[
На правах рукописи
ГАЙСИНА ЮЛИЯ РАМИЛЕВНА
ОСОБЕННОСТИ МИКРОБНОГО ПЕЙЗАЖА, ЭНДОТОКСИНЕМИИ И
ПОКАЗАТЕЛЕЙ ГЕМОСТАЗА У ЖЕНЩИН С БАКТЕРИАЛЬНЫМ
ВАГИНОЗОМ
03.02.03 – Микробиология
03.01.04 – Биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Уфа – 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации Научные руководители:
доктор медицинских наук, профессор Мавзютов Айрат Радикович доктор медицинских наук, профессор Гильманов Александр Жанович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Оренбургский научный центр РАМН, зав. лабораторией клеточного симбиоза Гриценко Виктор Александрович доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Тюменская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России, зав. кафедрой биохимии Галян Сергей Леонидович
Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации.
Защита состоится «» 2013 года в «_» часов на заседании Диссертационного совета Д 208.117.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 454092, г. Челябинск, ул. Воровского 64.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
Автореферат разослан «_»2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, доцент Л.С. Латюшина
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема дисбиотического нарушения микробиоценоза влагалища ввиду его широкой распространенности считается одной из наиболее актуальных в акушерской и гинекологической практике. Частота бактериального вагиноза (БВ) у беременных составляет в среднем 14-20 %, а в группах повышенного риска она возрастает до 30-38% (Анкирская А.С., 2005). Изменение микробиоты влагалища у хирургических больных в гинекологических стационарах наблюдается в 45-86% случаев и является основой послеоперационных инфекционных осложнений. В патогенезе последних нередко наблюдаются расстройства микроциркуляции, связанные чаще всего с нарушениями в системе гемостаза (Ness R.B. et al., 2005).
Поскольку одним из факторов патогенности грамотрицательных бактерий является капсульный липополисахарид (ЛПС), можно предположить определенную роль микробных эндотоксинов в развитии указанных выше осложнений.
Учитывая такие особенности патогенеза бактериального вагиноза, как дезинтеграция эпителиального слоя слизистой протеолитическими ферментами, незавершенность фагоцитоза (Кира Е.Ф., 2001), возможно проникновение ЛПС грамотрицательных бактерий через влагалищную стенку в венозные и лимфатические сосуды паравагинальной клетчатки и попадание в дальнейшем в системный кровоток. Предположительные изменения гемостаза при БВ еще очень мало изучены, а имеющиеся сведения разрознены и не имеют интегрированного обобщения.
Цель исследования. Определить особенности микробного пейзажа влагалища, выраженность эндотоксинемии и ассоциированных с ней сдвигов гемостаза у женщин с вагинальным дисбиозом.
Задачи исследования.
1. Оценить встречаемость бактериального вагиноза и состояние вагинальной микрофлоры у женщин репродуктивного возраста.
2. Изучить уровень эндотоксинемии, выраженность острофазового ответа и антиэндотоксинового иммунитета у женщин с дисбиозом влагалища.
3. Определить состояние системы гемостаза, антикоагулянтной системы и параметров дисфункции эндотелия в связи с особенностями клинической и микробиологической картины вагиноза и эндотоксинемии у женщин репродуктивного возраста.
4. Обозначить патогенетическое значение обнаруженных сдвигов, определить необходимость и направление подходов их коррекции.
Научная новизна исследования. Установлено, что влагалищная микробиота женщин при бактериальном вагинозе характеризуется повышением общей микробной обсемененности на фоне существенного уменьшения концентрации Lactobacillus spp., с превалированием аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий. Определена этиологическая роль представителей семейства Mycoplasmataceae, в частности М. hominis и U. urealyticum в развитии бактериального вагиноза.
У женщин с бактериальным вагинозом выявлено умеренное повышение уровня ЛПС грамотрицательных бактерий в системном кровотоке, сопровождающееся активацией неспецифического иммунитета, с существенным повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-), увеличением плазменной концентрации главного острофазового реактанта - С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Особенностью специфического иммунного ответа при БВ является увеличение выработки антител к core-региону ЛПС и тенденция к активации синтеза ЛПСсвязывающего белка – LBP на начальных этапах БВ и их снижением при утяжелении дисбиоза.
При БВ в условиях системной эндотоксинемии впервые показаны: развитие слабых гипокоагуляционных сдвигов (незначительное удлинение АЧТВ и ПВ, неизменность уровня фибриногена, D-димера и РФМК), тенденция к активации антикоагулянтного звена с увеличением уровня плазменного антитромбина и протеина С, коррелирующая с выраженностью дисбиоза. Реакция эндотелиальной системы проявлялась умеренно выраженной тенденцией к нарастанию уровня эндотелина, адгезивных молекул sPECAM-1 и sVCAM-1 и снижению концентрации фактора Виллебранда по мере утяжеления дисбиотического процесса. В целом отклик системы гемостаза носил адаптивный характер и свидетельствовал о компенсированности эндотоксинового воздействия, вместе с тем, допуская возможность выхода из-под контроля при продолжающейся эндотоксической агрессии и развития осложнений вплоть до ДВС крови.
Теоретическая и практическая значимость работы. Определены подходы к оценке значимости выявления этиологического фактора при вагинозах у женщин репродуктивного возраста, диагностическая значимость определения уровня циркулирующих эндотоксинов и компонентов антиэндотоксиновой защиты, а также сдвигов параметров гемостаза. На основании обнаруженных изменений сформулированы подходы к выявлению и коррекции сдвигов гемостаза и эндотелиальной дисфункции на фоне эндотоксинемии при бактериальном вагинозе, предполагающие контроль состояния гемостаза при декомпенсации БВ и, при необходимости, принятие коррегирующих мер.
Положения, выносимые на защиту:
1. Бактериальный вагиноз у женщин возрастной категории 20-29 лет обнаружен в 65% случаев. Видовой и количественный состав влагалищной микрофлоры при вагинозе характеризуется повышением общей микробной обсемененности на фоне снижения количества Lactobacillus spp. и преобладания аэробных и факультативно-анаэробных грамотрицательных бактерий; во всех случаях наблюдаются ассоциации микроорганизмов. Грамотрицательная микрофлора при бактериальном вагинозе в основном представлена бактериями семейства Enterobacteriaceae.
2. При прогрессировании бактериального вагиноза наблюдается тенденция к нарастанию уровня липополисахарида грамотрицательных бактерий в плазме крови пациентов.
Бактериальный вагиноз сопровождается активацией неспецифического иммунитета с повышением уровня провоспалительных цитокинов (IL-2, IL-6, TNF-) и плазменной концентрации С-реактивного белка, уровень которого четко коррелирует с выраженностью вагинального дисбиоза. Специфический иммунный ответ организма на начальных этапах бактериального вагиноза проявляется умеренным повышением концентрации липополисахарид-связывающего белка и нарастанием титров антител к core-региону липополисахарида с последующим их снижением при утяжелении дисбиоза.
При бактериальном вагинозе отмечается умеренно выраженная тенденция к гипокоагуляции - незначительное удлинение активированного частичного тромбопластинового времени и протромбинового времени на фоне неизменного уровня фибриногена и отсутствия маркеров активации свертывания крови. Реакция антикоагулянтного звена заключается в тенденции к увеличению плазменной антитромбиновой активности и возрастанию уровня протеина С.
В условиях дисбиоза отмечается вовлеченность клеток сосудистого эндотелия в антиэндотоксиновые реакции с относительным ростом уровня молекул адгезии sPECAM-1 и sVCAM-1 и фазными изменениями уровня маркеров эндотелиальной дисфункции (эндотелин-1, фактор Виллебранда).
Поступление липополисахарида грамотрицательных бактерий в организм при бактериальном вагинозе в целом не вызывает иммунопатогенного эффекта, не выходит за рамки «физиологической системной эндотоксинемии» и может служить фактором поддержания иммунного гомеостаза организма.
Внедрение результатов исследования в практику. Результаты исследования внедрены в работу женской консультации и гинекологического отделения МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы, а также в учебный процесс кафедры лабораторной диагностики ИПО ГБОУ ВПО «Башкирский Государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Апробация. Материалы диссертации представлены на международных, всероссийских, региональных научно-практических конференциях (IV международный конгресс «Проблемы репродукции» (Москва, 2010); II ежегодный Всероссийский Конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2010); IV региональный научный форум «Мать и дитя» (Екатеринбург, 2010); IX Всероссийский научный форум «Мать и дитя» (Москва, 2007); I региональный научный форум «Мать и дитя» (Казань, 2007); 21 конгресс Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины (Берлин, 2011). Апробация работы состоялась на совместном заседании сотрудников кафедр лабораторной диагностики ИПО, фундаментальной и прикладной микробиологии ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития РФ.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 работ, в том числе 6 - в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации основных результатов диссертаций на соискание ученой степени кандидата медицинских наук.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах компьютерного текста, содержит 16 таблиц, 18 рисунков, включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследования, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, заключение, выводы, практические рекомендации и список использованной литературы, включающий 98 отечественных и 103 зарубежных авторов.
Конкурсная поддержка работы. Работа выполнена при поддержке федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг., в рамках реализации мероприятия 1.2.1 «Государственный контракт № П385 от 30 июля 2009 г.»
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Объектом исследования явились женщин репродуктивного возраста, обратившиеся в женскую консультацию МУ «Городская клиническая больница № 21» города Уфы в 2009-2010 годы. Из них 183 здоровых составили контрольную группу; у 122 женщин, составивших основную группу наблюдения, был поставлен диагноз БВ. Проводили анкетирование (возраст, характер профессии, некоторые социально-демографические сведения), регистрировали данные акушерско-гинекологического анамнеза, жалобы на момент поступления, данные объективного и вагинального осмотров, результаты клинико-лабораторных и специальных исследований.
Для оценки микроскопической картины влагалищного биоценоза проводили световую микроскопию окрашенных по Граму мазков (микроскоп Люмам-Р8, ЛОМО, г. Санкт-Петербург). Степень дисбиоза влагалища определялась микроскопически по критериям, предложенным Мавзютовым А.Р. и соавт. (2001). Количественно и качественно влагалищный микробиоценоз характеризовали культуральным методом у 45 женщин основной группы и 26 клинически здоровых женщин на соответствующих питательных средах. Для культивирования использовались сухие коммерческие питательные среды производства НПО «Питательные среды» (г. Махачкала) и фирмы «Вio-Merieux» (Франция). Микроорганизмы культивировали в термостате при 37оС, дрожжеподобные грибы - при 22оС. Микроаэрофилы (G. vaginalis, Lactobacillus spp.) выращивали в эксикаторах с использованием газ–паков GEN Bag Anaer фирмы «Bio-Merieux», Франция. По окончании инкубации производился подсчет всех выросших колоний (КОЕ) и пересчет на 1 мл клинического материала. Результаты бактериологического исследования выражали в КОЕ/мл и рассчитывали десятичный логарифм колониеобразующих единиц – lg КОЕ/мл (логарифмическое микробное число). В качестве критериев нормоценоза учитывали микробную обсемененность 106-108 КОЕ/мл. а условнопатогенными микроорганизмами - не более 104 КОЕ/мл Микроорганизмы идентифицировали по биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем «ЛАХЕМА», Чехия (Strepto-test, Stafi-test, Entero-test, EnteroRapidtest, Neferm-test); «Bio Merieux», Франция (ID 32 E, ID 32 Staf, ID 32 Strep, ID GN, ID 32 Cand, ID 32 A); НПО «Диагностические системы», г. Н.Новгород (ПБДЕ, ПБДС). Методом ПЦР определялись специфические фрагменты ДНК Chlamydia trachomatis, Trichomonas vaginalis, Neisseria gonorrhoeae с использованием стандартных наборов («Интерлабсервис», «Литех», «ДНК-технология», Россия) на амплификаторе «Терцик МС-2» («ДНК-технология», Россия). Этиологическую значимость M. hominis и U. urealyticum оценивали методом ИФА с использованием тест-систем фирмы «Вектор-Бест» (Россия).
Для оценки уровня эндотоксина в плазме крови и выраженности антиэндотоксинового иммунитета у 122 женщин с БВ (основная группа) и 183 здоровых женщин из группы контроля в сыворотке крови были определены концентрации липополисахаридов, липополисахарид-связывающего белка (LBP) и титров IgG к соre-региону липополисахарида (IgG EndoCab) в плазме крови. Пациентки из основной группы по выраженности БВ были разделены на три подгруппы: 1-ю подгруппу составили 26 (21%) женщин с первой степенью дисбиоза; 2-ю - 10 (8%) пациенток со второй степенью; 86 (70%) с 3-й степенью дисбиоза влагалища – 3ю подгруппу наблюдения. Для определения уровня ЛПС использовали тест-набор ENDOSAFE® ENDOCHROME™ («HyСult biotechnology», Голландия). Предел чувствительности метода - 0,01 EU/мл, диапазон измеряемых концентраций - от 0,01 до 10 EU/мл. Тест основан на способности липополисахарида вызывать коагуляцию белковых фракций гемолимфы амебоцитов краба Limulus polyphemus.
Количественное определение человеческого LBP и IgG EndoCab-антител в плазме крови осуществляли иммуноферментным методом при помощи наборов Hbt human LBP ELISA и Hbt EndoCab ELISA («HyСult biotechnology», Голландия).
Концентрации в плазме крови TNF-, IL -1, IL-2, IL-6, IL-8 и противовоспалительных цитокинов (IL- 4, IL - 10) определяли методом ИФА («Вектор-Бест», Россия), СРБ - при помощи набора hsCRP ELISA, («Biomerica», Австрия).
Для определения скрининговых параметров плазменного звена гемостаза (АЧТВ, ПВ, уровень фибриногена) использовали клоттинговый метод. Материалом служила свежая цитратная плазма, исследование проводили с помощью коагулометра АСКа-2-01 фирмы «Астра» (Россия) с использованием тест-наборов фирмы «Технология Стандарт» (Россия). Определение маркеров дисфункции эндотелия (фактор Виллебранда, большой эндотелин-1, sPECAM-1, sVCAM-1) в плазме крови применялся ИФА-метод с использованием наборов: Technozym vWF Ag ELISА, производства «Technoclone» (Австрия); BIG ENDOTHELIN («Biomedica Gruppe», Австрия); «Bender MedSystems». При определении маркеров активации свертывания (РФМК, D-димер) применялся метод экспресс-оценки содержания в плазме крови РФМК - паракоагуляционный о-фенантролиновый тест (НПО «РЕНАМ», Россия); полуколичественный метод латекс-агглютинации с использованием стандартных тест-систем «Tulip Diad», (Индия) для D-димера. Для определения концентрации факторов антикоагулянтной системы (АТ-III, протеин С) в плазме крови использовали количественный ИФА-набор Technozym Protein C ELISA, фирмы «Technoclone» (Австрия) и тест-систему Аntithrombin ELISA (фирма Siemens, Германия). Иммуноферментные исследования проводились на ИФА-анализаторе «BioRad iMark» (США).
Обработка данных осуществлялась с применением современных пакетов прикладных программ математико-статистического анализа (Реброва О.Ю., 2003).
Характер распределения количественных признаков оценивался по критерию Колмогорова-Смирнова. Если показатель имел нормальное распределение, то применялись методы параметрической статистики (расчет средней арифметической и ее стандартной ошибки, критерия Стьюдента, коэффициента линейной корреляции Пирсона). Для показателей, не имеющих нормального распределения, вычислялась медиана и проводился ранговый анализ по методу КраскелаУоллиса. Достоверность различий количественных показателей оценивалась по критерию Манна-Уитни, а относительных показателей - по 2-критерию Пирсона.
С целью проверки гипотезы о влиянии степени дисбиоза влагалища на уровень эндотоксина (LAL) и иммунного ответа (LBP и антитела к сore-региону) нами был использован метод однофакторного дисперсионного анализа. Результаты анализа выражались через коэффициент силы влияния фактора, показывающий долю (в %) вариации исследуемого признака под действием контролируемых факторов, и критерии достоверности влияния - критерий F, и его уровень значимости p. Влияние фактора менее 5% в расчет не принималось. Результаты дисперсионного анализа по Фишеру интерпретировались по значению r - коэффициента корреляции количественного признака с качественным или категориальным; в роли фактора выступали как количественные, так и качественные переменные. Результаты также представлялись в виде «отклика» переменной на действие фактора или сочетаний факторов – средних значений переменных (с указанием границ их вариации) при различных градациях фактора. Для сравнения отдельных средних значений использовался критерий Fd (Гареев Е.М., 2009).
«