры для трансформации ТДГ только в биореакторах. Реализация этого процесса в природных условиях не рассматривается.

Другой штамм Alcaligenes xylosoxydans PGH10 оказался не способен использовать ТДГ в качестве источников углерода и энергии, только интактные клетки этого штамма могут трансформировать ТДГ в концентрации до 7,2 г/л.

[Garcia-Ruiz et. аl., 2002]. В связи с этим использование данного штамма в качестве активного деструктора ТДГ не целесообразно.

xylosoxydans PGH10 показала, что наибольшей активностью обладают клетки в начале стационарной фазы роста. А эффективность процесса трансформации ТДГ возрастает при добавлении в экспериментальную среду фруктозы, в качестве дополнительных источников углерода и энергии [GarciaRuiz et. аl., 2002].

Изучение возможности штамма Alcaligenes xylosoxydans TD2 к трансформации ТДГ выявило, что рост культуры возможен при концентрации ТДГ от 0,8 г/л до 39 г/л. Однако, на кривой роста культуры отмечают фазы замедления, что, по мнению авторов, связано с лимитированием или ингибированием роста бактерии продуктами трансформации ТДГ (ДГСО и ТДГК) [Тихонова и др., 2002]. Этот факт, по мнению авторов, ставит под сомнение использование данного штамма в качестве культуры-деструктора.

При определении промежуточных продуктов трансформации ТДГ культурой Pseudomonas sp. 8-2, были идентифицированы только органические кислоты: 2-оксиэтилгликолевая кислота; тиодигликолевая кислота [Медведева и др., 2000а]. Штамм уксуснокислой бактерии Gluconobacter oxydans L- трансформирует ТДГ в высоких концентрациях – до 100 г/л, с образованием 2оксиэтилтиогликоля и ТДГК, в качестве основных продуктов метаболизма.

Дальнейшей трансформации и тем более утилизации образующихся продуктов не происходит [Медведева и др., 1996; Медведева и др., 2000б].

ТДГ может использоваться бактериями и как источник серы. Так, при росте культуры Rhodococcus rhodochrous IGTS8 (АТСС 53968) в среде с глицерином и 2-хлордиэтил-сульфидом (хлорированным аналогом ТДГ), в качестве источника серы, была идентифицирована 2-хлорэтансульфиновая кислота [Kilbane, Jakowski, 1996].

Изучается возможность деструкции иприта с помощью микробных ферментов. Израильские ученые предложили использовать для деградации иприта смесь, состоящую: из грибной хлоропероксидазы (источником которой является Caldariomyces fumago); 0,5М раствора NaCl; смеси глюкозы с глюкозооксидазой (Aspergillus niger), в качестве альтернативного источника H2O2. Ученым удалось найти такое соотношение компонентов в данной смеси, которое позволяло добиться полной деградации растворенного иприта (10микроМ/л) за 30 минут при 25С, pH 2.75 [Amitai et. аl., 2003].

большинства исследователей, самым перспективным методом для очистки различного рода экосистем от загрязнения ипритом является именно микробиологический метод. Однако на пути реализации этой задачи ученые столкнулись с рядом проблем. Основная сложность состоит в выделении или получении методами генетики и/или селекции высокоактивной культуры микроорганизмов, обладающей свойством осуществлять не только процесс деструкцию токсиканта с полным потреблением всех промежуточных продуктов этого процесса. Кроме того, культура не должна являться токсичной использования для очистки открытых экосистем. Не менее важное значение, имеет определение условий ведения процесса с учетом свойств используемой культуры.

1.4. Влияние продуктов гидролиза иприта микроскопические грибы [Полянская и др., 1977; Anderson et. аl., 1975] и бактерии [Мишустин, Емцев, 1987]. Они принимают активное участие в разложении поступающего в почву органического материала и формировании гумуса [Мирчинк, 1988; Christensen, 1989]. В целом, видовой и количественный состав микробиоты почв зависит от климатической зоны, характеристики почвы и ее состояния, времени года и т.д. Таким образом, микробиологический состав почв представляет собой весьма динамическую систему, каждая составляющая которой вносит свой вклад в сохранение структурной и функциональной целостности сообщества в целом.

Для разработки научно обоснованной методологии реабилитации экосистем от ипритного загрязнения необходимо оценить возможность самой экосистемы (и микробиоты как ее составляющей части) по преодолению вредных воздействий.

Особенность почв, загрязненных ипритом и его производными, состоит в том, что они сохраняют высокую токсичность в течение длительного времени, что, по-видимому, связано с тем, что полного разложения этих веществ, т.е.

самоочищения в почве не происходит [Medvedeva et. аl.,2000]. Более того, в том случае если загрязнение почвы ипритом произошло в глубоких слоях, то оно может сохранять в неизменном виде годами [Watson, 1992; Munro et. аl., 1999].

Существует два основных пути деградации иприта в почве: химический гидролиз и биодеградация. Скорость химического гидролиза зависит от относительной влажности менее 50%, химический гидролиз в почве не идет [Medvedeva et. аl., 2000]. В условиях повышенной влажности и высокой температуры – химический гидролиз ускоряется, но никогда не достигает хлорорганических производных сохраняется в почве и через 12 месяцев после загрязнения [Медведева и др., 2000б]. Что касается типа почвы, то быстрее всего иприт подвергается гидролизу в почвах со щелочным рН [Franke, 1967].

Одним из важнейших показателей биологической активности почв является активность почвенных ферментов. Иприт и его производные негативным образом влияют на биохимические процессы в почвах, что приводит к резкому падению их биологической активности. Под действием иприта снижается активность инвертазы, уреазы, дегидрогеназы.

Отрицательное влияние оказывает иприт и на такой важнейший показатель биохимических процессов в почве как интенсивность выделения углекислоты дыхание почвы. Восстановление исходных (до загрязнения) показателей активности почвенных ферментов не достигается даже через год после первичной обработки токсикантом [Medvedeva et. аl., 2000].

Кроме того, высокой чувствительностью к иприту обладают высшие растения: даже в незначительных концентрациях он полностью подавляет рост и развитие исследованных зерновых и бобовых культур: овса, пшеницы, гороха, овсяницы луговой, костра безостого, полевицы белой [Medvedeva et. аl., 2000].

Таким образом, загрязненные ипритом почвы отличаются высокой токсичностью и замедленным характером протекания биологических процессов, их детоксикация естественным путем происходит крайне медленно.

Наиболее значимым показателем устойчивости почв к антропогенным воздействиям служит активность микробных сообществ [Ohtonen, 1994]. По данным Медведевой с соавт. [Medvedeva et. аl., 2000], кантоминация почвы ипритом приводит, как к изменению характеристик почвы (изменение активности ферментов, снижение интенсивности дыхания и т.д.), так и к изменению численности и структуры сообщества почвенных микроорганизмов.

В загрязненных ипритом и тиодигликолем почвах происходит увеличение показателей доминирования, снижение показателей сходства и видового разнообразия почвенной микрофлоры, что свидетельствует о снижении устойчивости системы в целом [Medvedeva et. аl., 2000]. В результате экспериментов обнаружено, что в загрязненных ипритом и ТДГ почвах значительно подавляется жизнедеятельность целлюлозоразрушающих бактерий, а жизнедеятельность микромицетов и актиномицетов подавляется практически полностью [Medvedeva et. аl., 2000]. Так, через год после кантоминиции дерново-подзолистой почвы продуктами гидролиза иприта в концентрации 0,07 г/л ХОС численность микромицетов и актиномицетов составляла около 5-10% от исходного количества. Столь сильное подавление активности микроорганизмов почвы приводит к тому, что разложение ксенобиотиков содержащимися в почве аборигенными микроорганизмами происходит крайне медленно.

Отрицательное воздействие, оказываемое ипритом и продуктами его гидролиза на экосистему в целом, может привести к тому, что она не вернется к первоначальному устойчивому состоянию и будет необратимо деградировать.

При сравнительно низких концентрациях токсикантов в почве постепенно происходит активизация местного микробиоценоза - увеличение численности различных микроорганизмов, что связано со снижением токсического действия загрязнителя, под их воздействием. Так, количество бактерий в торфяноглеевой почве, содержащей смесь ПГИ в концентрации (0,24-0,97 г/л ХОС) и дерново-подзолистой почве, содержащей смесь ПГИ в концентрации (0,07-0, г/л ХОС) почвах, восстанавливается до уровня контроля в течение 6 месяцев с момента загрязнения [Medvedeva et. аl., 2000].

Способность почвенных микроорганизмов сохраняться в неблагоприятных и восстанавливать популяцию в благоприятных условиях, делает их незаменимыми в современных экологических исследованиях для ранней диагностики изменений, происходящих в экосистемах под воздействием токсичных веществ и возможности их микробной деструкции [Звягинцев, 1987б; Сулей, 1989]. Большинство исследователей проблемы биоремедиации почв загрязненных продуктами гидролиза иприта, предлагают использование для этой цели активных штаммов микроорганизмов-деструкторов, устойчивых к повышенным концентрациям токсикантов. Этот способ представляет особый интерес и важность, так как является наиболее экологически безопасным из числа известных.

Для разработки такого способа очистки необходимо изучить вопрос о характере и механизмах действия смеси ПГИ и ТДГ как на природные микробиоценозы в целом, так и на отдельные их компоненты. Эти исследования позволят не только объяснить изменение видового разнообразия микробных сообществ в почве под действием ПГИ и ТДГ, но и определить наиболее перспективные микроорганизмы для использования их с целью очистки почв от этих поллютантов.

Важнейшей, центральной задачей этой проблемы является выделение (получение) микроорганизмов - высокоэффективных деструкторов этих ксенобиотиков, изучение продуктов деструкции, с целью оценки их безопасности для живых организмов, растений.

Внесение в почву микроорганизмов – деструкторов в сочетании с различными агрохимическими приемами, следует рассматривать как оптимальное решение проблемы очистки территорий, загрязненных ПГИ.

В работе использовали микроорганизмы различных таксономических групп – бактерии, актиномицеты, дрожжи, мицелиальные грибы. Культуры получали из различных коллекций, указанных, как и названия культур, в таблице 1.

Arthrobacter globiformis (Cohn.) Connet Dimmick Bacillus megaterium De Bary Bacillus mycoides - Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn.

Brevibacterium flavum Escherichia coli АТСС Micrococcus lysodukticus Fleming - Mycobacterium lacticola Lehmann et Neumann - Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula - Pseudomonas fluorescens (Trevisan) Migula - Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus citereus Micromonospora echinospora Micromonospora sp.

Nocardia dossonsillei Nocardia baciliensis Streptomyces roseviolaceus Sveshnicova - Streptomyces globisporus Krassilnicov - Streptomyces violancens Preobrazhenskaya - Streptomyces flaveolus (Waksman) Krassilnicov - Streptosporangium sp.

Streptosporangium sp.

Candida utilis П- Candida humicola - Cryptococcus flavus Y- Cryptococcus humicola (Daszewska 1912) Golubev Rhodotorula VI Torula roseum Trichosporon cutaneum Нем.2(70) Lipomyces lipotereus Saccharomyces cerevisiae Hansen - Saccharomyces cerevisiae 4- Sporobolomyces paraposeus Sporobolomyces pararoseus T Alternaria consortiale Alternaria radicina Aspergillus flavus Link Aspergillus fumigatus Fresenius F - Aspergillus niger F - Aspergillus terreus Thom - Aspergillus versicolor (Vuillemin) Tiraboschi F - Botritis cinerea Fusarium oxysporum Helmintosporium sativum (Bipolaris sorokiniana) Helmintosporium inaeguale (Curvularia inaegualis) Mucor hiemalis Wehner F - Mucor murorum Penicillum funiculosum Thom F - Penicillum ochrochloron Biourge F - Penicillum stoloniferum Trichoderma viride Persoon F - Scopulatoriopsis brevicaulis (Saccarda) Bainier – 85c.

2.2. Методы исследования морфологических и физиологобиохимических признаков микроорганизмов 2.2.1. Определение морфологических признаков просвечивающей электронной микроскопии [Hayat, 1974].

Ультратонкие срезы готовили на ультратоме LKB-8800, окраску срезов проводили по методу Рейнольдса 0,1%-ным раствором уранилацетата.

Препараты исследовали в электронном микроскопе JEM-100С (Япония) при ускоряющем напряжении 80кВ [Spurr, 1969]. Сканирующую микроскопию проводили с использованием микроскопа JSM-35C (Япония) при ускоряющем напряжении 15кВ.

Эти исследования выполнены в ГосНИИОЧБ (г. Санкт-Петербург) с участием д.б.н. Рыбальченко О.В., любезно предоставившей снимки, помещенные в работе.

2.2.2. Определение физиолого-биохимических признаков Об изменении уровня проницаемости клеток микроорганизмов судили по утечке из клеток в среду (инкубационную жидкость) метаболитов, имеющих полосы поглощения в ультрафиолетовой области (220-350 нм) [Federson et. аl., 1990]. Полученные спектры обсчитывали с применением метода спектральных моментов, используя для характеристики данных экспериментальных спектров момент нулевого порядка 0 [Александров и др., 1993; Иванов, Совков, 1993].

Количественное содержание белка определяли методом Лоури [Lowry, et.

аl., 1975], количество белка выражали в мкг/г а.с.б.; аминокислот - методом тонкослойной хроматографии на пластинках Silufol [Munavalli et. аl., 1988] в системе растворителей 1-пропанол: 25%-ный аммиак в соотношении 1:1. Для выявления пятен использовали 2 % раствор нингидрина в ацетоне, для элюирования пятен использовали 0,5% раствор хлористого кадмия в этаноле.

Ионы калия определяли фотометрически на пламенном фотометре ПАЖ- [Аринушкина, 1970], количество ионов калия выражали в мкг/г а.с.б.

Выделение липидов микромицетов проводили методом Фолча [Кейтс, 1975]. Выход липидов рассчитывали на 1 г а.с.б. Для получения метиловых эфиров жирных кислот применяли HCI-метанольный реагент [Кейтс, 1975].

Метиловые эфиры жирных кислот анализировали методом газожидкостной хроматографии по ГОСТ Р51483-99 “Масла растительные и жиры животные.

Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров индивидуальных жирных кислот к их сумме”. Анализ проводили на хроматографе Perkin-Elmer 8410 c пламенно-ионизационным детектором.

Температурный режим детектора 200С. Условия анализа: колонка металлическая микронасадочная, 2м Х 1/8 дюйма, неподвижная фаза 3% SP 2310 + 2% SP 2300 на носителе газ-хром Q. Температура печи колонки 50С, скорость нарастания температуры 8/мин. Температура испарителя 230С. Газ-носитель – азот (скорость 70 мл/мин). Идентификацию жирных кислот проводили сравнением их времен удержания со временем удержания стандартных веществ.

Эти исследования выполнены во Всероссийском НИИ жиров (г. СанктПетербург) с участием к.б.н. Горшковой Э.И.

Амилолитическую активность микроорганизмов определяли методом, основанным на гидролизе крахмала ферментами амилолитического комплекса до декстринов различной молекулярной массы. Исследования проводили по общепринятой методике, амилолитическую активность выражали в г крахмала/г а.с.б. [Грачева и др., 1982].

Для определения каталазной активности у микроорганизмов использовали разложившейся перекиси водорода в течение определенного времени. За единицу активности принимали количество фермента, катализирующее разложение 1 мкМ Н2О2 за 1 мин. и выражали в ед./мг а.с.б. [Борисова, 1973].

восстановлению 2,3,5-трифенил тетразолиум хлорида (ТТХ). Полученные результаты выражали в граммах трифенилформазана из расчета на 100 мг а.с.б.

[Логинова, Гужева, 1961].

Активность комплекса целлюлолитических ферментов, выделяемых в культуральную жидкость определяли методом Мандельс-Вебера [Марчева, 1985], для чего микромицеты выращивали на среде Чапека, содержащей в качестве единственного источника углерода фильтровальную бумагу.

Целлюлазную активность определяли по количеству редуцирующих сахаров, образующихся при гидролизе фильтровальной бумаги и выражали в ед.

(ммоль/мл). Редуцирующие сахара определяли методом Сомоджи-Нельсона, используя в качестве стандарта глюкозу [Somogyi, Babu, 1952]. Прирост биомассы определяли по количеству белка методом Лоури [Lowry et. аl., 1975].

титрометрическим методом по количеству перекиси водорода, образующейся в глюкозооксидазной активности принято количество фермента, катализирующее окисление 1мкМ глюкозы за 1 минуту в оптимальных условиях (при +30С, избытке кислорода и глюкозы, что сопровождается потреблением 1 мкМ кислорода, равного 22,4 мкг) и выражали в ед./мг а.с.б. [Борисова, 1973].

Определение количества меланина подобных пигментов проводили по методу водно-щелочной экстракции из биомассы микромицетов [Лысенко, Лях, 1977]. Количество пигмента определяли весовым методом и выражали в мг/г а.с.б.

Определение количества экзополисахаридов. проводили в культуральной жидкости, используя для их осаждения этанол [Егоров, 1976]. Получаемый осадок осаждали центрифугированием, высушивали при 120оС и взвешивали.

Количество экзополисахаридов выражали в мг/г а.с.б.

2.3. Выделение микроорганизмов - деструкторов продуктов гидролиза иприта из почвенных образцов Микроорганизмы–деструкторы продуктов гидролиза иприта (ПГИ) выделяли из почвенных компостов. Для приготовления почвенных компостов 20-25г воздушно-сухой почвы помещали в бюкс, увлажняли (до 60% от полной влагоемкости), добавляли смесь продуктов гидролиза иприта из расчета 0,30 г ХОС/кг почвы, тщательно перемешивали и помещали в термостат с температурой +27±1°С. Периодически компосты увлажняли, перемешивали.

Время инкубации – 20 суток.

Для выделения культур микроорганизмов из почвенных компостов предварительно получали накопительные культуры. Для этого образцы почвенных компостов вносили на кончике скальпеля в колбы Эрленмейера объемом 250 мл со стерильной жидкой средой № 1, следующего состава (г/л):

(NH4)2SO4 – 6,0; KH2PO4 – 5,0; K2HPO4 – 5,0; MgSO4 – 0,2; содержащую смесь ПГИ в качестве единственного источника углерода (0,78 ± 0,04 г/л ХОС и 7,0 ± 0,2 г/л ТДГ), рН 7,2–7,4. Раствор смеси ПГИ предварительно стерилизовали фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, затем вводили в среду с соблюдением мер асептики одновременно с посевным материалом. Культивирование проводили в колбах емкостью 250 мл с 50 мл питательной среды на роторной качалке при 230 об./мин и температуре +28±1C. Через 7 суток производили пересев – пассаж (5% об.) в колбы со свежей средой того же состава. О наличии прироста биомассы в каждом пассаже судили по изменению рН и по данным нефелометрического анализа (КФК-2, = 540 нм). Выделение чистых культур бактерий (толерантных к продуктам гидролиза иприта) из накопительных культур (после 4-ого пассажа) проводили методом Коха на плотной питательной среде №1а следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 – 4,0; KH2PO4 – 1,5; K2HPO4 – 1,5; MgSO4 – 0,2; с добавлением (г/л) глюкозы – 5,0; дрожжевого экстракта – 2,0; смеси ПГИ (0, ± 0,006 г/л ХОС ; 0,72 ± 0,04 г/л ТДГ); агара – 20.

Способность отобранных культур осуществлять деструкцию ПГИ определяли двумя методами:

1. по росту на твердой среде №1а с добавлением (г/л): ТДГ– 2,0; CaCO3 – 2,5; агара – 20; рН 7,2–7,4. Контролируемые показатели – наличие роста и растворение CaCO3, что свидетельствует об образовании кислых продуктов деструкции тиодигликоля.

2. по росту в глубинных условиях в колбах Эрленмейера объемом 250 мл со стерильной жидкой средой №1 с добавлением СаСО3 – 10 г/л и содержащей смесь ПГИ, в качестве единственного источника углерода (0,78 ± 0,04 г/л ХОС и 7,0 ± 0,2 г/л ТДГ). Объем среды в колбе – 50 мл, рН – 6,8 – 7,2. Растворы ПГИ, стерилизовали отдельно и вносили в среду как описано выше, одновременно с засевом колб исследуемой бактериальной культурой. Культивирование проводили в тех же условиях.

Прирост биомассы определяли нефелометрически (КФК-2, = 540 нм) и весовым методом; рН культуральной жидкости измеряли потенциометрически (рНметр-673М); интенсивность аэрации сульфитным методом [Егоров, 1976], на качалке.

На основе полученных данных отобрали наиболее активную культурудеструктора ПГИ для проведения дальнейших исследований.

2.4. Изучение морфолого-культуральных и физиологобиохимических признаков выделенной общепринятым методам [Егоров, 1983].

В качестве физиолого-биохимических признаков изучали способность культуры проявлять ферментативную активность в отношении различных субстратов, используя среду Хью-Лейферсона [Hugh, Leifson, 1953] следующего состава (% масс.): пептон – 0,2 г; NaCl – 0,5; K2HPO4 – 0,03; агарагар – 0,3; бромтимоловый синий (водорастворимый) – 0,003; углеводы – 1; рН – 6,8 – 7,2.

Образование индола определяли по качественной реакции с реактивом Эрлиха [Егоров, 1983], образование сероводорода по почернению индикаторной бумаги (пропитанной насыщенным раствором уксуснокислого свинца) [Егоров, 1983].

Способность культуры к усвоению азота в аммиачной форме изучали по наличию роста на агаризованной синтетической среде следующего состава (г/л): глюкоза – 3,0; NH4NO3 – 0,3; K2HPO4 – 0,1; KH2PO4 – 0,1; MgSO4 – 0,05;

NaCl – 0,05; CaCO3 – 0,5; FeSO4 – следы; агар-агар – 15; рН 6,8 – 7,2 [Егоров, 1983].

восстанавливать нитраты до нитритов определяли по выделению газа на мясопептонном бульоне, содержащем 0,5% KNO3 и 0,1% глицерина [Sneath, Collins, 1974].

Для обнаружения оксидазной активности использовали 1% раствор солянокислого диметилпарафенилендиамида [Kovacz, 1956]. Каталазную активность выявляли с применением 10% раствора перекиси водорода [Егоров, 1983].

2.5. Токсикологическая оценка выделенной С наиболее активным штаммом-деструктором ПГИ проведены токсикологические исследования с целью изучения его безопасности для теплокровных животных. Оценку безопасности штамма проводили на базе виварного комплекса НИЦ ТБП (Московская область, г. Серпухов), на лабораторных линиях беспородных белых мышей массой 16-18г. и белых крыс живой массой 160-180г. по общепринятым методикам [Лабинская и др., 2004].

Для определения среднесмертельной дозы LD50 была приготовлена суспензия микроорганизмов, которая содержала 106-1010 микробных клеток в мл. Полученной суспензией были заражены белые мыши и белые крысы.

Использовали два способа заражения: внутрибрюшинно и через пищеварительный тракт. При внутрибрюшинном заражении доза составила 106клеток на одно животное, при заражении через пищеварительный тракт клеток на одно животное. Контрольным группам животных вводили по 1 мл физиологического раствора той же партии, что использовали для смыва микроорганизма с питательной среды. В каждой подопытной и контрольной группах было по 6 животных. Наблюдения проводили в течение 30 дней с момента заражения.

Для определения токсичности суспензия штамма в концентрации 108- клеток в мл была прогрета при 70°С в течении 30 минут на водяной бане и внутрибрюшинно введена белым мышам. В группе было 6 животных, срок наблюдения за которыми составлял 5 дней.

Определение токсигенности, т.е. способности штамма продуцировать токсины и выделять их в окружающую среду, фильтрат бульонной культуры изучаемого штамма, в объеме 0,25-1,50 мл, вводили белым мышам внутрибрюшинно и через пищеварительный тракт. Контрольным животным вводили чистую питательную среду. В каждой группе было по 6 животных.

Учет токсигенности проводили через 24 часа.

Определение диссеминации во внутренних органах экспериментальных животных [Лабинская и др., 2004] проводили по истечению 30-дневного срока наблюдения над крысами и мышами, зараженными живой культурой микроорганизма. Животных умерщвляли методом цервикальной дислокации, а из их внутренних органов (легкие, сердце, печень, почка, селезенка) делали высевы на селективную питательную среду методом отпечатков. За инкубируемыми посевами вели наблюдение в течение 7 дней, отмечая наличие или отсутствие роста бактерий.

2.6. Хранение и культивирование бактерий, методы контроля за процессом культивирования Культуру-деструктор хранили на твердой питательной среде №1а с добавлением (г/л): глюкозы – 5,0; дрожжевого экстракта – 2,0; смеси ПГИ 0, ± 0,001 г/л ХОС (0,14 ± 0,01 г/л ТДГ); агара - 20; рН - 7,0. Хранение производили при 4С, частота пересевов - 1 раз в месяц.

Выращивание в глубинных условиях проводили в колбах на среде №1 при +28±1С на роторной качалке (n=230 об/мин) при различных значениях рН - от 6,0 до 9,0. В качестве единственного источника углерода в питательную среду вносили смесь ПГИ (от 0,15 до 2,70 г/л ХОС, содержащую соответственно от 1,2 до 24,4 г/л ТДГ). Растворы ПГИ, стерилизовали фильтрованием и вносили с соблюдением методов асептики в ферментационную среду одновременно с посевным материалом. В качестве посевного материала использовали суспензию клеток, выращенных при 28С в течение 48-72 часов на агаризованной среде № 1. Количество посевного материала, вносимого в ферментационную среду, составляло 10% от объема среды, с тем расчетом, чтобы оптическая плотность ферментационной среды после засева составляла 0,4±0,03, при длине волны 540 нм.

В процессе и в конце культивирования контролировали уровень рН.

Заданный уровень рН (6,0-9,0) поддерживали стерильным раствором 1,0 N NaOH.

Концентрацию биомассы определяли нефелометрически (КФК-2, длина волны 540 нм). В вариантах, содержащих СаСО3, при определении биомассы мел предварительно растворяли 20%-ным раствором HCl.

2.7. Определение тиодигликоля, хлорорганических соединений, продуктов трансформации продуктов Модельную смесь ПГИ получали нагреванием водной смеси 0,65 М ТДГ (ICN 103039 RT, 99%, плотность 1,18) и 0,65 M HCl при 90°C в течение 8 часов.

Полученная смесь ПГИ содержит 7,5 ± 0,03 г/л ХОС; 67,8 ± 0,2 г/л ТДГ.

Количественное определение ТДГ в растворах проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе "Hewlett - Packard" HP1090 в режиме обращеннофазовой хроматографии при следующих условиях: температура - 25°C, колонка Luna фирмы Phenomenex, скорость потока – 1 мл/мин., детекция – 215 нм, элюент – 5 %-ый ацетонитрил, объем пробы - 10 мкл.

Для идентификации и количественного определения промежуточных продуктов деструкции ТДГ использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (хроматограф НР-1090 с диодноматричным УФдетектором и компьютерной системой управления и сбора данных).

Определение тиогликолевой (ТГК) и тиодигликолевой (ТДГК) кислот и ацетатов проводили с использованием колонки Vydac (USA) 218TP54 (RP-18, 4,6x250мм). Рабочий режим – изократический. В качестве рабочего буфера использовали 20 мМ тетрабутиламмоний, забуференный 20 мМ фосфатом натрия, рН 6,35, содержащий в случаях анализа ТГК и ТДГК 15% (объемных) ацетонитрила, при анализе ацетатов – 5% (объемных) ацетонитрила.

Определение ТДГК проводили при 20°С, скорость потока составляла мл/мин. Анализ ТДК и ацетата проводили при 50°С и скорости потока 1, мл/мин.

Определение меркаптоэтанола (МЭ) после его модификации по методу Элмана [Ellman, 1959] проводили на том же приборе с использованием колонки Waters (C-18, -Pack, 3,9х150мм). Рабочий режим – градиентный. Рабочие буферы: А – 0,1% трифторуксусная кислота, В – 100% ацетонитрил. При анализе использовали линейный градиент от 20% В до 30% В за 8,5 мин, общее время анализа 12 мин., поток 1,5 мл/мин, температура 20°С.

Эти исследования выполнены в ГосНИИОЧБ (г. Санкт-Петербург) с участием ст. научного сотрудника Протасова Е.А.

Содержание хлорорганических соединений – продуктов гидролиза иприта определяли спектрофотометрическим методом на КФК-2, длине волны 420нм (кювета 2см), с последующим использованием калибровочной кривой [Франке, 1973; Issa et. аl., 1975]. Для построения калибровочной кривой использовали исходный раствор иприта в гексане с концентрацией 10,0 ± 1,0 г/л, из которого готовили ряд стандартных растворов, с диапазоном концентраций 0,050 – 1,0 г/л. К 1 мл из каждой пробы добавляли 3 мл «синего» реактива (1 г тимолфталеина растворенного в 200 мл этанола с добавлением 18 мл 3%-ого раствора KOH). Полученную смесь кипятили с обратным холодильником на водяной бане в течение 30 минут. После остывания проб к каждой из них приливали по несколько капель уксусной кислоты, после чего объем пробы доводили этанолом до 10 мл. Растворы окрашивались в желтый цвет, интенсивность которого и определяли по оптической плотности.

Для определения способности бактерий осуществлять деструкцию ПГИ в почве использовали серую лесную почву (Московская обл., г. Серпухов).

Воздушно-сухую почву просеивали через сито с диаметром отверстий – 2 мм.

Необходимые навески воздушно-сухой почвы помещали в пластмассовые емкости объемом 1000 мл, увлажняли, обрабатывали раствором ПГИ, создавая концентрацию 1,0 г ХОС/кг а.с.почвы. Опытные образцы инокулировали суспензией бактерии-деструктора, в количестве – 108 – 109 кл./г а.с.почвы.

Для определения содержания тиодигликоля и хлорорганических соединений в почве использовали почвенную вытяжку, которую готовили из 5 г почвы, ее помещали в 10 мл воды и встряхивали в течение 15 мин. Полученную суспензию отфильтровывали и в фильтрате определяли содержание ХОС и ТДГ по методикам, описанным в разделе 2.6.

Агрохимические показатели почв определяли по стандартным методикам [Аринушкина, 1970].

Определение фитотоксичности почв. Для определения острой токсичности исследуемых почвенных образцов был выбран метод фитотестирования [Звягинцев, 1987a; Андреюк, 1981]. Сущность метода заключается в определении влияния на нормальное развитие и рост растений химикатов различной концентрации, добавленных к испытуемой почве. Метод соответствует международному стандарту ИСО 11269-2 [Фомин и др., 2003].

В качестве тест-объекта использовали однодольное растение семейства злаков – овес яровой (Hordeum vulgare L.) Используемая методика рекомендует выращивание растений на образцах почв в чашках Петри в условиях, обеспечивающих нормальный рост выбранного в качестве тест – объекта вида растений: при комнатной температуре воздуха (18-22С), влажности – 60 ± 5%, уровень освещенности не менее 4000 ЛК в течение 10-16 часов за сутки. Весь тест-материал был предварительно откалиброван, т.е. отобраны семена определенной длины (не менее 13 мм) и массы (не менее 40 мг). Для проведения фитотестирования почвенные образцы после инкубирования в течение 10, 14 и 30 недель переносили в чашки Петри, располагая ровным слоем, толщиной 0,5 см и раскладывали равноудаленно друг от друга по семян овса в каждую чашку. В течение последующих 4-х суток поддерживали достаточное увлажнение почвенных образцов, смачивая их при необходимости водой. Для оценки уровня всхожести семян определяли количество семян с наличием проростка от общего количества семян. Для оценки уровня роста и развития растений измеряли длину их корня и колеоптиля. В качестве опытного варианта использовали образцы почв загрязненные 1 г ХОС/ кг а.с.п.(7,7 г ТДГ/кг а.с.п.) и инокульрованные клетками Pseudomonas sp. Y-13, в качестве контроля использовали не загрязненные и загрязненные 1 г ХОС/ кг а.с.п. (7,7 г ТДГ/кг а.с.п.) образцы почв.

Cодержание влаги и сухого вещества в пробах почв определяли при высушивании пробы до постоянной массы при 105±5С и определении разницы в массе почвы до и после высушивания [Фомин и др., 2003].

2.9. Математическая обработка результатов Математическую обработку результатов исследований проводили в соответствии с методиками Ашмарина [Ашмарин и др., 1974] и Максимова [Максимов, 1980]. Данные, представленные в экспериментальной части, являются средними арифметическими значениями результатов, полученных в трех-четырех опытах с трех-пятикратными повторностями каждого варианта.

В качестве меры разброса значений от средней величины применяли среднее квадратичное отклонение среднего арифметического по формуле:

(x xi ) - отклонение каждого значения от среднеарифметического (x x ) - сумма всех квадратов отклонений (n - 1) - число степеней свободы.

Ошибку среднего арифметического Sx определяли по формуле:

контрольных условиях величинами проводили с помощью критерия Стьюдента по формуле:

Рассчитанный на основании экспериментальных данных t-критерий сравнивали с табличными значениями, учитывая число степеней свободы.

Уровень достоверности полученных данных не ниже 95%, что является допустимым для исследования биологических систем.

Влияние продуктов гидролиза иприта на рост и физиологобиохимические признаки микроорганизмов Как показано ранее [Медведева и др., 2000], продукты гидролиза иприта оказывают токсическое действие на микробиоценоз в почвах.

Загрязнение почв ТДГ и смесью ПГИ приводит к формированию, практически новых микробных сообществ, характерной чертой которых является повышенный уровень показателя доминирования, понижение уровней сходства и видового разнообразия, что свидетельствует о снижении биоустойчивости системы в целом. На изменение видового разнообразия микробного состава в почвах влияет различный уровень чувствительности отдельных групп микроорганизмов к этим ксенобиотикам.

К настоящему времени решение проблемы очистки природных экосистем – почв, водоемов от этих загрязнителей затруднено из-за отсутствия соответствующих экологически безопасных технологий. В литературе практически отсутствует информация о характере и механизмах действия ПГИ, как на природные микробиоценозы в целом, так и на отдельные компоненты микробных сообществ.

В настоящей главе представлены результаты сравнительного исследования степени чувствительности различных микроорганизмов – бактерий, актиномицетов, мицелиальных грибов и дрожжей к смеси ПГИ и основному из них – ТДГ, а также влияния этих субстратов на морфологические и физиологоиз основных групп почвенных биохимические свойства одной микроорганизмов – мицелиальных грибов.

3.1. Рост актиномицетов, бактерий, микромицетов и дрожжей на средах, содержащих продукты гидролиза иприта Список культур микроорганизмов, использованных в работе, представлен в таблице 1 (раздел 2.1.), среди них 18 культур мицелиальных грибов из родов:

Alternaria (2), Aspergillus (5), Botrytis (1), Fusarium (1), Helmintosporium (2), Mucor (2), Penicillium (3), Trichoderma (1), Sсopulariopsis (1) и 12 культур дрожжей, следующих родов: Candida (2), Cryptococcus (2), Rhodotorula (1), Trichosporon (1), Lipomyces (1), Torula (1), Saccharomyces (2), Sporobolomyces (2).

Из актиномицетов в качестве тест-культур выбраны 10, относящиеся к родам: Micromonospora (2), Nocardia (2), Streptomyces (4), Streptosporangium (2);

из бактерий – 12 культур из родов: Artrobacter (1), Bacillus (3), Brevibacterium (1), Escherichia (1), Micrococcus (1), Mycobacterium (1), Pseudomonas (2), Staphylococcus (2).

агаризованной среде Чапека с глюкозой, дрожжи на среде Сабуро, а бактерии на двух агаризированных средах: Чапека с глюкозой (рН 7) и МПА с глюкозой.

В состав сред вносили ТДГ в концентрациях от 5 до 100 г/л, или смесь ПГИ – от 0,6 г/л ХОС; 0,5 г/л ТДГ до 6,6 г/л ХОС; 55 г/л ТДГ.

Продолжительность культивирования для микромицетов и актиномицетов составляла 14 суток, а для бактерий и дрожжей 4-7 суток, соответственно.

Уровень чувствительности микроорганизмов к ПГИ оценивали по наличию или отсутствию их роста на соответствующих средах.

Как показали результаты, на средах, содержащих ТДГ и смесь ПГИ, подавление роста наблюдается у всех исследованных микроорганизмов.

Однако, как и следовало ожидать, степень чувствительности к этим веществам зависит от родовой, а в некоторых случаях и видовой их принадлежности, а также от концентрации ТДГ и смеси ПГИ (табл. 2; рис. 3,4).

Показатели среднесмертельной LD50 и биоциднойLD концентрации ТДГ и смеси ПГИ для микроорганизмов.

Arthrobacter globiformis (Cohn.) Connet Dimmick Bacillus megaterium De Bary Bacillus mycoides - Bacillus subtilis (Ehrenberg) Brevibacterium flavum Escherichia coli АТСС Micrococcus lysodukticus Mycobacterium lacticola Lehmann et Neumann - Pseudomonas aeruginosa (Schroeter) Migula - Pseudomonas fluorescens (Trevisan) Migula - Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus citereus Micromonospora echinospora Micromonospora sp.

Nocardia dossonsillei Nocardia baciliensis Streptomyces roseviolaceus Sveshnicova - Streptomyces globisporus Krassilnicov - Streptomyces violancens Preobrazhenskaya - Streptomyces flaveolus (Waksman) Krassilnicov - Streptosporangium sp.

Streptosporangium sp.

Candida utilis П- Candida humicola - Cryptococcus flavus ВКМ-УТДГ 20 ТДГ Cryptococcus humicola (Daszewska 1912) Golubev Rhodotorula VI Torula roseum Trichosporon cutaneum Нем.2(70) Lipomyces lipotereus Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae ВКМ-4- Sporobolomyces paraposeus ВКМ- Sporobolomyces pararoseus T Alternaria consortiale Alternaria radicina Aspergillus flavus Link Aspergillus fumigatus Aspergillus niger F - Aspergillus terreus Thom - Aspergillus versicolor (Vuillemin) Tiraboschi F - Botritis cinerea Fusarium oxysporum Helmintosporium sativum (Bipolaris sorokiniana) Helmintosporium inaeguale (Curvularia inaegualis) Penicillum funiculosum Thom Penicillum ochrochloron Penicillum stoloniferum Trichoderma viride Persoon F Scopulatoriopsis brevicaulis (Saccarda) Bainier – 85c.

использованные культуры, однако у представителей родов Alternaria, Fusarium, Trichoderma, Scopulariopsis, размер колоний, определяемый методом Эббота [Методические указания, 1985], уменьшался на 25-30%.

При увеличении концентрации ТДГ до 20 г/л размер колоний на 30-40% Botrytis, Helmintosporium, Mucor, у которых признаки подавления роста отсутствуют.

отсутствует на среде с различным содержанием ТДГ. Контроль – исходное число тест-культур, 100%.

Концентрация ТДГ в среде: 1 – 40 г/л; 2 – 50 г/л; 3 – 60 г/л; 4 – 130 г/л; 5 – 150 г/л; 6 – 170 г/л.

концентрациях 40-60 г/л. Рост культур мицелиальных грибов, отмеченных выше как наиболее чувствительные, отсутствует уже при концентрации ТДГ в 40 г/л, в то время как у остальных культур полное подавление роста происходит только при 60 г/л ТДГ.

Значительно большую чувствительность микромицеты проявляют к смеси ПГИ. В силу повышенной токсичности ХОС шаг варьирования его концентраций в среде был меньше, чем ТДГ и составлял около 0,6 г/л по ХОС.

Испытаны следующие концентрации ПГИ: 1,2 г/л ХОС и 10 г/л ТДГ; 1,8 г/л ХОС и 15 г/л ТДГ; 2,4 г/л ХОС и 20 г/л ТДГ; 3,0 г/л ХОС и 25 г/л ТДГ; 3,6 г/л ХОС и 30 г/л ТДГ; 4,2 г/л ХОС и 35 г/л ТДГ.

мицелиальных грибов рост отсутствует уже при концентрации смеси ПГИ 3, г/л ХОС; 30 г/л ТДГ, подавление роста у всех культур наблюдали при 4,2 г/л ХОС; 35 г/л ТДГ (рис.4.).

Интересно отметить, что грибы родов Botrytis и Helmintosporium, толерантных к ТДГ, не растут на среде, содержащей смесь ПГИ в самой низкой концентрации 1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ.

Дрожжи. По своей реакции на присутствие в среде ТДГ и смеси ПГИ, в целом, сходны с мицелиальными грибами (рис.3, 4), однако и в том и в другом вариантах дрожжи проявляют большую устойчивость.

Как следует из данных представленных на рисунках 3, 4 самыми чувствительными к ТДГ и смеси ПГИ являются актиномицеты. Рост всех исследованных актиномицетов отсутствовал на среде с 50 г/л ТДГ и при самой низкой из испытанных концентраций смеси ПГИ - 1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ.

Визуальные наблюдения показали, что на средах с ТДГ и смесью ПГИ появление колоний микромицетов, актиномицетов и дрожжей задерживалось на 2 - 3 суток. В этих условиях, в отличие от контрольных, вырастали более мелкие, сильно приподнятые, плотные колонии. У актиномицетов и микромицетов отмечено слабое развитие воздушного мицелия и в значительной степени подавление процесса спорообразования.

Количество невыросших тест-культур, Рис. 4. Количество тест-культур микроорганизмов, рост которых отсутствует на среде с различным содержанием смеси ПГИ. Контроль – исходное число тесткультур, 100%.

Концентрации смеси ПГИ: 1 - 2,4 г/л ХОС; 20 г/л ТДГ; 2 - 3,6 г/л ХОС; г/л ТДГ; 3 - 4,2 г/л ХОС; 35 г/л ТДГ; 4 – 5,4 г/л ХОС; 45 г/л ТДГ; 5 – 6,0 г/л ХОС; 50 г/л ТДГ.

Самыми устойчивыми микроорганизмами к ТДГ и смеси ПГИ являются Pseudomonas, Staphylococcus.

Полное подавление всех использованных в работе бактериальных культур (12 культур) на среде с ТДГ наблюдается при 170 г/л ТДГ, а смеси ПГИ – 6, г/л ХОС и 50 г/л ТДГ. Следует отметить, что на богатой питательной среде – концентраций и ТДГ и смеси ПГИ.

Таким образом, биоцидные концентрации ТДГ и смеси ПГИ для бактерий в 2,6 – 1,4 раза, соответственно, выше, чем для других микроорганизмов.

3.2. Действие продуктов гидролиза иприта на некоторые морфологические и физиолого-биохимические свойства Мицелиальные грибы являются важнейшим и неотъемлемым компонентом биоценоза в целом. Именно грибам, отведена ведущая роль в разложении растительного опада, минерализации органических веществ в природе, в том числе таких труднодоступных для других микроорганизмов, как клетчатка, лигнин, пектиновые вещества и многое другое [Мирчинк, 1976].

Сравнительно высокая чувствительность грибов к ПГИ позволяет предположить, что загрязнение ими почв приводит к нарушению жизнедеятельности, прежде всего этой группы микроорганизмов со всеми вытекающими из этого негативными последствиями.

Эти позиции и определили выбор мицелиальных грибов, как объекта для начала изучения всего многообразия воздействий, которые могут оказать ПГИ на микроорганизмы.

3.2.1. Влияние продуктов гидролиза иприта на морфологические Изучение морфологии мицелиальных грибов, выращенных на среде с ПГИ проводили с использованием 2-х культур - Aspergillus terreus и Penicillium ochrochloron. C помощью электронной микроскопии у обеих культур выявлены существенные и очень сходные изменения в характере роста, взаимном расположении гиф, размеров и формы клеток. Показано, что на среде, содержащей смесь ПГИ в концентрации 1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ гифы грибов ( суток культивирования) утолщаются, наблюдается плотное их прилегание друг к другу с образованием плотных тяжей (рис. 5, 6). Плотность прилегания настолько велика, что изменяется форма клеток – создается впечатление, что наружные слои клеточных стенок сливаются. Кроме того, в опытных клетках увеличивается количество митохондрий (рис.8).

Рис. 5. Характер агрегации гиф Penicillium ochrochloron, при росте на агаризованной среде Чапека, содержащей смесь ПГИ (1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ) и без нее (контроль). Увеличение X 600.

а – контроль (среда без смеси ПГИ); б – опыт (среда со смесью ПГИ).

Рис. 6. Характер агрегации гиф Aspergillus terreus, при росте на агаризованной среде Чапека, содержащей смесь ПГИ (1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ) и без нее (контроль). Увеличение X 600.

а – контроль (среда без смеси ПГИ); б – опыт (среда со смесью ПГИ).

Рис. 7. Форма клеток Penicillium ochrochloron, при росте на агаризованной среде Чапека, содержащей смесь ПГИ (1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ) и без нее (контроль). Увеличение X 30 000.

а – контроль (среда без смеси ПГИ); б – опыт (среда со смесью ПГИ).

При изучении ультратонких срезов клеток P. ochrochloron (3 суточная культура) был выявлен интересный факт, а именно – в цитоплазме клеток, выросших на среде со смесью ПГИ содержится значительно больше митохондрий, чем в контрольных (рис.8).

Рис. 8. Ультратонкая структура клеток Penicillium ochrochloron, при росте на агаризованной среде Чапека, содержащей смесь ПГИ (1,2 г/л ХОС; 10 г/л ТДГ) и без нее (контроль). Увеличение X 45 000.

а – контроль (среда без смеси ПГИ); б – опыт (среда со смесью ПГИ).

неблагоприятных факторов, по мнению многих авторов, может быть связано со многими жизненноважными функциями клеток, в том числе с их способностью контролировать процесс адаптации и множественной устойчивости к биоцидам [Мацкевич, 1981] за счет усиленного образования энергии, необходимой для репарации внутриклеточных повреждений [Рапопорт, Вентыня, 1987].

3.2.2. Изменение клеточной проницаемости и жирнокислотного состава липидов микромицетов под действием Первичной мишенью негативного действия многих химических веществ является цитоплазматическая мембрана [Овчинников и др., 1974]. Изменение проницаемости клеточных мембран одно из следствий адаптации микроорганизмов к токсическому воздействию [Карасевич, 1982].

Возникающие при этом нарушения ее структуры или функций приводят к различным изменениям в процессах жизнедеятельности микроорганизмов или к их гибели.

Результаты исследования на клеточную проницаемость бактерий, дрожжей и микромицетов показали, что данные токсиканты способствуют увеличению проницаемости у всех культур (табл.3).

Сохраняется тенденция более выраженного действия смеси ПГИ на увеличение проницаемости клеточных оболочек по сравнению с действием чистого ТДГ. Очевидно, механизм нарушения проницаемости клеточных оболочек имеет одинаковую природу у культур разных видов.

Аналогичный характер воздействия ТДГ и смеси ПГИ на мембраны наблюдается у дрожжей (родов Cryptococcus и Candida) (табл.3).

Влияние ТДГ и смеси ПГИ на клеточную проницаемость Мембранотропное действие ТДГ и смеси ПГИ подтверждается и данными, полученными и в других экспериментах с дрожжевыми культурами (рис.9).

Как следует из результатов, представленных на рисунке 9, под действием исследуемых субстратов из клеток усиливается «утечка» ионов калия, аминокислот и белков.

Известно, что одной из первых реакций организма на негативное воздействие факторов внешней среды, являются изменения в составе липидов мембран [Poff et al., 1984; Рубан, 1977]. Такие изменения заключаются в увеличении содержания ненасыщенных липидов или уменьшении средней длины ацильной цепи, что способствует уменьшению плотности упаковки липидов в мембране и поддержанию текучести мембран. Это позволяет клетке выжить в экстремальных условиях [Геннис, 1997; Чиркова, 1997; DeLong, Yayanos, 1985; Rock, Cronan, 1985, Cossins, 1986].

Наблюдаемые в клетках микроорганизмов взаимопревращения жирных кислот связывают с их регулирующей ролью в процессах транспорта веществ [Hsu, Fox, 1970; Mortimer, Niehaus, 1972], изменением клеточной проницаемости [Рубан, 1977; Богач, 1981; Cronan, Vagelos, 1972; Lauwers, Heinen, 1973; Cronan, Gelmann, 1973], функционирование мембраносвязанных ферментов [Богач, 1981; Болдырев, 2001] и др.

С использованием культуры P. ochrochloron нами проведены сравнительные исследования жирнокислотного состава липидов мицелия, полученного при культивировании микромицета в среде Чапека содержащей смесь ПГИ и без нее (контроль).

Рис. 9. Влияние ТДГ и смеси ПГИ на уровень «утечки» белка, аминокислот и ионов калия из клеток Candida humicola-6 (а) и Cryptococcus humicolus ВКПГУ 675 (б). Контроль 100%.

1 – прирост биомассы; 2 – количество белка; 3 – количество аминокислот;

4 – количество ионов калия Влияние ТДГ и смеси ПГИ на содержание доминирующих жирных кислот в общих липидах гриба P. ochrochloron Из результатов, представленных в таблице 4, следует, что под действием ТДГ и смеси ПГИ у P. ochrochloron происходит изменение жирнокислотного состава липидов. Степень ненасыщенности жирных кислот в липидах (отношение суммы ненасыщенных к сумме насыщенных кислот [Фунтикова, 1992; Фунтикова, 1998] опытных вариантов выше, чем в липидах контрольной биомассы. По данным ряда авторов [Дедюхина и др., 1988, Фунтикова и др., 1998] наблюдаемое изменение в жирнокислотном составе липидов клеток неблагоприятным воздействиям исследуемых веществ.

3.2.3. Влияние продуктов гидролиза иприта на физиологобиохимические признаки микромицетов жирнокислотном составе липидов будут влиять и на функциональные свойства мембранных белков, в частности ферментов.

В настоящем разделе работы представлены результаты изучения действия ТДГ и смеси ПГИ на активность у микромицетов таких ферментов как:

дегидрогеназы, амилазы, целлюлазы, каталазы, пероксидазы.

Дегидрогеназы – ферменты, катализирующие отщепление водорода от органических веществ, имеются у всех организмов и играют большую роль в функционировании цикла Кребса, гликолиза и пентофосфатного цикла [Билай, 1982].

Эксперименты, проведенные с культурами Penicillium ochrochloron и Aspergillus terreus, показали, что суммарная активность дегидрогеназ, а также отдельных дегидрогеназ цикла трикарбоновых кислот значительно возрастает под действием ТДГ и смеси ПГИ.

Под действием ТДГ и смеси ПГИ активность всех дегидрогеназ Penicillium ochrochloron возрастает 2-10 и 3-3,5 раза соответственно, по сравнению с таковой в контрольных условиях (рис.10).

Аналогичные результаты получены в вариантах с использованием Aspergillus terreus.

Столь значительное повышение дегидрогеназной активности свидетельствует о существенных изменениях в метаболизме мицелиальных грибов и коррелирует с увеличением количества митохондрий в клетках (рис.8, стр. 58).

Каталаза и глюкозооксидаза. Значительный интерес представляет вопрос о влиянии ТДГ и ПГИ на активность таких оксидоредуктаз, как каталаза и глюкозооксидаза. Известно, что под действием многих токсических веществ в клетках происходит накопление активных форм кислорода, которые могут повреждать практически все их компоненты, включая белки, ферменты, ДНК, мембранные структуры [Shigenaga et al., 1994; Cutler, 1999].

дегидрогеназ, % к контролю Рис.10. Влияние ТДГ (а) и смеси ПГИ (б) на дегидрогеназную активность Penicillium ochrochloron. Контроль 100%.

нейтрализующих негативное действие свободных радикалов [Козлов, 1985].

Важнейшими антиоксидантами ферментной группы у микромицетов являются ферменты из класса оксидоредуктаз и, прежде всего, каталаза и глюкозооксидаза [Еремин и др., 2000; Семашко и др., 2003; Павловская и др., 2004].

Глюкозооксидаза катализирует окисление -D-глюкозы с образованием глюконовой кислоты и перекиси водорода, используя молекулярный кислород в качестве акцептора электронов [Кретович, 1986], который, как известно, является предшественником образования свободных радикалов.

Каталаза катализирует реакцию расщепления перекиси водорода и является важнейшим компонентом антиоксидантной системы клеток [Максименко, 1993].

Результаты действия ТДГ и смеси ПГИ на эти оксидоредуктазы у мицелиальных грибов представлены в таблице 5.