ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной

медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина»

На правах рукописи

МОСЯГИН ВЛАДИМИР ВЛАДИМИРОВИЧ

Влияние возраста и физиологического состояния на

активность ферментных систем клеток, тканей

и органов животных

03.03.01 – физиология

03.01.04 биохимия Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Максимов В.И., доктор биологических наук, профессор Фурман Ю.В.

Москва-2011 Содержание …..

Общая характеристика работы

……………………………………….

….. Обзор данных литературы……………………………………………..

1. Физиолого-биохимическое значение ферментных систем клеток тканей и органов ………………………….……………………………… ...... 1.1. Роль транспортных ферментных систем, локализованных в мембранные структуры клеток тканей и органов организма животных …... 1.2. Механизмы транспорта питательных веществ в кишечнике……….. …... 1.3. Транспортные АТФазы и их активность…………………………….. ….. 1.3.1. Характеристика Na+, К +-АТФазы……………………………... ….. 1.2.2. Биологическая роль Са2+-АТФазы……………………………... ….. 1.2.3. Значение и биологическая роль HCO3--АТФазы……………... ….. 1.3.4. Особенности функционирования АТФаз птиц……………… …... 1.3.5. Влияние различных факторов на транспортные процессы и активность АТФаз …………………………………………………… ….. ….. 2. Собственные исследования…………………………………………… ….. 2.1. Материалы и методы………………………………………………...

….. 2.2. Результаты собственных исследований…………………………...

2.2.1. Транспорт веществ и АТФазная активность эритроцитов, ….. тканей и органов птиц…

….. 2.2.2. Активность АТФаз эритроцитов свиней……………..................

....... 2.2.3. Активность АТФаз эритроцитов крупного рогатого скота......

….. Заключение………………………………………………………...............

….. Выводы……………………………………………………………………...

….. Практические предложения……………………………………………..

….. Список литературы………………………………………………………....... Приложение

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АТФ аденозинтрифосфорная кислота АТФаза аденозинтрифосфатаза Д дальтон кДа килодальтон мг миллиграмм мкг микрограмм мкмоль микромоль ммоль миллимоль нм нанометр Фн (Pi) фосфор неорганический ЦТК цикл трикарбоновых кислот F1 фактор Рэкера * - P0,05) и была детерминирована ионами HCO3- на 96% (P0,01).

С целью выяснения степени влияния ионного состава среды инкубации и возраста на активность АТФаз цитоплазматических и ядерных мембран эритроцитов цыплят-бройлеров был проведен двухфакторный дисперсионный анализ (табл. 6). В качестве независимых переменных были определены:

А – возраст цыплят - 10, 20, 30 и 40 суток, Б – ионный состав среды. За нулевую точку отсчета принимали активность Mg2+-АТФазы в контрольной группе.

Коэффициенты детерминации возраста и ионного состава среды инкубации на активность АТФаз, (n=40) Цитоплазматическая мембрана фактора Б (ионный состав) 0,3450* 0,1290* 0,5230* Ядра фактора Б (ионный состав) 0,0004 0,010* 0,8490* В результате исследований были установлены коэффициенты детерминации активности ферментов от независимых факторов. Наибольшее влияние на активность Na+, K+- и Ca2+-АТФаз цитоплазматических мембран и ядер оказывал возраст цыплят. Изменение ионного состава среды оказывало различное влияние на АТФазы, локализованные в цитоплазматической и ядерной мембране. АТФазная активность цитоплазматической мембраны эритроцитов была на 34,5% детерминировали ионами Na+, K+, на 12,9% - ионами Ca2+ и на 52,3% - ионами HCO3-. В то же время ионы Na+, K+ и Ca2+ практически не влияли на АТФазную активность ядер, а анион HCO3- детерминировал ее на 84,9%. Это, по-видимому, связано с отсутствием в ядерных мембранах эритроцитов цыплят-бройлеров Na+,K+- чувствительной АТФазы.

Высокий уровень HCO3--АТФазы ядерных оболочек и цитоплазматических мембран можно объяснить усиленными энергетическими процессами, происходящими в эритроцитах цыплят суточного возраста.

В связи с вышеизложенным, нами в дальнейших исследованиях для определения активности АТФаз был выбран метод Иващенко А.Т. и др.

(1981). Активность Mg2+-АТФазы определяли в 50 ммольл-1 трис-H2S04 буфере (pH 7,4) содержащем 60 ммольл-1 NaCl, 2 ммольл-1 АТФ и 2 ммольл- MgCl2. Активность Na+, K+-АТФазы измеряли в той же среде, заменяя ммольл-1 NaCl на 15 ммольл-1 KCl. Ca2+-АТФазную активность определяли, внося в среду 510-4 мольл-1 CaCl2. Уровень HCO3--АТФазной активности оценивали по приросту неорганического фосфата при замене 30 ммольл- NaCl на 30 ммольл-1 NaHCO3.

Влияние ПКД и сукцината на активность АТФаз цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA»

Активность АТФаз цыплят 10 суточного возраста была существенно ниже, чем у цыплят 20, 30 и 40-суточного возраста, что, по-видимому, связано с возрастными особенностями строения эритроцитов (табл.7).

На величину активности Mg2+-АТФазы оказывали достоверное (P0,05) влияние изучаемые препараты, что подтверждается результатами регрессионного анализа (рис.14-17).

Активность Mg2+-, Na+,K+-, Ca2+- и HCO3--АТФаз (M±) цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров кросса «ISA» (n=640) Mg - 10,390,08*** 10,020,14** 8,710,11*** 9,460, Na,K - 12,080,06*** 11,750,07*** 11,050,09 11,090, Ca - 11,110,16*** 11,000,09*** 10,560,09** 10,230, Mg - 12,610,20*** 12,530,38*** 10,540,11 10,510, Na,K - 15,160,11*** 14,530,12*** 12,690,09*** 12,220, Ca2+- 14,250,13*** 13,930,21*** 12,590,13*** 11,570, HCO3 - 17,270,12*** 17,480,14*** 15,630,12*** 14,910, Mg - 13,390,11*** 12,940,10*** 11,330,15* 10,930, Na,K - 15,870,10*** 15,040,14*** 13,160,12* 13,630, Ca - 15,400,12*** 15,220,11*** 13,190,12*** 12,320, HCO3 - 21,700,13*** 21,310,13*** 17,940,11*** 16,890, Mg - 15,390,13*** 14,890,14*** 11,780,15** 12,740, Na,K - 17,400,17*** 16,880,20*** 13,970,17* 14,510, Ca - 16,400,15*** 16,130,14*** 14,710,18*** 13,530, HCO3 - 27,470,08*** 27,240,19*** 23,370,19* 22,790, *- по сравнению с контрольной группой Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 14. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 15. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 16. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Mg -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 17. Активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Результаты регрессионного анализа возрастной динамики активности Mg2+-АТФазы в зависимости от скармливаемых препаратов показали, что у цыплят опытной группы 1, получавшей ПКД, рост активности Mg2+-АТФазы происходил более интенсивно по сравнению с другими группами, а наименьшие значения он имел в опытной группе 3, получавшей сукцинат.

Уравнения регрессии динамики активности Mg2+-АТФазы:

Двухфакторный дисперсионный анализ влияния возраста и кормовых добавок на активность Mg2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят показал, что она была детерминирована возрастом на 59% (P0,001) и кормовыми добавками на 29% (P0,001).

Активность Na+,K+-АТФазы (рис. 18-21) была достоверно (P0,05) выше во всех опытных группах, по сравнению с активностью Mg2+-АТФазы.

Применение препаратов оказывало существенное влияние на уровень активности Na+,K+-АТФазы. Следует отметить, что разность активности данной АТФазы во всех опытных труппах по сравнению с контролем была достоверной (P0,05).

Активность Na,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 18. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Na,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 19. Активность Na,K -АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Na,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 20. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Активность Na,K -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 21. Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) С возрастом отмечался интенсивный прирост активности этой АТФазы, что подтверждается уравнениями регрессии:

Наибольший прирост ферментативной активности был отмечен в группах опыта 1 и 2, описываемых следующими уравнениями регрессии:

y=10,9619+0,1666x и y=10,5729+0,159x, соответственно, а наименьший - в опытной группе: y=10,4096+0,0924x, что, по-видимому, связано с увеличением активного транспорта под влиянием ПКД и сукцината.

Активность Na+,K+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят-бройлеров этого кросса была детерминирована возрастом на 62,2% (P0,001) и кормовыми добавками на 29,2% (P0,001).

Активность Ca2+-АТФазы с возрастом существенно увеличивалась (рис.22-25) что, вероятно, связано с достоверным увеличением концентрации кальция в сыворотке крови цыплят.

Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 22. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 1, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 23. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 2, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 24. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров опытной группы 3, (n=10, y - активность АТФазы, x - возраст цыплят) Активность Ca -АТФазы, нмоль Фн/мг белка в мин Рис. 25. Активность Ca2+-АТФазы цитоплазматических мембран эритроцитов цыплят бройлеров контрольной группы 4, (n=10, y - активность АТФазы, x возраст цыплят) Ca2+-АТФазы в зависимости от скармливаемых препаратов (табл. 6) показали, что наибольший прирост активности Ca2+-АТФазы с возрастом отмечен в группах опыта 1 и 2, а наименьший в контрольной группе 4:

цыплят-бройлеров этого кросса была детерминирована возрастом на 67,8%