«БОЛЬШОЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОЭКОЛОГИИ Учебное пособие Часть 1 Йошкар-Ола 2006 ББК Е 081.я7 УДК 574.24 Б 799 Рецензенты: С.И. Новоселов, д-р с./х. наук, профессор МарГУ; Р.Р. Иванова, канд. биол. наук, доцент МарГТУ ...»

Содержание железа в растениях обычно составляет сотые доли процента на сухую массу. При определении железа, как правило, используют колориметрические методы. Наиболее распространенным из них является метод определения железа с о-фенантролином. Он основан на измерении интенсивности окраски комплекса 1,10-фенантролина (С12Н8N2·HO2) c ионами Fe2+. Чувствительность данного метода составляет 0,005 мкг/мл.

Реактивы и оборудование: HCl (конц.); аммиак (конц.); 0,1н H2SO4; 10%-ный раствор гидроксиламин; 0,1%-ный раствор о-фенантролина; сульфат закисного железа (FeSO4·7H2O) (перекристаллизованный); индикаторная бумага конго-рот (22); фарфоровые тигли; колбы на 50 мл (25 шт.); муфельная печь; ФЭК.

1. Пробы растительного материала (300–500 мг) помещают в фарфоровые тигли и обугливают с 3–5 мл спирта. Раствор озоляют в муфеле при 450-500С со всеми предосторожностями, необходимыми во избежание потерь материала.

2. Полученную золу растворяют в 4 мл концентрированной HCl и количественно переносят небольшим объемом воды в мерную колбу на мл (можно использовать и мокрое озоление смесью H2SO4 и HNO3).

3. Для восстановления железа до Fe2+ в колбу добавляют 4 мл 10%ного раствора гидроксиламина и содержимое энергично встряхивают.

4. Затем туда приливают 1 мл 0,1%-ного раствора о-фенантролина в спирте и бросают в раствор маленький (22) кусок индикаторной бумаги конго-рот, при этом бумага окрашивается в синий цвет.

5. В колбу по каплям начинают приливать концентрированный раствор NH3, встряхивая ее после каждой капли до тех пор, пока индикаторная бумага не покраснеет от одной капли. Красно-оранжевая окраска появляется через 5 мин и отличается большой устойчивостью.

6. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре при =510 нм. Содержание железа рассчитывают в мг на 1 г сухой массы ткани по калибровочной кривой.

7. Для построения калибровочного графика готовят рабочие образцовые растворы перекристаллизованного сульфата закисного железа (FeSO 4·7H 2O). Раствор готовят из свежеперекристаллизованой соли в 0,1н H 2 SO 4 (1 г на 50 мл). На миллиметровой бумаге строят калибровочный график.

8. Вычисляют % содержания железа в растительном материале где А – концентрация железа в мг/мл, найдена по графику и соответствует оптической плотности раствора или показания прибора, переведенные на ctg ;

К н 2 о – поправка на влажность растительного материала;

1000 – для пересчета навески в мг;

100 – для пересчета в %;

Н – навеска в г, соответствующая взятому для опыта объему раствора.

9. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 18.

5.2. Определение меди с диэтилдитиокарбаматом Данный метод основан на образовании растворимого в органических растворителях комплекса ионов Cu2+ с диэтилдитиокарбаматом.

Для определения меди в качестве реагента используют бесцветную и стабильную соль свинца. Ион меди вытесняет свинец, образуя окрашенный комплекс. Кроме меди только ионы серебра и ртути образуют с диэтилдитиокарбаматом соединения с большей величиной констант устойчивости и поэтому могут вытеснить свинец из комплекса. Поскольку эти ионы в растительных тканях практически отсутствуют, метод специфичен для меди.

Реактивы и оборудование: 6н раствор HCl; 30%-ный раствор лимоннокислого аммония; 2н раствор аммиака; раствор диэтилдитиокарбамата; безводный Na2SO4; медный купорос (CuSO4); индикатор крезол-рота; делительная воронка емкостью 50-100 мл; фарфоровые тигли; фарфоровая чашка; колбы на 50 мл (25 шт.);

водяная баня; муфельная печь; ФЭК.

1. Пробы растительного материала (300-500 мг) помещают в фарфоровые тигли и обугливают с 3-5 мл спирта. Раствор озоляют в муфеле при 450–500С со всеми предосторожностями, необходимыми во избежание потерь материала. Золу растворяют в 10 мл 6н раствора HCl, переносят в делительную воронку и добавляют 2-3 капли свежей хлорной воды для окисления железа и меди.

2. Ионы металлов экстрагируют в эфир, для чего в делительную воронку прибавляют 15 мл перегнанного эфира, встряхивают и через мин отделяют эфирный слой. Операцию повторяют 2 раза. Объединенную эфирную фракцию помещают в стакан или чашку для выпаривания и отгоняют эфир под тягой при полностью опущенных стеклах вытяжного шкафа на бане с горячей водой.

3. Сухой остаток после испарения эфира обрабатывают 4 мл 30%ного раствора лимоннокислого аммония, переносят с 10 мл воды в делительную воронку на 100 мл и добавляют каплю индикатора крезол-рота.

4. В раствор по каплям (под тягой) приливают 2н раствор аммиака до перехода окраски в фиолетовую (рН=8,5), и вслед за этим, 10 мл раствора диэтилдитиокарбамата. Делительные воронки энергично встряхивают в течение 5 мин.

5. После разделения фаз хлороформенный слой отделяют в пробирку, добавляют туда на кончике скальпеля безводный Na2SO4 для удаления капель воды и измеряют экстинкцию на спектрофотометре при =436 нм.

6. Для построения калибровочной кривой в пределах от 1 до мкг меди в пробе используют раствор медного купороса. Стандартные растворы обрабатывают так же, как и опытные, начиная с момента экстракции ионов Cu2+ из подкисленных HCl растворов в эфир. Ионы Cu2+ сильно абсорбируются стеклом, поэтому стандартный раствор следует готовить в день употребления. Посуду перед определением необходимо вымыть 1%-ной HNO3, а затем многократно сполоснуть бидистиллятом.

7. Вычисляют процент содержания меди в растительном матеА 100 К Н 2О где А – концентрация меди в мг / мл, найден по графику и соответствует оптической плотности испытанного раствора или показания прибора, переведенные на ctg ;

1000 – для пересчета навески в мг;

К н2 о – поправка на влажность растительного материала;

100 – для пересчета в %;

Н – навеска в г, соответствующая взятому для опыта объему раствора.

8. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 19.

Приготовление реактивов:

раствор диэтилдитиокарбамата свинца готовят растворением 300 мг уксуснокислого свинца (CH3COO)3Pb в 50 мл воды. К раствору прибавляют 1,5 г сегнетовой соли (K, Na виннокислый), подщелачивают раствор несколькими каплями концентрированного КОН до появления слабо-розовой окраски по фенолфталеину (рН=9–10), затем добавляют туда 1,5 г КСN. Отдельно растворяют в 50 мл воды 400 мг натриевой соли диэтилдитиокарбамата, и растворы смешивают; при этом образуется суспензия. Последнюю переливают в большую делительную воронку и экстрагируют 500 мл хлороформа при энергичном встряхивании. Водную фазу еще раз экстрагируют 200 мл хлороформа. Хлороформенные фракции объединяют, дважды промывают половинным объемом воды, фильтруют и доводят до 2 л хлороформом. Такой раствор может храниться в темноте в течение 2 недель;

раствор цитрата аммония: 30 г двузамещенного цитрата аммония растворяют в 70–80 мл воды, дважды экстрагируют небольшим количеством хлороформенного раствора диэтилдитиокарбамата свинца (хлороформенную фазу отбрасывают, раствор кипятят 10 мин, фильтруют, охлаждают и доводят водой в мерной колбе до 100 мл).

Метод основан на получении окрашенного комплекса цинка с дитозаном. Этот комплекс может быть экстрагирован CCl4 и колориметрирован без удаления избытка дитозана (метод смешанной окраски).

Следы меди, свинца, серебра и некоторых других микроэлементов остаются в водной фазе вследствие образования прочных комплексов с используемым в методе для этих целей тиосульфатом.

Реактивы и оборудование: конц. HCl; ацетатный буфер; 25%-ный раствор тиосульфата натрия; раствор дитизона в CCl4; металлический цинк; метиловый красный; фарфоровые тигли; делительная воронка емкостью 50–100 мл; бюретка; колбы на 50 мл ( шт.); муфельная печь; ФЭК.

1. Пробы растительного материала (300-500 мг) помещают в фарфоровые тигли и обугливают с 3–5 мл спирта. Раствор озоляют в муфеле при 450–500С со всеми предосторожностями, необходимыми во избежание потерь материала. Полученную золу растворяют в 4 мл концентрированной HCl и количественно переносят небольшим объемом воды в мерную колбу на 50 мл. Солянокислый раствор золы разбавляют так, чтобы содержание Zn в ней было от 0,2 до 1 мкг/мл, а концентрация HCl – порядка 0,3н. Для этого при приготовлении сильно разбавленных растворов используют не только воду, но и растворы HCl.

2. Затем 10 мл разбавленного раствора помещают в делительную воронку емкостью 100 мл, прибавляют 2 капли индикатора метилового красного и по каплям раствор аммиака до перехода окраски от розовой к желтой. В воронку приливают 5 мл ацетатного буфера, 1 мл 25%-го раствора тиосульфата натрия и хорошо перемешивают.

3. Из бюретки добавляют в воронку 20 мл свежеприготовленного раствора дитозана в CCl4, закрывают воронку и энергично встряхивают в течение 1 мин. После расслаивания окрашенный слой CCl4 колориметрируют на ФЭКе с зеленым светофильтром или на спектрофотометре при длине волны =538 нм.

4. Для построения калибровочного графика используют хлорид цинка (ZnCl2), получаемый растворением металлического цинка в соляной кислоте. 100 мг чистого металлического Zn помещают в 500 мл мерную колбу и растворяют в 10 мл 20%-ного HCl. После растворения Zn, раствор доводят до метки бидистиллированной водой. Такой раствор содержит мкг/мл Zn. Разбавления готовят, используя 0,3н раствор HCl.

5. Вычисляют процент содержания цинка в растительном матеА 100 К Н 2О где А – концентрация цинка в мг/мл, найден по графику и соответствует оптической плотности испытанного раствора или показания прибора, переведенные на ctg ;

1000 – для пересчета навески в мг;

К н 2 о – поправка на влажность растительного материала;

100 – для пересчета в %;

Н – навеска в г, соответствующая взятому для опыта объему раствора.

6. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 20.

Варианты № Навеска, Показания Содержание Содержание Zn2+ Приготовление реактивов:

ацетатный буфер: для приготовления ацетатного буфера (рН 5) 272 г кристаллического уксуснокислого натрия (CH3COONa·3H2O) растворяют в бидистиллированной воде, добавляют 58 мл ледяной CH3COOН и доводят объем до 1 л бидистиллятом. Для обнаружения следов Zn пробу раствора обрабатывают дитозаном в CCl4. К 10 мл раствора приливают 1 мл раствора дитозана и встряхивают, дитозан не должен изменять своей ярко-зеленой окраски. Затем раствор промывают 2–3 раза перегнанным CCl4 для удаления следов дитозана; экстракты должны стать бесцветными;

раствор тиосульфата натрия (25%-ный) готовят на бидистилляте и обрабатывают дитозаном для полного удаления следов цинка;

раствор дитозана в CCl4 готовят растворением 0,04 г кристаллического дитозана в 100 мл CCl4 при энергичном встряхивании в течении 15 мин. Раствор переливают в делительную воронку на 250 мл и добавляют 100 мл разбавленного аммиака (0,5 мл конц. аммиака на 100 мл воды). Воронку встряхивают – дитозан переходит в водную фазу, окрашивая ее в яркооранжевый цвет. Слой CCl4 сливают и отбрасывают; водную фазу промывают небольшими порциями (5–10 мл) чистого CCl4, пока он не начинает окрашиваться в зеленый цвет. Затем водную фазу подкисляют 2,5 мл разбавленной H2SO4 (1:5), прибавляют к ней 100 мл CCl4, встряхивают, отделяют зеленый слой дитозана в CCl4 и сливают его в чистую делительную воронку. Раствор промывают 3 раза (порциями по 50 мл) бидистиллятом для удаления следов H2SO4, фильтруют через промытый и высушенный фильтр в темную склянку и хранят в холодильнике. Для приготовления рабочего раствора перед определением 15 мл исходного раствора дитозана разбавляют CCl4 в мерной колбе на 0,5 л. При встряхивании 5 мл раствора с 25 мл 0,01н аммиака слой CCl4 должен быть бесцветным. Если он окрашен в бурый цвет, раствор дитозана для анализа непригоден.

Метод основан на том, что при добавлении к щелочному раствору соли никеля диметилглиоксима и какого-нибудь окислителя, например, брома, раствор окрашивается в красный цвет. При этом, очевидно, образуется диметилглиоксимат четырехвалентного никеля. Никель можно определить в концентрациях от 0,02 до 10 мг/л.

Мешают определению железо, хром и медь. Для удаления железа прибавляют к пробе 2 мл 3%-го раствора перекиси водорода, нагревают, осаждают гидроокись железа (III) раствором аммиака и отфильтровывают выпавший осадок. Хромат- и бихромат-ионы восстанавливают в кислой среде любым восстановителем (спиртом, сульфитом), осаждают гидроокись хрома (III) вместе с Fe(OH)2 аммиаком и отфильтровывают осадок. Медь предварительно отделяют одним из методов: осаждением ее внутренним или внешним электролизом, тиосульфатом натрия или сероводородом при рН=2; маскируют ее цианидом или тиосульфатом (Методика …, 1996).

Реактивы и оборудование: диметилглиоксим; этиловый спирт; никель сернокислый или никель азотнокислый; бромная вода; аммиак; колбы на 1л (1 шт.), мл (3 шт.), 100 мл (10 шт.); ФЭК.

1. Для построения калибровочной кривой готовят стандартный раствор никеля. Для этого растворяют 0,0478 г сульфата никеля NiSO4·7Н2О или 0,0495 г нитрата никеля Ni(NO3)2·6Н2О в дистиллированной воде и разбавляют до 1 л (раствор А). Отобрав 50 мл полученного раствора, переносят в мерную колбу емкостью 250 мл и разбавляют дистиллированной водой до метки и перемешивают: 1 мл полученного раствора содержит 0,002 мг ( мкг) никеля (раствор Б) - этот последний раствор надо приготовить перед самым его применением. 1; 5; 10; … 50 мл стандартного раствора соли никеля с содержанием соответственно 2; 10; 20;.... 100 мкг никеля, разбавляют или упаривают каждый раствор до 10 мл, и дальше продолжают как при анализе пробы. По результатам измерения оптических плотностей строят калибровочный график (табл. 21).

2. Отбирают такой объем пробы, чтобы содержалось от 5 до мкг никеля, и, если проба содержит железо, хром, медь удаляют эти металлы как указано выше. Затем разбавляют пробу дистиллированной водой в мерной колбе до 100 мл.

Разбавленную пробу переносят в колбу на 150-250 мл, 0,5 мл концентрированной азотной кислоты и нагревают до кипения. Затем охлаждают, добавляют 2 мл бромной воды и раствор аммиака по каплям до исчезновения окраски брома и сверх того еще 1 мл.

3. После этого к раствору добавляют 1 мл 1%-го спиртового раствора диметилглиоксима и через 10 мин измеряют оптическую плотность окрашенного раствора по отношению к раствору в холостом опыте (где к 100 мл дистиллированной воды добавляют те же самые реагенты) при длине волны =450 нм.

4. Содержание никеля (Х) в пробе в мг/л рассчитывают по формуА где А – содержание никеля, найденное по калибровочной кривой, мг;

V – объем пробы взятой на определение, мл.

Приготовление реактивов:

1%-ный спиртовой раствор диметилглиоксима или 1%-ный раствор натриевой соли диметилглиоксима (1 г в 100 мл этилового спирта или дистиллированной воды);

никель сернокислый или никель азотнокислый (с содержанием 0,002 г никеля в 1 мл раствора).

ФОРМИРОВАНИЕ У РАСТЕНИЙ БИОХИМИЧЕСКИХ

АДАПТАЦИЙ В УСЛОВИЯХ ТЕХНОГЕНЕЗА

В процессе адаптации растение проходит два различных этапа:

стресс – реакция (быстрый первичный ответ) и специализированная адаптация (значительно более длительный этап, связанный с формированием новых изоэнзимов или стрессорных белков, которые обеспечивают протекание метаболизма в изменившихся условиях).

Эти фазы адаптации выполняют различные биологические функции. Стресс-реакция обеспечивает кратковременную защиту растения от гибели за счет формирования и функционирования быстрых защитных механизмов и предоставляет время для формирования более надежных и более эффективных механизмов специализированной устойчивости.

Для фазы специализированной адаптации свойственно образование новых, более надежных и более эффективных защитных механизмов, ответственных за протекание онтогенеза в условиях длительного действия стрессора.

Выживание организма в течение короткого первого этапа адаптационного процесса достигается за счет быстрого формирования энергоемких и малоэффективных «аварийных» защитных систем. Роль таких систем могут выполнять, прежде всего, системы шокового ответа.

Как правило, антиоксидантные системы и механизмы синтеза протекторных низкомолекулярных соединений функционируют также в условиях интенсивного повреждения метаболизма, что и происходит на первой фазе адаптации. Подобные системы оказываются крайне эффективными в случае, если на растение одновременно воздействуют несколько различных стрессоров высокой интенсивности или их действие носит случайный и кратковременный характер. Наличие общих систем устойчивости на фазе стрессового ответа позволяет быстро защищать организм от кратковременного действия повреждающих факторов различной физической природы без формирования специализированных, долговременных механизмов адаптации. Последнее позволяет не только сократить потенциальное повреждение метаболизма, но и обеспечить максимальную экономию энергетических и структурных ресурсов.

Следовательно, общие системы устойчивости функционируют обычно на фазе стресс-реакции, хотя могут функционировать и на фазе специализированной адаптации. Подобная временная структура адаптационного процесса позволяет растению выжить в первый момент действия повреждающего фактора. Формировать специализированные механизмы устойчивости и завершать программу онтогенеза в изменившихся условиях.

В настоящее время выделяют три группы механизмов устойчивости растений к большой группе стрессоров: 1) стресс-индуцированное новообразование макромолекул с защитными свойствами; 2) синтез совместимых осмолитов с множественными протекторными функциями; 3) антиоксидантные системы.

Клетки защищаются от активных форм кислорода с помощью антиоксидантов. Некоторые из этих веществ являются ферментами, поэтому существуют два протекторных механизма: ферментативный и неферментативный (Кузнецов, Дмитриева, 2005).

Состав внутриклеточной среды, в которой функционируют макромолекулы, может регулироваться за счет синтеза и аккумуляции низкомолекулярных органических протекторных (защитных) соединений. К протекторным соединениям относятся аминокислоты, прежде всего как пролин, сахароспирты, бетаины и некоторые другие молекулы. Регуляция состава микроокружения макромолекул – одна из наиболее распространенных стратегий адаптации растений к факторам различной физической природы.

6.1.1. Определение белка с раствором Фолина (метод Лоури) Метод основан на колориметрировании синей окраски, возникающей при взаимодействии белка со смесью, состоящей из щелочного раствора меди и раствора Фолина. Метод удобен для определения белка в ферментных вытяжках, тканевых гомогенатах.

Реактивы и оборудование: БСА - бычий сывороточный альбумин; 0,1н раствор NаОН; CuSO4·5H2O; Nа2СО3; ацетон; трихлоруксусная кислота; цитрат натрия;

реактив Фолина; фарфоровые ступки (2 шт.); штатив с пробирками (30 шт.); центрифуга; ФЭК.

1. Готовят растительную вытяжку, для этого 0,5-1 г навески растирают в фарфоровой ступке, постепенно доведя объем дистиллированной водой до 10 мл. Берут 1 мл полученной вытяжки и переносят в небольшую стеклянную или пластмассовую центрифужную пробирку.

Прибавляют равный объем 8%-го раствора трихлоруксусной кислоты ( мл). Центрифугируют 10 мин при 4 тыс. об./мин, при этом, происходит осаждение белка. Надосадочную жидкость сливают. Белковый осадок промывают ацетоном до тех пор, пока осадок не станет бесцветным, и снова центрифугируют. К осадку приливают 1 мл 2%-ой трихлоруксусной кислоты, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и центрифугируют в течение 5-8 мин при 4 тыс. об./мин.

2. Надосадочную жидкость сливают, а к белковому осадку прибавляют 0,1 мл 1н NаОН для растворения белка. Оставляют на 30 мин, если осадок белка трудно растворяется, то его подогревают на водяной бане (на этом этапе работу можно прервать и пробирки с белковым осадком для растворения оставить на ночь). После растворения белка в пробирки наливают 3 мл дистиллированной воды.

3. Для анализа берут 1 мл щелочного раствора белка, прибавляют 5 мл меднокарбонатного раствора (реактив С). Через 10 мин в пробирки вносят 0,5 мл реактива Фолина. Смесь перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20–30 мин для развития окраски. Интенсивность окраски измеряют на фотоколориметре с красным светофильтром (длина волны =750 нм).

Контроль: 0,1н раствор NаОН (1 мл) + меднокарбонатный раствор (реактив С) (5 мл) + 1н реактив Фолина (0,5 мл);

опыт: щелочной раствор альбумина (1 мл) + меднокарбонатный раствор (реактив С) (5 мл) + 1н реактив Фолина (через 10 мин) (0,5 мл).

Смесь перемешивают и через 30 мин колориметрируют на ФЭКе.

4. Концентрацию белка в исследуемых растворах рассчитывают по калибровочной кривой. Калибровочная кривая в интервале 0,02–0, мг белка в пробе строится по сывороточному альбумину.

Берут 50 мг альбумина (БСА) и растворяют его в 100 мл воды или 0,1н раствора NаОН. Затем колбу ставят в термостат при температуре 37–40°С на 1 ч для гидролиза. После гидролиза раствор альбумина разливают в пробирки согласно данным таблицы 22, добавив туда определенное количество щелочи.

5. Содержания белка в растительном материале вычисляют по где А – концентрация белка, найденная по графику и соответствующая оптической плотности испытанного раствора или показания прибора, переведенные на ctg ;

Е – разведение;

Н – навеска растительного материала (0,5 г).

х – следует увеличить объем альбумина и щелочи в одинаковых пропорциях (в 2–3 раза).

Пример: 0,5 г навески растирают и доводят до 10 мл, непосредственно для определения белка берут 1 мл вытяжки и получают разбавление равное 10 (Е1=10) - 1 мл вытяжки содержит 0,5:10=0,05 г навески. Данное количество вытяжки (1 мл) превращают в осадок, который растворяют 0,1 мл 0,1н раствора NаОН и разбавляют 3 мл воды (общий объем будет равен 3,1 мл) - в этом случае имеют второе разбавление, равное Е2=3,1. Для анализа берут 1 мл щелочного раствора белка, но дальнейшего разбавления уже не происходит. Поэтому общее разбавление будет составлять: Е=Е1Е2 = 103,1=31.

5. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 23.

Приготовление реактивов:

реактив А (2%-ный раствор карбоната натрия в 0,1н растворе щелочи): 20 г безводного карбоната натрия растворяют в 1 л 0,1н раствора щелочи;

реактив В: 1%-ный раствор сульфата меди (Cu SO4·5H2O);

реактив Д: 2%-ный раствор цитрата натрия;

реактив С (меднокарбонатный раствор) готовят перед постановкой опыта смешиванием реактивов А, В, Д в соотношении 100:1:1 мл;

реактив Фолина: 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия растворяют в 700 мл дистиллированной воды. К смеси добавляют 50 мл 85%-ного раствора фосфорной и 100 мл соляной кислот. Затем этот раствор кипятят 10 часов с обратным холодильником в вытяжном шкафу. После этого в колбу добавляют 150 г сернокислого лития, 50 мл дистиллированной и 5 капель бромной воды. Смесь кипятят в течение 15 мин в вытяжном шкафу для удаления избытка брома, после охлаждения доводят объем до 1 л. Затем смесь фильтруют и хранят в темной склянке с притертой пробкой. Раствор должен быть ярко-желтого цвета. Для определения концентрации реактива Фолина: 1-2 мл реактива разводят в 10 раз и титруют 0,1н раствором щелочи по фенолфталеину.

Биологические функции органических протекторных соединений крайне многообразны. Например, пролин, который является в растительном мире самым универсальным осмолитом, может выступать в роли источника азота, углерода и энергетического субстрата. Он обладает также антиоксидантным действием, понижая количество активных форм кислорода. Пролин регулирует также экспрессию стрессорных генов. При стрессовых воздействиях накопление свободного пролина рассматривают как один из механизмов биохимической адаптации.

Реактивы и оборудование: 18%-ный раствор сахарозы; 3%-ный раствор сульфосалициловой кислоты; нингидрин; ледяная уксусная кислота; фосфорная кислота (6 моль/л); толуол; пролин; торзионные весы; сушильный шкаф; ступки; водяная баня; кюветы со льдом; пробирки; стеклянные воронки; пипетки; складчатые фильтры; колбы на 50 мл; чашки Петри; ФЭК.

1. В чашках Петри на фильтровальной бумаге в воде выращивают 7-10-дневные проростки овса, пшеницы, гороха или фасоли. Затем воду сливают и заливают в чашки 18%-ный раствор сахарозы. Через или 72 ч определяют содержание пролина в срезанных листьях после осматического стресса, предварительно определив его исходное содержание. Параллельно берут две-три пробы листьев (100 мг), высушивают их при 1050С и находят сухую массу.

2. Для определения свободного пролина берут три пробы листьев по 1 г каждая. Мелко их нарезают, заливают 10 мл 3%-го раствора сульфосалициловой кислоты и растирают в течение 5 мин в ступках до получения однородной массы, растертую массу переносят на фильтр.

3. Берут 2 мл фильтрата, помещают в пробирки и добавляют мл реагента, который готовят непосредственно перед опытом, растворяя 1,25 г нингидрина в смеси 30 мл ледяной уксусной кислоты и 20 мл фосфорной кислоты (6 моль/л). Затем в пробирки добавляют 2 мл ледяной уксусной кислоты. После тщательного перемешивания содержимого пробирки ставят на 1 ч в кипящую водяную баню.

4. После этого пробирки охлаждают под холодной водой или в ледяной бане. Далее в каждую пробирку добавляют 4 мл толуола, взбалтывают 20-30 с и дают отстояться. Через 10-15 мин верхний слой толуола, в который переходит весь краситель, отделяют от водной фазы.

Окрашивание может быть от слаборозового до пурпурного в зависимости от содержания пролина.

5. Интенсивность окраски измеряют на ФЭКе при =520 нм против толуола. Концентрацию пролина определяют по калибровочной кривой, для построения которой готовят водные растворы пролина разных концентраций (от 0,0125 до 0,15 мг в 2 мл раствора). Результаты расчета выражают с мг% на сухое вещество, предварительно определив, сколько сухого вещества содержится в 1 г сырых листьев в контроле и при недостатке воды.

6. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 24.

6.2. Методы определения активности ферментов Ферментами называются коллоидные органические соединения, которые образуются в животных и растительных организмах и являются катализаторами протекающих в них биохимических процессов.

По своей химической природе ферменты принадлежат к белковым веществам. Физические и химические свойства ферментов обусловлены их белковой природой: они термолабильны, способны высаливаться, и дают характерные для белка качественные реакции.

Активность фермента очень сильно зависит от pH среды, присутствия электролитов и других веществ, активирующих или наоборот ингибирующих их действие. Различные загрязнения окружающей среды вызывают изменения ферментативной деятельности. Под влиянием кислых газов даже при невидимых повреждениях листьев происходит изменение активности ферментов в клетках вследствие подкисления и нарушения ионного режима, метаболизма и накопления балластных и, возможно, токсических продуктов. Нарушения ферментативных систем более значительны у неустойчивых видов, чем у устойчивых (Николаевский, 1979).

6.2.1. Определение активности пероксидазы (I.II.I.7) Пероксидаза – двухкомпонентный фермент класса оксидоредуктаз, состоящий из гематина (низкомолекулярного кофермента, содержащего железо) и апофермента (белковой частицы, составляющей основную часть фермента) (Уильямс, 1975). В настоящее время известно, что пероксидаза выполняет две функции: пероксидазную и оксидазную.

Выполняя пероксидазную функцию, этот фермент катализирует реакции окисления различных субстратов определенной химической природы, перекись выполняет роль акцептора электронов:

H2O2 H2O+O (Рубин, 1976). К субстратам, окисленным пероксидазой в присутствии перекиси, могут быть отнесены следующие соединения:

практически все фенолы (пирокатехин, пирогаллол, галловая кислота, гваякол и др.); ароматические амины (аланин, бензидин, парафенилоидиамин, белирубин и др.); йодистый водород, легкоокисляемые вещества типа аскорбиновой кислоты, нитритов и других.

Метод основан на измерении времени, за которое опытный раствор достигает определенную оптическую плотность. В качестве субстрата используется бензидин, в результате окисления которого образуется соединение синего цвета.

Реактивы и оборудование: бензидин; перекись водорода; пипетки; колбы на 25 мл (5 шт.); электронные весы; фарфоровые ступки, пестики; секундомер; ФЭК.

1. Готовят раствор бензидина, для этого в мерную колбу на 200 мл, наполненную на 2/3 дистиллированной водой, прибавляют 2-3 мл ледяной уксусной кислоты и 184 мг бензидина. Колбу нагревают на водяной бане до 60°С при постоянном взбалтывании. После растворения бензидина в колбу добавляют 5,45 г уксуснокислого натрия. После его растворения колбу охлаждают и доливают водой до метки.

2. Навеску растительного материала (50–100 мг) растирают в ступке с водой, переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят дистиллированной водой до метки.

3. Растительную вытяжку настаивают в течение 5-10 минут, а затем центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об./мин (центрифугирование можно заменить фильтрованием). Фильтрат или надосадочную жидкость используют для определения пероксидазной активности.

4. Для определения активности фермента берут две кюветы толщиной 1 см. По первой кювете (контроль) устанавливают ноль прибора (ФЭК), регулируя переключатели «чувствительность» (1, 2, 3) и «установка нуля». В контрольную кювету помещают 2 мл бензидина, мл фильтрата и 2 мл воды. Стрелка прибора должна находиться в положении «0». Определение проводят с красным светофильтром при длине волны =670 нм.

5. Во вторую кювету (опыт) вливают 2 мл бензидина, 2 мл фильтрата и 2 мл 0,3%-ный раствор H2О2, при этом сильная струя перекиси перемешивает содержимое кюветы. Добавление H2О2 служит стартом реакции.

6. Одновременно с вливанием пероксида водорода включают секундомер. В опытной кювете раствор синеет, стрелка прибора передвигается справа налево. Отмечают время, за которое стрелка достигает 0,2 делений прибора (ед. оптической плотности). Это время должно находиться в пределах от 20 до 50 секунд.

7. Если активность фермента низкая, то есть стрелка прибора достигает значений 0,2 за более длительное время (более 1-2 мин), тогда можно вести отсчет до 0,1 ед. оптической плотности. Если активность фермента высокая, тогда следует разбавить вытяжку. В этом случае в кювету вливают не 2 мл фильтрата, а 1 мл и добавляют 1 мл воды.

8. Активность пероксидазы рассчитывают по формуле:

где Д – оптическая плотность (0,1–0,2);

Е – разведение (перерасчет на 1 г сырой массы);

d – толщина слоя жидкости, толщина кюветы (1 см).

Активность пероксидазы выражают в единицах оптической плотности на грамм сырой массы в секунду (Д670г-1·с-1).

Пример расчета разведения. Для опыта была взята навеска 100 мг или 0, г, которую перенесли в колбу на 25 мл. Непосредственно для определения активности фермента было взято 2 мл вытяжки, что соответствует 25:2=12,5 частей всей вытяжки или 100:12,5=8 мг навески. Данная вытяжка имеет определенную ферментативную активность «а», тогда составляется пропорция:

Таким образом, в данном случае в формулу вместо Е ставится 125.

1. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу25.

Объект Навеска, г Объем экс- Разведение Время, с Активность 6.2.2. Определение активности полифенолоксидазы (I.I0.3.1) Полифенолоксидаза – медьсодержащий фермент, катализирует окисление орто-дифенолов в присутствии кислорода с образованием воды и орто-хинонов. Ферментная система окисляет также монофенолы.

Принцип метода определения активности полифенолоксидазы тот же, что и для пероксидазы.

Реактивы и оборудование:

1%-ный раствор парокатехина (готовят перед определением); 0,01–0,02%-ный раствор парафенилендиамина на 0,01н щавелевой кислоте (можно использовать диметилпарафенилендиамин, который растворяют в воде); фосфатный буферный раствор (рН=7,0–7,5); мерные колбы на 25 мл (5 шт.); пипетки на 2 мл; фарфоровые ступки с пестиком;

секундомер; центрифуга с пробирками;

ФЭК.

1. Предварительно взвешенную навеску массой 0,5-1 г растирают в ступке с фосфатным буфером (pH=7,0–7,4), переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят дистиллированной водой до метки. Растительную вытяжку центрифугируют в течение 10 мин при 3000 об./мин. Центрифугирование можно заменить фильтрованием.

2. Для определения активности фермента берут две кюветы толщиной 2 см. В каждую кювету вносят по 2 мл вытяжки и 2 мл воды или буферного раствора, 2 мл раствора парафенилендиамина.

3. Обе кюветы ставят в ФЭК, уравнивают световые потоки (стрелка прибора стоит на нуле). Определение проводят при желтозеленом светофильтре (=560 нм).

4. В левую контрольную кювету вносят 2 мл воды, в правую опытную кювету – 2 мл раствора пирокатехина. Одновременно с вливанием пирокатехина включают секундомер и отмечают время, когда стрелка гальванометра достигнет нулевого положения. Рекомендуется брать такие разведения вытяжки, при которых время изменения окраски не превышало 30-60 секунд.

5. Активность фермента рассчитывают по формуле:, где Д – оптическая плотность;

Е – разведение (перерасчет на 1 г сырой массы);

d – толщина слоя жидкости, толщина кюветы, см.

Активность полифенолоксидазы выражают в единицах оптической плотности на грамм сырой массы в секунду (Д560г-1·с-1).

6. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 26.

Определение активности полифенолоксидазы 6.2.3. Определение активности каталазы (I.II.I.6) Каталаза - это двухкомпонентный фермент, состоящий из белка и соединенной с ним простетической группы. Кристаллическая каталаза содержит 0,09% железа, что соответствует четырем его атомам на молекулу.

Каталаза всегда присутствует в системах, где происходят процессы клеточного дыхания с участием флавиновых дегидрогеназ, в результате деятельности которых образуется токсичная для клетки перекись водорода. Поэтому каталаза выполняет важную роль, разлагая токсичную для клеток перекись водорода. Кроме того, весьма существенной должна быть признана роль каталазы в снабжении молекулярным кислородом тех участков ткани, куда доступ его в силу тех или иных причин затруднен. Например, ткани перикарпия сочных плодов, многослойная паренхима и др. Активность фермента зависит от вида растения, возраста клеток, типа ткани и других факторов.

Методы, используемые для определения активности каталазы основаны, главным образом, на количестве кислорода, образующегося в результате действия фермента (Кретович, 1986).

6.2.3.1. Определение активности каталазы Этот метод анализа получил название перманганатометрия и используется для определения веществ, обладающих восстановительными свойствами, в данном случае H2O2.

Реактивы и оборудование: 0,3% -ный раствор перекиси водорода; 10% -ный раствор серной кислоты; 0,05н перманганат калия; водяная баня; бюретка для титрования;

ступки; пестики; колбы на 50 мл (5 шт.); стаканы для титрования (15 шт.).

1. Навеску растительного материала (100–200 мг) растирают в ступке с водой, переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят дистиллированной водой до метки.

2. Растительную вытяжку фильтруют, берут 5 мл отфильтрованного гомогената и инкубируют 10 мин с 5 мл 0,3%-го раствора перекиси водорода.

3. Инкубацию прекращают, добавляя 5 мл 10%-ой серной кислоты. Неразложившуюся перекись водорода оттитровывают 0,05н раствором KMnO4 до появления слабо розовой окраски, не исчезающей в течение минуты: 5H2O2+2KMnO4+3H2SO4K2SO4+2MnSO4+8H2O+5O2.

4. Контрольную пробу гомогената для инактивации фермента предварительно прогревают в кипящей водяной бане в течение 5 мин, затем добавляют 5 мл 0,3%-го раствора перекиси водорода, инкубацию прекращают добавлением серной кислоты. Оттитровывают перекись водорода перманганатом калия.

5. Активность каталазы рассчитывают по формуле:

где К – количество KMnO4, пошедшего на титрование в контроле, мл;

О – количество KMnO4, пошедшего на титрование в опыте, мл;

0,85 – количество мл H2O2, соответствующее 1 мл 0,05н KMnO4;

Т – время инкубации (10 мин);

Е – разведение.

Активность каталазы выражают в количестве O2, образовавшегося в результате действия фермента за 1 мин на 1 г сырой массы (мл О2·г-1·мин-1).

Пример расчета разведения. Навеску ткани 0,20 г перенесли в колбу на мл. Непосредственно для определения каталазы было взято 5 мл вытяжки. Получается разбавление равное 50:5=10 или 200 мг:10=20 мг навески. Данная вытяжка имела определенную каталазную активность «а», тогда составляют пропорцию:

Т.о. в формулу вместо Е ставится разбавление 50.

6. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 27.

6.2.3.2. Газометрический метод определения активности каталазы Реактивы и оборудование: перекись водорода; каталазник; бюретка; ступки;

пестики; колбы на 25 мл (5 шт.); пипетки; секундомер.

1. Навеску растительного материала (0,5 г) растирают в ступке с водой с добавлением 0,2 г мела (для создания щелочной реакции) и небольшим количеством песка, переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят дистиллированной водой до метки.

2. Полученную смесь (10 мл) вносят в одно колено каталазника, а в другое колено вносят 5 мл 3%-го раствора перекиси водорода.

3. Соединяют каталазник с резиновой трубкой, не допуская смешивания жидкостей, установив уровень воды в бюретке на нуле.

4. Быстрым изменением положения каталазника смешивают жидкости в обоих коленах. Включают секундомер и отмечают время начала опыта. По понижению уровня воды в бюретке определяют объем кислорода (в мл), выделенного в течение 3-5 мин.

где а – количество O2, выделившегося в результате работы фермента, мл;

Е – разведение (перерасчет на 1 г сырой массы);

Т – время (3-5 мин).

Пример расчета разведения: 0,5 г навески25 мл10 мл (Е=2,5), что соответствует 0,5:2,5=0,2 г навески, а 1 г навески проявит активность (1:0,2=5) в 5 раз больше, значит в формулу вместо Е ставим 5.

6. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 28.

Варианты № колб Навеска, взятая Показания Активность каталазы, 6.2.4. Определение активности аскорбатоксидазы (I.I0.3.3) Аскорбатоксидаза катализирует прямое окисление аскорбиновой кислоты, которая, легко отдавая два иона водорода, превращается в дегидроформу. Являясь переносчиком водорода, аскорбиновая кислота тесно связана со всей системой ферментов, участвующих в дыхательном метаболизме растительной клетки (Гавриленко, 1975).

Реактивы и оборудование: 0,005М раствор НСl; 0,005 М раствор MgSO4;

фосфатный буфер рН=6,2; 1,2·10-4М аскорбиновая кислота; дистиллированная вода;

ступки, пестики; колбы на 25 мл (5 шт.); пипетки; воронка; сверла диаметром 12– мм; фильтровальная бумага.

1. Навеску растительного материала (0,2–1 г) растирают в фарфоровой ступке в холодной камере (при температуре 0-4°С), переносят в мерную колбу на 25 мл и доводят до метки с помощью фосфатного буфера (рН=7,4). В случае, если расчет необходимо сделать на площадь, а не на вес, то вырезаются диски из листьев с помощью сверла определенного диаметра; в этом случае в анализ берут 15–20 дисков (диаметром 12–18 мм).

2. После доведения до метки колбу взбалтывают, и всю вытяжку переносят в воронку с обычным фильтром (фильтрацию проводят в холодной камере в течение 5–10 мин).

3. Фильтрат немедленно фотометрируют, так как активность фермента снижается при стоянии проб даже в холодной камере.

Определение производят на спектрофотометре в ультрафиолетовой области спектра (при длине волны =279 нм).

4. Для определения активности фермента в кюветы приливают:

фосфатный буфер рН=6,2 - 1,0 мл фосфатный буфер рН=6,2 -мл мл дистиллированная вода - 0,8 мл 5. Момент приливания раствора аскорбиновой кислоты отмечают по секундомеру (отсчет снимается через 30 с, 1 мин, в течение 10 мин).

6. Падение оптической плотности линейно во времени. Результаты выражают в единицах падения оптической плотности за 10 мин на единицу веса или площади листа по формуле:

где А – активность фермента;

Д – величина падения оптической плотности;

d – разведение в колбе;

n – количество листьев в пробе;

n1.– количество дисков;

V – объем фильтрата в кювете;

V1 – общий объем жидкости в кювете.

7. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 29.

Определение активности аскорбатоксидазы Объект Навеска, Количество Разведение Объем Показания Активность АТФ-азы растительных тканей состоит из нескольких ферментативных систем, биологическая роль которых еще недостаточно полно изучена. АТФ-азы освобождают энергию пирофосфатной связи при гидролизе АТФ: АТФ+ H2OАДФ+Фн.

В связи с этим АТФ-азам принадлежит большая роль на заключительном этапе энергетического обмена клетки. В митохондриях обнаружено несколько АТФ-аз, активируемых двухвалентными катионами (Са+2, Mg+2) и различающихся по характеру зависимости от pH среды.

Высказывается предположение, что эти различия АТФ-азы соответствуют трем пунктам сопряжения в дыхательной цепи (Плешков,1968;

Починок, 1976).

Реактивы и оборудование: сульфат магния; АТФ; трихлоруксусная кислота;

соляная кислота; трис (оксиметиламинометан); молибдат аммония; сурьмяновокислый калий; серная кислота; аскорбиновая кислота; перекристаллизованный КН2РО4;

колбы на 1 л и 2 л; пробирки; термостат; холодильник; ФЭК.

1. Готовят ферментативную вытяжку, для чего 2–3 г навески растирают в ступке с дистиллированной водой и доводят объем до 10 мл.

2. Берут 2–3 мл ферментативной вытяжки, приливают 1 мл 0,2М трис-HCl буфера (pH=7,8) и выдерживают при температуре 25°С 15 мин. Затем приливают 0,5 мл 0,005М раствора АТФ и 0,5 мл 0,005М MgSO4.

3. Пробирки ставят в термостат при температуре 37°С на 30 мин.

4. Одновременно готовят холостой опыт, для этого в контрольные пробирки добавляют все те же растворы, кроме АТФ (субстрата реакции).

5. Пробирки из термостата вынимают и в каждую пробирку для осаждения белков (инактивации фермента) добавляют по 1 мл 20%-го раствора трихлоруксусной кислоты (ТХУ) и ставят на 30 мин в холодильник. В холостой опыт добавляют 0,5 мл 0,005М раствора АТФ.

6. Профильтровывают, и фильтрат используют для определения фосфора. Активность фермента измеряют по количеству образовавшегося неорганического фосфора, отщепленного от аденозинтрифосфата АТФ-азой.

Активность фермента выражают в мкг P·г-1 сырой массы·ч-1.

Активность АТФ-азы рассчитывают по формуле:

где О – количество Рн в опытных образцах;

К – количество Рн в холостом опыте;

Е – разведение (перерасчет на навеску).

Пример расчета разведения: 2 г навески растирали и довели объем до мл. Непосредственно для определения АТФ-азы взяли 2 мл, тогда 10:2=5, т.е. разведение в 5 раз или это соответствует 2 г:5=0,4 г навески. Данная вытяжка (0,4 г) имела определенную АТФ-азную активность «а», можно составить пропорцию:

Т.о. формулу вместо Е ставим 2,5.

7. Определение фосфора (см. стр. 44).

8. Фильтрат в объеме 5 мл полученного раствора переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки реактивом С, колба стоит мин, затем ее колориметрируют на ФЭКе с красным светофильтром при длине волны =670 нм.

9. Результаты измерений и расчетов записывают в таблицу 30.

Приготовление реактивов:

реактив А: 1) в 250 мл дистиллированной воды растворяют 12 г молибдата аммония; 2) в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0,2908 г сурьмяновокислого калия (рвотный камень); 3) готовят 5н раствор серной кислоты (140 мл конц.

H2SO4 + дистиллированной воды до 1 л), этот объем переливают в 2-х литровую колбу, прибавляют туда растворы молибдата аммония и сурьмяновокислого калия и доводят до метки водой.

реактив С: 0,877 г аскорбиновой кислоты растворяют в 168 мл реактива А и доводят до 1 л (готовят в день определения).

приготовление трис-HCl буфера: 1) готовят раствор 0,2М триса (м.в. 121,14) в мерной колбе на 1 л; 2) готовят 0,1М раствор HCl, непосредственно перед работой сливают эти растворы в соотношении 25 мл триса + 35 мл HCl и доводят до 100 мл водой (pH=7,8).

В группу неферментативных антиоксидантов входят каротиноиды, флавоноиды, витамины, фенольные соединения, полиамины, аминокислоты и многие другие органические низкомолекулярные соединения, молекулы которых способны «гасить» активные молекулы кислорода (Кузнецов, Дмитриева, 2005).

Витамины - низкомолекулярные вещества, относящиеся к различным классам органических соединений. Витамины - непременные участники важнейших физиологических и биохимических процессов у животных, растений и микроорганизмов. Многие из них входят в состав простетических групп двухкомпонентных ферментов или являются веществами, служащими для синтеза указанных соединений, активируют некоторые ферментные системы. В основном витамины синтезируются растениями, с которыми главным образом и поступают в организм человека и животных. Некоторые из них образуются симбиотической микрофлорой пищеварительного тракта (Кушманова, Ивченко, 1974).

Недостаточное содержание витаминов в пище и кормах, а также нарушение их всасывания в организме ведут к развитию тяжелых нарушений обмена веществ гиповитаминозов и авитаминозов.

В основу классификации витаминов положена их растворимость.

По этому признаку витамины делят на две группы: а) витамины, растворимые в жирах и органических растворителях (витамины группы А, D и К);

непредельные (полиненасыщенные) жирные кислоты, имеющие две и больше двойных связей; б) витамины, растворимые в воде: тиамин (В1), рибофлавин (В2), никотинамид (РР), пиридоксин (В6), биотин (Н), пантотеновая и парааминобензойная кислоты, холин, инозит, фолиевая кислота, цианкобаламин (В12), пангамовая кислота (B15), витамин С (аскорбиновая кислота), витамин Р (биофлавоноиды) (Шапиро, 1976).

Витамин С – аскорбиновая кислота хорошо растворима в воде и представляет собой бесцветное кристаллическое вещество. Аскорбиновая кислота содержится в фруктах и овощах (апельсин, капуста, лимон, лук, перец, роза морщинистая, рябина обыкновенная, черная смородина, и др.). Суточная потребность человека в аскорбиновой кислоте составляет 70-100 мг. Недостаток аскорбиновой кислоты вызывает заболевание – цингу; наблюдаются изменения со стороны соединительной ткани; нарушаются процессы костеобразования и деятельность сердца. Аскорбиновая кислота принимает участие в окислительновосстановительных процессах в тканях, связана с системой глютатиона.

Колориметрический метод определения аскорбиновой кислоты основан на фотометрическом определении избытка 2,6-дихлорфенолиндофенола после восстановления определенной части его аскорбиновой кислоты (Кушманова, Ивченко, 1974; Чупахина, 1974).

Реактивы и оборудование: 2%ный раствор метафосфорной кислоты;

фенолиндофенола; весы электронные; ножницы; пипетки; пестики и фарфоровые ступки; колбы на 100 мл; фильтры; ФЭК.

1. Для количественного определения восстановленной аскорбиновой кислоты необходимо взять навеску свежего растительного материала массой 2 г (навеску измельчают ножницами).

2. Измельченный материал заливают 10 мл 2%-ой метафосфорной кислотой и быстро растирают. Гомогенат переносят в мерную колбу на 100 мл и объем доводят до метки 2%-ой метафосфорной кислотой.

Содержимое колбы встряхивают и фильтруют, из фильтрата отбирают пробы по 10 мл.

3. К пробе добавляют 1 мл 0,025%-ного раствора 2,6дихлорфенолиндофенола (0,0625 г 2,6-дихлорфенолиндофенола переносят в колбу на 250 мл, добавляют 6 капель 0,01н раствора щелочи и доводят дистиллированной водой до метки). Затем раствор заливают в кювету толщиной 10 мл (нулевая проба устанавливается по 2%-ной метафосфорной кислоте при =530 нм). Как только к пробе прилита краска, необходимо включить секундомер (параллельно колориметрируют 10 мл 2%-ной метафосфорной кислоты с 1 мл краски - контроль). Изменение в интенсивности окрашивания контрольного и опытного образца пропорционально количеству аскорбиновой кислоты, находящемуся в растительной вытяжке. Расчет производится по калибровочной кривой.

4. Для построения калибровочной кривой готовят рабочий раствор (раствор А) (100 мг аскорбиновой кислоты растворить в 1 л 2%ной метафосфорной кислоты). Из данного раствора отбирают 1, 2, 3, 4, 5, 6 мл и доводят до 100 мл 2%-ной метафосфорной кислотой. Полученные растворы содержат соответственно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 мкг аскорбиновой кислоты в 1 мл.

По разнице в колорировании раствора 2%-ной метафосфорной кислоты и стандартных растворов строится калибровочная кривая (рис. 12).

5. Содержание аскорбиновой кислоты (Х, мкг/г) рассчитывается по где А – содержание аскорбиновой кислоты вытяжки, найденное по калибровочной кривой, мкг/мл;

V – объем экстракта, полученного из данной навески, мл;

m – масса навески исследуемого материала, г.

7. Данные оформляют в таблицу 31.

Содержание аскорбиновой кислоты в растительном материале Рутин (витамин Р) - кристаллическое вещество желтооранжевой окраски. Содержится в тех же продуктах, что и витамин С, много его в чае (30-50 мг% рутина), бруснике, клюкве, чернике, сливе, вишне, винограде и др.

Действие витамина Р и витамина С связано, они участвуют в окислительно-восстановительных процессах. Терапевтическое действие витамина С гораздо более эффективно в присутствии витамина Р. При недостатке витамина Р у человека повышается проницаемость капилляров.

Это проявляется во внезапных кровоизлияниях после сдавления, болях в конечностях, быстрой утомляемости и слабости. Потребность человека в витамине Р составляет около 50 мг в сутки.

Количественное определение рутина основано на его способности окисляться перманганатом. В качестве индикатора применяется индигокармин, который вступает в реакцию с перманганатом после того, как окислится весь рутин (Кушманова, Ивченко, 1974).

Реактивы и оборудование: 0,06н раствор перманганат калия; индикатор индигокармин; конические колбы на 50 мл; пипетка на 10 мл; бюретка.

1. К 100 мг листьев чая приливают 50 мл горячей дистиллированной воды и проводят экстракцию в течение 5 мин.

2. Отбирают 10 мл экстракта чая и переносят в коническую колбу, добавляют 10 мл дистиллированной воды и 10 капель индигокармина.

3. Пробу титруют 0,05н раствором перманганата калия до появления устойчивой желтой окраски.

4. Процентное содержание рутина рассчитывают по формуле:

где Х – содержание витамина Р, мг%;

А – количество 0,05н раствора перманганата калия, пошедшее на титрование, мл;

m – количество сухого вещества, взятого для анализа, г;

V1 – объем вытяжки, взятой для титрования, мл;

V2 – объем пробы, добавленное к сухому веществу для экстракции, мл;

100 – коэффициент для вычисления процентного содержания;

1000 – коэффициент для перевода в мг.

5. Данные оформляют в таблицу 32.

Витамин РР (В5, никотиновая кислота, никотинамид) по своей химической природе является никотиновой кислотой и ее амидом - никотинамидом.

Биологическая активность никотиновой кислоты и ее амида в общем одинакова, но в организме встречается преимущественно никотинамид, так как никотиновая кислота легко подвергается амидированию.

Это дало основание некоторым исследователям считать никотиновую кислоту провитамином РР, а ее амид — витамином. Амид никотиновой кислоты — важнейший участник процессов биологического окисления. Он входит в состав анаэробных дегидрогеназ, коферментами которых являются никотинамидадениндинуклеотид (НАД) и никотинамидаде-ниндинуклеотидфосфат (НАДФ). Витамин РР довольно широко распространен в продуктах животного и растительного происхождения. Суточная потребность человека составляет 15-25 мг.

Никотиновая кислота, реагируя с бромроданом и анилином (или другими ароматическими аминами, например метолом), образует соединение, окрашенное в желтый цвет (производное глютаконового альдегида) (Шапиро, 1976).

Реактивы и оборудование: кристаллическая никотиновая кислота; 96%ный раствор этилового спирта; 0,1н раствор роданистого калия (KCNS) или роданистого аммония (NH4CNS); бромистый калий (КВг); соляная кислота HCl (1:1); 7%ный раствор HCl; бром; анилин; асканит (бентонит); азотнокислое серебро; 20%-ный раствор NaOH; 1н раствор NaOH; универсальный индикатор; насыщенный раствор сернокислого цинка; 1н раствор марганцовокислого калия; кристаллический K3PO4;

весы электронные; колбы на 50 мл; пипетки; фильтры; воронки; водяная баня; сушильный шкаф; фарфоровые пестик и ступка; центрифужные пробирки; центрифуга;

мерные цилиндры; стаканы; ФЭК.

1. Навеску растертого исследуемого материала (1-20 г) заливают 100 мл 1н раствором соляной кислоты и подвергают гидролизу в течение часа на кипящей водяной бане. Солянокислую вытяжку охлаждают, затем нейтрализуют 20%-ным раствором едкого натра до рН=6, (под контролем универсального индикатора), после чего к, ней добавляют 100 мл 95-96%-ного этилового спирта и хорошо перемешивают.

2. Выпавший осадок отфильтровывают, к прозрачному фильтрату прибавляют 2 г асканита и взбалтывают с адсорбентом в течение 3 мин, асканит отфильтровывают. Фильтр с асканитом переносят в ту же колбу, в которой обрабатывали вытяжку адсорбентом, добавляют 25 мл 1н раствора едкого натра и встряхивают колбу в течение 3 мин для элюирования никотиновой кислоты.

Взвесь переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют.

Объем центрифугата измеряют тем же цилиндром, потом его без потерь переливают в стакан и прибавляют раствор сернокислого цинка до рН=6, (по универсальному индикатору).

3. Образовавшуюся в стакане густую массу фильтруют. Фильтрат нагревают на электрической плитке и к нему по каплям добавляют нормальный раствор марганцовокислого калия до получения прозрачного раствора (окисление посторонних примесей); расходуют обычно 4капель раствора.

4. После охлаждения содержимое колбы центрифугируют. Центрифугат обрабатывают кристаллическим К3РО4 (индикатор - спиртовой раствор фенолфталеина), после чего добавляют раствор соляной кислоты (1:1) до рН=6,5 и фильтруют.

5. Затем 5 мл испытуемой вытяжки и 5 мл стандартного раствора никотиновой кислоты прогревают 5 мин на кипящей водяной бане (в отдельных стаканчиках), затем к ним одновременно прибавляют по 2 мл роданбромидного раствора и 7 мл спиртового раствора анилина. Смеси оставляют на 30-40 мин, потом фильтруют через бумажные фильтры и колориметрируют на ФЭКе ( =440 нм). В качестве контроля применяют водный раствор этилового спирта (1:1).

10. Содержание никотиновой кислоты рассчитывают по формуле: Х 25 v1 n1 где Х – содержание никотиновой кислоты, мг/100 г растительного материала;

25 – количество 1н раствора NaOH, взятое для элюирования никотиновой кислоты, мл;

v – объем элюата после извлечения никотиновой кислоты нормальным раствором NaOH и центрифугирования, мл;

v1 – объем элюата после обработки раствором сернокислого цинка, мл;

5 – объем вытяжки, взятой для реакции, мл;

10 – содержание никотиновой кислоты в 1 мл стандартного раствора, мкг;

100 – коэффициент пересчета, мг%;

1000 – пересчет в миллиграммы;

n1, n2 – оптическая плотность соответственно испытуемого и стандартного растворов.

11. Данные заносят в таблицу 33.

Приготовление реактивов:

стандартный раствор никотиновой кислоты (раствор А): 25 мг кристаллической никотиновой кислоты растворяют в мерной колбе емкостью 50 мл в 96%ном этиловом спирте;

раствор Б - 1 мл основного раствора пипеткой переносят в мерную колбу на 50 мл и доводят до метки 96%-ным этиловым спиртом, получая стандартный раствор - в 1 мл которого содержится 10 мкг никотиновой кислоты;

раствор роданбромида готовят следующим образом: в 10 мл 0,1н раствора роданистого калия (KCNS) или роданистого аммония (NH4CNS) растворяют 1 г бромистого калия (КВг), к раствору прибавляют 1 мл раствора соляной кислоты (1:1) и по каплям мл брома (не давая раствору остыть, тотчас же используют его для реакции).

раствор анилина, для этого анилин перегоняют над цинковой пылью, один объем свежеперегнанного анилина растворяют в шести объемах 96%-ного этилового спирта (раствор должен быть бесцветным, раствор хранят в холодильнике в склянке из темного стекла);

раствор асканита: асканит заливают 7%-ным раствором соляной кислоты, дают постоять 20 мин, затем раствор нагревают до кипения, а затем охлаждают, отфильтровывают и многократно промывают дистиллированной водой до отрицательной реакции промывных вод на хлор-ион (проба с азотнокислым серебром). Затем раствор высушивают в сушильном шкафу при 120°С, после чего остаток растирают в сухой ступке и пересыпают в банку с притертой пробкой.

К группе витаминов А относятся несколько веществ, близких по строению и физиологическим функциям.

Витамин А1 (ретинол) образуется при расщеплении желтооранжевых пигментов растений — каротиноидов — в печени и слизистой оболочке тонких кишок при участии фермента каротиназы. Витамин А1 содержится в печени и почках животных, печеночных жирах морских рыб (морского окуня, тунца, лосося, трески, камбалы и др.), мясе рыб (сельди, карпа и т. д.), молоке и молочных продуктах, яйцах.

другие каротиноиды. Наиболее активен -каротиноид, в состав молекулы которого входят два кольца -ионона:

При расщеплении симметричной молекулы - каротина освобождаются две молекулы витамина А1. Молекула -каротина состоит из одного -иононового кольца и одного кольца -ионона. В состав молекулы каротина входят кольца -ионона и псевдоионона.

Каротины экстрагируют ацетоном или этиловым спиртом и выделяют из смеси пигментов на хроматографической бумаге, а затем элюируются из хроматограммы петролейным эфиром или низкокипящим бензином и их содержание определяют путем колориметрирования (Шапиро, 1976).

Реактивы и оборудование: петролейный эфир или бензин; ацетон или 95-96 %ный этиловый спирт; хроматографическая бумага (вес 1 дм2= 0,85 г); углекислый натрий или углекислый кальций; азобензол; мерные колбы на 100 мл; кварцевый песок; цилиндры (высота – 25-30 см, диаметр – 13-15 см, с притертыми пробками или крышками); ступки фарфоровые; мерные цилиндры на 100 мл с притертыми пробками; ФЭК.

1. Навеску растительного материала (1-10 г в зависимости от предполагаемого содержания каротинов) растирают в ступке с ацетоном или 95-96%-ным спиртом, добавив немного стеклянного или кварцевого песка и щепотку углекислого натрия или химически чистого мела (углекислого кальция) для нейтрализации кислот. Ацетон или спирт приливают небольшими порциями (по 10-15 мл). Экстрагирование повторяют несколько раз. Вытяжки сливают в мерный цилиндр на 100 мл. Извлечение продолжают до получения бесцветного экстракта. Раствор в мерном цилиндре доводят ацетоном или спиртом до определенного объема (50-100 мл).

2. Хроматографическую бумагу нарезают на полоски длиной см и шириной, 15 см 0,5-1 мл ацетонового (или спиртового) раствора пигментов наносят (в виде полосы) на полоску хроматографической бумаги на расстоянии 4 см от ее нижнего края. Бумагу подсушивают на воздухе (лучше всего с помощью фена) в затененном месте и затем сворачивают в однослойную трубку, верхний конец которой сшивают или скрепляют пластмассовой скрепкой. Трубку ставят на дно стеклянного сосуда, куда заранее был налит петролейный эфир или низкокипящий бензин слоем в 2-3 см (он должен быть ниже места нанесения раствора пигментов на бумагу).

3. Через 20-30 мин бумажную трубку вынимают из сосуда. Вырезают полоску бумаги, окрашенную в желто-оранжевый цвет (она находится сразу же за фронтом подъема растворителя), измельчают ее (нарезают) в стеклянный бюкс или стаканчик и извлекают каротины небольшими порциями (по 1-2 мл) петролейного эфира или бензина, повторяя экстрагирование до получения бесцветного раствора. Раствор каротинов доводят этими же растворителями до определенного объема (например, 10-20 мл) и колориметрируют, употребляя в качестве стандартного рабочий раствор азобензола (14,5 мг в 100 мл). При колориметрировании каротинов пользуются синим светофильтром.

где Х – содержание каротина, мг/100 г растительного материала;

v1 – объем ацетонового (или спиртового) экстракта пигментов в мерном цилиндре, мл;

v2 – объем ацетонового (или спиртового) экстракта, нанесенный на бумагу, мл;

v3 – объем раствора каротинов в петролейном эфире или бензине, взятый для колориметрирования, мл;

h1 – показания шкалы колориметра для стандартного раствора;

h2 – показания шкалы колориметра для исследуемого раствора (среднее из 5-6 определений);

Н – навеска растительного материала, г.

5. Данные заносят в таблицу 34.

Определение содержания каротинов в растительных объектах Приготовление реактивов:

стандартный раствор (раствор А) азобензола: 145 мг препарата растворяют в 100 мл 96%-ного этилового спирта (в мерной колбе).

раствор Б: из указанного основного раствора готовят рабочий (раствор Б), разбавляя его спиртом в 10 раз (также в мерной колбе на 100 мл) – 1 мл рабочего раствора азобензола соответствует 0,00235 мг каротина.

Растворы (основной и рабочий) хранят в темном месте.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Аксенова, А.В. Влияние избытка цинка в среде на динамику формирования цианидрезистентного дыхания в корнях овса / А.В. Аксенова, О.Л. Воскресенская // Регуляция ферментативной активности у растений. – Горький, 1990. – С. 36-43.

Аксенова, В.А. Основной и альтернативный путь дыхания корней овса, выращенных при избытке цинка / А.В. Аксенова, О.Л.

Воскресенская // Актуальные проблемы охраны и рационального использования природных ресурсов. – Уфа, 1987. – С. 54.

Алябышева, Е.А. Эколого-физиологические особенности популяций гигрофитов / Е.А. Алябышева, О.Л. Воскресенская // Экология и генетика популяций. – Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. – С. 173-174.

Алябышева, Е.А. Онтогенез и особенности организация ценопопуляций некоторых гигрофитов Республики Марий Эл: автореф. дис.

… канд. биол. наук / Е.А. Алябышева. – Йошкар-Ола, 2001. – 21 с.

Алябышева, Е.А. Механизмы распределения химических элементов у некоторых гигрофитов / Е.А. Алябышева, О.Л. Воскресенская // Современные аспекты экологии и экологического образования. – Казань, 2005. – С. 190-192.

Алябышева, Е.А. Частуха подорожниковая Alisma plantagoaquatica L. / Е.А. Алябышева // Биоразнообразие растений в экосистемах национального парка «Марий Чодра»: научное издание. Ч. 2. – Йошкар-Ола: Стринг, 2005. – 115-120 с.

Андриянова, О.В. Особенности биологического круговорота химических элементов в елово-пихтовых лесах республики Марий Эл:

автореф. дис. … канд. биол. наук / О.В. Андриянова. – Йошкар-Ола, 2001. – 22 с.

Артамонов, В.И. Растения и чистота природной среды / В.И.

Артамонов. – М.: Наука, 1986. – 172 с.

Базилевич, Н.И. Биологическая продуктивность и круговорот химических элементов в растительных сообществах / Н.И. Базилевич, Л.Е. Родин. – Л., 1971. – 198 с.

Базилевич, Н.И. Биологическая продуктивность экосистем Северной Евразии / Н.И. Базилевич. – М.: Наука, 1993. – С. 15.

Белозерский, А.Н. Практическое руководство по биохимии растений / А.Н. Белозерский, Н.И. Проскуяров. – М., 1951. – 216 с.

Биохимические методы в физиологии растений / Под ред. О.А.

Павлинова. – Л.: Наука, 1971. – 228 с.

Большой практикум по физиологии растений / И.А. Чернавина, Н.Г. Потапов, Л.Г. Косулина, Т.Е. Кренделева; под ред. Б.А. Рубина. – М.: Высш. шк., 1978. – 408 с.

Буданова, О.Н. Накопление тяжелых металлов растениями тысячелистника обыкновенного (Achillea millefolium L.) / О.Н.Буданова // Принципы и способы сохранения биоразнообразия. – Йошкар-Ола:

МарГУ, 2006. – С. 375.

Васильева, Э.В. Руководство к практическим занятиям по физиологии растений / Э.В. Васильева, Г.А. Кириллова. – М.: Просвещение, 1968. – 68 с.

Вернадский, В.И. Размышления натуралиста. Научная мысль как планетарное явление. Кн.2. / В.И. Вернадский. - М.: Наук, 1977. – 191 с.

Викторов, Д.П. Малый практикум по физиологии растений / Д.П. Викторов. – М.: Высш. шк., 1983. – 135 с.

Влияние излучателей на биомассу и структуру наземных, почвенных и пресноводных биоценозов / Н.В. Тимофеев-Ресовский и др. // Сб. работ лаб. биофизики УФ АН СССР. – 1957, вып. 9. – С. 202-250.

Воробьев, В.И., Содержание некоторых микроэлементов в макрофитах дельты Волги / В.И. Воробьев, Э.И. Афанасьев // Гидробиологический журнал. – 1973. –Т. 9, № 6. – С. 75-77.

Воскресенская, О.Л. Влияние избытка цинка на накопление железа и активность железосодержащих ферментов у овса / О.Л, Воскресенская, И.А. Чернавина, В.А. Аксенова // Физиология растений. – М.,1986. – Т. 33, вып. 6. – С. 1056-1060.

Воскресенская, О.Л. Влияние избытка цинка на поглощение металлов растениями овса / О.Л, Воскресенская, И.А. Чернавина, В.А. Аксенова // Физиология устойчивости растений Нечерноземной зоны РСФСР. – Саранск, 1986. – С. 34-41.

Воскресенская, О.Л. Влияние избытка цинка на целостность мембран и сверхслабое свечение корней овса / О.Л. Воскресенская: депонир. в ВИНИТИ, № 2103. Йошкар-Ола: МарГУ, 1987. – С. 15.

Воскресенская, О.Л. Влияние избытка цинка на ионный обмен и дыхательный метаболизм растений овса: автореф. дис. … канд. биол. наук / О.Л. Воскресенская. – Казань, 1989. – 23 с.

Воскресенская, О.Л. Физиолого-биохимические изменения в онтогенезе календулы лекарственной / О.Л. Воскресенская, Н.П. Грошева, Н.М. Смирнова, С.Е. Королев // Популяции растений: принципы организации и проблемы охраны природы. – Йошкар-Ола, 1991. – С. 25-26.

Воскресенская, О.Л. Влияние избытка цинка в среде роста на свойства клеточных мембран растений овса / О.Л. Воскресенская, А.В.

Аксенова, Н.В. Гужова // Биологические науки. – М., 1991. – С. 80-86.

Воскресенская, О.Л. Руководство к большому практикуму. Ч. 1 / О.Л. Воскресенская, Н.П. Грошева. – Йошкар-Ола: МарГУ, 1994. – 62 с.

Воскресенская, О.Л. Изменение содержания металлов в онтогенезе Аmarantlus cruentus L. в популяционных локусах разной плотности / О.Л. Воскресенская // Жизнь популяций в гетерогенной среде. – Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. – С. 210-211.

Воскресенская, О.Л. Эколого-физиологические подходы при изучении адаптации в онтогенезе однолетников / О.Л. Воскресенская // Принципы и способы сохранения биоразнообразия. – Йошкар-Ола:

МарГУ, 2006. – С. 7-8.

Второва, В.Н. Обоснование методов и объектов мониторинга по химизму растений / В.Н. Второва, В.С. Скулкин // Экология, 1992. – № 4. – С. 28-37.

Второва, В.Н. Мультиэлементный анализ растений лесных экосистем Восточной Европы / В.Н. Второва, Б. Маркет // Изв. РАН. – Сер.

биол., 1995. – № 4. – С. 447-454.

Гавриленко, В.Ф. Большой практикум по физиологии растений / В.Ф.

Гавриленко, М.Е. Ладыгина, Л.М. Халдобина. – М.: Высш шк., 1975. – 285 с.

Горышина, Т.К. Экология растений / Т.К. Горышина. – М.:

Высш. шк., 1979. – 368 с Гришина, Л.А. Учет биомассы и химический анализ растений / Л.А. Гришина, Е.М. Самойлова. – М.: Изд-во МГУ, 1971. – С. 5.

Гродзинский, А.М. Краткий справочник по физиологии растений / А.М. Гродзинский, Д.М. Гродзинский. – Киев: Наукова думка, 1973. – 219 с.

Грошева, Н.П. Физиологическая характеристика популяций подорожника большого при разных антропогенных нагрузках / Н.П. Грошева, О.Л. Воскресенская, Н.М. Гуськова // Популяции и сообщества растений:

экология, биоразнообразие, мониторинг: тез. докл. V научной конференции памяти А.А. Уранова. – Кострома, 1996. – С. 114.

Двораковский, М.С. Экологическое значение важнейших макрои микроэлементов для растений / М.С. Двораковский // Экология растений. – М.: Высш. школа, 1983. – С. 124-132.

Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям / Под ред. Г.В. Удовенко. – Л., 1988. – 226 с.

Дикиева, Д.Н. Химический состав макрофагов и факторы, определяющие концентрацию минеральных веществ в высших водных растениях / Д.Н. Дикиева, Н.А. Петрова // Гидробиологические процессы в водоемах. – Л.: Наука, 1983. – С. 107-213.

Дмитриева, Г.А. Практикум по физиологии растений / Г.А.

Дмитриева, В.И. Кафели. – М., 1991. – 74 с.

Еникеев, С.Г. Практикум по физиологии и биохимии растений / С.Г. Еникеев, Н.Л. Борисова. – Казань, 1972. – 147 с.

Жуйкова, Т.В. Загрязнение почв тяжелыми металлами в городской среде / Т.В. Жуйкова // Актуальные проблемы экологогеографического изучения Урала для целей оптимизации природопользования и регионализации образования: тез. докл. – Екатеринбург, 1997а. – С. 60-61.

Жуйкова, Т.В. Taraxacum officinale в условиях технологического загрязнения почв тяжелыми металлами: уровни накопления / Т.В.

Жуйкова // Проблемы изучения биоразнообразия на популяционном и экосистемном уровне. – Екатеренбург, 1997б. – С. 73-79.

Жукова, Л.А. Морфологические и физиологические особенности онтогенеза календулы лекарственной в посевах разной плотности / Л.А. Жукова, О.Л. Воскресенская, Н.П. Грошева // Экология. – Т. 2, 1996. – С. 104-110.

Иванов, Н.Н. Методы физиологии и биохимии растений / Н.Н.

Иванов. – Л.: Сельхозгиз, 1946. – 494 с.

Ильин, В.Б. Об элементарном содержании микроэлементов в растении / В.Б. Ильин, М.Д. Степанова // Изв. СО АН СССР. – Сер.

биол. науки. – 1981, вып. 1, № 5. – С. 26-32.

Ильин, В.Б. Элементный химический состав растений: факторы его определяющие / В.Б. Ильин // Изв. СО АН СССР. – Сер. биол.

науки. – 1997, вып. 2, № 10. – С. 3-15.

Илькун, Г.М. Загрязнители атмосферы и растения / Г.М. Илькун. – Киев: Наукова думка, 1978. – 246 с.

Коваленский, А.Л. Основные закономерности формирования химического состава растений / Биогеохимия растений / А.Л. Коваленский // Тр. Бурятского ин-та ЕН БФСО АН СССР. – Улан-Уде. – Сер.

биохимия. – 1969, вып. 2. – С. 6-28.

Ковда, В.А. О биологической реакции растений на тяжелые металлы в среде / В.А. Ковда, Б.Н. Золотарева, И.И. Скрипническо // Докл.

АН СИР. – 1980. – Т. 247, № 3. – С. 766-768.

Кокин, К.А. О фильтрующей роли высшей растительности в процессах самоочищения реки Москвы / К.А. Кокин // Научн. докл.

высш. школы. – Сер. биол. науки. – 1961. – № 4. – С. 104-108.

Кокин, К.А. Экология высших водных растений / К.А. Кокин. – М.: Изд-во МГУ, 1982. – 160 с.

Комарова, Т.А. Развитие и продуктивность травянистых и кустарниковых ценопопуляций / Т.А. Комарова. – Владивосток: Дальнаука, 1992. – С. 15.

Кузнецов, В.В. Физиология растений / В.В. Кузнецов, Г.А.

Дмитриева. – М,: Высшая школа, 2005. – 736 с.

Куркаев, В.Т. Сельскохозяйственный анализ и основы биохимии растений / В.Т. Куркаев, С.М. Ерошкина, А.А Пономарев. – М.: Колос, 1977. – 240 с.

Кушманова, О.Д. Руководство к практическим занятиям по биологической химии / О.Д. Кушманова, Г.М. Ивченко. – М.: Медицина, 1974. – 424 с.

Лархер, В. Экология растений / В. Лархер. – М.: Мир, 1978. – Лукина, Г.А. Выделение аминокислот погруженными водными растениями / Г.А. Лукина // Всесоюз. конф. по высш. вод. и прибреж.вод. растениям: тез. докл. – Борок, 1988. – С. 96- Лукина, Л.Ф. Физиология высших водных растений / Л.Ф. Лукина, Н.Н. Смирнова. – Киев: Наукова думка, 1988. – 185 с.

Мережко, А.И. Эколого-физиологические особенности высших водных растений и их роль в формировании качества воды / А.И. Мережко // Физиол. растений, 1991. – Т. 32, № 2. – С. 282-287.

Мерзляк, М.Н. Роль супероксидных анион-радикалов и синглетного кислорода в патологии мембран / М.Н. Мерзляк, А.С. Соболев // Итоги науки и техники: ВИНИТИ. – Сер. биофизика. – 1975. – Т. 5. – С. 118-165.

Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и окислительные процессы в мембранах растительной клетки / М.Н. Мерзляк // Итоги науки и техники: ВИНИТИ. – Сер. физиология растений, 1989. – Т. 6. – С. 1-168.

Мерзляк, М.Н. Активированный кислород и жизнедеятельность растений / М.Н. Мерзляк // Соросовский образовательный журнал, 1999. – № 9. – С. 20-26.

Методика выполнения измерений массовой концентрации никеля в сточных водах (ПНД Ф 14.1.46-96). – М., 1996. – 11 с.

Мониторинг и методы контроля окружающей среды: учеб. пособие в 2-х частях. Ч. 2. Специальная / Ю.А. Афанасьев, С.А. Фомин, В.В. Меньшиков и др. – М.: Изд-во МНЭПУ, 2001 – 337 с.

Методы оценки устойчивости растений к неблагоприятным условиям среды / Под ред. Г.В. Удовенко. – Л.: Колос, 1976. – 318 с.

Николаевский, В.С. Биологические основы газоустойчивости растений / В.С. Николаевский. – Новосибирск: Наука, 1979. – 280 с.

Николаевский, В.С. Эколого-физиологические основы газоустойчивости растений / В.С. Николаевский. – М., 1998. – 64 с.

Никоноров, А.И. Биомониторинг металлов в пресноводных экосистемах / А.И. Никоноров, А.В. Жулидов. – Л.: Гидрометеоиздат, 1991. – 311 с.

Номенклатура ферментов / Под ред. А.Е. Браунштейна. – М.:

Изд-во ВИНИТИ, 1979. – 321 с.

Одум, Ю. Экология / Ю Одум. – М.: Мир, 1986. – Т.1. – 328 с.

Осипова, В.Ю. Характер распределения микроэлементов в органах деревьев елово-пихтовых лесов Республики Марий Эл / В.Ю.

Осипова: дис. … канд. хим. наук. – Казань, 2000. – 144 с.

Петрова, И.А. Флора и растительность озер, особенности ее химического состава / И.А. Петрова // Реакция экосистем озер на хозяйственное преобразование их водосборов (по материалам Восточной Латвии). – Л., 1983. – С. 75- Плешков, Б.П. Методы биохимического анализа растений / Б.П.

Плешков. – М.: Колос, 1978. – 126 с.

Плешков, Б.П. Практикум по биохимии растений / Б.П. Плешков. – М.: Колос, 1968. – 726 с.

Полевой, В.В. Физиология растений / В.В. Полевой. – М.:

Высш. шк., 1989. – 462 с.

Половникова, М.Г. Влияние растворов солей микроэлементов на всхожесть семян ряда лекарственных растений / М.Г. Половникова, О.Л.

Воскресенская // Принципы и способы сохранения биоразнообразия. – Йошкар-Ола: МарГУ, 2004. – С. 165 – 166.

Починок, Х.Н. Методы биохимического анализа растений / Х.Н.

Починок. – Киев: Наукова думка, 1976. – 330 с.

Практикум по физиологии растений / Н.Н. Третьяков, Т.В. Карнаухова, Л.А. Паничкин. – М.: Агропромиздат, 1990. – 271 с.

Практикум по физиологии растений / Под ред. В.Б. Иванова. – М.: Академия, 2004. – 144 с.

Практикум по физиологии растений / Под ред. Т.В. Карнаухова.

– М.: Агропромиздат, 1990. – 270 с.

Работнов, Т. А. Фитоценология / Т.А. Работнов. – М.: Изд-во МГУ, 1992. – 352 с.

Родин, Л.Е. Методические указания к изучению динамики и биологического круговорота в фитоценозах / Л.Е. Родин, Н.П. Ремезев, Н.И. Базилевич. – Л.: Наука, 1967. – 145 с.

Сабанин, Д.А. Избранные труды по минеральному питанию растений / Д.А. Сабанин. – М.: Наука, 1971. – 512 с.

Садчиков, А.П. Гидроботаника: Прибрежно-водная растительность / А.П. Садчиков, М.А. Кудряшов. – М.: Изд. центр «Академия», 2005. – 240 с.

Свидетельство на стандартный образец состава злаковой травосмеси (СБМТ – 01) / Под ред. Ю.С. Шафринского. – М., 1978. – 24 с.

Ситникова, А.С. Влияние промышленных загрязнителей на устойчивость растений / А.С. Ситникова. – Алма-Ата: Наука, 1990. – 88 с.

Соловьева, Е.В. Изменение некоторых физиологических параметров хвои туи западной в сезонной динамике / Е.В. Соловьева, А.Н.

Баранова, О.Л, Воскресенская // Актуальные вопросы экологической физиологии в XXI веке: материалы междунар. конф. – Сыктывкар, 2001.

– С. 331-332.

Тимофеева-Ресовская, Е.А. О накоплении пресноводными организмами химических элементов из водных растворов: о коэффициентах накопления различных радиоизотопов тремя видами водных растений / Е.А. Тимофеева-Ресовская, М.А. Тимофеева, Н.В. ТимофеевРесовский // Бюл. МОИП. – 1959. – Т. 64. – С. 117-131.

Титова, Л.М. Накопление гидрофитами редких и рассеянных элементов в придонных условиях / Л.М. Титова, И.П. Лубянов // Вопросы радиационной и химической экологии организмов. – Днепропетровск, 1970. – С.85-99.

Тихомиров, А.А. Спектральный состав света и продуктивность / А.А. Тихомиров, Г.М. Лисовский, Ф.Я. Сидько. – Новосибирск: Наука, 1991. – С. 69.

Уильямс, Д. Металлы жизни / Д. Уильямс. – М.: Мир, 1975. – 188 с.

Чернавина, И.А. Физиология и биохимия микроэлементов / И.А. Чернавина. – М.: Высш. шк., 1980. – 309 с.

Чернавина, И.А. Большой практикум по физиологии растений.

Минеральное питание / И.А. Чернавина. – М.: МГУ, 1976. – 286 с.

Чернавина, И.А. Медьсодержащие оксидазы растений овса в условиях избытка цинка / И.А. Чернавина, О.Л. Воскресенская // Межвузовский сб.

«Ферменты, ионы и биоэлектрогенез у растений». – Горький, 1984. – С. 95-101.

Черных, Н.А. Экологический мониторинг токсикантов в биосфере / Н.А. Черных, С.Н. Сидоренко. – М.: Изд-во РУНД, 2003. – 430 с.

Чиркова, Т.В. Клеточные мембраны и устойчивость растений к стрессовым воздействиям / Т.В. Чиркова // Соросовский образовательный журнал. – 1997. – № 9. – С.12-17.

Чиркова, Т.В. Физиологические основы устойчивости растений / Т.В. Чиркова. – Спб.: Изд-во СПб ун-та, 2002. – 244 с.

Чупахина, Г.Н. Количественное определение аскорбиновой кислоты колориметрическим методом: специальный практикум по биохимии и физиологии растений / Г.Н. Чупахина. – Томск: Изд-во Томского ун-та, 1974. – С. 27-31.

Шапиро, Д.К. Практикум по биологической химии / Д.К. Шапиро. – М.: «Вышэйш. школа», 1976. – 288 с.

Шафринский, Ю.С. Свидетельство на стандартный образец состава злаковой травосмеси СБМТ-01, № 1485-01 / Ю.С. Шафринский, В.С. Николаевский, А.А. Горшкова и др. – М., 1978. – 24 с.

Шафринский, Ю.С. Требование к хранению стандартных образцов почв и растений / Ю.С. Шафринский, В.С. Николаевский, Т.Д, Швецова и др. // Сб. науч. трудов «Селекция и возделывание кормовых трав на Дальнем Востоке». – Новосибирск, 1982. – С. 116-140.

Шилов, И.А. Экология: учеб. для биол. и мед. спец. вузов / И.А.

Шилов. – М.: Высш. шк., 2000. – 512 с.

Bolwell, G.P. Mechanisms for the generation of reactive oxygen species in plant defense - a broad perspective / G.P. Bolwell, P. Wojtaszek // Physiol.

mol. plant pathol. – 1997. – vol. 51. – P. 347-366.

Boyd, C.E. Production, mineral nutrient absorption and biohemical assimilation by Justicia americana and Alternanthera philoxeroides / C.E.

Boyd // Arch. Hydrobiol. – 1969, vol. 66. – Р. 139-160.

Cowgill, U.M. The hydrochemistry of Linsley Pond: The chemical composition of the aquatic macrophytes / U.M. Cowgill // Arch. Hydrobiol. – 1974, vol. 45. – Р. 1-119.

Carpenter, S.R. The macrophyte tissue nutrient pool of a harwater eutrophic lake / S.R. Carpenter, M.S. Adams // Aquqt. Bot. – 1977, vol. 3. – P. 239-255.

Foy, C.D. The physiology of metal toxicity in plants / C.D. Foy, R.L. Chaney, M.C. // Ann. Res. Plant Physiol. – 1978, vol. 28. – P. 511-549.

Riemer, D.N. A survey of the chemical composition of aquatic plants in New Jersey / D.N. Riemer, S.J. Toth // New Jersey Agric. Exp. Stat.

Bull. – 1968, vol. 820. – 14 p.

Roser, J.A. Zinc, Iron and chlorophyle metabolism in zinc-toxic corn / J.A. Roser, C.S. Pike, M.L. Jorder // Plant Physiol. – 1977, vol. 59. – № 6. – P. 1085-1087.

Sheffer, S.E.B. Influence of substrate conditions of the Phtagmites au stralis after a reduction in oxygen transport to brlowground parts / S.E.B.

Sheffer, W. Stach // Aquatic botany. – 1989, vol. 35. – № 1. – P. 71-80.

ПРИЛОЖЕНИЕ I

Приготовление растворов различных концентраций Процентные растворы (% (вес/объем) – вес в граммах растворенного вещества на 100 мл раствора; % (вес/вес) – вес в граммах растворенного вещества на 100 г раствора).

Пример 1. Необходимо приготовить 5%-ный раствор соды (Na2CO3) в количестве 200 мл.

Решение: для приготовления 100 мл потребуется 5 г безводной соды, а для 200 мл – в 2 раза больше, т.е. 10 г.

Пример 2. Необходимо приготовить 100 мл 10%-го раствора сульфата меди, имея в наличии медного купороса CuSO4·5H2O.

Решение: в данном случае необходимо сделать перерасчет, так как исходное вещество – не безводная соль, а кристаллогидрат. Для приготовления 100 мл 10%-го раствора CuSO4 необходимо 10 г безводной соли. Рассчитаем, в каком количестве медного купороса CuSO4·5H2O содержится CuSO4. Молекулярная масса (Mr) CuSO4·5H2O равна 250, а молекулярная масса CuSO4 равна 160.

Рассчитаем, в каком количестве этой соли содержится 10 г CuSO4, для этого составим пропорцию:

Значит, для приготовления 100 мл 10%-го раствора CuSO4 из медного купороса CuSO4·5H2O надо взять 15,63 г соли.

Пример 3. Необходимо приготовить 1 л 10%-го раствора соляной кислоты.

Имеющаяся в лаборатории соляная кислота содержит 35,39% чистой HCl ( =1,18).

Решение: для приготовления 1 л 10%-го раствора HCl необходимо 100 г чистой соляной кислоты. В 100 г имеющейся в лаборатории кислоты содержится 35,39 г чистой HCl. Рассчитаем, в каком количестве кислоты будет содержаться 100 г чистой HCl, для этого составим пропорцию:

Однако взвешивать жидкость неудобно, поэтому вес жидкости переводится в объем. Для этого полученный вес необходимо разделить на Таким образом, для приготовления 1 л 10%-го раствора HCl необходимо взять 239,5 мл концентрированной соляной кислоты с плотностью 1,18 г/см3.

Задача 1. Рассчитаете, какое количество концентрированной азотной кислоты необходимо взять, для того чтобы приготовить 250 мл 30%-го раствора HNO3 (см. приложение, табл. ).

Задача 2. Рассчитайте, какое количество молибденовокислого аммония необходимо взять, для того чтобы приготовить 500 мл 10%-го раствора соли, имея в наличии (NH4)6·Mo7O24·4H2O.

Задача 3. Рассчитайте, какое количество 50%-го раствора серной кислоты необходимо взять, для того чтобы приготовить 300 мл 30%-го раствора H2SO4.

Молярность (М) – число молей растворенного вещества в 1 л ( мл) раствора. Моль – относительная молекулярная масса вещества, выраженная в граммах.

Пример 1. Приготовить 200 мл 0,5 М раствора поваренной соли NaCl.

Решение: молекулярная масса NaCl равна 58,5, значит, 1 моль ее составляет 58,5 г. Необходимо приготовить 0,5М раствор, т.е. в 1000 мл такого раствора содержится 0,5 моль, т.е. 29,25 г NaCl. Рассчитаем, какое количество соли необходимо взять для приготовления 200 мл 0,5М раствора, для этого составим пропорцию:

Таким образом, для приготовления 200 мл 0,5 М NaCl необходимо взять 5,85 г соли.

Пример 2. Приготовить 500 мл 0,1М раствора сульфата цинка, если в лаборатории имеется цинковый купорос (ZnSO4·7H2O).

Решение: 1 моль ZnSO4 равен 161 г. Для приготовления 1000 мл 0,1М раствора потребуется 16,1 г ZnSO4. Так как в наличии только ZnSO4·7H2O, то необходимо сделать перерасчет. Для приготовления 500 мл 0,1 М раствора ZnSO потребуется 8,05 г соли. Рассчитаем, в каком количестве цинкового купороса содержится такое количество безводного сульфата цинка: молекулярная масса ZnSO4·7H2O равна 287 г/моль, составим пропорцию:

Значит, для приготовления 500 мл 0,1М раствора сульфата цинка надо взять 14,35 г цинкового купороса.

Пример 3. Приготовить 1 л 2М раствора H2SO4, если в лаборатории имеется концентрированная кислота с плотностью 1,84 г/см3 (см. приложение II).

Решение: 98%-ная серная кислота имеет плотность 1,84 г/см3, моль серной кислоты равен 98 г. Для приготовления 1000 мл 2М раствора H2SO4 потребуется ее в два раза больше, т.е. 196 г. Необходимо узнать, в каком количестве 98%-ной H2SO4 содержится 196 г чистой кислоты, для этого составим пропорцию:

Значит, в 200 г 98%-ной H2SO4 содержится 196 г чистой серной кислоты. Однако взвешивать жидкость неудобно, поэтому вес жидкости переводится в объем. Для этого полученный вес необходимо разделить на плотность кислоты: V 200 108,7 мл.

Для приготовления 1 л 2М раствора H2SO4 необходимо взять 108, мл концентрированной серной кислоты с плотностью 1,84 г/см3.

Задача 1. Рассчитаете, какое количество фенилгидразина солянокислого (C6H5NHNH2·HCl) необходимо взять, для того чтобы приготовить 250 мл 0,01М раствора фенилгидразина солянокислого.

Задача 2. Рассчитайте, какое количество серноватистокислого натрия необходимо взять, для того чтобы приготовить 250 мл 5М раствора соли, имея в наличии Na2S2O3·5H2O.

Задача 3. Рассчитайте, какое количество концентрированной уксусной кислоты (CH3COOH) необходимо взять, для того чтобы приготовить 100 мл 6М раствора кислоты.

Нормальность (н) – число грамм-эквивалентов растворенного вещества, содержащееся в 1 л (1000 мл) раствора. Эквивалентом элемента называют такое его количество, которое соединяется с 1 молем атомов водорода или замещает то же количество атомов водорода в химических реакциях. Чтобы вычислить грамм-эквивалент, величину молярного веса делят:

а) в случае кислоты – на число атомов водорода в кислоте (на ее основность);

б) в случае основания – на число гидроксильных групп в молекуле основания (на его кислотность);

в) в случае соли – на основность кислоты, из которой образована взятая соль;

г) у таких солей, как, например, KMnO4 (марганцовокислый калий), K2Cr2O7 (двухромовокислый калий), грамм-эквивалент вычисляется иначе, т.к.

эти соли относятся к окислителям. У окислителей грамм-эквивалент вычисляется путем деления молекулярного веса на число электронов, принимаемых металлом аниона, окисляющего другой какой-либо анион или атом.

Так, в кислой среде атом Mn в KMnO4 принимает 5 электронов, поэтому для этих условий грамм-эквивалент KMnO4 равен молекулярной массе, деленной на 5: 158 31,6.

В щелочной среде атом Mn в KMnO4 принимает только 3 электрона, поэтому грамм-эквивалент KMnO4 равен: 158 52,66.

K2Cr2O7 имеет грамм-эквивалент, равный молекулярному весу, деленному на 6, т.к.к каждый атом Cr в K2Cr2O7 принимает 3 электрона, а их в соли 2, поэтому при окислении этой солью от окисляемых веществ отнимается 6 электронов на каждую молекулу K2Cr2O7 и ее грамм-эквивалент будет равен: 294 49.

Пример 1. Приготовить 0,2н раствор NaOH в количестве 250 мл.

Решение:1 грамм-эквивалент NaOH равен его молекулярной массе, так как это одноосновное основание. Для того чтобы узнать чему будет равен 0,2 грамм-эквивалент составим пропорцию:

Для приготовления 1 л 0,2н раствора NaOH требуется 8 г, а для приготовления 250 мл – в 4 раза меньше, т.е. 2 г NaOH. Данное количество щелочи необходимо растворить в объеме дистиллированной воды, равном 250 мл.

Пример 2. Приготовить 500 мл 0,5н раствора HCl, имея в наличии концентрированную кислоту с плотность 1,18.

Решение: Соляная кислота плотностью 1,18 г/см3 имеет концентрацию – 35,39%.

Грамм-эквивалент HCl равен ее молекулярной массе (это одноосновная кислота),т.е. 36.5 г. Для приготовления 1 л 0,5н раствора HCl потребуется 18,25 г, а для 500 мл 0,5н раствора – 9,13 г. Для того, чтобы рассчитать, в каком количестве имеющейся 35,39%-ной HCl содержится какое количество чистой кислоты составим пропорцию:

Пересчитаем на объем, разделив массу кислоты на ее плотность:

1, Таким образом, для приготовления 500 мл 0,5н раствора соляной кислоты необходимо взять 2,2 мл HCl, имеющей плотность 1,18, это количество растворяют в мерной колбе объемом 500 мл дистиллированной водой.

Задача 1. Рассчитаете, какое количество хлорида кобальта (CoCl2) необходимо взять, для того чтобы приготовить 500 мл 0,01н раствора соли.

Задача 2. Рассчитайте, какое количество KMnO4 необходимо взять, для того чтобы приготовить 400 мл 0,5н раствора KMnO4 (среда щелочная).

ПРИЛОЖЕНИЕ II

Окраска растворов и соответствующих им светофильтров Наименование рН Изменение Приготовление раствора Метиловый Желтая-зеленая 0,1 г индикатора в 10 мл воды Тимоловый Красная-желтая 0,1 г индикатора растирают с 4, Метиловый Красная-желтая 0,1 г индикатора в 10 м воды Бромкрезоло- Желтая-синяя 0,1 г индикатора растирают с 2, Лакмоид Красная-синяя 0,1 г индикатора в 100 мл этилового спирта Бромкрезоло- Бледно-желтая- 0,1 г индикатора растворяют в Бромтимоло- Желтая-синяя 0,1 г индикатора растворяют в Нейтральный Красная-желтая 0,1 г индикатора в 10 мо воды Феноловый Желтая-красная 0,1 г индикатора растирают с 5, Тимоловый Желтая-синяя 0,1 г индикатора с 4,3 мл 0,05н Фенолфталеин Бесцветная- 0,5-1,0 г индикатора в 10 мл 60красная 90% этилового спирта Тимолфталеин Бесцветная- 0,1 г индикатора в 100 мл этилосиняя вого спирта Приготовление 0,2М ацетатного буфера (рН=3,6–5,8) Приготовление 0,05М сукцинатного буфера (рН=3,8–6,0) Приготовление 0,1М фосфатного буфера (рН=5,8–8,0) (Na2 HPO4·2H2O, Mr = 178,05; Na2HPO4·12H2O, Mr = 358,22; Na 2PO4·H2O, Mr = 138,0;

Приготовление 0,05М трис-HCl буфера (рН=7,2–9,1) (трис Mr = 121,14) Приготовление 0,05М боратного буфера (рН =9,3–10,1) Приготовление 0,1М цитратного буфера (рН = 3,0–6,2) трехзамещенный цитрат натрия Na3 С6 Н5O7·2H2O, Mr = 294,12) 1 куб. метр (м3) = 1000 куб. дециметрам = 1000000 куб. сантиметрам 1 кв. километр = 1000000 кв. метрам 1 кв. метр = 100 кв. дециметрам 1 гектар (га) = 10000 кв. метрам ВОСКРЕСЕНСКАЯ Ольга Леонидовна АЛЯБЫШЕВА Елена Александровна ПОЛОВНИКОВА Марина Григорьевна

БОЛЬШОЙ ПРАКТИКУМ ПО БИОЭКОЛОГИИ

УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ

Печатается в авторской редакции Лицензия ИД № 06434 от 10 декабря 2001 г.

Подписано в печать 06.05.2006 г. Формат 60x84/16.

Усл. печ. л. 6,75. Уч.-изд. л. 6,28. Тираж 200. Заказ № 926.

Оригинал-макет подготовлен к печати на кафедре экологии БХФ ГУО ВПО «Марийский государственный университета»

424002, г. Йошкар-Ола, ул. Осипенко, 60.

424002, г. Йошкар-Ола, ул. Коммунистическая, д. 31, офис