БИОЛОГИЯ Биогенные оксиды азота

Б И О Г Е Н Н Ы Е О К С И Д Ы А З О ТА

Б И О Г Е Н Н Ы Е О К С И Д Ы А З О ТА

А.А. Недоспасов, Н.В. Беда

Андрей Артурович Недоспасов, доктор химических наук, заведующий группой

энзиматического анализа Института молекулярной генетики РАН. Руководитель проекта 02-04-49530.

Наталия Владимировна Беда, младший научный сотрудник той же группы.

Руководитель проекта 03-04-06492.

Мицеллярное окислительное нитрозирование Оксиды азота, в классическом понимании, — термодинамически неустойчивые вещества, состоящие из азота и кислорода. Биохимики и физиологи часто используют более широкое понимание этого термина: наряду с истинными (в химическом смысле) оксидами, к ним относят гидратированные формы, в том числе азотную (HNO3) и азотистую (HNO2) кислоты, и соответствующие ионы (нитрат, нитрит), а также пероксиды и другие соединения со связями NOO. С учетом изомерии общее число всех этих веществ составляет несколько десятков, что достаточно для образования практически бесконечного количества комплексов с ионами металлов и всевозможными метаболитами.

Поскольку реальные процессы in vivo протекают и регулируются именно через эти комплексы, биохимия оксидов азота воистину неисчерпаема.

Все оксиды азота, за исключением N2O, ядовиты — именно их присутствие в выхлопных газах контролирует автоинспекция; именно их примесями в табачном дыме объясняли повышенную частоту рака легких среди курильщиков, т.е. с детства оксиды азота ассоциируются у нас с неприятностью, опасностью, ущербом для здоровья.

Естественно, все они были всесторонне изучены химиками, нашли важные применения в химической индустрии и прикладных дисциплинах, их повсеместно изучали в курсах общей и неорганической химии, т.е. они были широко известны уже в начале XX в. не только из повседневного опыта (порох, взрывчатые вещества, лекарства, удобрения, красители и др.), но и из художественной литературы (например, «Гиперболоид инженера Гарина»). Эта известность была в значительной степени кажущейся, а в истории открытия и исследования биогенных оксидов азота она часто играла роль ингибитора.

Напомним известные из школьного курса химии уравнения реакций, описывающих получение азотной кислоты:

4NH3+ 5O2= 4 NO + 6H2O, (1) 2NO + O2 = 2NO2, (2) 2NO2 + H2O = HNO2 + HNO3, (3) или: 3NO2 + H2O = 2HNO3 + NO. (3,a) Казалось, в нашем организме таких реакций быть не может. К середине XX в. оксиды азота воспринимались как вещества, несовместимые с какими-либо нормальными физиологическими процессами у высших животных. Наличие естественных источников оксидов азота в организме человека представлялось настолько противоречащей здравому смыслу и всей сумме химических знаний, что всерьез не рассматривалось десятки лет.

Открытие синтеза NO в клетках млекопитающих и его роли в расширении кровеносных сосудов, стало одним из наиболее неожиданных и парадоксальных открытий естествознания, и было отмечено в 1998 г. Нобелевской премией. Один из парадоксов состоит в том, что in vivo оксиды азота ранее многократно наблюдали, но не замечали, не верили собственным глазам и чужим экспериментам или не понимали, что они означают. Теперь трудно понять, как в течение десятилетий можно было «не видеть» давно знакомых химикам веществ, играющих ключевые роли в регуляции кровообращения, отвечающих за формирование БИОЛОГИЯ Биогенные оксиды азота памяти и участвующих в передаче внутри и межклеточной информации, дифференцировке тканей и иммунных реакциях, веществ, непосредственно связанных с наиболее опасными болезнями, включая инфаркты и инсульты, рак и диабет, инфекционные заболевания и септический шок.

Биосинтез NO был открыт в 1987 г. благодаря активации им гуанилатциклазы (ведущая роль этого фермента в расширении кровеносных сосудов была известна и ранее), которая осуществляется при взаимодействии NO с атомом железа гема с образованием связи FeN.

Путь к этому открытию был долог и тернист. Первой заметной вехой была работа П.

Митчелла и соавторов 1916 г.: любознательные исследователи пытались выяснить, откуда берется нитрат, выводимый с мочой человека и животных. В те годы удобных методов анализа нитрата не существовало — его определяли взвешиванием в виде KNO3 (калийной селитры, использовавшейся для получения пороха). Современному химику-аналитику остается только восхищаться мастерством, трудолюбием и терпением исследователей, которые ежедневно в течение нескольких месяцев количественно (!) кристаллизовали нитрат из мочи лабораторных животных и собственной, а для сравнения — из образцов еды и напитков, эквивалентных съеденным / выпитым за сутки. Диета экспериментаторов не отличалась однообразием или ограниченностью источников продуктов — каждодневно анализ нитрата в пище проводили заново. Вывод не вызывал сомнений: человек выделяет нитрата больше, чем потребляет с пищей. Иными словами, какие-то соединения азота окисляются в организме в нитрат. Увы, авторы слишком опередили время — это замечательное открытие оставалось фактически не востребованным более 60 лет.

У млекопитающих NO образуется при окислении аргинина — природной аминокислоты, входящей в состав белков, и расходуется в серии конкурирующих реакций (рис.1). Благодаря циклам, возвращающим продукты окисления обратно в NO, его синтез in vivo продолжается даже после полной блокады NO-синтаз. Интересно, что ингибиторы этих ферментов используются в медицине для защиты от перепроизводства NO, обычного при септическом шоке («заражение крови») и некоторых инфекциях.

Рис.1. Схема биосинтеза NO и основных метаболических путей оксидов азота. NO, первоначально образующийся из аргинина под действием NOS (1), вступает во множество конкурирующих реакций:

комплекс кислорода с гемоглобином (HbO2) и другими гемсодержащими белками окисляет его в нитрат, NO3 (2); при взаимодействии с супероксидным радикалом он образует перосинитрит (OONO) (3); небольшие количества NO восстанавливаются до N2O БИОЛОГИЯ Биогенные оксиды азота (4) и даже до аммония. NO окисляется до диоксида NO2 (5), дающего смесь других оксидов азота (изомеры N2O3 иN2O4). Все высшие оксиды реакционноспособны; показано нитрозирование тиолов (RSH) с образованием тионитритов (RSNO) и ионов нитрата (NO3) или нитрита (NO2). Как и NO, RSNO вызывают расширение сосудов. NO2 и RSNO могут снова превращаться в NO; восстановление нитрата у млекопитающих малоэффективно. Избыток NO ингибирует NOS (цветная стрелка).

Среднее время жизни молекулы NO в организме человека — менее пяти секунд, а для тионитритов (нитрозотиолов, RSNO — см. рис.1), в зависимости от радикала R, составляет десятки минут и даже часы. По этой причине основная масса оксидов азота, вовлеченных в круговорот, приходится не на NO, а на продукты его окисления, которые и образуют депо оксидов азота. У человека и многих млекопитающих восстановление нитрата в нитрит с обычных условиях малоэффективно — основная часть образовавшегося нитрата выводится с мочой.

Таким образом, баланс между реакциями окисления NO регулирует количество обращающихся в цикле оксидов азота, а, следовательно, и все зависящие от них физиологические процессы. Ясно, что изучение механизмов сохранения или изменения этого баланса и активности NO-синтаз (двух путей поддержания пула оксидов азота) — фундаментальная проблема биохимии, имеющая важнейшие практические приложения.

В организме наиболее многочисленны реакции оксидов азота, обеспечивающие их участие в регуляции активности белков, а через них и генов. Это реакции нитрования, нитрозилирования (введение остатка нитрозила под действием NO — электрофильная реакция), нитрозирование (введение радикала (NO — свободнорадикальный механизм) с образованием связей CN, NN, SN, ON (рис.2). Среди них лучше всего изучено нитрозилирование SH групп остатков цистеина, т.е. превращение их в нитрозотиолы RSNO (R — остаток цистеина белковой молекулы).

Рис.2. Основные типы химических реакций (нитрозирование, нитрозилирование, нитрование, окисление) и продуктов биогенных оксидов азота. (В биохимической литературе термины нитрозирование и нитрозилирование часто ипользуют как синонимы; в русскоязычной химической — нитрозилирование, обычно, электрофильная реакция, а по официальной номенклатуре IUPAC — Быстро обнаружилось, что в молекулу белка вводится сразу несколько NO-групп, а избирательность этой модификации никакими разумными схемами объяснить не удавалось.

Пока в молекуле белка два-три свободных остатка цистеина, можно рассматривать гипотезы случайного выбора модифицирущего сайта — по закону лотереи какая-то часть молекул модифицируется правильно. Но если остатков цистеина более 80, а при активации белка нитрозилируются определенные 20, ни для какой лотереи места не остается — даже единственного выигрыша пришлось бы ждать вечно. А при активации кальциевого канала реализуется именно этот случай [1].

S-нитрозирование и другие NO-зависимые модификации белков имеют первостепенное значение для всего комплекса наук о живом. Между тем, основной постулат ранних работ о биохимическом нитрозировании оказался ошибочным. Детальные исследования показали, что при физиологических концентрациях NO практически не реагирует с тиолами (RSH), при высоких образует N2O, но не RSNO [2]. Таким образом, ни механизмов нитрозирования, ни механизмов избирательности, ни источников энергии для ее поддержания, ни даже самого нитрозирующего агента in vivo найдено не было.

После открытия биосинтеза NO в клетках млекопитающих считалось, что главный путь его распада in vivo — окисление в нитрат под действием комплексов гемоглобина и миоглобина с кислородом. Понадобилось пять лет всемирного увлечения биохимией оксида азота, чтобы назвать NO «Молекулой года» (1992), и еще год, чтобы усомниться в правомочности логического вывода из общеизвестного факта — казалось само собой разумеющимся, что при окислении NO in vivo нитрат образуется и без гемоглобина (реакции (3), (3,а)). В 1993-1994 гг. в ведущих биохимических и общенаучных журналах появилась серия статей, показывающих, что в модельных экспериментах с физиологическими концентрациями NO и кислорода в воде образуется нитрит и лишь следы нитрата. Факт казался парадоксальным, поскольку в общеизвестных из школьного курса химии реакциях (3, 3а) полу чается нитрат (азотная кислота). В действительности реакция (3) невозможна.

Молекула NO2 с нечетным числом электронов (2, 3е) не может прореагировать с молекулой воды (четное число — 10е). Сначала она взаимодействует с другой нечетной молекулой, в данном случае — со второй молекулой NO2. Обычно в организме концентрация NO такова, что получающегося при его окислении NO2, столь мало, что встреча этих двух молекул — весьма редкое событие.

Осознав, что синтезируемый из аргинина NO может окисляться в нитрит и должен участвовать в нитрозилировании, биохимики столкнулись с необходимостью поиска основного нитрозилирующего интермедиата в организме. Исследовав кинетику реакции в кислородсодержащих растворах NO и перебрав все известные оксиды азота, группа американских ученых пришла к выводу: ни один из них на эту роль не подходит.

Предположили наличие неизвестного оксида (о-в), который назвали NOX [3, 4]. Работы имели большой резонанс, однако вскоре в них обнаружился ряд неточностей, существование неизвестного оксида стало восприниматься скептически (как увидим, преждевременно), а символ NOX остался для обозначения нитрозирующего интермедиата при действии NO в аэробных условиях.

Чуть более года потребовалось для следующего логического шага: раз при окислении NO кислородом в водных растворах образуется только нитрит, значит, нитрозилирующий агент — N2O3, который, получается, по обратимой реакции (4) и тут же гидролизуется (5):

Однако изучение кинетики окисления NO показало: при его физиологических