«МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА И ИХ ФАРМАКОТЕРАПИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ СРЕДСТВАМИ ...»

На правах рукописи

РАЗУВАЕВА ЯНИНА ГЕННАДЬЕВНА

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ПОВРЕЖДЕНИЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА

И ИХ ФАРМАКОТЕРАПИЯ РАСТИТЕЛЬНЫМИ СРЕДСТВАМИ

06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных,

патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Благовещенск – 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки «Институт общей и экспериментальной биологии» Сибирского отделения Российской академии наук

Научный консультант:

Кухаренко Наталья Степановна – доктор ветеринарных наук, профессор

Официальные оппоненты:

Хибхенов Лопсондоржо Владимирович – доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Бурятская государственная сельскохозяйственная академия им. В.Р. Филиппова» Министерства сельского хозяйства РФ / кафедра анатомии, гистологии и патоморфологии, заведующий Ламажапова Галина Петровна, доктор биологических наук, ФГБОУ ВПО «Восточно-Сибирский государственный университет технологий и управления» / кафедра биоорганической и пищевой химии, старший преподаватель Ильина Ольга Петровна, доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Иркутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства РФ / факультет биотехнологии и ветеринарной медицины, декан

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Якутская государственная сельскохозяйственная академия» Министерства сельского хозяйства РФ

Защита диссертации состоится «18» декабря 2013 года в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 220.027.02 при ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет» по адресу:

675005, г. Благовещенск, ул. Политехническая, 86.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Дальневосточный государственный аграрный университет»

Автореферат разослан “ ” _2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук О.Л. Самусенко

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Данные эпидемиологических исследований, проводимые Всемирной организацией здравоохранения, и исследования в отдельных странах показывают, что рост темпа жизни, урбанизация и научнотехнический прогресс, а также социально-экономическое напряжение в обществе приводят к увеличению числа заболеваний нервной системы (Атаманов А.А., Менделевич В.Д., 2011; Вельтищев Д.Ю., 2011; Weisberg R.B., 2009; Provencher M.D., 2013), среди которых, с отчетливой тенденцией к увеличению, преобладают синдром хронической усталости, тревожные расстройства и когнитивные нарушения (Воронина Т.А., 2009; Захаров В.В., 2012;

Luyckx K. et al., 2011; Durham R.C. et al., 2012). Основными факторами развития как тревожных расстройств, так и когнитивных нарушений являются наследственная предрасположенность, стрессы, расстройства мозгового кровообращения различного генеза, использование нейропсихотропных средств, а также соматические и эндокринные заболевания (Вельтищев Д.Ю., 2011;

Захаров В.В., Вахнина Н.В., 2011; Старчина Ю.А., 2012; Forbes D. et al., 2011; Provencher M.D. et al., 2012). Отмечается рост резидуальной церебрально-органической патологии, вследствие цереброастенических и энцефалопатических нарушений, возникающих на фоне внутриутробной асфиксии плода, родовых травм мозга и др. (Евтушенко Е.Д., 2003; Уракова Н.А., 2012;

Poletti М. et al., 2012; Suttanon Р. et al., 2012). С увеличением продолжительности жизни населения, резко возрос процент лиц с нейродегенеративными заболеваниями (Камчатнов П.Р. и др., 2010; Старчина Ю.А., 2012; Smith R.A.

et al., 2006; Li H. et al., 2011; Poletti М. et al., 2012).

В настоящее время в медикаментозном лечении больных с заболеваниями нервной системы применяются средства с анксиолитическим, антидепрессивным, ноотропным и другими действиями, влияние которых направлено на высшие интегративные функции мозга: восстановление нарушенных мнестических и мыслительных функций, снижение неврологического дефицита, уровня тревожности и повышение резистентности организма к экстремальным воздействиям (Гуревич М.А., 2006; Jellinger К.А., 2008). При этом большинство применяемых синтетических препаратов вызывает побочные реакции, что, в конечном итоге, нивелирует их терапевтическую эффективность. Так, на фоне анксиолитиков бензодиазепинового ряда наблюдаются нарушения когнитивных функций, синдром отнятия и рецидива тревоги в случае их отмены (Durham R.C. et al., 2012); трициклические транквилизаторы проявляют антихолинергическое, кардиотоксическое влияние, нарушают когнитивные функции и др. (Durham R.C. et al., 2012; Friborg О. et al., 2013).

Применяемые в настоящее время синтетические ноотропные средства также обладают рядом побочных эффектов, которые ограничивают их применение (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2007; Akabay Р. et al., 2003).

Между тем, для лечения неврологической патологии с глубокой древности используются такие растения как женьшень, валериана лекарственная, пустырник сердечный, мелисса лекарственная, пион уклоняющийся, зверобой продырявленный, шлемник байкальский и созданные на их основе фитосборы (Барнаулов О.Д., 2010; Венгеровский А.И. и др., 2011; Арушанян Э.Б., 2008; 2012). Доказано, что благодаря наличию комплекса биологически активных веществ растительные средства обладают широким спектром фармакологической активности, оказывают выраженный терапевтический эффект и их побочное действие, в большинстве случаев, ограничивается индивидуальной непереносимостью компонентов (Авдеева Т.И., Кинкулькина М.А., 2008; Турищев С.Н., 2008; Алексеева А.В., 2011; Бурчинский С.Г., 2012; Куркин В.А. и др., 2012). Преимущество комплексных средств перед монопрепаратами обусловлено синергизмом действия лекарственных растений в сборах, благодаря чему усиливаются полезные свойства компонентов, входящих в их состав. Рационально подобранные фитопрепараты способны выступать в качестве регулирующей системы при патологических состояниях организма (Николаев С.М., 2008; 2012). Интерес представляют традиционные медицинские системы, в частности тибетская, которая широко использует многокомпонентные сборы при болезнях «гза» («болезни, насылаемые духами»: при инсультах, параличах и других нарушениях функций нервной системы) (Тибетская…, 2008).

В связи с этим актуальным является поиск средств в лечении расстройств нервной системы, обладающих широким спектром фармакологических свойств в сочетании с максимальной безвредностью. Лекарственные растения и созданные на основе тибетской традиции врачевания средства представляют большой интерес.

Целью исследования явилось определение особенностей морфофункциональных нарушений центральной нервной системы, вызванных алкогольной интоксикацией, длительным эмоциональным стрессом, депривацией сна, введением скополамина, а также гипоксией, и оценка фармакотерапевтической эффективности растительных средств при указанных патологических состояниях.

Для достижения указанной цели были сформулированы следующие задачи:

1) определить особенности влияния алкогольной интоксикации, эмоционального стресса, депривации сна, скополамина и гипоксии на морфофункциональное состояние центральной нервной системы;

2) изучить структурные изменения в коре больших полушарий головного мозга, гиппокампе и мозжечке при указанных патологических состояниях;

3) определить спектр нейропротективной активности исследуемых растительных средств;

4) оценить фармакотерапевтическую эффективность растительных средств на фоне алкогольной интоксикации;

5) определить фармакотерапевтическую эффективность экстракта соплодий хмеля обыкновенного (ЭСХО), настойки цимицифуги даурской (НЦД) и «Анксиофита» при патологических состояниях, сопровождающихся тревожными расстройствами;

6) изучить влияние растительных средств на морфофункциональное состояние нервной системы при нейродегенеративных и гипоксических состояниях;

7) выявить основные механизмы нейропротективного влияния исследуемых растительных средств.

Научная новизна. Работа представляет комплексное исследование по влиянию алкогольной интоксикации, эмоционального стресса, депривации сна, введения скополамина и гипоксии на морфофункциональное состояние головного мозга белых крыс с обоснованием возможности и целесообразности фармакокоррекции растительными средствами указанных патологических состояний. Определено, что при алкогольной интоксикации, стрессовых, нейродегенеративных и гипоксических состояниях у животных развивается комплекс поведенческих нарушений, характеризующийся двигательной и эмоциональной заторможенностью животных, нарушениями когнитивных функций. В коре больших полушарий, гиппокампе и мозжечке наблюдаются морфофункциональные изменения, характеризующиеся уменьшением количества функционально активных и увеличением количества регрессивных форм нейронов (пикнотических, резко гипохромных и «клеток-теней»), явлений сателлитоза и нейронофагии на фоне снижения энергетического потенциала и подавления активности моноаминергической системы головного мозга. Установлено, что при длительной инъекции скополамина (экспериментальная болезнь Альцгеймера) у животных отмечаются наиболее выраженные структурные изменения в гиппокампе, характеризующиеся не только тотальным гиперхроматозом нейронов, характерным для других патологических состояний, но и их лизисом, в результате чего наблюдаются массивные очаги клеточного опустошения.

Выявлено, что основными и общими механизмами в повреждающем действии нервной системы при указанных патологических состояниях являются активация свободнорадикального окисления липидов и снижение активности системы антиоксидантной защиты.

В работе установлено, что исследуемые растительные средства оказывают ноотропное, антидепрессивное, антиагрессивное, анксиолитическое и умеренное седативное действие. Определено, что «Ноофит» проявляет более выраженное ноотропное действие, «Анксиофит» – анксиолитическое; при этом, с повышением дозы фитопрепарата снижается ноотропное действие и повышается седативный эффект.

Установлено, что исследуемые растительные средства обеспечивают выраженную фармакотерапевтическую эффективность при хронической алкогольной интоксикации, оказывая противотревожное и антиамнестическое влияние, уменьшая количество регрессивных нейронов в коре больших полушарий, гиппокампе и мозжечке. Показано, что на фоне длительного эмоционального стресса и депривации сна ЭСХО, НЦД и «Анксиофит» нормализуют у животных поведенческие реакции, снижая эмоциональное напряжение, оказывая антиамнестическое влияние; уменьшают количество регрессивных нейронов в структурах головного мозга и стимулируют моноаминергическую систему. При экспериментальных нейродегенеративных состояниях «Ноофит» проявляет выраженную фармакотерапевтическую эффективность, нормализуя у животных поведенческие реакции, оказывая антиамнестическое влияние, подавляя свободнорадикальные процессы, активируя антиоксидантную систему организма, уменьшая количество регрессивных нейронов. Курсовое введение исследуемых средств оказывает антиамнестическое влияние, нормализует энергетический потенциал нейронов и снижает содержание нейрон-специфической енолазы при гипоксии.

Доказано, что основными механизмами, определяющими нейропротективное влияние растительных средств, являются стимуляция ГАМКергической и катехоламинергической нейропередач, нормализация энергетического обмена при антиоксидантном, мембраностабилизирующем, стресспротективном, антигипоксическом и церебропротекторном действии.

Практическое значение. Результаты проведенных экспериментальных исследований позволяют рекомендовать исследуемые средства для клинических исследований с целью их применения в качестве эффективных и безопасных средств в клинической и ветеринарной практике для лечения и профилактики тревожных расстройств, а также умеренных когнитивных нарушений.

Результаты проведенных исследований включены в научный отчет «Молекулярно-клеточные механизмы стресс-индуцированных патологических состояний и коррекция их средствами природного происхождения», представленный в СО РАН. Материалы исследований включены в учебное пособие «Особенности фитокоррекции заболеваний нервной системы» и используются в учебном процессе на кафедрах общей патологии человека и фармакологии, клинической фармакологии и фитотерапии медицинского факультета Бурятского государственного университета; анатомии, гистологии и патоморфологии Бурятской государственной сельскохозяйственной академии им. В.Р. Филиппова; внутренних незаразных болезней, клинической диагностики и фармакологии Иркутской государственной сельскохозяйственной академии; клинической фармакологии Иркутской государственной медицинской академии последипломного образования. По результатам исследований получены патент РФ (№ 2460534 от 10.09.2012 «Способ получения вещества, обладающего анксиолитической активностью») и Свидетельство о государственной регистрации биологически активной добавки к пище:

«Арура-Тан № 10» – «Анксиофит» (№ 77.99.11.003.Е.004344.05.13 от 28.05.2013).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Особенности влияния алкогольной интоксикации, эмоционального стресса, депривации сна, скополамина и гипоксии на психоэмоциональное состояние животных, когнитивные функции; влияние указанных патологических состояний на процессы свободнорадикального окисления липидов и активность ферментов антиоксидантной защиты организма.

2. Структурные изменения в коре больших полушарий головного мозга, гиппокампе и мозжечке при указанных патологических состояниях: снижение количества функционально активных нейронов (нормохромных, умеренно гипер- и гипохромных), увеличение количества регрессивных нейронов (резко гипохромных, пикнотических и «клеток-теней»), явлений сателлитоза и нейронофагии.

3. Спектр нейропротективной активности растительных средств: анксиолитическое, антидепрессивное, антиагрессивное, ноотропное и умеренное седативное действие.

4. Нейропротективное влияние фитопрепаратов при указанных патологических состояниях: снижение количества дистрофически измененных и регрессивных форм нейронов и увеличение функционально активных нейронов в структурах головного мозга; подавление свободнорадикальных процессов и активация антиоксидантной системы организма.

5. Нормализация растительными средствами при расстройствах нервной системы поведенческих реакций: снижение неврологического дефицита, чувства страха и тревоги, восстановление эмоционального статуса и антиамнестическое влияние.

6. Основные механизмы нейропротективного влияния исследуемых фитопрепаратов: стимуляция ГАМК-ергической и катехоламинергической нейропередачи, нормализация энергетического обмена, антиоксидантное, мембраностабилизирующее, антигипоксическое и церебропротекторное действие.

Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на: Южно-Сибирской Международной научной конференции молодых ученых «Экология Южной Сибири» (Абакан, 2001);

Международной научно-практической конференции «Устойчивое развитие сельского хозяйства в бассейне озера Байкал» (Улан-Удэ, 2002); Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы адекватного питания в эндемичных регионах» (Улан-Удэ, 2002); IX, X, XII, XIX, XX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002; 2003; 2005;

2012; 2013); VI Всероссийской научной конференции молодых ученых “Биология – наука XXI века» (Пущино, 2002); Международной научной конференции «Возрастная физиология и патология сельскохозяйственных животных» (Улан-Удэ, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Развитие традиционной медицины в России» (Улан-Удэ, 2004; 2010); III Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва, 2005); Международной научной конференции «Дорно-орнийн анагаах ухааны хосолмол тогтолцоо» (Уланбатор, 2005);

Всероссийской научной конференции молодых ученых «Экология в современном мире: взгляд научной молодежи» (Улан-Удэ, 2007); II International Symposium on Chemistry of Herbal Medicine and Mongolian Drug (Ulaanbaatar, 2006); II International Сonference «Traditional medicine: current situation and future status» (Ulaanbaatar, 2006); III International Scientific Conference «Traditional Medicine: a Current Situation and Perspectives of Development» (UlanUde, 2008); IV International Symposium on Traditional Medicine and Innovative Drugs (Erdos, 2009); Международном научном конгрессе «Современные тенденции и перспективы развития курортного дела в Российской Федерации»

(Москва, 2010); The International Scientific Conference “Current Situation and Future Trends of Drug Research and Development from Natural Sources” (Ulaanbaatar, 2010); V International Symposium on Present Situation and Future Development of Mongolian Traditional Medicine (Ulaanbaatar, 2011); II Международной научной конференции «Разнообразие почв и биоты Северной и Центральной Азии» (Улан-Удэ, 2011); II Международной научно-практической конференции «Особенности формирования здорового образа жизни: факторы и условия» (Улан-Удэ, 2012); VI International Scientific Conference “Traditional Medicine: Ways of Integration with Modern Health Care» (Ulan-Ude, 2013).

Личный вклад автора. Вклад автора состоял в формировании направления исследования, непосредственном выполнении, постановке конкретных задач и их экспериментальном решении, интерпретации и обсуждении экспериментальных данных. Диссертационная работа представляет собой обобщение результатов многолетних исследований, полученных автором лично.

Связь задач исследований с проблемным планом НИР. Работа выполнена в Отделе биологически активных веществ ФГБУН ИОЭБ СО РАН в соответствии с комплексной программой по научным проектам: интеграционный проект № 54 «Научные основы разработки новых лекарственных средств. Перспективы использования возобновляемого сырья»; проект СО РАН № 146 «Разработка лекарственных и профилактических препаратов для медицины. Фундаментальные основы и реализация», проект СО РАН № VI.52.1.3 «Молекулярно-клеточные механизмы стресс-индуцированных патологических состояний и коррекция их средствами природного происхождения».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 105 научных работ, из них 40 статей – в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, получены 1 патент РФ на изобретение и свидетельство о регистрации.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 285 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований ( главы), обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы, приложений. Работа иллюстрирована таблицами и 92 рисунками, в том числе 53 микрофотографиями. Список литературы включает 476 источников, из них 326 отечественных и 150 иностранных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования выполнены на 1720 белых крысах линии Wistar обоего пола с исходной массой 180–200 г. Содержание животных соответствовало «Правилам лабораторной практики» (GLP) и Приказу МЗ РФ № 708Н от 23.08.2010 г. «Об утверждении правил лабораторной практики». Перед началом экспериментов животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, распределялись на группы с учетом пола, возраста, массы и принципа рандомизации. Экспериментальную работу осуществляли в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР №755 от 12.08.77 г.), «Правилами, принятыми в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (Страсбург, 1986). Протокол исследования согласован с этическим комитетом ИОЭБ СО РАН (протокол №5 от 05.09.2000). Эвтаназию животных осуществляли методом мгновенной декапитации под легким эфирным наркозом.

Кроме того, в экспериментах (in vitro) были использованы суспензии эритроцитов и желточных липопротеидов, препараты тканей и биохимические тест-системы.

Алкогольную интоксикацию (АИ) вызывали внутрижелудочным введением животным 40% этанола в объеме 9,0 мл/кг в течение 45 дней (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2005). Эмоциональный стресс (ЭС) моделировали помещением крыс в тесные пластиковые цилиндры с последующим погружением их в воду до уровня шеи (20-220 С) на 2 часа ежедневно в течение суток (Захарова И.А. и др., 2009); стресс Жуве (СЖ) – трехдневной депривацией парадоксальной фазы сна (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005). Экспериментальную болезнь Альцгеймера (БА) у крыс воспроизводили по методике Т.А. Ворониной и др. (2005): животным ежедневно в течение 20 суток внутрибрюшинно вводили М-холиноблокатор – скополамин в дозе 1 мг/кг/сут. Острую гипобарическую гипоксию моделировали путем «подъема» лабораторных животных в барокамерной установке на «высоту» 9000 м со средней скоростью 50 м/с, экспозицией их в этих условиях в течение мин и последующей трехчасовой реоксигенацией (Березовский В.А. и др., 1985).

В качестве объектов исследования были использованы:

сухой экстракт соплодий хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) (ЭСХО), полученный путем последовательной экстракции (70%, 50% и 40 % спирт этиловый и вода) и последующей вакуумной сушкой;

настойка цимицифуги даурской (Cimicifuga dahurica (Turcz.) Maxim.) (НЦД)*, полученной экстрагированием на 70% спирте этиловом;

полиэкстракт «Анксиофит» (условное название), полученный путем последовательной экстракции (70%, 50% и 40% спирт этиловый и вода) и последующей вакуумной сушкой из: соплодий хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.), травы пустырника сердечного (Leonurus cardiaca L.), корней и корневищ шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), травы мяты перечной (Mentha х piperita L.), цветков календулы лекарственной (Calendula officinalis L.), плодов шиповника (Rosa spp.), взятых в соотношении 6:3:3:3:2:3 массовых частей;

полиэкстракт «Ноофит» – условное название экстракта жидкого, полученного путем экстракции 40% спиртом этиловым из: корней и корневищ шлемника байкальского (Scutellaria baicalensis Georgi), левзеи сафроловидной (Rhaponticum carthamoides (Willd.) Iljin) и валерианы лекарственной (Valeriana officinalis L), травы мяты перечной (Mentha х piperita L.), горца птичьего (Polygonum aviculare L.) и тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.) и листьев крапивы двудомной (Urtica dioica L.), взятых в соотношении 5:2:3:2:3:2:3 массовых частей.

Перед экспериментами, с целью исключения влияния этанола, НЦД и экстракт «Ноофит» деалкоголизировали путем выпаривания на водяной бане до 1/10 от исходного объема. Полученный остаток доводили водой очищенной до заданного объема в соответствии с рекомендациями (Правила…,1992).

ЭСХО вводили животным внутрижелудочно через зонд один раз в сутки в дозах 100, 200 и 300 мг/кг; «Анксиофит» – в дозах 50, 100 и 300 мг/кг; НЦД – в дозах 0,5 и 1,0 мл/кг; «Ноофит» – в дозах 2,0; 5,0 и 10,0 мл/кг. Конечный объем исследуемых средств, вводимый животным, составлял 10 мл/кг. ПроИсследования проведены совместно с м.н.с. Д.Э. Гармаевым должительность введения фитоэкстрактов, а также сроки исследования варьировали в зависимости от цели и продолжительности экспериментов. Животные контрольной и интактной групп получали воду очищенную в соответствующем объеме по аналогичной схеме введения растительного средства. В качестве препаратов сравнения использовали аптечный экстракт из валерианы (ЭВ) в изоэффективной дозе 120 мг/кг и пирацетам в дозе 200 мг/кг, которые вводили животным по аналогичной схеме введения исследуемого средства.

Анксиолитическое и седативное действие фитосредств изучали согласно Методическим указаниям по изучению транквилизирующего (анксиолитического) действия фармакологических веществ (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005) в методиках: конфликтная ситуация по Vogel, приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ), «светлая/темная камера», «открытое поле», пролонгирование наркотического сна (кетамин гидрохлорид, 2,0 мл/кг; гексенал, 60 мг/кг). Антидепрессивное действие оценивали в тесте «поведенческое отчаяние» по Порсолту, антиагрессивную активность – в тесте «немотивированная агрессия» (Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2005). Ноотропное действие исследовали согласно Методическим рекомендациям по изучению ноотропного действия новых фармакологических веществ (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2005) в методиках: условная реакция пассивного избегания (УРПИ), условная реакция активного избегания (УРАИ) и условный рефлекс с положительным подкреплением, который проводили в Т-образном лабиринте.

Об антистрессорной активности исследуемых фитосредств судили по выраженности триады Селье. Для оценки напряжения симпатоадреналовой и гипоталамо-гипофизно-адренокортикальной системы в плазме крови и гомогенате головного мозга методом иммуноферментного анализа определяли содержание катехоламинов (адреналина, норадреналина и дофамина) с использованием набора «IBL, RE 59395 TriCat ELISA» на анализаторе «Stat Fax 2100»; в плазме крови – уровень адренокортикотропного гормона (АКТГ) и кортизола с помощью набора «СтероидИФА-кортизол» на автоматическом анализаторе «ALISEI»; в гомогенате головного мозга (ГМ) – содержание метаболитов катехоламинов (метанефрина и норметанефрина) с помощью набора «MetCombiPlasma» на анализаторе «Multiskan Ascent». В сыворотке крови определяли содержание нейрон-специфической енолазы (NSE) с помощью набора «Can Ag NSЕ» на иммуноанализаторе «Multiskan Ascent».

Интенсивность процессов свободнорадикального окисления (СРО) биомакромолекул оценивали по накоплению малонового диальдегида (МДА) в сыворотке крови (Стальная И.Д., Гаришвили Т.Г., 1977) и гомогенате ГМ (Владимиров Ю.В., Арчаков А.И., 1972). О состоянии антиоксидантной системы (АОС) судили по активности каталазы в гомогенате ГМ и в сыворотке крови (Королюк М.А. и др., 1988), супероксиддисмутазы (СОД) – в эритроцитах (Чевари С. и др., 1985) и содержание восстановленного глутатиона (ВГ) – в крови (Anderson T., 1991).

Для оценки влияния исследуемых средств на энергетический потенциал нейронов определяли содержание АТФ, молочной и пировиноградной кислот в гомогенате ГМ (Методы…, 1982).

Антигипоксическое действие фитопрепаратов исследовали с использованием моделей: острая нормобарическая гипоксия с гиперкапнией (Лукьянова Л.Д., 1989); острая гемическая гипоксия (натрий нитрит, 200 мг/кг) (Костюченко Ю.Ф., Фаранщук Н.Ф., 1982); острая гистотоксическая гипоксия (натрий нитропруссид, 20 мг/кг) (Лукьянова Л.Д., 1989).

Противосудорожное действие исследуемых средств изучали на моделях стрихниновых (2 мг/кг), коразоловых (100 мг/кг) и камфорных (2 мл/кг) судорог (Руководство…, 2005).

Мембраностабилизирующую активность фитосредств оценивали in vitro по степени торможения перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов донорской крови (Ковалев И.Е. и др., 1986).

Антирадикальную активность экстрактов и их компонентов оценивали с применением DPPH-метода (Seyoum А. et al., 2006). Влияние исследуемых средств на связывание супероксидных анион-радикалов (О2·-) определяли в неэнзиматической системе феназин метосульфат/НАДН (Chen A.-S. et al., 2003); Fe2+-хелатирующую активность – фенантролиновым методом (Оленников Д.Н., 2008); связывание молекул оксида азота (NO) – согласно R.

Govindarajan et al. (2003). Для оценки влияния экстрактов на процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) использовали также модельную систему, состоящую из суспензии желточных липопротеидов (Клебанов Г.И., 2003).

Влияние фитосредств на состояние ГАМК-ергической системы исследовали c помощью метода конфликтной ситуации по Vogel. С целью блокады ГАМКА-рецептора использовали бикукуллин (1,0 мг/кг), а для блокады хлорного канала – пикротоксин (1,0 мг/кг) (Воронина Т.А., Островская Р.У., 2005).

Для патоморфологических исследований ГМ животных фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина и 960 спирте. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином и эозином, а также крезилвиолетом по Нисслю (Коржевский Д.Э., Гиляров А.В., 2010). Для определения степени повреждения структур ГМ проводили морфометрический анализ клеточного состава II-V слоев коры больших полушарий (КБП), мозжечка и гиппокампа.

Во II-V слоях КБП и подсчитывали количество разных по структуре нейронов: нормохромные, умеренно и резко гиперхромные, умеренно и резко гипохромные, «клетки-тени», в гиппокампе – количество (в %) темных и светлых нейронов по отношению к общей сумме клеток (Артюхина Н.И., Русинова Е.В., 2002). Для выявления сукцинатдегидрогеназы (СДГ) свежезамороженные срезы, приготовленные на криостате МК-25, окрашивали по Нахласу, для выявления липидов – суданом IV (Микроскопическая…, 1996).

Цифровые данные статистически обработаны общепринятыми методами для малой выборки с определением средней величины (М) и ошибки (m).

Степень значимости результатов исследований (Р) оценивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни. Различия между данными контроля и опыта считали статистически значимыми при вероятности 95 % (Р 0,05) (Сергиенко В.И., Бондарева И.Б, 2006).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Характеристика морфофункциональных повреждений головного мозга при различных патологических состояниях Полученные в работе данные свидетельствуют о том, что морфофункциональные изменения в структурах ГМ на фоне патологических состояний различного генеза (АИ, стрессовые, нейродегенеративные и гипоксические состояния) сопровождаются комплексом поведенческих нарушений, характеризующихся повышением уровня тревожности и эмоциональности, изменением ориентировочно-исследовательского и целенаправленного поведения на хаотичные движения, ухудшением процессов обучения и памяти. Так, на фоне 45-дневной АИ у животных контрольной группы при тестировании в «открытом поле» наблюдалось увеличение горизонтальной активности, при этом ни одно животное не заходило в центральные квадраты установки, и у них отсутствовал норковый рефлекс. Хаотическое поведение крыс сопровождалось увеличением количества дефекаций и актов груминга. О превалировании у контрольных животных чувства страха и тревоги на фоне указанного патологического состояния свидетельствовало поведение их в ПКЛ: количество заходов и время, проведенное в открытых рукавах установки, были соответственно в 4,7 и 12,4 раза ниже указанных показателей животных интактной группы. На фоне ЭС у контрольных животных количество заходов и время пребывания в открытых рукавах ПКЛ были соответственно на 79% и 73 % ниже данных интактных животных; 72-часовая депривация сна (СЖ), оказывала более выраженное угнетающее действие на эмоциональное состояние животных: ни одно животное контрольной группы в данной серии экспериментов не посетило открытые рукава ПКЛ, а количество переходов между закрытыми рукавами было в 3,0 раза ниже данных в интактной группе.

При оценке когнитивных функций установлено, что гипоксия вызывает снижение процесса обучаемости и оказывает амнестический эффект в тесте УРПИ, что проявлялось в снижении латентного периода (ЛП) захода в темный отсек установки у контрольных животных через 1 час после выработки рефлекса в 1,9 раза, через 24 часа и 7 суток – в среднем в 2,7 раза по отношению к показателям интактных животных. Введение крысам этанола в течение 45 дней не оказывало влияние на выработку УРПИ у крыс контрольной и опытных групп, что согласуется с данными исследований других авторов (Буров Ю.В., 1985; Воронина Т.А., 1989; Шабанов П.Д., 1998), показавших, что этанол влияет на выработку условного рефлекса только после 4 месяцев введения. Однако, даже однократное введение этанола, по мнению этих же авторов, приводит к нарушению процессов консолидации и воспроизведения памятного следа, что соответствует результатам наших исследований: ЛП у крыс контрольной группы через 24 часа и 7 суток был ниже аналогичного показателя животных интактной группы на 53% и 66% соответственно. Нарушение когнитивных функций отмечалось и на фоне стрессовых ситуаций:

в контрольной группе после четырехкратной иммобилизации ни у одного животного УРПИ не сохранился, при 80% показателе в интактной группе; на фоне СЖ рефлекс воспроизводился у 30% животных, при этом ЛП был в 3, раза ниже показателя крыс интактной группы.

Достоверно известно, что когнитивные нарушения коррелируют со степенью органических изменений в ГМ. Многочисленными работами показано, что КБП и гиппокамп являются структурами ГМ, участвующими в реализации и организации когнитивных и эмоциональных процессов, таких как память, внимание, ориентация в пространстве, тревога и др. (Одинак М.М. и др., 2011) и являются основными мишенями при различных патологических состояниях (Сапфирова В.А. и др., 2005; Овчинников А.А. и др., 2006; Арушанян Э.Б. и др., 2007; Мухаметшина Э.И., 2008; Lamy V. et al., 2007). Прижизненные магнитно-резонансные, а также посмертные исследования ГМ показали, что деструктивные процессы, ведущие к БА, также развиваются преимущественно в структурах, участвующих в процессах обучения и памяти (Аршавский Ю.И., 2011). При микроскопическом исследовании ГМ животных, потреблявших в течение 45 дней этанол, обнаруживались значительные изменения в структуре нейронов КБП. При этом в III слое изменения были направлены в сторону увеличения гиперхромных, а в V слое – в сторону гипохромных нейронов. При количественном анализе нейронов указанных слоев КБП установлено, что у животных контрольной группы количество нормохромных клеток снижалось в среднем на 65%, умеренно гиперхромных клеток – на 28% и 38% по сравнению с таковыми у животных интактной группы (табл. 1). При этом в III слое увеличивалось количество резко гиперхромных нейронов и «клеток-теней» в 3,1 и 4,7 раза, в V слое резко гипохромных нейронов и «клеток-теней» – в 2,0 и 10,3 раза по сравнению с данными интактных животных.

Таблица 1 – Влияние «Ноофита» на количество (%) разных типов нейронов III и V слоев коры больших полушарий головного мозга белых крыс при алкогольной интоксикации; M±m; n= Нормохромные 41,0±4,05 13,1±1,36** 26,8±3,12* 26,9±0,26* Умеренно гиперхромные 25,2±1,68 18,2±1,47** 11,2±1,18* 15,3±0, Резко гиперхромные 11,4±0,76 34,8±5,95** 26,3±2,29 25,8±2,36* Умеренно гипохромные 13,8±1,04 17,7±1,47 26,3±1,12* 20,9±3, Нормохромные 42,2±5,07 16,1±1,21** 26,8±2,35* 24,5±0,84* Резко гиперхромные 11,7±0,64 15,5±1,32 13,7±1,09 15,1±2, Умеренно гипохромные 23,2±1,71 30,5±1,44** 25,7±2,46 26,8±4, Резко гипохромные 6,6±0,90 13,2±1,15** 9,8±3,32* 9,3±1, «Клетки-тени» 1,5±0,01 15,5±1,09** 12,0±0,60* 11,5±2, Примечание. Здесь и далее различия статистически значимы при Р 0,05: **– между данными животных интактной и контрольной групп, * – между данными животных контрольной и опытной групп; n – количество животных в группе.

Для нейронов V слоя КБП при АИ было характерно поражение, называемое «острое набухание» по Шпильмейру (Жаботинский Ю.М., 1965): увеличение размеров клеточного тела, набухание отростков, постепенное растворение тигроида при четкой структуре слегка увеличенного ядра; в ряде случаев набуханию подвергается верхушечный дендрит. Полученные морфологические данные согласуются с результатами других исследователей, показавших, что введение этанола вызывает в КБП изменения, направленные на увеличение сосудистых нарушений, атрофических процессов и острых дистрофических изменений нейронов (Попова Э.Н., 1984; 1995; 1997; Пермяков А.В., 1997; Актушина Г.А., 1998; Шпинькова В.Н., 2000; Guerri C., 1994; Kril J.J., 1999).

На фоне гипоксии у животных контрольной группы во II-V слоях КБП наблюдались нейроны с «тяжелой» степенью повреждения, которая характеризуется пикнозом нейронов (28%) и образованием «клеток-теней» (16%). В результате чего, общее количество регрессивных нейронов составляло 54% от общей популяции клеток, что в 2,8 раза превышало показатели интактных животных. На фоне образования многочисленных очагов клеточного опустошения отмечались явления нейронофагии и сателлитоза, нарушения цитоархитектоники.

По данным патоморфологических исследований на фоне стрессовых ситуаций (ЭС и СЖ) структурные изменения нейронов II - V слоев КБП характеризовались появлением значительного количества резко гиперхромных пикнотических нейронов, образующих скопления, и резко гипохромных клеток, находящихся в состоянии умеренного и тотального хроматолиза. Наблюдали набухание и вакуолизацию цитоплазмы нейронов, увеличение количества «клеток-теней», явлений сателлитоза и нейронофагии. Результаты морфометрических исследований показали, что у животных на фоне стрессовых ситуаций количество нормохромных нейронов в КБП снижалось в среднем в 2,0 раза, резко гипохромных нейронов возрастало соответственно в 1,7 и 1,4 раза, резко гиперхромных – в 3,9 и 5,3 раза и количество «клетоктеней» – в 5,1 и 6,6 раза по сравнению с указанными показателями животных интактной группы (табл. 2).

Таблица 2 – Влияние «Анксиофита» на количество (%) разных типов нейронов II – V слоев коры больших полушарий головного мозга белых крыс на фоне длительного эмоционального стресса; М±m; n= Нормохромные 48,6±2,10 25,8±1,43** 34,2±1,42* 32,6±2,11* Умеренно гиперхромные 16,2±0,91 15,2±1,41 20,2±1,41* 21,2±1,21* Резко гиперхромные 5,2±0,12 20,2±1,62** 12,0±1,02* 13,2±1,02* Умеренно гипохромные 19,3±0,42 13,2±0,92** 18,2±1,41* 16,2±1,10* Резко гипохромные 8,6±0,61 14,8±1,01** 10,2±0,91* 11,2±1,12* В связи с тем, что на сегодняшний день наблюдается неуклонное старение населения, нейродегенеративные заболевания в структуре неврологической патологии занимают значительное место, являясь основной причиной деменции (Суслина З.А., 2008; Капай Н.А. и др., 2010; Carvalho A.L. et al., 2008; Jellinger K.A., 2008; Downey D., 2008). Наиболее известными представителями данного класса заболеваний являются болезни Альцгеймера и Паркинсона, для которых характерна медленно прогрессирующая гибель определенных групп нервных клеток и одновременно – постепенно нарастающая атрофия соответствующих отделов головного и/или спинного мозга (Рогачева Т.А., Краснослободцева Н.А., 2007; Birks J., 2006). По данным многочисленных исследований установлено, что при развитии БА происходит утрата холинергических нейронов, в первую очередь, в области базальных ганглиев, при этом степень нарушения функции холинергической системы коррелирует с тяжестью когнитивного дефицита (Боголепова А.Н., 2009; Francis Р.Т. et al., 1999). В связи с этим, для моделирования БА использовали хроническое введение блокатора мускариновых холинорецепторов – скополамина. Полученные нами данные показали, что на фоне введения скополамина у животных наблюдается понижение мышечного тонуса, нарушение координации, увеличение уровня тревожности, а также снижение способности к обучению:

на 5 сутки в контрольной группе рефлекс выработался у 30 % животных, при 100 % показателе в интактной группе (рис. 1).

Количество животных с выработанным рефлексом, % Патоморфологические исследования ГМ свидетельствуют, что на фоне экспериментальной БА в наружном зернистом слое КБП отмечалось выраженное увеличение количества пикнотических нейронов; в третьем слое по направлению с поверхности в глубину – снижение пикнотических и увеличение клеток в состоянии хроматолиза. Исчезновение тигроидного вещества сопровождалось развитием набухания различной степени. В V слое КБП на фоне повышения количества гипохромных нейронов и «клеток-теней» увеличивалось число пикнотических нейронов, образующих небольшие скопления, что создавало мозаичную картину с явлениями нейронофагии, сателлитоза и «выпадения» нейронов. В нейронах выявлялись отложения липофусцина. Данные морфометрических исследований показали (табл. 3), что у животных контрольной группы при моделировании БА число нормохромных клеток снижалось в 11,6 раза, умеренно гиперхромных нейронов – на 16%, количество резко гипохромных нейронов возрастало в 2,5 раза, резко гиперхромных и «клеток-теней» в среднем в 5,0 раз по сравнению с таковыми показателями животных интактной группы.

Таблица 3 – Влияние «Ноофита» на количество (%) разных типов нейронов II – V слоев коры больших полушарий головного мозга белых крыс на фоне экспериментальной болезни Альцгеймера; M±m; n = Нормохромные 48,6±2,12 4,2±0,49** 15,8±1,61* 13,7±1,02* Умеренно гиперхромные 16,2±0,91 13,6±0,91 22,1±1,92* 19,2±1,21* Резко гиперхромные 5,2±0,11 26,3±1,87** 16,7±1,32* 19,8±1,42* Умеренно гипохромные 19,3±0,42 23,5±2,29 24,7±1,21 26,6±1, Резко гипохромные 8,6±0,61 21,8±1,52** 14,6±0,51* 13,2±1,03* «Клетки-тени» 2,1±0,11 10,6±1,02** 6,1±0,23* 7,5±0,22* По данным литературы известно, что гиппокамп, как центральная структура лимбической системы, играет существенную роль в формировании физической и психической зависимости от психоактивных веществ (Савоненко А.В., 1997; De Bellis M.D. et.al, 2000), участвует в организации эмоционального поведения и реакции на стресс (Арушанян Э.Б. и др., 2007). Особенно велико значение гиппокампа в организации познавательных процессов. Так, с повреждающим воздействием на структуры гиппокампа связывают амнестический эффект алкоголя (Бородкина Л.Е. и др., 2002). Установлено, что патологические изменения при нейродегенеративных состояниях в ГМ начинаются непосредственно в медиальной височной области полушарий, включающий гиппокамп (Аршавский Ю.И., 2011).

Патоморфологические исследования показывают, что нервные клетки гиппокампа у интактных животных светлые и однородные по форме, содержат большое округлое ядро и узкий ободок цитоплазмы. На фоне доминирующего количества таких нейронов в гиппокампе интактных животных, локально отмечаются гиперхромные пикнотические нейроны, не образующие скопления. По результатам наших морфометрических исследований количество последних колеблется в пределах от 4,2% до 6,7%, что согласуется с данными других авторов (Артюхина Н.И., Русинова Е.В., 2002). На фоне АИ, ЭС, СЖ и гипоксии наблюдалось увеличение количества пикнотических нейронов в гиппокампе соответственно в 3,7; 3,9; 4,6 и 5,1 раза по сравнению с указанным показателем животных интактной группы (рис. 2). Длительная инъекция скополамина вызывала более выраженные структурные изменения в гиппокампе, характеризующиеся не только тотальным гиперхроматозом нейронов, но и их лизисом, в результате чего отмечались массивные очаги клеточного опустошения. Установлено, что количество регрессивных нейронов в гиппокампе животных на фоне инъекции скополамина увеличивалось в 5,9 раза по сравнению с интактом (рис. 2).

Количество %, от интактного Как известно, кора мозжечка очень чувствительна к действию токсических веществ и гипоксическому воздействию (Сергиенко В.И., 1993; Baker K.G., 1999; Thomas J.D.,1998; Walker J.J.,1997). В наших исследованиях введение этанола и гипоксия вызывали токсикогипоксические изменения клеток Пуркинье, сходные с изменениями нейронов в КБП: увеличивалось количество пикнотических, «клеток-теней», резко гипохромных клеток с наличием в цитоплазме вакуолей, что согласуется с данными других авторов (Wenisch S., 1996; Walker J.J.,1997).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют, что на фоне АИ, ЭС, СЖ, нейродегенеративных и гипоксических состояний отмечаются нарушения психоэмоционального статуса и когнитивных функций животных, коррелирующие с изменениями в структурах ГМ. Последние характеризуются снижением количества функционально активных нейронов и увеличением количества пикнотических нейронов, клеток с тотальным хроматолизом тигроидного вещества и дистрофическими изменениями в виде вакуолизации цитоплазмы, а также «клеток-теней», явлений сателлитоза и нейронофагии.

По мнению некоторых авторов (Боголепов Н.Н., 1979), вакуольная дистрофия нейронов отражает нарушение их липопротеинового каркаса, что свидетельствует о тяжелых необратимых изменениях. Гиперхроматоз является эквивалентом заторможенного состояния и характеризует гипоксическое повреждение ГМ (Гипоксия…, 2000; Орловская Д.Д., 1986). Так, в литературе имеются сведения (Гипоксия…, 2000; Матвеев В.Ф., 1976; Попова Э.Н., 1984), что ультрамикроскопическое строение гиперхромных нейронов, наблюдаемых при гипоксических повреждениях и при действии психотропных веществ, однотипно: в цитоплазме наблюдаются увеличение объема митохондрий, просветление их матрикса, деструкция крист, фрагментация и лизис эндоплазматической сети. Наличие большого количества измененных нейронов: пикнотических, «клеток-теней», а также явлений сателлитоза и нейронофагии, по мнению Н.Н. Боголепова и др. (1979, 2001), является одним из признаков выраженной гипоксии ГМ и указывает на истощение резервных возможностей нейронов. Степень гипоксических изменений ГМ и других органов определяется также по снижению активности митохондриальных ферментов и повышению активности лактатдегидрогеназы в них (Пермяков А.В., Витер В.И., 1997). Так, в наших исследованиях на фоне алкогольной интоксикации на микропрепаратах животных контрольной группы, окрашенных по Нахласу, было выявлено снижение активности СДГ во всех структурах ГМ. При всех указанных патологических состояниях отмечались гидропические изменения, характеризующиеся появлением перицеллюлярного и периваскулярного отеков и наличием дренажных форм олигодендроглиоцитов, что согласуется с результатами других авторов (Сергиенко В.И. и др., 1993) и, по мнению Э.Н. Поповой (1984), являются компенсаторно-приспособительной реакцией, направленной на поддержание функции нейронов.

По данным литературы (Завалишин И.А., Захарова М.Н., 1996; Шабанов П.Д., 2009; Александровский Ю.А., 2007), ключевым звеном в гибели нейронов является СРО биомакромолекул и снижение АОС организма. Результаты исследований показали, что на фоне всех исследуемых патологических состояний отмечались повышение содержания продукта ПОЛ – МДА в сыворотке крови и гомогенате ГМ, а также снижение ферментов АОС – каталазы в сыворотке крови и гомогенате ГМ и СОД в эритроцитах, а также содержания ВГ в крови. У животных контрольных групп содержание МДА в сыворотке крови повышалось в среднем в 3,5 раза, активность каталазы понижалась в 2,0 раза по сравнению с данными интактных крыс. Наибольшее повышение МДА (в 3,6 раза) и снижение активности каталазы (в 3,0 раза) в гомогенате ГМ по отношению к интакту наблюдалось при моделировании БА (табл. 4). Также при данном патологическом состоянии выявлялось выраженное снижение активности СОД в эритроцитах (на 75 %), тогда как при других патологических состояниях указный показатель уменьшался в среднем на 55% по сравнению с показателем интактных животных.

Таблица 4 – Влияние «Ноофита» на показатели перекисного окисления липидов и антиоксидантную активность организма белых крыс при экспериментальной болезни Альцгеймера; M±m; n= МДА в сыворотке 3,8±0,12 12,8±0,71** 7,2±0,52* 7,4±0,85* крови, µМ/л МДА в гомогенате 2,7±0,11 9,8±0,12** 3,0±0,12* 3,9±0,22* ГМ, µМ/г ткани Каталаза в сыворотке 1,9±0,09 1,0±0,05** 1,6±0,10* 1,3±0,12* крови, mкат/л Каталаза в гомогенате 12,0±0,77 3,9±0,40** 6,7±0,65* 6,0±0,59* ГМ, µкат/г ткани СОД в эритроцитах, 2,4±0,12 0,6±0,04** 1,1±0,09* 0,92±0,09* усл.ед Исследование спектра нейропротективной активности и фармакотерапевтической эффективности растительных средств Широкое распространение психических и неврологических расстройств в ветеринарной и клинической практике делает актуальным поиск эффективных препаратов для их лечения. Известно, что в развитии данных расстройств участвуют нейрохимический и нейроэндокринный уровни: нейромедиаторные системы, а также гормоны или пептиды, антиоксидантная система, что объясняет столь широкий спектр фармакологических препаратов, использующихся для их купирования (Курпатов В.И., Осипова С.А., 2006).

Все это определяет значительный интерес к лекарственным средствам растительного происхождения, сочетающих в себе высокую эффективность, широкий спектр терапевтического действия, за счет реализации в одном растительном средстве всех основных направлений этиопатогенетической и симптоматической терапии на фоне достаточно низкой токсичности (Вознесенская Т.Г., 2008; Николаев С.М., 2008, 2012; Турищев С.Н., 2009; Дробижев М.Ю., Овчинников А.А., 2010).

Исследование спектра нейропротективной активности фитосредств включало изучение ноотропного, анксиолитического, антидепрессивного антиагрессивного и седативного действия. «Открытое поле» – классическая модель, основанная на конфликте двух мотиваций: инстинктивной тенденции к исследованию нового окружения и тенденций минимизировать возможную опасность со стороны, и характеризует сразу два показателя лекарственного средства – исследовательскую активность и седативное действие (Voronina T.A., 2006). В предварительной серии экспериментов по данной методике было исследовано 10 лекарственных средств: экстракт соплодий хмеля обыкновенного (ЭСХО), экстракт сабельника болотного, настойка цимицифуги даурской (НЦД), а также ряд комплексных фитопрепаратов:

«Анксиофит», «Ноофит», «Нейрофит», «Полиноофит», «Гепатон», «Вентрофит» и «Фитотон». Результаты тестирования показали, что наиболее выраженное влияние на ориентировочно-исследовательскую активность проявляет комплексное средство «Ноофит». «Анксиофит» оказывает более выраженное противотревожное действие по отношению к моноэкстракту из соплодий хмеля обыкновенного, являющегося составным компонентом первого. При этом в данном тесте на фоне введения «Анксиофита» отмечалось, что с увеличением дозы снижается анксиолитическая активность и повышается седативный эффект.

Анксиолитические свойства фитопрепаратов изучали в тестах ПКЛ, «светлая/темная камера» и конфликтная ситуация по Vogel. Установлено, что ЭСХО в дозах 200 и 300 мг/кг, «Анксиофит» в дозах 50, 100 и 300 мг/кг и «Ноофит» в дозах 5,0 и 10,0 мл/кг проявляют выраженное анксиолитическое действие в условиях ненаказуемого поведения, увеличивая количество переходов и время пребывания в светлом отсеке «светлой/темной камеры» и количество заходов и время пребывания в открытых рукавах ПКЛ; в условиях наказуемого поведения, достоверно повышая количество наказуемых взятий воды в методике по Vogel по отношению к показателям интактного контроля. Наиболее выраженное анксиолитическое действие проявляет «Анксиофит» в дозах 100 и 300 мг/кг, увеличивая количество заходов в открытые рукава ПКЛ в 3,0 и 2,8 раза, время пребывания в них – в 7,1 и 4,7 раза, а также число наказуемых взятий воды – в 5,3 и 6,4 раза соответственно по сравнению с данными контрольных животных. Выраженное анксиолитическое действие «Анксиофита», вероятно, обусловлено -кислотами и эфирным маслом H. lupulus (Hansel R. et al., 1980; Schiller H. et al., 2006), эфирами изовалериановой кислоты M. piperita (Павлов М., 1998), кислотами, вогонином S. baicalensis (Hui К.М. et al., 2002; Jeong J.O. et аl., 2004), проявляющие анксиолитические свойства в эксперименте.

Одними из основных терапевтических свойств хмеля являются его седативное и снотворное действия. По данным литературы (Schiller Н. et al., 2006) экспериментально подтверждено седативное действие этанольного и СО2-экстрактов соплодий. Седативный эффект выявлен у -кислот и одного из компонентов эфирного масла хмеля – 2-метил-3-бутен-2-ола (Hansel R. et al., 1980; Wohlfart R. et al., 1983). При этом имеются противоположные литературные данные, свидетельствующие об отсутствии у соплодий хмеля седативного действия (Зузук Б.М., 2008). Данные наших исследований показали, что ЭСХО только в дозе 300 мг/кг оказывает потенцирующее влияние на длительность кетаминового сна, удлиняя его время на 21% по сравнению с контролем. При этом комплексное средство «Анксиофит» в дозе 300 мг/кг оказывает более выраженное седативное действие по сравнению как с ЭСХО, так и с «Ноофитом», сокращая время наступления и удлиняя длительность кетаминововго и гексеналового сна в 1,4 и 1,8 раза соответственно по сравнению с контролем. Выраженный седативный эффект «Анксиофита», вероятно, обусловлен синергизмом действия его компонентов; так, седативное влияние характерно для C. officinalis (Ercetin L.T. et al., 2012) и L.

cardiacа (Воробьева О.В., Акарачкова Е.С., 2007).

Наряду с анксиолитическими свойствами исследуемые фитопрепараты обладают антидепрессивной и антиагрессивной активностью, снижая время иммобилизации животных в тестах «поведенческого отчаяния» по Порсолту и порог возникновения агрессивной реакции. В литературе имеются сведения, что у фракции хмеля обыкновенного, содержащей -киcлoты, выявлено в эксперименте антидепрессивное действие (Lee К. et al., 1993; Zanoli Р. et al., 2005; 2007); аналогичным эффектом обладают: экстракт A. millefolium (Baretta I.P., 2012), галеновые лекарственные формы V. officinalis (Andreatini R., 2002; Occhiuto F. et al., 2009), экстракты и флавоноид вогонин S.

baicalensis (Hui К.М. et al., 2002; Jeong J.O. et аl., 2004), являющиеся компонентами «Ноофита» и «Анксиофита».

Ноотропную активность исследуемых фитоэкстрактов исследовали по выработке и сохранности условных рефлексов с отрицательным (активным и пассивным) и положительным подкреплением. Полученные в работе данные показывают, что использование ЭСХО, «Анксиофита» и «Ноофита» вызывает стимуляцию когнитивных функций у крыс, что выражается в ускорении выработки условных рефлексов и сохранности памятного следа в отдаленные после обучения сроки в тестах Т-образный лабиринт, УРПИ и УРАИ.

Наиболее выраженное ноотропное действие, превосходящее эффект препарата сравнения – пирацетама, проявляет «Ноофит» в дозе 5 мл/кг. При этом влияние «Ноофита» на формирование рефлекса с положительным подкреплением значимо не отличалось от действия ЭСХО и «Анксиофита», что, вероятно, обусловлено тем, что выработка данного рефлекса основана на активации исследовательской активности, за счет снижения у животных пассивно-оборонительной реакции, что более выражено у «Анксиофита». Выявленное ноотропное действие у комплексных фитоэкстрактов в большей степени обусловлено входящим в их состав S. baicalensis, обладающим ноотропными свойствами (Дамдинова Г.Х., 2001; Першина О.В. и др., 2005; Heo Н. et al., 2009; Jeong J.O., 2004). Комплексное воздействие на состояние нервной системы характерно и для M. piperita (Conforti F., 2008) и V.

officinalis (Valle-Mojica Del L.M. et al., 2011).

Таким образом, исследуемые растительные средства ЭСХО, «Анксиофит» и «Ноофит» обладают спектром нейропротективной активности, проявляя анксиолитическое, умеренное седативное, антиагрессивное, антидепрессивное и ноотропное действие. Установлено, что более выраженное анксиолитическое действие оказывает «Анксиофит», ноотропное – «Ноофит»;

при этом, с увеличением дозы снижаются ноотропнные свойства и увеличиваются седативные. По данным литературы, «полимодальность» психотропных эффектов, обусловленная сложностью механизмов нарушений психики, происходящих с участием многих нейромедиаторов, и общностью некоторых нейрохимических и нейрофизиологических звеньев этих нарушений (Бурчинский С.Г., 2005), характерна как для классических анксиолитиков и ноотропов (Александровский Ю.А., 2007; Машковский М.Д., 2010), так и для лекарственных средств на основе растений гинко билоба, родиолы розовой, шлемника байкальского и др. (Арушанян Э.Б., 2008). Так, классический ноотроп – пирацетам в дозе 200 мг/кг проявляет ноотропные свойства, а в дозе 400 мг/кг – анксиолитические (Воронина Т.А., 2000); подобный эффект присущ фенотропилу, афобазолу и др. (Васильева А.В., 2006; Волкова А.В., 2010; Дьякова И.Н., Гаврилин М.В., 2010; Самотруева М.А. и др., 2011).

Принимая во внимание, что психические и неврологические нарушения, возникающие на фоне интоксикаций, стрессовых, гипоксических и нейродегенеративных состояний сопровождаются выраженными структурными нарушениями в КБП и гиппокампе, фармакотерапевтическое влияние лекарственных средств должно быть направлено на купирование данного комплекса: снижение тревожных состояний, ослабление нарушений памяти и обучения, а также на предотвращение гибели нервных клеток, что характерно для истинных нейропротекторов в эксперименте и клинике (Полуэктов М.Г., Левин Я.И., 2008).

По мнению некоторых авторов (Lamy V. et al., 2007), восстановление нарушений функций мозга у лиц, склонных к злоупотреблению психоактивными веществами, идет двумя основными путями: восстановление изменений мозга, вызванных развитием пристрастия, и нормализация когнитивных и моторных функций, нарушенных вследствие повреждения и гибели мозговых клеток под влиянием этих веществ. Результаты наших исследований показали, что введение животным ЭСХО в дозе 200 мг/кг и «Анксиофита» в дозе 100 мг/кг на фоне длительной алкогольной интоксикации вызывало у крыс снижение чувства страха и тревоги. Так, в тесте «открытое поле» у животных указанных опытных групп наблюдалось увеличение вертикальной активности в 4,3 и 6,2 раза соответственно по сравнению с контролем; количество посещений центральных квадратов и показатели норкового рефлекса соответствовали таковым у крыс интактной группы, что указывает на превалирование ориентировочно-исследовательского поведения над хаотичным движением. При исследовании поведения животных в тесте ПКЛ установлено, что введение крысам ЭСХО и «Анксиофита» увеличивает количество заходов и время пребывания их в открытых рукавах лабиринта по отношению к контролю. При проверке сохранности памятного следа выявлено, что введение белым крысам на фоне алкогольной интоксикации ЭСХО, «Анксиофита» и «Ноофита» обеспечивает сохранность когнитивных функций.

При этом более выраженное влияние на консолидацию и воспроизведение памятного следа оказывает «Ноофит»: ЛП был выше показателя у крыс контрольной группы через 24 часа и 7 суток после выработки рефлекса в 2,3 и 2,7 раза соответственно.

Патоморфологическими исследованиями показано, что применение исследуемых фитосредств на фоне алкоголизации вызывало менее выраженные структурные изменения в КБП и гиппокампе. По данным морфометрических исследований введение животным ЭСХО и «Анксиофита» снижало количество резко гиперхромных нейронов на 49% и 39%, резко гипохромных на 42% и 37% и «клеток-теней» на 53% и 49% и, а также увеличивало число умеренно гипо- и гиперхромных клеток в среднем в 2,0 и 1,7 раза соответственно по сравнению с таковыми показателями животных контрольной группы (табл. 2). Применение «Ноофита» вызывало снижение количества резко гиперхромных нейронов в III слое на 24 % и резко гипохромных в V слое на 26%, а также выраженное уменьшение количества «клеток-теней» в указанных слоях КБП по сравнению с контролем (табл. 1). На фоне введения «Ноофита» происходило увеличение количества нормохромных, умеренно гипои гиперхромных клеток, повышение активности СДГ на микропрепаратах всех структур ГМ, что свидетельствует о повышении функциональной активности нейронов. На фоне введения животным ЭСХО и «Анксиофита»

количество гиперхромных нейронов в гиппокампе снижалось на 26% и 20%, «Ноофита» – на 44% по сравнению с таковым контрольных животных.

Выраженное стресспротективное и нейропротективное влияние исследуемых фитосредств установлено и на фоне стрессовых ситуаций. Курсовое введение животным ЭСХО, «Анксиофита» и НЦД оказывало выраженное снижение относительной массы надпочечников, увеличение относительных масс тимуса и селезенки по сравнению с показателями контрольных животных. На фоне эмоционального стресса применение ЭСХО и «Анксиофита»

увеличивало количество заходов в открытые рукава ПКЛ в среднем в 3,0 раза и время пребывания в них – в 3,7 и 2,4 раза по сравнению с показателями животных контрольной группы. Введение животным НЦД повышало указанные показатели по отношению к контролю соответственно в 7,5 и 7, раз, а также увеличивало в 2,1 и 6,6 раза горизонтальную и вертикальную активность в тесте «открытое поле». Оценка когнитивных функций показала, что введение белым крысам на фоне эмоционального стресса ЭСХО и «Анксиофита» вызывает сохранность памятного следа. Так, в указанных опытных группах на 4 сутки эксперимента рефлекс сохранялся у 60% животных, при 80% – в интактной группе. НЦД не проявляла ноотропное влияние при данном патологическом состоянии.

В другой серии экспериментов установлено выраженное противотревожное и антиамнестическое влияние ЭСХО на фоне СЖ: 30% животных данной опытной группы посетили однократно открытый рукав ПКЛ, время пребывания в нем в среднем составило 8 секунд (рис. 3); количество животных с сохранившимся рефлексом при проверке сохранности УРПИ было в 2,0 раза выше, чем в контрольной группе.

Результаты патоморфологических исследований ГМ показали, что курсовое введение животным ЭСХО и «Анксиофита» на фоне ЭС предотвращало развитие выраженных структурных изменений: количество гиперхромных пикнотических нейронов в КБП снижалось на 54% и 41%, нейронов с тотальным лизисом тигроидного вещества – на 28% и 31% и «клеток-теней» – на 57% и 52%; количество пикнотических нейронов в гиппокампе – на 25% и 43% соответственно по сравнению с таковыми показателями животных контрольной группы. На микропрепаратах ГМ животных, получавших ЭСХО на фоне СЖ, выявлено, что в среднем более 70 % от всей популяции клеток составляют функционально активные нейроны, находящиеся в состоянии умеренного гиперхроматоза или слабо выраженного хроматолиза (табл. 5), единично находили изменения, характеризующиеся наличием пикнотических нейронов, «клеток-теней», явлений сателлитоза и нейронофагии. Применение ЭСХО на фоне депривации сна снижало количество гиперхромных нейронов в гиппокампе на 26 % по сравнению с контролем.

Как показали проведенные исследования, ЭС сопровождается активацией симпато-адреналовой и гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной систем, о чем свидетельствует повышение уровня гормонов стресса: адреналина и норадреналина, АКТГ и кортизола в плазме крови, а также уменьшение концентрации катехоламинов и их метаболитов (метанефрина и норметанефрина) в гомогенате ГМ животных контрольной группы (табл. 6). Курсовое введение животным НЦД оказывало выраженное стресспротективное действие, о чем свидетельствует достоверное снижение содержания адреналина и норадреналина в плазме крови соответственно на 57% и 20% по сравнению с аналогичными данными крыс контрольной группы. Наряду с этим показано, что испытуемый препарат предотвращает гиперактивацию гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы, о чем свидетельстовало снижение уровня кортизола в крови животных опытной группы на 55% по сравнению с данными крыс контрольной группы, а также тенденция к снижению содержания АКТГ в плазме крови.

Таблица 5 – Влияние ЭСХО на количество (%) разных типов нейронов II-V слоев коры больших полушарий головного мозга белых крыс при стрессе Жуве; M±m; n = Полученные нами данные об истощении на фоне хронического эмоционального стресса запасов катехоламинов в ГМ согласуются с результатами других авторов (Белякова Е.И., Менджерицкий А.М., 2006), которые выявили дефицит катехоламинов в гомогенате ГМ при болевом стрессе. По данным литературы (Титкова А.М., Эпштейн О.И., 2002; Лелевич С.В. и др., 2010), нарушение серотонин- и норадренергических систем отмечается также при естественном старении, гипоксии, алкогольной и других интоксикациях. На фоне курсового введения ЭСХО, «Анксиофита» и «Ноофита» наблюдалось повышение содержания катехоламинов в гомогенате ГМ (табл.

6); применение НЦД увеличивало уровень метанефрина и норметанефрина в гомогенате ГМ в среднем на 62% по сравнению с данными контрольных животных. Способность ослаблять нарушения нейромедиаторных систем на фоне восстановления когнитивных функций в условиях хронического стресса выявлено у препаратов на основе гинкго билоба (Арушанян Э.Б., Бейер Э.В., 2008).

Таблица 6 – Влияние растительных средств на содержание катехоламинов в гомогенате головного мозга (нмоль/г ткани) белых крыс при эмоциональном стрессе; M±m; n = Интактная (Н2О) 130,0±12,50 472,9±15,91 227,1±2, Контрольная (стресс + Н2О) 1,3±0,01** 16,2±1,10** 13,2±1,12** Опытная (стресс + ЭСХО) 34,9±2,32* 75,7±4,54* 30,2±1,06* Опытная (стресс + «Анксиофит») 49,1±1,40* 37,9±2,21* 58,7±1,10* Опытная (стресс + «Ноофит») 55,7±2,19* 262,0±20,1* 33,8±0,98* В экспериментах на животных доказана высокая эффективность растительных адаптогенов в лечении дегенеративных заболеваний, в частности, БА. Так, препараты родиолы розовой и женьшеня улучшают когнитивные функции, защищают клетки ГМ от токсического действия -амилоидного пептида (Арушанян Э.Б., 2008). Полученные нами данные показывают, что применение «Ноофита» в дозе 5 мл/кг нормализует когнитивные функции, мышечный тонус, координацию движений, а также уменьшает чувство страха и тревоги у животных на фоне экспериментальной БА. Патоморфологическими исследованиями показано, что на фоне введения животным «Ноофита» наблюдалась более сглаженная гистологическая картина по сравнению с контролем: в наружном зернистом слое КБП не отмечался тотальный гиперхроматоз нейронов; в III слое выявлялись нейроны с умеренным хроматолизом, единичные «клетки-тени» и явления сателлитоза; в V слое наблюдались нейроны, в основном, с периферическим и центральным хроматолизом на фоне локально расположенных единичных гиперхромных клеток, не образующих очаговых скоплений. В результате чего общая гистологическая картина у животных опытной группы не выглядела так мозаично, как на микропрепаратах животных контрольной группы. Результаты морфометрических исследований КБП показали, что введение белым крысам «Ноофита» вызывало снижение количества резко гиперхромных, гипохромных нейронов и «клеток-теней» в среднем в 1,5 раза, а также увеличение количества нормохромных и умеренно гиперхромных клеток в 3,8 и 1,6 раза соответственно по сравнению с контролем. Использование «Ноофита» ограничивало в значительной мере развитие дистрофических и некротических изменений в гиппокампе животных, в результате чего количество регрессивных нейронов снижалось в 1,5 раза по сравнению с контролем.

Установленная фармакотерапевтическая эффективность «Ноофита» при нейродегенеративных нарушениях, вероятней всего, обеспечивается нейропротективными и нейротропными эффектами экстрактов S. baicalensis (Yune T.Y. et al., 2009, Zhang X.W. et al., 2011) V. officinalis (Valle-Mojica Del L.M. et al., 2011), и M. piperita (Lim J.S. et al., 2010). По данным литературы (Роговский В.С. и др., 2012) известно, что рутин и кверцетин предотвращают амнезию, индуцированную введением скополамина. Данные флавоноиды являются биологически активными веществами компонентов «Ноофита»: рутин входит в состав M. piperita (Гелла Э.В., 1980), кверцетин – P. aviculare (Chen Х., Cheng D., 2004).

По данным многочисленных исследований установлено, что гипоксия органов и тканей, особенно ГМ, возникает практически при любом патологическом процессе (Гипоксия…, 2000; Лукьянова, Л.Д., 2000; 2011; Новиков В.Е., Левченкова О.С., 2013). По мнению Т.А. Ворониной (2009), именно наличие противогипоксической активности в значительной степени определяет нейропротекторные свойства отдельных ноотропных препаратов. Полученные нами данные показывают, что ЭСХО, «Анксиофит» и «Ноофит»

проявляют антигипоксическое действие при нормобарической гипоксии с гиперкапнией, гемической и гистотоксической гипоксиях, увеличивая среднюю продолжительность жизни животных. На модели ишемического инсульта выявлен церебропротекторный эффект «Ноофита»: в опытной группе гибель животных составила 30 %, тогда как в контрольной группе – 70 %.

Высокой антиамнестической активностью нейропротекторы обладают и в условиях амнезии, вызванной гипоксией. Основными проявлениями нарушений интегративной функции после гипоксии служат сужение объема восприятия, затруднение усвоения новой информации, ухудшение качества запоминания, угнетение мотивации и переключение с одного вида деятельности на другой (Воронина Т.А., 2002). При проверке выработки УРПИ через 1 час, установлено (рис. 4), что на фоне введения животным ЭСХО ЛП был выше показателя животных контрольной группы на 27%. В опытных группах животных, получавших «Анксиофит» и «Ноофит», условный рефлекс выработался в 100 % случаях, тогда как в контрольной группе – у 50 % животных, в результате чего ЛП был в 2,2 раза выше такового в контроле. При проверке сохранности памятного следа выявлено, что на фоне введения животным ЭСХО и «Анксиофита» ЛП через 24 часа и 7 суток увеличивался в среднем в 1,5 и 1,7 раза соответственно по сравнению с данными животных контрольной группы. Наиболее выраженное антиамнестическое влияние проявлял «Ноофит», увеличивая ЛП через 24 часа и 7 суток по отношению к контролю в 3,5 и 2,7 раза соответственно.

Данные морфометрических исследований показывают, что введение «Ноофита» предотвращало развитие дистрофических и некротических процессов в КБП, индуцированных гипоксией, в результате чего, общее количество регрессивных нейронов снижалось на 41% по отношению к контролю.

На фоне введения указанного средства возрастало количество умеренно гипо- и гиперхромных нейронов в среднем в 1,9 раза по сравнению с показателями животных контрольной группы. При анализе клеточного состава гиппокампа и мозжечка выявлено, что у животных, получавших «Ноофит», количество гиперхромных нейронов в гиппокампе снижалось на 41 %, количество регрессивных клеток Пуркинье (в основном за счет резко гиперхромных) – в 2,0 раза по сравнению с данными животных контрольной группы.

Латентный период, % от контроля Результаты наших исследований показали (табл. 7), что 30-минутная гипобарическая гипоксия животных на «высоте» 9000 км приводит к снижению содержания АТФ и повышению соотношения лактат/пируват в гомогенате ГМ животных контрольной группы по сравнению с показателями интактных животных. На фоне введения животным исследуемых средств содержание АТФ в гомогенате ГМ было значительно выше показателя контрольных животных, а соотношение лактат/пируват соответствовало таковому крыс интактной группы. Вероятно, использование указанных фитоэкстрактов в условиях гипоксии вызывает регуляторное репрограммирование дыхательной цепи в сторону компенсаторной активации митохондриального комплекса – сукцинатдегидрогеназного пути окисления субстратов, благодаря чему предупреждаются или ослабляются нарушения синтеза АТФ, что согласуется с предположением Л.Д. Лукьяновой (2011).

Таблица 7 – Влияние растительных средств на показатели энергетического статуса головного мозга белых крыс на фоне гипоксии; M±m, n= АТФ, мкм/г 1,41±0,015 0,46±0,075** 0,76±0,112* 0,94±0,150* 1,25±0,075* ПВК, ммоль/г 0,15±0,042 0,09±0,004** 0,13±0,009 0,12±0,009 0,14±0,0290* МК, ммоль/г 0,31±0,034 0,37±0,026** 0,27±0,069 0,25±0,025* 0,28±0,056* Нейрон-специфическая енолаза (NSЕ) является маркером повреждения ГМ при различных патологических состояниях (Карякина Г.М. и др., 2007;

Nagdyman N. et al., 2003). Данные, представленные в таблице 8, показывают, что на фоне гипобарической гипоксии наблюдалось повышение содержания NSЕ в сыворотке крови белых крыс на 29% по сравнению с данными интактных животных, что подтверждается работой Е.И. Мурач и Е.И. Ерлыкиной (2013), в которой отмечается увеличение на фоне гипобарической гипоксии («высота» 12000 м) содержания NSЕ на 65 % по отношению к интакту.

Результаты исследований свидетельствуют, что наиболее выраженное нейропротективное действие проявляет «Ноофит»: содержание NSЕ в сыворотке крови достоверно снижалось на 18 % по сравнению с контролем. На фоне курсового введения животным ЭСХО наблюдалась лишь тенденция к снижению NSЕ в сыворотке крови.

Таблица 8 – Влияние растительных средств на содержание NSЕ в сыворотке крови белых крыс на фоне гипоксии; M±m, n= Свободнорадикальные процессы, повреждающие мембрану нейронов, принимают участие в базисных механизмах нарушений синаптической пластичности, когнитивных функций, тревожных расстройств. Многие ноотропы и анксиолитики обладают поликомпонентным механизмом действия, включающим и антирадикальные свойства (Дьякова И.Н., Гаврилин М.В., 2010). При этом анксиолитические и ноотропные свойства выявлены и у мексидола – препарата, относящегося к группе антигипоксантов с антиоксидантным действием (Воронина Т.А., 2009; Ерофеева С.Б., 2009). Многочисленные исследования показывают, что эффективными антиоксидантами являются флавоноиды (и содержащие их растения), для которых характерно:

радикал-утилизирующая активность в отношении активных форм кислорода (АФК) и вторичных продуктов ПОЛ, реализуемые при непосредственном взаимодействии с биорадикалами; хеллатирование металлов переменной валентности, участвующих в образовании свободных радикалов, что ограничивает продукцию АФК; ингибирование некоторых прооксидантных ферментов и/или активацию других эндогенных антиоксидантов (Азарова О.В., Галиктионова Л.П., 2012; Niki E., Nogochi N., 2000; Soobrattee M.A., 2005;

Apak R. et al., 2007). Отдельным механизмом антиоксидантного действия флавоноидов является стабилизация клеточных мембран, благодаря их способности проникать в липидный бислой мембран, изменяя их текучесть (Nijveldt R.J., 2001). Данные наших исследований показывают, что на фоне нормализации эмоционального статуса, когнитивных функций, а также структурных изменений в ГМ при всех исследуемых патологических процессах, применение ЭСХО, НЦД, «Анксиофита» и «Ноофита» вызывало ингибирование ПОЛ (снижение содержания МДА в сыворотке крови и гомогенате ГМ) и активацию АОС (увеличение активности каталазы в сыворотке крови и гомогенате ГМ, СОД в эритроцитах и содержания ВГ в крови). Выраженное антиоксидантное действие исследуемых фитопрепаратов подтверждается исследованиями в модельных системах. Так, в условиях in vitro выявлено, что «Анксиофит» (IC50=41 мкг/мл) и «Ноофит» (IC50 =35 мкг/мл) обладают выраженной антирадикальной активностью в отношении DPPH-радикала. В проявление данного вида активности комплексных фитосредств наибольший вклад вносит входящая в их состав M. piperita (IC50=39 мкг/мл). При изучении влияния «Анксиофита» и «Ноофита» на ряд активных форм кислорода (O2•-и NO) и ионы Fe2+ выявлено, что исследуемые средства обладают способностью к их инактивации. Fe2+-хелатирующая способность «Анксиофита»

(IC50=678 мкг/мл) и связывание NO (IC50=1110 мкг/мл) в большей степени обусловлена присутствием L. cardiacа (IC50Fe=133 мкг/мл; IC50NO=70 мкг/мл).

При этом Fe2+-хелатирующая способность L. cardiacа выше таковой препарата сравнения – аскорбиновой кислоты (IC50=150 мкг/мл). Активность «Анксиофита» в отношении связывания О2•- (IC50=320 мкг/мл) обусловлена за счет S. baicalensis (IC50=48 мкг/мл) и H. lupulus (IC50=65 мкг/мл). Fe2+хелатирующая способность «Ноофита» (IC50 = 660 мкг/мл) определена присутствием A. millefolium (IC50=110 мкг/мл), а именно входящими в его состав эфирными маслами и полифенольно-полисахаридным комплексом (SalukJuszczak J. et al., 2010, Vitalini S. et al., 2011). Активность «Ноофита»

(IC50=290 мкг/мл) в отношении связывания О2•- обусловлена присутствием в его составе S. baicalensis (IC50=48 мкг/мл), V. officinalis (IC50=51 мкг/мл) и R. carthamoides (IC50=59 мкг/мл). Связывание NO (IC50=1540 мкг/мл), вероятно, происходит за счет биологически активных веществ растений, входящих в состав «Ноофита»: R. carthamoides (IC50=210 мкг/мл), M. piperita (IC50=270 мкг/мл), V. officinalis (IC50=460 мкг/мл). Установлено, что исследуемые фитосредства «Анксиофит» (IC50=720 мкг/мл) и «Ноофит» (IC50 = мкг/мл) снижают скорость накопления ТБК-активных продуктов в модельной системе. Наиболее выраженный вклад в антиоксидантный эффект фитосборов вносят M. piperita и S. baicalensis, антиоксидантная активность которых подтверждена данными других авторов (HuangW.H. et al., 2006; Shang Y.Z. et al., 2006; Liang R. et al., 2009; Zhang X.W. et al., 2011). В экспериментах in vitro также установлено наличие выраженной мембраностабилизирующей активности исследуемых фитосредств в условиях перекисного и осмотического гемолиза эритроцитов. Мембраностабилизирующая активность исследуемых экстрактов на фоне перекисного гемолиза возрастает в ряду: ЭСХО (IC50=52 мкг/мл) < «Ноофит» (IC50=24 мкг/мл) < «Анксиофит»

(IC50=17 мкг/мл). Указанная закономерность отмечается и при осмотическом гемолизе: ЭСХО (IC50=65 мкг/мл)< «Ноофит» (IC50=9 мкг/мл)< «Анксиофит»

(IC50=8 мкг/мл).

Нейробиологические исследования последних лет показывают, что в патогенезе психических расстройств и неврологических заболеваний участвуют общие механизмы, в основе которых наблюдается торможение ГАМКергической передачи в ЦНС (Мартюшев-Поклад А.В., Воронина Т.А., 2003;

Тюренков И.Н. и др., 2011). С усилением ГАМК-ергического торможения связывают механизмы действия большинства применяемых в настоящее время анксиолитиков и ноотропов (Александровский Ю.А., 2007). В экспериментах также установлен инициирующий эффект на ГАМК-ергическую систему препаратов V. оfficinalis: производные валериановой кислоты уменьшают распад ГАМК в ГМ (Булаев В.М., 2011; Hellum B.N., 2009) и связываются с бензодиазепиновыми рецепторами ГМ животных (Circosta С.

et al., 2007; Zizovic I. et al., 2007). Снижение у животных на фоне введения ЭСХО, «Анксиофита» и «Ноофита» проконфликтного эффекта пикротоксина и бикукуллина, а также наличие у них выраженного противосудорожного действия на моделях камфорных, стрихниновых и коразоловых судорог, свидетельствует о том, что реализация нейропротекторного действия исследуемых фитоэкстрактов обеспечивается за счет участия ГАМК-ергической системы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в работе данные свидетельствуют об угнетающем влиянии АИ, ЭС, СЖ, скополамина, а также гипоксии на морфофункциональное состояние ГМ. Установлено, что АИ вызывает выраженные структурные изменения и снижение энергетического потенциала нейронов КБП, гиппокампа и клеток Пуркинье, а также связанные с ними нарушения процессов консолидации и воспроизведения памятного следа у животных. На фоне ЭС и СЖ отмечаются двигательная и эмоциональная заторможенность животных, когнитивные нарушения, выраженные морфофункциональные изменения ГМ, характеризующиеся увеличением количества регрессивных нейронов в КБП и гиппокампе на фоне подавления состояния моноаминергической системы ГМ. Выявлено, что при длительной инъекции скополамина (БА) у животных развиваются неврологические и когнитивные нарушения, сопровождающиеся состоянием тревоги и эмоционального дискомфорта. В КБП наблюдается увеличение количества гиперхромных клеток и клеток в состоянии набухания и хроматолиза, выявляются явления нейронофагии, сателлитоза и отложение липофусцина в нейронах. Длительная инъекция скополамина вызывает наиболее выраженные структурные изменения в гиппокампе, характеризующиеся не только тотальным гиперхроматозом нейронов, характерным для других патологических состояний, но и их лизисом, в результате чего отмечаются массивные очаги клеточного опустошения. Гипоксические состояния оказывают амнестическое влияние, увеличивают количество дистрофически измененных и пикнотических нейронов, а также «клеток-теней»

в КБП, мозжечке и гиппокампе, снижают энергетический потенциал ГМ.

Показано, что основными и общими механизмами повреждающего действия нервной системы при указанных патологических состояниях являются активация СРО липидов, снижение активности системы антиоксидантной защиты, дестабилизация мембранных структур нейронов, наряду с торможением нейромедиаторных систем.

Выявлено, что исследуемые растительные средства (ЭСХО, «Анксиофит»

и «Ноофит»), оказывают ноотропное действие, ускоряя выработку условных рефлексов с активным и пассивным избеганием, положительным и отрицательным подкреплением, улучшая сохранность памятного следа в отдаленные после обучения сроки; обладают антидепрессивным, антиагрессивным, умеренным седативным и анксиолитическим действием в условиях как наказуемого, так и ненаказуемого поведения. Показано, что у «Ноофита» более выражены ноотропные свойства, у «Анксиофита» – анксиолитическое действие; при этом, с повышением дозы фитосредства снижается ноотропная активность и повышается седативный эффект. Исследуемые растительные средства (ЭСХО, «Анксиофит» и «Ноофит») обеспечивают выраженную фармакотерапевтическую эффективность при длительной АИ, оказывая противотревожное и антиамнестическое влияния, уменьшая количество регрессивных нейронов в КБП, гиппокампе и мозжечке. На фоне стрессовых ситуаций (ЭС и СЖ) ЭСХО, НЦД и «Анксиофит» нормализуют у животных поведенческие реакции, снижая эмоциональное напряжение, оказывают антиамнестическое влияние, уменьшают количество регрессивных нейронов в КБП и гиппокампе, а также стимулируют моноаминергическую систему ГМ.

При экспериментальных нейродегенеративных и гипоксических состояниях «Ноофит» обеспечивает выраженную фармакотерапевтическую эффективность, нормализуя у животных поведенческие реакции, оказывая антиамнестическое влияние, подавляя свободнорадикальные процессы, активируя АОС организма, уменьшая количество регрессивных нейронов в структурах ГМ. Применение исследуемых средств на фоне гипоксии оказывает антигипоксическое, антиамнестическое влияние, повышает энергетический потенциал клеток ГМ и снижает содержание нейрон-специфической енолазы в сыворотке крови.

Основными фармакологическими механизмами, определяющими нейропротективное влияние растительных средств, являются стимуляция ГАМКергической и катехоламинергической нейропередач, нормализация энергетического обмена, а также их способность оказывать антиоксидантное, антирадикальное, мембраностабилизирующее, стресспротективное, антигипоксическое и церебропротекторное действие.

ВЫВОДЫ

1. Алкогольная интоксикация, эмоциональный стресс, депривация сна, длительная инъекция скополамина, а также гипоксические состояния оказывают выраженное угнетающее влияние на морфофункциональное состояние головного мозга, проявляя анксиогенное (снижение двигательной активности животных в тесте «открытое поле», количества заходов и времени пребывания в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта), амнестическое влияние (нарушение процессов консолидации и воспроизведения памятного следа в тестах УРПИ и УРАИ), понижая энергетический потенциал головного мозга (снижение содержания АТФ и повышение соотношения лактат/пируват в 2,0 раза по сравнению с данными интактных животных) и подавляя состояние моноаминергической системы (снижение содержания адреналина, норадреналина, дофамина, метанефрина и норметанефрина в гомогенате головного мозга по отношению к данным интактной группы), а также повышая содержание нейрон-специфической енолазы в сыворотке крови.

2. Указанные патологические состояния сопровождаются структурными изменениями в коре больших полушарий, гиппокампе и мозжечке головного мозга, характеризующиеся снижением количества функционально активных нейронов (нормохромных, умеренно гипер- и гипохромных), увеличением количества регрессивных нейронов (резко гипохромных, пикнотических, «клеток-теней»), явлений сателлитоза и нейронофагии; длительная инъекция скополамина вызывает более выраженные структурные изменения в гиппокампе, характеризующиеся не только тотальным гиперхроматозом нейронов, но и их лизисом с образованием массивных очагов клеточного опустошения.

3. Установлено что активация свободнорадикального окисления липидов (повышение содержания МДА в сыворотке крови и гомогенате головного мозга) и снижение активности системы антиоксидантной защиты (снижение активности каталазы в сыворотке крови и гомогенате головного мозга, СОД в эритроцитах и содержание восстановленного глутатиона в крови) являются основными и общими механизмами повреждающего действия нервной системы при патологических состояниях различного генеза; более выраженные указанные процессы отмечаются при экспериментальной БА: содержание МДА в гомогенате мозга повышается в 3,6 раза, активности каталазы в гомогенате мозга и СОД в эритроцитах снижается в 3,0 и 3,7 раза по сравнению с данными животных интактной группы.

4. ЭСХО, «Анксиофит» и «Ноофит» оказывают ноотропное действие, ускоряя выработку условных рефлексов с активным и пассивным избеганием, положительным и отрицательным подкреплением, улучшая сохранность памятного следа в отдаленные после обучения сроки; обладают анксиолитической, антидепрессивной, антиагрессивной и умеренной седативной активностью; при этом, «Ноофит» проявляет более выраженное ноотропное действие, «Анксиофит» – анксиолитическое; с увеличением дозы снижается ноотропное действие фитосредств и повышается седативный эффект.

5. Исследуемые средства – ЭСХО, «Анксиофит» и «Ноофит» в экспериментально-терапевтических дозах оказывают выраженное нейропротективное действие на фоне хронической алкогольной интоксикации, нормализуя поведенческие реакции, оказывая антиамнестическое и антиоксидантное влияние, снижая количество регрессивных и увеличивая количество функционально активных нейронов в структурах головного мозга; наиболее выраженный фармакотерапевтический эффект оказывает «Ноофит», в большей степени проявляя антиамнестическую активность и предотвращая развитие дистрофических и некротических процессов в гиппокампе.

6. ЭСХО, НЦД и «Анксиофит» в экспериментально-терапевтических дозах обеспечивают выраженную фармакотерапевтическую эффективность при хроническом эмоциональном стрессе: нормализуют эмоциональное состояние животных, улучшают когнитивные функции, стимулируют симпатоадреналовую систему, способствуют уменьшению образования дистрофически измененных и регрессивных форм нейронов в коре больших полушарий и гиппокампе, предотвращая истощение нейромедиаторных систем в головном мозге; ЭСХО в дозе 100 мг/кг оказывает выраженное нейропротективное влияние на фоне длительной депривации сна.

7. «Ноофит» проявляет выраженное нейропротективное влияние на модели болезни Альцгеймера, уменьшая неврологический дефицит, чувство страха и тревоги, восстанавливая эмоциональный статус, способствуя обучению и сохранению памятного следа, снижая количество дистрофических и некротических нейронов в структурах головного мозга, подавляя свободнорадикальные процессы и активируя антиоксидантную систему организма.

8. На фоне гипоксических состояний указанные растительные средства оказывают антигипоксическое и антиамнестическое влияние, стабилизируют энергетический потенциал головного мозга, повышая содержание АТФ и нормализуя соотношение лактат/пируват в головном мозге, снижают содержание NSE; наиболее выраженное нейропротективное влияние на фоне гипоксических состояний оказывает «Ноофит».

9. Основными фармакологическими механизмами, определяющими нейропротективное влияние растительных средств, являются стимуляция ГАМК-ергической и катехоламинергической нейропередачи, нормализация энергетического обмена, а также их способность оказывать антиоксидантное, антирадикальное, мембраностабилизирующее, стресспротективное, антигипоксическое и церебропротекторное действие.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты проведенных экспериментальных исследований позволяют рекомендовать растительные средства для включения в ветеринарную и клиническую практику с целью их применения в качестве эффективных и безопасных средств для лечения и профилактики тревожных расстройств и умеренных когнитивных нарушений.

2. Полученные результаты по стресспротективному действию указанных фитосредств позволяют рекомендовать их к применению для снижения отрицательного воздействия на организм стресс-факторов и профилактики заболеваемости в осенне-зимний период при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных.

3. Наличие у исследуемых растительных средств выраженного анксиолитического и антидепрессивного действия позволяют их рекомендовать к применению в зооветеринарной практике для нормализации нарушений физиологического статуса животных, возникающих на фоне технологических стрессоров: формирование групп животных, проведение ветеринарнопрофилактических и зоотехнических мероприятий (вакцинация, санитарная обработка животных, взвешивание, кастрация), транспортировка и др., что позволит снизить экономические затраты, связанные со снижением продуктивности животных.

4. Полученные данные могут быть использованы в экспериментальной работе кафедр биологических, медицинских и ветеринарных факультетов высших учебных заведений, а также лабораторий научно-исследовательских учреждений, занимающихся изучением механизмов развития неврологических и психических расстройств и вопросами их фармакологической коррекции лекарственными средствами растительного происхождения.

5. Полученные результаты позволяют использовать данные материалы при написании учебно-методических изданий, монографий по патологии, морфологии животных, патофизиологии, нейрофармакологии и фитотерапии, а также в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий, семинаров на биологических, медицинских и ветеринарных факультетах высших учебных заведений.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ 1. Убашеев И.О. Антигипоксическое действие многокомпонентного растительного средства / И.О. Убашеев, Я.Г. Разуваева, В.Н. Прокопьев, Е.П. Багинова // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 11: Медицина. – 2003. – Вып. 3.

– С. 141-144.

2. Лоншакова К.С. Влияние фитосбора «Ноофит» на нарушения когнитивных функций у белых крыс, вызванных острой гипоксией с гиперкапнией / К.С. Лоншакова, Я.Г. Разуваева, И.О. Убашеев, В.Н. Прокопьев // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 11: Медицина. – 2004. – Вып.4 – С. 59-64.

3. Разуваева Я.Г. Структурные изменения нейронов гиппокампа у белых крыс на фоне алкогольной интоксикации / Я.Г. Разуваева, К.С. Лоншакова, И.О. Убашеев, В.Н. Прокопьев // Морфология. – 2004. – №4. – С. 103.

4. Разуваева Я.Г. Нейропротекторное действие комплексного растительного средства «Ноофит» при алкогольной интоксикации у белых крыс / Я.Г. Разуваева, И.О.

Убашеев, К.С. Лоншакова, В.В. Жапова // Сибирский медицинский журнал. – 2005.

– Т. 51, № 2. – С. 67-70.

5. Разуваева Я.Г. Антиамнестическое действие растительного средства «Ноофит» / Я.Г. Разуваева, К.С. Лоншакова, И.О. Убашеев, В.Н. Прокопьев // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 11: Медицина. – 2005. – Вып.4. – С.

204-209.

6. Разуваева Я.Г. Влияние комплексного растительного средства «Ноофит» на структурные изменения в коре больших полушарий головного мозга крыс при алкогольной интоксикации / Я.Г. Разуваева, К.С. Лоншакова, И.О. Убашеев, В.В. Жапова // Вестник Бурятского государственного университета. Серия 11: Медицина. – 2006. – Вып. 4. – С. 184-188.

7. Разуваева Я.Г. Морфофункциональная оценка нейропротекторного действия экстракта многокомпонентного растительного средства «Полиноофит» при гипобарической гипоксии / Я.Г. Разуваева, Л.Д. Дымшеева, Г.Х. Дамдинова, И.Г. Николаева // Сибирский медицинский журнал. – 2006. – Т. 62, № 4. – С. 63-65.

8. Намсараева Г.Т. Ноотропное и антигипоксическое влияние комплексного растительного средства «Ноофит» и перспективы его применения в новых технологиях восстановительной медицины / Г.Т. Намсараева, А.Н. Разумов, Я.Г. Разуваева, С.М.

Николаев, В.К. Фролков, В.В. Аюшеева, С.В. Цыремпилов // Вестник восстановительной медицины. – 2009. – № 4. – С. 7-10.

9. Разуваева Я.Г. Влияние комплексного растительного средства «Полиноофит» на сохранность условного рефлекса пассивного избегания у белых крыс в постнаркозном состоянии / Я.Г. Разуваева, М.Ю. Итыгилов, С.А. Чукаев, А.А. Торопова, И.Г.

Николаева // Сибирский медицинский журнал. – 2009. – Т. 91, № 8. – С. 130-132.

10. Кабачук Н.В. Антигипоксическое действие соплодий Humulus lupulus L. / Н.В.

Кабачук, Я.Г. Разуваева // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2010. – № 3(67). – C. 185Разуваева Я.Г. Стресспротективное действие экстракта соплодий Humulus lupulus L. / Я.Г. Разуваева, Н.В. Кабачук, Т.А. Ажунова, О.В. Нагаслаева // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. – 2010. – № 2 (72). – С. 210-212.

12. Разуваева Я.Г. Антиамнестическое действие комплексных растительных средств из арсенала традиционной медицины / Я.Г. Разуваева, С.М. Николаев, А.О. Занданов, С.В. Цыремпилов, А.А. Гулевич, В.В. Аюшеева // Сибирское медицинское обозрение. – 2010. – Т. 61, № 1. С. 43-47.

13. Разуваева Я.Г. Влияние соплодий хмеля обыкновенного (Humulus lupulus L.) на функциональное состояние нервной системы белых крыс / Я.Г. Разуваева, С.М. Николаев, Н.В. Кабачук, О.В. Нагаслаева // Сибирский медицинский журнал. – 2010. – Т. 92, № 1. – С. 115-117.

14. Разуваева Я.Г. Оценка влияния сухого экстракта Comarum palustre L. на функциональное состояние центральной нервной системы. К обоснованию перспектив его применения в восстановительной медицине / Я.Г. Разуваева, А.Н. Разумов, С.М. Николаев, И.П. Бобровицкий // Вестник восстановительной медицины. – 2010. – № 3, Ч.2. – С. 60-62.

15. Разуваева Я.Г. Психотропное действие экстракта соплодий Humulus lupulus L. / Я.Г. Разуваева, С.М. Николаев, Н.В. Кабачук, О.В. Нагаслаева // Вестник Бурятского государственного университета. Серия: Медицина. – 2010. – Вып.12. – С. 41-45.

16. Итыгилов М.Ю. Фармакотерапевтическая эффективность растительного средства «Полиноофит» при коррекции токсического действия тиопентала натрия / М.Ю.

Итыгилов, Я.Г. Разуваева, С.А. Чукаев, А.А. Торопова, Л.Д. Дымшеева // Вестник Бурятского государственного университета. Серия: Медицина – 2010. – Вып.12. – С. 96-100.