[ «УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ ДЛЯ САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ ПОДГОТОВКИ СТУДЕНТОВ К КУРСУ БИОФИЗИКА Составители: Башарина О.В., Артюхов В.Г. ВОРОНЕЖ 2007 2 Утверждено Научно-методическим советом фармацевтического факультета 30.05. ...»
3. Биофизика : учеб. для вузов / Ю.А. Владимиров [и др.]. – М., 1983.
– С. 33-36.
4. Биофизика : практикум для студентов / В.Г. Артюхов, О.В.
Башарина. – Воронеж, 2003. – С. 7-16.
5. Конспект лекций.
4.3. Люминесценция. Флуоресценция и фосфоресценция.
Применение люминесцентного анализа в биологии и фармации.
Механизмы миграции энергии При поглощении фотона электрон переходит на одну из свободных орбиталей (или на новый энергетический уровень) и молекула оказывается в возбужденном состоянии. Таких уровней может быть несколько, и молекула может оказаться на любом из них, в зависимости от того, какой была длина волны действующего излучения (см. рис. 4.1.2). Время жизни в возбужденном состоянии, как правило, очень мало, и происходит обратный переход электрона на основную орбиталь. Это приводит к уменьшению энергии системы, которая может выделиться по частям, растратившись на колебательные движения ядер и поступательное движение молекул растворителя, т. е. теплоту, или же эта энергия возбужденного состояния может выделиться одной порцией в виде кванта люминесценции. Люминесценцией тела в данной спектральной области называют избыток светового излучения над температурным при условии, что это избыточное излучение обладает конечной длительностью, превышающей период световых колебаний. (Признак длительности в этом определении был предложен С.И.Вавиловым для того, чтобы отличить люминесценцию от других явлений вторичного свечения, например отражения и рассеяния света.) Образование электронно-возбужденных молекул может быть не только результатом поглощения ими квантов света, в зависимости от источника энергии при возбуждении молекул говорят о разных типах люминесценции. Люминесценцию, возникшую в результате освещения молекул, называют фотолюминесценцией. Свечение, сопровождающее химические реакции,— хемилюминесценция (слабая хемилюминесценция сопровождает, например, свободнорадикальное цепное окисление липидов). Многие живые организмы, например светляки, бактерии, некоторые морские организмы, способны испускать довольно сильный свет в результате определенных биохимических реакций; такое свечение называют биолюминесценцией. В физике известны явления термолюминесценции, электролюминесценции и др. Эти термины указывают на то, что причиной образования электронно-возбужденных молекул в этих случаях является соответственно нагревание образцов, пропускание электрического тока.
В состоянии теплового равновесия с окружающей средой практически все молекулы находятся на самом нижнем колебательном подуровне самого нижнего электронного уровня. Из основного состояния So молекула может перейти на разные колебательные подуровни вышележащих электронных орбиталей S1, S2 и т. д., поглотив фотоны соответствующей энергии. Таким образом, длина стрелок вверх на рис.
4.1.2 (энергия переходов) позволяет найти частоты и длины волн максимумов тонкой структуры спектров поглощения молекул по уравнению (4.1.1). Обычно приходится решать обратную задачу: зная структуру спектра поглощения, строить схему электронных уровней молекул в возбужденном состоянии.
В люминесцирующих молекулах возбужденное (синглетное) состояние относительно устойчиво: электрон может находиться на орбитали в возбужденном состоянии до 10-9 – 10-8с. В отсутствие переноса энергии на другие молекулы и фотохимической реакции обратный переход возбужденной молекулы в основное состояние может происходить тремя путями.
1. Энергия возбужденного состояния постепенно растрачивается на тепловые движения молекул. Квант света при электронном переходе с возбужденного уровня на основной не высвечивается (переход ВК с уровня S1 на уровень S0). Такой электронный переход называют безызлучательным.
2. Электрон переходит с орбитали возбужденного состояния S 1 на орбиталь основного состояния So, при этом высвечивается квант света флуоресценции. Такой переход может происходить на разные колебательные подуровни основного состояния.
3. Происходит обращение спина электрона на орбитали S 1. Молекула переходит в триплетное состояние Т1, энергия которого несколько ниже энергии синглетного. Поскольку прямой переход из триплетного состояния в основное синглетное запрещен, т. е. маловероятен, молекула может находиться в триплетном состоянии сравнительно длительное время: от 10-4 с до нескольких секунд. При обычных температурах в жидкой фазе за это время происходит безызлучательный переход в основное состояние Т1 S0. Но в растворах, замороженных жидким азотом, и даже при комнатных температурах, но в твердых образцах может наблюдаться излучательный переход, сопровождающийся высвечиванием кванта фосфоресценции.
Спектром люминесценции (спектром испускания – флуоресценции или фосфоресценции) называют зависимость интенсивности света люминесценции от длины волны излучения.
Согласно закону Стокса спектр люминесценции расположен в более длинноволновой области по сравнению со спектром поглощения того же соединения. Это означает, что средняя энергия квантов люминесценции меньше средней энергии поглощенных квантов. На рис. 4.1.2 данная закономерность проявляется в том, что длина прямых стрелок вверх (электронные переходы при поглощении света) больше длины стрелок, направленных вниз (электронные переходы при флуоресценции и фосфоресценции). Причина такого явления уже была рассмотрена выше — это превращение части энергии поглощенного фотона в тепловую энергию окружающих молекул.
Правило Каши относится к форме спектра флуоресценции при возбуждении объекта светом разных длин волн. Оно гласит, что спектр флуоресценции (и фосфоресценции) не зависит от длины волны возбуждающего излучения. Испускание квантов флуоресценции всегда происходит с нижнего возбужденного уровня молекулы, независимо от того, на какой уровень был «заброшен» перед этим электрон в результате поглощения фотона. Это означает, что какой бы длиной волны ни была возбуждена молекула (разные вертикальные стрелки вверх на схеме), излучение будет происходит из одного и того же состояния молекулы и спектр флуоресценции во всех случаях будет одинаковым.
Согласно закону Вавилова, квантовый выход люминесценции не зависит от длины волны возбуждающего света.
Правило Каши и закон Стокса имеют большое значение при проведении спектрофлуориметрических измерений. Если в растворе люминесцирует одно вещество, то (правило Каши) на форме спектра люминесценции длина волны возбуждения не сказывается. Это позволяет использовать спектрофлуориметрию для качественного и количественного анализов люминесцирующих веществ (в том числе лекарственных препаратов).
Флуоресцентным зондом называют флуоресцирующую молекулу, которая связывается с белками, биологическими мембранами или другими компонентами клетки нековалентными связями. В качестве зондов используют соединения, параметры люминесценции которых резко меняются в зависимости от свойств среды. Поэтому, зная локализацию зонда в клетке, можно по люминесценции судить о физических свойствах непосредственного микроокружения молекул зонда, т. е. о свойствах белков, мембран, нуклеиновых кислот и других структур клеток. В некоторых случаях компоненты клеток ковалентно связывают («метят») с флуоресцирующими соединениями, в этих случаях используют термин флуоресцентные метки.
Перенос энергии электронного возбуждения между двумя молекулами можно представить в виде схемы D*+A D+A*. В результате переноса энергии возбужденная молекула донора энергии D* переходит в основное (невозбужденное) состояние D, а молекула акцептора энергии переходит из невозбужденного состояния А в возбужденное А*.
Один из возможных способов переноса энергии между молекулами донора и акцептора заключается в том, что молекула D * излучает квант флуоресценции, а молекула А его поглощает. Такой перенос за счет реабсорбции света флуоресценции называют излучательным.
Одним из путей дезактивации электронно-возбужденного состояния молекулы является миграция энергии. Это самопроизвольная безызлучательная передача энергии от одной частицы (атома, молекулы) к другой на расстояния, значительно превышающие межатомные, происходящая без растраты на тепловые колебания и без кинетических соударений донора и акцептора энергии. Она происходит в газах, жидкостях и твердых телах как между одинаковыми, так и между разными частицами в направлении от более высокого к более низкому или одинаковому энергетическому уровню. Известно несколько механизмов миграции энергии: индуктивно-резонансный, обменно-резонансный, экситонный и полупроводниковый (зонная проводимость). Мы рассмотрим только три первые вида миграции энергии, так как зонная проводимость рассматривается в курсе физики.
Передача энергии по индуктивно-резонансному механизму осуществляется за счет диполь-дипольных взаимодействий между молекулами донора и акцептора без переноса каких-либо частиц вещества или световых квантов. В этом случае энергия взаимодействия обратно пропорциональна третьей степени межмолекулярных расстояний (R3), а вероятность миграции энергии обратно пропорциональна R6. Для осуществления индуктивно-резонансной миграции энергии необходимо, чтобы молекулы D и A имели одинаковые Е между определенными энергетическими уровнями (условие резонанса), и чтобы взаимодействия между ними были достаточно интенсивны (условие индукции). Миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму может происходить в случае выполнения трех правил Ферстера:
1. Донор энергии (D*) должен обладать способностью к флуоресценции.
2. Спектр флуоресценции донора (D*) должен перекрываться со спектром поглощения акцептора (A). Эффективность миграции энергии прямо пропорциональна площади перекрытия указанных спектров.
3. Донор и акцептор энергии должны быть сближены на определенные расстояния (R).
Индуктивно-резонансная миграция энергии может протекать как в одной молекуле, от одних ее групп к другим (внутримолекулярная миграция), так и между отдельными молекулами (межмолекулярная миграция энергии).
В случае обменно-резонансной, или триплет-триплетной миграции энергия переносится с триплетного возбужденного уровня донора (3D) на триплетный уровень акцептора (3А) в соответствии со схемой 3D + 1А D + 3A из-за прямого перекрывания "триплетных" электронных облаков за счет электростатических взаимодействий электронов донора и акцептора.
Чем больше объем перекрывания электронных орбит (облаков), тем вероятнее перенос, при котором донор и акцептор взаимно обмениваются своими электронами. Отсюда возник и сам термин "обменно-резонансный перенос", для которого необходимо большее сближение молекул (Ro= нм), чем для индуктивно-резонансного переноса энергии. Эффективность обменно-резонансной миграции энергии обратно пропорциональна R6.
Экситонный перенос энергии возникает вследствие электрических, диполь-дипольных взаимодействий между молекулами или ионами.
Экситон - квазичастица, представляющая собой электронное возбуждение в диэлектрике или полупроводнике, мигрирующее по кристаллу и не связанное с переносом электрического заряда и массы.
В биологических системах наиболее частой является миграция энергии по индуктивно-резонансному механизму.
Вопросы и задания для самоподготовки 1. Что собой представляет люминесценция? Какие виды люминесценции (в зависимости от способа перевода вещества в возбужденное состояние) вы знаете?
2. Что такое флуоресценция и фосфоресценция?
3. Что собой представляет спектр испускания и спектр возбуждения люминесценции?
4. Сформулируйте закон Вавилова и правило Каши.
5. Сформулируйте правило Стокса. Почему максимум испускания в спектре испускания всегда сдвинут в длинноволновую область по отношению к максимуму поглощения данного вещества?
6. Что такое хемилюминесценция? Приведите примеры использования хемилюминесцентного метода исследования в медицине и биологии.
7. Что собой представляют люминесцентные зонды? Для чего они используются?
8. Какие вы знаете способы миграции энергии? Какой способ чаще всего встречается в биосистемах?
9. Что такое миграция энергии?
10. При каких условиях будет осуществляться индуктивнорезонансная миграция энергии (правила Ферстера)?
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 459Артюхов В.Г. Биофизика : учеб. пособие / В.Г. Артюхов, Т.А.
Ковалева, В.П. Шмелев. - Воронеж, 1994. – С. 242-259.
3. Владимиров Ю.А. Физико-химические основы фотобиологических процессов : учеб. пособие / Ю.А. Владимиров, А.Я. Потапенко. – М. :
Высш. шк., 1989. – 199 с.
4. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка / Е.А.
Пермяков. – М. : Наука, 2003. – 189 с.
5. Конспект лекций.
4.4. Фотобиологические процессы и их стадии. Фотохимические превращения биополимеров и мембран Изучение биофизических аспектов фотобиологических процессов является центральным разделом квантовой биофизики. К фотобиологическим относят процессы, начинающиеся с поглощения кванта света биологически важной молекулой и заканчивающиеся какойлибо физиологической реакцией (позитивной или негативной) на уровне организма. К таким процессам относятся: фотосинтез — синтез органических молекул за счет энергии солнечного света, поглощенной хлорофиллом; фототаксис — движение организмов, например бактерий, к свету или от света; фототропизм — поворот листьев или стеблей растений к свету или от света; зрение — превращение световой энергии в энергию нервного импульса в сетчатке глаза или в аналогичных фоторецепторах; действие ультрафиолетовых лучей (бактерицидное или бактериостатическое действие на микроорганизмы, мутагенное действие, канцерогенное действие, образование витамина D из провитаминов, эритемное действие на кожу, образование загара, терапевтические эффекты). К фотобиологическим процессам также может быть отнесена биолюминесценция (см. раздел 4.3).
Условно всякий фотобиологический процесс можно разбить на несколько стадий: 1) поглощение кванта света; 2) внутримолекулярные процессы размена энергии (фотофизические процессы); 3) межмолекулярные процессы переноса энергии возбужденного состояния;
4) первичный фотохимический акт (образование первичных, нестабильных фотопродуктов); 5) темновые реакции, заканчивающиеся образованием стабильных продуктов; 6) биохимические реакции с участием фотопродуктов; 7) общефизиологический ответ на действие света.
В задачу биофизики входит исследование первых четырех стадий фотопроцессов, Более поздние стадии – предмет исследования биохимиков, физиологов и медиков.
Спектром фотобиологического действия называют зависимость фотобиологического эффекта от длины волны действующего света.
Согласно первому закону фотохимии (закон Гротгуса – Дрейпера), фотохимически активным является свет с длиной волны, которая поглощается веществом. Одна из задач при изучении фотобиологических процессов - определение вещества, которое поглощает действующее излучение и тем самым участвует в первых стадиях процесса. Для этого изучают спектр фотохимического действия и сравнивают его со спектрами поглощения предполагаемых участников реакции. Например, было установлено, что кривая гибели бактерий под действием УФ-света имеет максимум в области 265 нм и что форма этой кривой очень похожа на спектр поглощения ДНК. Поэтому был сделан вывод, что гибель бактерий под действием УФ-излучения обусловлена повреждением ДНК.
Первичные фотохимические реакции белков, липидов и нуклеиновых кислот. Белки, нуклеиновые кислоты и липиды являются основными компонентами всех живых существ, поэтому их фотохимические превращения изучались очень интенсивно.
На рис. 4.4.1 приведена схема процессов фотопревращения белков при УФ-облучении.
Основными хромофорами белков в УФ-области являются остатки ароматических (в основном триптофана) и серосодержащих аминокислот.
Причем при действии УФ-света с > 285 нм поглощение осуществляется в основном триптофаном и тирозином. В более коротковолновой области спектра (240-260 нм) резко возрастает роль фотолиза цистина.
Образованию конечных стабильных фотопродуктов ароматических аминокислот предшествует возникновение ряда первичных (промежуточных) лабильных (неустойчивых) фотопродуктов свободнорадикальной природы.
хемилюминесценция стабильные фотопродукты ароматических аминокислот (ДОФА, формилкинуренин) Рис. 4.4.1. Схема процессов фотоинактивации белковых молекул.
Все пояснения – в тексте Появление в белковых образцах при УФ-облучении (260 - 280 нм) свободных радикалов ароматических аминокислот зарегистрировано с помощью методов электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) и фотолюминесценции. Установлено, что основной первичной фотореакцией ароматических аминокислот в белке является фотоионизация - отрыв электрона от молекулы аминокислоты (АН) с образованием катионрадикала (АН+) и сольватированного (т.е. окруженного молекулами растворителя) электрона (es) по следующей схеме: AH + h АН* АН++ еs. При распаде (диссоциации) катион-радикала возникает нейтральный радикал: АН+ А + Н+. Стабильными фотопродуктами ароматических аминокислот являются диоксифенилаланин (ДОФА), формилкинуренин. Фотолиз -S-S-связи может происходить при поглощении квантов УФ-излучения как самим цистином, так и ароматическими аминокислотами (с последующей миграцией энергии на цистин). Разрывы дисульфидной связи цистина, входящего в активный центр белка, приводят к его фотоинактивации, под которой понимают потерю ферментативной, регуляторной, гормональной, транспортной, иммунологической и других видов активностей белковых макромолекул.
Относительно редко при действии определенных доз УФ-света наблюдается фотоактивация некоторых белков (например, супероксиддисмутазы, гемогобина, папаина и др.).
Выявлено, что существенное влияние на фоточувствительность белков оказывает конформация их молекул.
Процессы свободнорадикального окисления липидов могут инициироваться под действием УФ-излучения солнечного спектра, поэтому представляют значительный интерес для медицины. Более подробно окисление липидов рассмотрено в разделе 3.1. Процесс фотоокисления липидов играет важную роль в развитии УФ-эритемы. Этот вывод основан на двух фактах. Во-первых, нанесение на кожу антиоксидантов (витамина Е или ионола) уменьшает степень покраснения, вовторых, нанесение на кожу ненасыщенных липидов резко повышает эритемную чувствительность кожи.
Под действием УФ-света происходит несколько фотохимических реакций повреждения нуклеиновых кислот. Важнейшими из них являются фотодимеризация и фотогидратация пиримидиновых оснований, а также образование ковалентных сшивок с белками. Эти повреждения являются причиной летальных и мутагенных эффектов УФ-излучения.
Фотопротекторы и фотосенсибилизаторы Фотомодификаторы – это вещества, изменяющие чувствительность биообъектов к свету. Фотопротекторы понижают чувствительность биосистемы (защищают от действия света). Антиоксидантная система (АОС) организма разрушает свободные радикалы, в том числе и образующиеся под действием УФ-света, следовательно, компоненты АОС являются фотопротекторами. К ним относятся ферменты-антиоксиданты (например, супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.) и низкомолекулярные антиоксиданты (глутатион, -каротин, витамин С, витамин Е и др.). Некоторые из них используются как лекарственные препараты.
ультрафиолетовому или видимому свету, в фотобиологии называются фотосенсибилизаторами. В медицине часто используют для них термины «фототоксические» и «фотоаллергические» вещества в зависимости от того, какие процессы они индуцируют.
Фотосенсибилизаторы по механизму их действия делятся на два типа. Фотосенсибилизаторы I типа под действием света сами химически изменяются. Характерной особенностью реакций I типа является их независимость от присутствия кислорода. Например, в терапии псориаза широко используются сенсибилизаторы I типа - псоралены. При совместном действии псораленов и длинноволнового УФ-излучения псориаз излечивается. В основе терапевтического эффекта псораленов лежит реакция ковалентного фотоприсоединения псораленов к ДНК, больные клетки в результате погибают. Другим примером сенсибилизаторов I типа являются фотоаллергены. Обычно эти соединения используются как антибактериальные препараты и транквилизаторы (сульфаниламид, прометазин и др.). Однако они поглощают в УФ-области спектра и при УФ-облучении способны фотохимически присоединяться к белкам; эта реакция приводит к образованию антигена - аллергена.
Аллерген взаимодействует с макрофагами или Т-лимфоцитами, вызывая их сенсибилизацию. При повторных воздействиях Т-лимфоциты «узнают»
аллерген и возникает ответная реакция кожи. (уртикария или экзема);
часто наблюдается анафилактический шок или астма.
фотодинамическими соединениями. Характерной особенностью реакций II типа является их полная зависимость от присутствия кислорода.
Поглотив квант света, эти соединения переходят в триплетное возбужденное состояние (3А), а затем взаимодействуют с молекулярным кислородом. При этом кислород может переходить в возбужденное синглетное состояние (1О2):
в котором он примерно в 100 раз более эффективно, чем невозбужденный кислород, окисляет липиды, белки и другие биомолекулы.
В некоторых случаях сенсибилизаторы II типа образуют супероксиданионрадикал путем переноса электрона на О2:
Типичный представитель сенсибилизаторов II типа - протопорфирин.
Он накапливается в аномально высоких концентрациях в организме человека при некоторых нарушениях биосинтеза порфиринов.
Протопорфирин переходит в возбужденное состояние под действием синего света и с высокой эффективностью генерирует 1О2. Последний окисляет ненасыщенные липиды, вызывая резкое увеличение ионной проницаемости биомембран. Одновременно инактивируются многие белки, происходит полимеризация мембранного белка спектрина и др.
Если больные находятся на дневном свету, то у них развивается эритема.
После того, как было выяснено, что сенсибилизированная протопорфирином эритема возникает с участием синглетного кислорода, был предложен терапевтический метод, основанный на приеме внутрь каротина, способного инактивировать (тушить) синглетный кислород.
Раздел медицины, посвященный лечебному применению или патологическим последствиям действия оптического излучения, называют фотомедициной.
Вопросы и задания для самоподготовки 1.Что такое фотобиологический процесс? Из каких стадий он состоит? Охарактеризуйте эти стадии.
2. Какие фотохимические реакции протекают: а) в белках, б) в липидах, в) в нуклеиновых кислотах?
3. К каким последствиям приводит ПФОЛ (пероксидное фотоокисление липидов)?
4. Что собой представляет спектр фотобиологического действия?
5. Для чего в медицине применяют метод АУФОК (аутотрансфузия УФ-облученной крови)?
6. Что такое фотомодификаторы?
7. Какие вы знаете типы фотосенсибилизаторов?
8. Опишите механизм действия фотопротекторов.
фотомодификаторов.
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 476Артюхов В.Г. Биофизика : учеб. пособие / В.Г. Артюхов, Т.А.
Ковалева, В.П. Шмелев. - Воронеж, 1994. – С. 282-301.
3. Биофизика : учеб. для вузов / Ю.А. Владимиров [и др.]. – М., 1983.
– С. 41-46; 50-63.
4. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификации физико-химическими агентами : учеб. пособие. / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. - Воронеж, 1994. – С. 102-107; 126-142.
5. Рощупкин Д.И. Основы фотобиофизики : учеб. пособие. / Д.И.
Рощупкин, В.Г. Артюхов. – Воронеж : Изд-во ВГУ, 1997. – 116 с.
6. Конспект лекций.
4.5. Фоторецепция, ее молекулярные механизмы Сначала студенту необходимо повторить материал о том, как устроен зрительный рецептор, а мы сейчас рассмотрим строение и функции палочек. Зрительный пигмент палочек родопсин сосредоточен в наружных сегментах, где он встроен в зрительные диски. Диски представляют собой замкнутые бимолекулярные липидные мембраны, уложенные в стопку. Молекулы родопсина пронизывают липидный бислой мембран зрительных дисков. Хромофорная группа родопсина расположена так, что вероятность поглощения фотонов максимальна. Для нормальной фоторецепции очень важно, чтобы молекулы пигмента могли совершать быструю латеральную диффузию и находились в очень «мягком»
окружении в мембране, так как молекулы пигмента после поглощения фотона претерпевают значительные конформационные перестройки.
Низкая вязкость липидного слоя обусловлена очень высоким (до 50 %) содержанием полиненасыщенной докозагексеновой жирной кислоты.
Однако по этой же причине в липидах мембран могут легко активироваться процессы пероксидного окисления, что, по-видимому, и лежит в основе ряда заболеваний глаз.
Зрительный пигмент родопсин - сложный белок. Он состоит из гликопротеидной части - опсина и хромофорной группы - ретинальдегида, или просто ретиналя. Ретиналь под действием света способен переходить в различные цис-транс-изомеры. Только одна из этих изомерных форм, а именно 11-цис-ретиналь, структурно соответствует центру связывания ретиналя на опсине и образует с ним прочный комплекс. Другие изомеры таким соответствием не обладают, и комплекс хромофор - белок непрочен.
Молекула ретиналя содержит длинную систему сопряженных двойных связей, а так как вращение вокруг двойной связи невозможно, то молекула хромофора — плоская. Поглощение света ретиналем приводит к *-электронному переходу. В органических молекулах -орбитали (основное состояние) связывающие, а *-орбитали (электронновозбужденное состояние) - разрыхляющие (см. раздел 4.1). Поэтому после поглощения фотона двойная связь разрывается и две части молекулы ретиналя поворачиваются вокруг -связи.
При возвращении молекулы в основное состояние она опять становится плоской. При длинах волн, поглощаемых преимущественно цис-формой, в стационарных условиях будет больше молекул в трансформе, и наоборот. При наличии многих взаимопревращающихся веществ накапливаться будет то, которое обладает наименьшим поглощением в спектральной области действующего света. Фотообратимость цис-трансизомеризации имеет два важных следствия. Во-первых, под действием света не происходит полного перехода 11-цис- в полностью-трансконформацию при любых интенсивностях действующего света. Вовторых, реакции транс-цис-фотоизомеризации играют важную роль в регенерации зрительного пигмента.
Единственной фотохимической реакцией, которая приводит к появлению ощущения света, в зрительном рецепторе является фотоизомеризация 11-цис-ретиналя в полностью-транс-конформацию.
После образования транс-формы стерическое соответствие хромофора и опсина нарушается, а это приводит к целой серии конформационных перестроек в молекуле белка, которые сопровождаются изменениями в спектре поглощения зрительного пигмента. Такие перестройки родопсина были впервые исследованы Г. Уолдом, получившим Нобелевскую премию в 1966 г.
Каким образом фотопревращения родопсина приводят к электрическому ответу рецепторной клетки? Ответ на этот вопрос позволяют дать данные, полученные методами отведения потенциалов и данные по конформационным превращениям родопсина. Под действием света происходит развитие некоторого подобия потенциала нервных клеток, но с противоположным знаком. Особенностью наружных сегментов палочек сетчатки является то, что в покое (в темноте) потенциал на их цитоплазматической мембране имеет натриевую природу, тогда как потенциал покоя нервных и многих других клеток имеет калиевую природу. Асимметрия распределения ионов в палочке по сравнению с внешней средой такая же, как и других клеток,— внутри мало натрия, но много калия. В наружных сегментах палочек в состоянии покоя коэффициент проницаемости для натрия превышает значения таких коэффициентов для других ионов. Вследствие возникновения электрохимического градиента внутрь движется постоянный поток ионов натрия. Натрий накапливается в цитоплазме наружного сегмента, а затем через ножку, соединяющую его с внутренним сегментом, диффундирует во внутренний сегмент. Здесь ионы натрия попадают в целую «энергетическую фабрику» (скопление митохондрий), где, используя поставляемую митохондриями АТФ, работает фермент АТФ-аза, активно выкачивающий натрий во внешнюю среду. После того как из родопсина под действием света в зрительных дисках образуется метародопсин, проницаемость цитоплазматической мембраны для натрия снижается. И большую роль начинает играть проницаемость для калия: развивается поздний рецепторный потенциал со знаком (-) внутри клетки.
Вопросы и задания для самоподготовки 1. Опишите строение зрительной клетки.
2. Какие вы знаете зрительные пигменты фоторецепторной мембраны.
3. Что собой представляет родопсин? Какие фотохимические превращения происходят в его молекуле?
4. Механизм генерации позднего рецепторного потенциала в зрительной клетке.
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 487Биофизика : учеб. для вузов / Ю.А. Владимиров [и др.]. – М., 1983.
– С. 244-252.
3. Рощупкин Д.И. Биофизика органов : учеб. пособие / Д.И.
Рощупкин, Е.Е. Фесенко, В.Н. Новоселов. – М. : Наука, 2000. – 255 с.
4. Конспект лекций.
4.6. Понятие об индуцированном излучении. Принцип действия гелий-неонового лазера, его применение в медицине Лазер представляет собой источник монохроматического когерентного света с высокой направленностью светового луча. Слово лазер составлено из первых букв английского словосочетания, означающего усиление света в результате вынужденного излучения.
В 1954 г. русские физики Н.Г. Басов и А.М. Прохоров и независимо от них американский ученый Ч. Таунс использовали явление индуцированного испускания для создания микроволнового генератора радиоволн с длиной волны = 1,27 см. Спустя несколько лет, в 1960 г., американским физиком Т. Мейманом был создан первый действующий квантовый генератор оптического диапазона – лазер. Первый гелийнеоновый лазер был создан в 1961 г., он стал широко доступным источником когерентного света.
Лазерное излучение характеризуется такими свойствами, как 1) временная и пространственная когерентность, 2) поляризованность, 3) монохроматичность, 4) коллимированность.
В настоящее время существует множество способов и вариантов проведения лазеротерапии, которые разделяют в зависимости:
– от мощности излучения (высокоинтенсивное и низкоинтенсивное (терапевтическое));
– от точек приложения (непосредственное воздействие на органы и ткани, фотодинамическая терапия, применение облученных инфузионных жидкостей и медикаментов);
– от способа доставки лазерного излучения к тканям и органам пациентов (внутривенное лазерное облучение крови (ВЛОК), экстракорпоральное облучение крови, подведение лазерного излучения к патологическому очагу с помощью эндоскопической техники, воздействие на болевую точку или проекцию органа через кожу).
Под действим лазера в организме могут протекать: 1) фотохимические, 2) термические, 3) нелинейные процессы.
Высокоинтенсивные лазеры (с плотностью мощности облучения больше 10 Вт/см2) используются в хирургии как световые скальпели для разрезания биологических тканей. При этом в месте падения луча ткань испаряется, в прилегающих областях происходит обугливание и коагуляция, в результате коагуляции завариваются сосуды и останавливается кровотечение.
В последние годы в результате создания современных лазеров в клиническую практику внедряются новые способы применения низкоинтенсивного лазерного излучения, которое используется в медицине в двух основных направлениях: при лечении лазеротерапией широкого круга различных воспалительных заболеваний, где проявляется стимулирующий эффект низкоинтенсивного лазерного излучения (НИЛИ) и при фотодинамической терапии опухолей, где проявляется поражающий эффект НИЛИ. Для терапевтических целей в основном используют НИЛИ с длинами волн 632 нм и 830-888 нм (красной и инфракрасной области спектра электромагнитных волн), которое дают гелий-неоновые и углекислотные лазеры. Низкоинтенсивное лазерное излучение лежит в пределах плотности потока излучения от 0,1 до мВт/см2 и не вызывает видимых деструктивных изменений в тканях. При этом излучение, будучи поглощенным теми или иными биологическими структурами, оказывает на них фотохимическое действие.
Газовые лазеры представляют собой наиболее широко используемый в настоящее время тип лазеров. Типичный лазер на нейтральных атомах – это газоразрядный гелий-неоновый лазер, в котором используется смесь гелия и неона (соотношени He и Ne примерно 10:1). Активным газом, на котором возникает генерация на длине волны 632,8 нм (ярко-красный свет) в непрерывном режиме, является неон. Гелий – это буферный газ, он участвует в механизме создания инверсной населенности одного из верхних уровней неона. На рис. 4.6.1 представлена упрощенная схема уровней гелия и неона и механизм создания инверсной населенности лазерного перехода.
Рис. 4.6.1. Механизм накачки гелий-неонового лазера. Прямыми стрелками показаны спонтанные безызлучательные преходы в атомах неона. Лазерный переход осуществляется между уровнями Е4 и Е (волнистые стрелки) Накачка лазерного перехода E4 E3 в неоне осуществляется следующим образом. В высоковольтном электрическом разряде вследствие соударений с электронами значительная часть атомов гелия переходит в верхнее метастабильное состояние E2. Возбужденные атомы гелия сталкиваются с атомами неона, находящимися в основном состоянии, и передают им свою энергию. На уровне E4 неона возникает инверсная населенность по отношению к уровню E3, который сильно обедняется за счет спонтанных переходов на ниже расположенные уровни. При достаточно высоком уровне накачки в смеси гелия и неона начинается лавинообразный процесс излучения идентичных когерентных фотонов.
Если кювета со смесью газов помещена между высокоотражающими зеркалами, то возникает лазерная генерация.
В основе механизма поражающего действия НИЛИ при фотодинамической терапии опухолей лежит инициация фотосенсибилизированных свободнорадикальных реакций, возникающих в результате взаимодействия квантов лазерного излучения с молекулами фотосенсибилизатора (гематопорфирин, фталоцианин) в присутствии кислорода, что приводит к избирательному разрушению клеток опухоли.
Взаимодействие лазерной энергии с хромофором основывается на первом законе фотохимии: действующим является только тот квант, который поглощается веществом. Следовательно, для запуска всех последующих биохимических и физиологических ответов организма при лазерной терапии необходим хромофор, способный поглощать строго определенные кванты лазерной энергии.
Сторонники физических взглядов связывают биологическое действие НИЛИ с взаимодействием электромагнитных волн с электрическими полями клеток. Фотоэффект обусловливается поглощением кванта света молекулой-акцептором и переходом ее в возбужденное состояние, при этом между участками облучаемого объекта образуется разность потенциалов, а возникающая фотоэлектродвижущая сила активизирует физиологические процессы.
Авторы гипотезы биохимического механизма воздействия НИЛИ считают, что биологический эффект связан в первую очередь с акцепцией квантов света ферментами или другими веществами, имеющими в составе металлосодержащие простетические группы, поглощающие свет в видимой и инфракрасной областях спектра.
Ю.А. Владимиров высказал предположение, что терапевтический эффект НИЛИ связан в основном с тремя типами фотохимических реакций:
1) фотоокисление липидов в клеточных мембранах (сами липиды не поглощают свет в видимой области, но в клетках могут находиться фотосенсибилизаторы – гематопорфирины, запускающие цепь ПФОЛ (см.
раздел 4.4), в результате ПФОЛ повышается пассивная проницаемость мембраны, в том числе для ионов Са2+. Эти ионы играют в организме важную регуляторную роль, в частности, приводят к активации некоторых клеток и их пролиферации. Увеличение содержания ионов Са2+ в цитозоле лейкоцитов запускает Са2+-зависимые процессы, приводящие к праймингу клеток, что выражается в повышении уровня функциональной активности клетки.);
хроническом воспалении активность СОД, как правило, понижена. При облучении гелий-неоновым лазером активность фермента восстанавливается и, следовательно, снижается концентрация Есть исследования, свидетельствующие о том, что акцепторами НИЛИ, запускающими клеточный ответ, являются и другие ферментыантиоксиданты, такие как церулоплазмин, каталаза, глутатионпероксидаза, Энергия лазерного излучения первично поглощается этими ферментами, молекулы их переходят в активное состояние и усиливают систему антиоксидантной защиты.);
3) фотолиз комплексов окида азота (NO является фактором вазодилатации (расслабления сосудов), он также выделяется фагоцитами и играет важную роль в иммунной защите от микроорганизмов;
следовательно, при повышении концентрации NО улучшаются реологические и иммунные свойства крови).
Возможным механизмом действия НИЛИ может явиться реактивация ферментов дыхательной цепи (цитохром-с-оксидазы, НАДНдегидрогеназы), приводящая к восстановлению потока электронов, повышению трансмембранного потенциала, что в итоге отражается на клеточном метаболизме.
Для НИЛИ характерна резкая зависимость величины и даже знака эффекта от дозы облучения и функционального состояния биологического объекта, что значительно затрудняет применение лазеротерапии.
Установлено, что с увеличением дозы характер биоэффекта изменяется от стимулирующего до летального исхода. Позитивное, стимулирующее действие проявляется, как правило, в узком интервале доз облучения, а затем исчезает или даже сменяется угнетающим действием. Однако следует учитывать, что при одной и той же дозе, но с увеличением плотности мощности и с уменьшением экспозиции биоэффект усиливается.
Разнообразные биологические эффекты, проявляющиеся при действии НИЛИ на молекулярном, клеточном, тканевом, органном и организменном уровнях, обусловливают также широкий диапазон медицинских эффектов: противоотечный, противовоспалительный, обезболивающий, бактерицидный, бактериостатический, иммуномодулирующий и др.
Вопросы и задания для самоподготовки 1. Что собой представляет лазер?
2. Назовите основные свойства лазерного излучения.
3. Какие типы лазеров используются в медицине?
4. От каких параметров лазерного излучения зависит биологический эффект лазера?
5. Какие лазеры используют в хирургии?
6. Что такое фотодинамическая терапия?
7. На чем основан терапевтический эффект лазерного излучения?
При каких заболеваниях используют лазеротерапию?
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 466Гейниц А.В. Внутривенное лазерное облучение крови / А.В.
Гейниц, С.В. Москвин, Г.А. Азизов. – М. : Изд-во «Триада», 2006. – 144 с.
3. Конспект лекций.
Тема 5. Биофизические методы исследования 5.1. Методы изучения конформационного состояния биомолекул и надмолекулярных комплексов Для исследования структуры биополимеров в кристаллическом состоянии используют метод рентгено-структурного анализа (РСА). РСА дает прямую информацию о расположении атомов в молекулах и кристаллах. В его основе лежит взаимодействие рентгеновского излучения с электронами вещества, в результате которого возникает дифракция рентгеновских лучей с длиной волны ~ 0,1 нм. Последние рассеиваются на электронных оболочках атомов. Интерференция волн, рассеянных веществом, приводит к возникновению дифракционной картины (регистрируется рентгенограмма).
Условие дифракции (отражения) дается формулой Брэгга - Вульфа:
где - длина волны; d - расстояние между кристаллическими плоскостями; - угол между направлением падающего луча и кристаллической плоскостью.
Главная идея рентгеноструктурного анализа состоит в определении расстояний d на основании дифракционной картины, получаемой для рентгеновских лучей с известной. Подробные сведения о строении вещества можно получить только при изучении кристаллов, так как их атомы расположены периодически. Дифракционные максимумы характеризуются различными интенсивностями: их анализ позволяет установить распределение электронной плотности в кристалле.
Бурному развитию молекулярной биофизики способствовало применение рентгеноструктурного анализа для исследований пространственной структуры белков и нуклеиновых кислот (ДНК). В настоящее время рентгенография высокого разрешения осуществлена для многих белков. Расшифровка сложных рентгенограмм белков и нуклеиновых кислот - трудная и длительная работа, которую проводят с использованием компьютера.
Для исследования структуры биополимеров в кристалле используют также метод нейтронографии. Принцип этого метода аналогичен РСА, но вместо рентгеновских лучей используют поток нейронов.
Электронный парамагнитный резонанс (ЭПР) - резонансное поглощение энергии электромагнитных колебаний в сантиметровом или миллиметровом диапазоне длин волн веществами, содержащими парамагнитные частицы (молекулы, атомы, ионы, свободные радикалы, слабо связанные с атомом электроны). Явление ЭПР было открыто Е.К.
Завойским в 1944 г. На основе этого явления был разработан один из методов радиоспектроскопии - метод ЭПР. Сущность этого метода подробно изложена в учебнике «Медицинская и биологическая физика»
(А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко), поэтому в данном пособии мы не будем на этом останавливаться.
Выделяют следующие основные направления применения ЭПРспектроскопии в исследованиях биологически важных структур и процессов.
1. Изучение механизмов появления свободных радикалов различной природы в ходе биохимических процессов; исследование процессов транспорта электронов в митохондриях, механизмов окисления и восстановления хинонов, флавинов, порфиринов, хлорофиллов, гемопротеидов и др.
2. Радиобиологические исследования: идентифицированы свободные радикалы, возникающие в биосистемах под влиянием ионизирующего излучения в условиях различного микроокружения.
3. Фотобиология и фотосинтез. Фотохимические процессы в биосистемах сопровождаются образованием свободных радикалов в качестве промежуточных продуктов. Свободные радикалы появляются и при реализации первичных актов фотосинтеза.
4. Для изучения структуры биологических молекул был предложен метод спин-меток, сущность которого стоит в том, что с молекулой исследуемого объекта ковалентно связывают парамагнитное соединение с хорошо известной структурой. По спектрам ЭПР находят положение такой спин-метки в молекуле. Вводя «метки» в различные части молекул, можно установить расположение различных групп атомов, их взаимодействия, изучить молекулярное движение в веществе (системе).
5. Используются также и спиновые зонды - парамагнитные частицы, которые нековалентно связаны с молекулами. Изменение ЭПР-спектра спиновых зондов дает информацию о состоянии окружающих его молекул.
По форме спектра ЭПР можно определить микровязкость — вязкость ближайшего окружения спинового зонда. Так, в частности, определяют микровязкость липидного слоя мембран, его изменение при разватии ряда патологий, влияние лекарственных препаратов на ПОЛ мембран (см.
разделы 3.1 и 4.4).
6.С санитарно-гигиенической целью метод ЭПР используют для определения концентрации радикалов в воздушной среде.
Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) - резонансное поглощение электромагнитной энергии веществом, обусловленное переориентацией системы магнитных моментов атомных ядер в постоянном магнитном поле. ЯМР был открыт и объяснен Ф. Блохом и Э. Перселлом в 1946 г.
ЯМР, как и ЭПР, - один из методов радиоспектроскопии, так как частота электромагнитных волн, вызывающих переходы между энергетическими состояниями при резонансе, соответствует радиодиапазону.
ЯМР высокого разрешения представляет собой стандартный метод изучения строения органических молекул, используемый также для исследования механизма и кинетики химических и биохимических реакций.
Спектроскопия ЯМР находит все более широкое применение в биофизике и в медицине. Так, методы ЯМР были эффективно использованы при анализе конформационных свойств биополимеров, взаимодействий белков с фармакологическими веществами, взаимодействий белок - лиганд (гемопротеиды), антиген - антитело. Очень часто методы ЯМР используют для определения природы химических групп, участвующих в образовании специфических комплексов (сывороточный альбумин - пенициллин, сывороточный альбумин стрептомицин), а также природы вновь образующихся связей.
Исследование методом ЯМР осуществляется без разрушения образца и поэтому его можно проводить на живых объектах. Такой метод называют ЯМР-интроскопией или магнито-резонансной томографией (МРТ). Он позволяет различать кости, сосуды, нормальные ткани и ткани со злокачественной патологией. ЯМР-интроскопия, например, отличает изображение серого вещества мозга от белого, опухолевых клеток от здоровых. Это эффективный метод диагностики заболеваний, которые связаны с изменением состояний органов и тканей.
В оптической молекулярной спектроскопии соответствующие методы можно классифицировать по характеру взаимодействия молекул вещества с излучением конкретного диапазона; при этом важно помнить, что ответственными за возникновение аналитических сигналов являются процессы, указанные в последней колонке табл. 4.1.1. В соответствии с этим классификационным принципом можно выделить разделы оптической молекулярной спектроскопии, каждый из которых связан с определенным спектральным диапазоном.
Так, энергия квантов инфракрасного излучения достаточна лишь для изменения вращательного и колебательного состояний молекул, что используют в методах микроволновой и инфракрасной (ИК) спектрометрии.
ИК-спектрометрия широко используется для изучения структуры различных соединений (как неорганических, так и биомакромолекул), что обусловлено четкой взаимосвязью между химическим строением и составом исследуемого соединения и характеристическим для него поглощением излучения. Методы инфракрасной спектроскопии позволяют проводить качественный и количественный анализ смесей различных веществ (лекарственных препаратов, полупроводниковых материалов, биологических соединений). С помощью быстродействующих спектрофотометров регистрируют ИК-спектры поглощения за доли секунды, что необходимо при изучении быстропротекающих химических и биохимических реакций.
Энергия квантов видимой и ультрафиолетовой (УФ) областей спектра существенно больше, чем для ИК-излучения (см. табл. 4.1.1).
Поэтому при взаимодействии излучения этих диапазонов с веществом оказываются возможными и электронные переходы, определяющие особенности и возможности соответствующих оптических методов.
Характер взаимодействия излучения с веществом в видимой и ультрафиолетовой областях спектра может быть различным — это либо поглощение, либо, реже, частичное испускание поглощенного ранее возбуждающего излучения. Методы, основанные на изучении явления поглощения света видимой и УФ-областей электронной поглощающей системой вещества, составляют основу абсорбционного фотометрического анализа.
Видимая и УФ-спектрометрия исследует электронные спектры поглощения (то есть спектры, обусловленные электронными переходами на более высокий уровень, идущие с поглощением энергии кванта видимого или УФ-света). Поглощение излучения, отвечающего этому диапазону, можно связать с определенными электронными переходами, обусловленными строением молекулы исследуемого вещества. Это позволяет по спектрам поглощения в видимой и УФ-области получать качественную информацию о наличии определенных групп атомов в молекулах данного вещества, о его структурном состоянии. Эти методы применяют также для определения концентраций поглощающего вещества в растворе.
Техника измерения поглощения излучения видимого и УФдиапазонов заключается в измерении интенсивности лучистого потока, прошедшего через пробу. В этом – сущность фотометрии как приема измерений. Любые изменения в пробе, вызывающие уменьшение интенсивности прошедшего лучистого потока, закономерно приводят к возникновению соответствующего сигнала. Ослабление интенсивности излучения при прохождении его через пробу может быть связано не только с поглощением фотонов, но и с экранированием хромофоров или с рассеиванием света какой-либо дисперсной системой.
Лазерная спектроскопия - раздел оптической спектроскопии, методы которой основаны на использовании лазерного излучения. Применение лазерного излучения позволяет стимулировать квантовые переходы между определенными уровнями энергии атомов и молекул. Благодаря высокой монохроматичности излучения лазеров с перестраиваемой частотой удается измерять истинную форму спектральных линий вещества, не искаженную аппаратной функцией спектрального прибора. Из-за высокой монохроматичности и когерентности излучение лазера переводит значительное число частиц из основного состояния в возбужденное, что повышает чувствительность метода. Успешно разрабатываются методы регистрации отдельных атомов и молекул. Лазерная спектроскопия дает возможность изучать быстропротекающие (~ 10-6 – 10-12с) процессы возбуждения в веществе. Лазерная спектроскопия широко внедряется в биологию, химию и медицину, особенно для исследования короткоживущих продуктов химических и биологических реакций.
Измерение интенсивности потока, рассеянного дисперсной системой, также можно связать с концентрацией определяемого вещества и реализовать метод фотонефелометрии.
В некоторых случаях молекулы при поглощении квантов энергии могут испускать излучение в более длинноволновой области спектра.
Использование такого рода электронных спектров испускания (фотолюминесценции) для химико-аналитических целей составляет основу другого метода - флуориметрии.
К методам оптической молекулярной спектрометрии относятся также метод рефрактометрии (основан на использовании явления преломления света веществом) и поляриметрии (использует способность оптически активных соединений вращать плоскость поляризации света).
Вопросы и задания для самоподготовки 1. Какие методы используют для изучения структуры белков в кристаллическом состоянии?
2. В чем сущность методов ренгеноструктурного анализа и нейтронографии? В чем достоинства и недостатки этих методов?
3. С помощью каких методов можно исследовать структуру белка в растворе?
4. Какие вы знаете спектральные методы исследования? Кратко охарактеризуйте их.
5. Что собой представляет ЭПР (электронный парамагнитный резонанс)? В чем состоит принцип метода ЭПР?
6. Опишите сущность метода ЯМР (ядерного магнитного резонанса)?
7. Что собой представляют спектры ЭПР и ЯМР?
8. Какую информацию можно получить с помощью методов радиоспектроскопии (ЭПР и ЯМР)? Приведите примеры их применения в фармации.
8. Опишите сущность методов определения дисперсии оптического вращения, кругового дихроизма.
Применение оптических методов (спектрофотометрия, рефрактометрия, люминесцентные методы, метод флуоресцентных зондов) для изучения действия лекарственных веществ, контроля качества лекарств.
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 357Артюхов В.Г. Биофизика : учеб. пособие / В.Г. Артюхов, Т.А.
Ковалева, В.П. Шмелев. - Воронеж, 1994. – С. 264-281.
3. Биофизика : учеб. для вузов / Ю.А. Владимиров [и др.]. – М., 1983.
– С. 46-50.
4. Артюхов В.Г. Биологические мембраны: структурная организация, функции, модификации физико-химическими агентами: учеб. пособие. / В.Г. Артюхов, М.А. Наквасина. – Воронеж, 1994. – С. 202-217.
5. Биофизика : практикум для студентов / В.Г. Артюхов, О.В.
Башарина. – Воронеж, 2003. – С. 7-11; 17-22; 23-25.
6. Конспект лекций.
Тема 6. Биофизика сложных систем.
6.1. Термодинамика биологических процессов. I и II начала термодинамики Прежде чем рассматривать основы термодинамики биологических процессов, необходимо вспомнить термины, нужные для изучения данного раздела.
Термодинамическая система - часть пространства с материальным содержимым, ограниченная поверхностью раздела (стенка сосуда, где идет реакция, или мембрана клетки). Примеры: клетка, митохондрия.
Термодинамика рассматривает три типа систем, отличающихся по характеру взаимодействия с внешней средой.
Изолированные системы не обмениваются с окружающей средой ни веществом, ни энергией, т.е. границы такой системы непроницаемы.
(например, сосуд Дьюара - колба с двойными посеребренными стенками, из пространства между которыми выкачан воздух. Теплопроводность сосуда Дьюара минимальна, и стенки его непроницаемы для химических веществ.). К закрытым системам относятся системы, обменивающиеся через свои границы энергией с окружающей средой, но непроницаемые для веществ. Реальные системы в природе никогда не бывают абсолютно изолированными и закрытыми. В открытых системах осуществляется обмен как веществом, так и энергией с окружающей средой.
Термодинамические системы характеризуются определенными свойствами или термодинамическими параметрами (температура, давление, объем, энергия). Параметры, которые не зависят от массы (температура, давление), называются интенсивными. Они используются в качестве независимых термодинамических переменных при моделировании и могут иметь определенное значение в каждой точке системы. Параметры, зависящие от общего количества вещества в системе и изменяющиеся пропорционально массе отдельных компонентов системы, называются экстенсивными (объем, число молей в системе).
Состояние системы - совокупность физико-химических параметров, которыми она обладает в данный момент времени.
Совокупность изменяющихся состояний в системе называется термодинамическим процессом. Процессы, протекающие в системе, могут быть обратимыми (равновесными) и необратимыми (неравновесными).
Обратимыми называются такие термодинамические процессы, при которых возвращение системы в первоначальное состояние не требует затрат энергии извне и связанных с этим изменений в окружающей среде.
При обратимых процессах не происходит рассеивания энергии в виде теплоты. Необратимыми называются термодинамические процессы, при которых возвращение системы в исходное состояние возможно лишь при условии затрат внешней энергии, что влечет за собой определенные изменения в окружающей среде. Необратимые процессы характеризуются переходом части энергии в теплоту. Ни один из осуществляющихся в природе естественных процессов или процессов, связанных с деятельностью человека, не является в строго термодинамическом смысле обратимым. Можно лишь приблизить его к условиям протекания обратимого процесса (например, обратимая химическая реакция). При этом сводятся к минимуму потери энергии, и процесс осуществляется вблизи состояния равновесия. Термодинамика биологических процессов изучает именно необратимые (неравновесные) процессы.
Внутренняя энергия системы – это энергия, зависящая от термодинамического состояния системы и состоящая из следующих частей: кинетической энергии, обусловленной тепловым хаотическим движением частиц, образующих систему (атомов и др.); потенциальной энергии частиц, обусловленной силами их межмолекулярного взаимодействия, энергией электронов и внутриядерной энергией.
Внутренняя энергия (U) является экстенсивным свойством системы, то есть зависит от количества вещества. Нельзя вычислить абсолютное значение внутренней энергии для данной системы, так как она включает большое число трудно поддающихся учету слагаемых, некоторые из них при современном состоянии науки пока еще трудно оценить количественно. Поэтому в термодинамике вычисляют разность между запасом внутренней энергии системы для начального и конечного ее состояния (U).
Живые организмы - открытые термодинамические системы, существующие в условиях постоянства давления и температуры. Поэтому для оценки их жизнедеятельности важен еще один термодинамический параметр (функция) - энтальпия. Энтальпия - (от греч. - нагреваю) - это сумма внутренней энергии системы (U) и произведения объема (V) и давления (Р):
где Н – теплосодержание (энтальпия) системы.
Абсолютное значение энтальпии для рассматриваемой системы определить невозможно, и в термодинамических расчетах фигурирует лишь изменение энтальпии Н, происходящее при переходе системы из одного состояния в другое. Для эндотермических процессов изменение энтальпии имеет положительный знак, для экзотермических отрицательный.
Первый закон термодинамики Это закон сохранения энергии, сформулированный в 1842-1847 г.г.
Ю.Р. Майером и Г.А. Гельмгольцем: в изолированной термодинамической системе полный запас энергии есть величина постоянная и возможны только превращения одного вида энергии в другой в эквивалентных соотношениях:
Формулировка первого начала (закона) термодинамики для закрытых систем следующая: теплота, подведенная к закрытой системе, расходуется на изменение внутренней энергии системы и на совершение работы против внешних сил:
где Q - теплота, подведенная к системе; U - внутренняя энергия системы; А – работа; обозначает, что теплота и работа не являются функциями состояния системы и не могут быть полными дифференциалами.
В настоящее время применение закона сохранения энергии к биологическим объектам не вызывает сомнения.
Закон Гесса - основное следствие первого начала термодинамики. Он формулируется следующим образом: тепловой эффект химической реакции, развивающейся через ряд промежуточных стадий, не зависит от пути перехода, а определяется лишь разностью энтальпий конечных и исходных продуктов реакции.
Математическое выражение закона Гесса:
где iHi,k - сумма энтальпий всех продуктов реакции; јHј,u - сумма энтальпий всех исходных веществ; Н - изменение энтальпии химической реакции.
Изменение энтальпии соответствует величине поглощенной или выделенной теплоты, которую можно определить с помощью калориметра.
Второе начало термодинамики позволяет судить о направлении протекания процесса и, таким образом, дополняет первое начало термодинамики. Формулировку второго начала термодинамики впервые дали независимо друг от друга Р. Клаузиус и У. Томпсон (1850-1851).
Второе начало не имеет столь простой и общепринятой формулировки, как первое, и формулируется по-разному, в зависимости от той группы явлений, к которой оно прилагается. С. Карно: Коэффициент полезного действия всех обратимых тепловых машин одинаков и не зависит от рода работающего тела, а только от интервала предельных температур, в котором работает машина. Р. Клаузиус: Теплота не может переходить сама собой от более холодного тела к более теплому.
Важной физической величиной, используя которую можно сформулировать второе начало термодинамики в более общем виде, является еще один термодинамический параметр систем – энтропия.
Энтропия - это мера неупорядоченности или вероятности состояния системы. Энтропия измеряется в тех же единицах, что и теплоемкость, Дж/мольК. Энтропия является таким же свойством термодинамической системы, как температура, давление и др. В любом теле содержится определенная энтропия; как и внутренняя энергия, энтропия системы растет с ее массой и равна сумме энтропии подсистем, она увеличивается при повышении температуры за счет усиления теплового движения молекул. Если атомы в молекуле упорядочены, то энтропия системы низка.
Увеличение энтропии наблюдается при переходе вещества из твердого состояния в жидкое. Для вычисления изменения энтропии (dS) биохимической реакции поступают так же, как при вычислении изменения энтальпии, т.е. из суммы изменения энтропии продуктов реакции вычитают сумму изменения энтропии исходных веществ.
Изменение энтропии dS системы равно отношению количества теплоты (Q), сообщенного системе, к температуре (Т):
Если ввести понятие энтропии, то второе начало термодинамики можно сформулировать так: энтропия изолированной системы возрастает в необратимом процессе и остается неизменной в обратимых термодинамических процессах:
Сущность второго начала термодинамики для изолированных систем состоит в том, что все необратимые процессы протекают в направлении увеличения энтропии системы, т.е. dS > 0, dF dU. (F - свободная энергия системы). Это означает, что не вся внутренняя энергия системы переходит в работу, часть ее рассеивается в виде теплоты. При обратимых процессах dS = 0 и dF = dU, т.е. рассеивания энергии в пространстве не происходит.
Энтропия - это часть общей энергии клетки, которая не может быть использована в данной системе. С увеличением энтропии энергия, вовлеченная в обмен, уменьшается, и процесс становится менее обратимым. Согласно второму началу термодинамики, энтропия изолированной системы стремится к максимуму, при котором достигается равновесие и реакция прекращается. Формулировка второго закона термодинамики для живых организмов: скорость изменения энтропии в организме равна алгебраической сумме производства энтропии внутри организма и скорости поступления энтропии из среды в организм.
Уравнение второго начала термодинамики для открытых систем следующее:
где dS/dt - скорость изменения энтропии в организме; diS/dt – скорость производства энтропии внутри организма; deS/dt - скорость обмена энтропией между организмом и окружающей средой.
В отличие от первого закона термодинамики, имеющего абсолютное значение, второй закон носит статистический характер. Увеличение энтропии в необратимых процессах отражает лишь наиболее вероятное их макроскопических систем с большим количеством компонентов.
Вопросы и задания для самоподготовки 1. Применение законов термодинамики в биологии и медицине.
2. Что собой представляет термодинамичесая система? Какие типы термодинамических систем вы знаете?
3. Какие параметры характеризуют термодинамическую систему?
4. Что собой представляет термодинамический процесс?
Охарактеризуйте обратимый и необратимый процессы.
5. Сформулируйте I начало термодинамики: а) для изолированной системы; б) для закрытой системы. Напишите необходимые уравнения.
6. Что такое энтальпия?
7. Сформулируйте закон Гесса - следствие первого закона термодинамики. Напишите уравнение этого закона.
термодинамике биологических процессов.
9. Что собой представляет первичная (основная) и вторичная (активная) теплота?
10. В чем физическая сущность понятия энтропии? Назовите единицы измерения энтропии.
11. Как связана энтропия с термодинамической вероятностью системы? Напишите уравнение.
изолированных и открытых систем. Запишите математические уравнения, определяющие его смысл.
13. Какие виды энергии характеризуются наименьшим значением энтропии?
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 163Артюхов В.Г. Биофизика : учеб. пособие / В.Г. Артюхов, Т.А.
Ковалева, В.П. Шмелев. - Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. – С. 56-67.
3. Конспект лекций.
6.2. Организм как открытая термодинамическая система.
Стационарное состояние биологических систем. Уравнение Пригожина для открытой системы Общая теория роста и развития организмов на основе представлений термодинамики была выдвинута И. Пригожиным в 1947 году. По данной теории в процессе роста и развития организмов происходит уменьшение скорости продуцирования энтропии, отнесенной к единице массы объекта.
О скорости продуцирования энтропии можно судить по теплопродукции, которая сопровождает необратимые процессы в системе и отражает уровень процессов дыхания или анаэробного гликолиза и поэтому может быть оценена по характеру поглощения О2 или образованию гликолитических продуктов.
Измерения на различных объектах скорости теплопродукции d/dt, отнесенной к единице массы, показали, что этот параметр уменьшается, начиная с первых стадий развития организмов. Измерение удельной интенсивности дыхания имеет такую же тенденцию в те же периоды эмбрионального развития. Сходную картину можно получить и для целых организмов, и на изолированных органах и тканях. В процессе регенерации конечностей у амфибий, заживления ран у млекопитающих происходит уменьшение скорости теплопродукции или уменьшение dS/dt.
Таким образом, согласно теории И. Пригожина, в процессе развития и роста организмов скорость продуцирования энтропии непрерывно снижается и достигает минимальных значений в конечном стационарном состоянии. Благодаря более интенсивным процессам обмена веществ отток энтропии превышает ее продукцию:
Жизнь - это постоянная борьба против тенденции к возрастанию энтропии. Усложнение структуры клеток в процессе эволюции (прокариоты, эукариоты) и организации живых существ – мощные антиэнтропийные факторы.
Термодинамическое равновесие - это состояние системы, при котором ее параметры не изменяются, и она не обменивается с окружающей средой ни веществом, ни энергией.
Стационарное состояние системы характеризуется тем, что ее параметры также не изменяются во времени, но происходит обмен веществ и энергии с окружающей средой. Особенности стационарного состояния и термодинамического равновесия показаны в табл. 6.2.1.
Различие между системами, находящимися в термодинамическом равновесии и стационарном состоянии Термодинамическое равновесие Стационарное состояние Отсутствие обмена с окружающей Непрерывный обмен с окружающей средой веществом и энергией средой веществом и энергией Энтропия системы постоянна и Энтропия системы постоянна, но не соответствует максимально равна максимально возможному в возможному в данных условиях данных условиях значению значению Полное отсутствие в системе какихНаличие постоянных по величине Не требуется затраты свободной Необходимы постоянные затраты Система нереакционноспособна и не совершает работу против внешних сил Сходство термодинамического равновесия и стационарного состояния системы заключается в том, что стационарное состояние, так же как и термодинамическое равновесие, сохраняет все основные параметры неизменными.
Энтропия системы, находящейся в стационарном состоянии, имеет некоторую постоянную величину, не равную максимальной. Поэтому наиболее характерными свойствами стационарного состояния являются стремление системы к минимуму ежесекундного прироста энтропии и определенная внутренняя стабильность и упорядоченность.
Теорема Пригожина И. Пригожин на основе изучения открытых систем сформулировал основное свойство стационарного состояния (1946): в стационарном состоянии при фиксированных внешних параметрах скорость продукции энтропии в открытой системе, обусловленная протеканием необратимых процессов, постоянна во времени и минимальна по величине:
Таким образом, согласно теореме Пригожина стационарное состояние характеризуется минимальным рассеянием энергии. Условия стационарного процесса оказываются эквивалентными условиям минимума прироста энтропии. Это утверждение справедливо только для тех открытых систем, в которых выполняются линейные соотношения между величинами скоростей и движущих сил процессов. Кроме того, открытые системы должны находиться в частично-равновесном состоянии, при котором процессы их обмена с окружающей средой протекают равновесным образом.
Вопросы и задания для самоподготовки 1. Что собой представляет термодинамическое равновесие?
2. Сравните термодинамическое равновесие и стационарное состояние системы.
3. Как изменяется баланс энтропии при росте и старении организмов (теория Пригожина и Виам)?
4. Когда энтропия достигает своего максимального значения? Ответ поясните.
5. Охарактеризуйте устойчивое и неустойчивое стационарное состояние.
6. Как может происходить переход из одного стационарного состояния в другое? Приведите примеры.
7. Сформулируйте теорему Пригожина.
8. Как изменяется энтропия при развитии заболевания?
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 176Артюхов В.Г. Биофизика : учеб. пособие / В.Г. Артюхов, Т.А.
Ковалева, В.П. Шмелев. - Воронеж, 1994. – С. 67-79.
3. Конспект лекций.
6.3. Этапы моделирования, типы моделей. Новейшие достижения биофизики, их применение в фармации Моделирование - один из основных методов биофизики. Он используется на всех уровнях изучения живых систем, начиная от молекулярной биофизики, биофизики мембран, биофизики клетки и органов и заканчивая биофизикой сложных систем.
При изучении сложных систем исследуемый объект может быть заменен другим, более простым, но сохраняющим основные, наиболее существенные для данного исследования свойства. Такой более простой объект исследования называется моделью. Модель — это всегда некое упрощение объекта исследования и в смысле его структуры, и по сложности внутренних и внешних связей, но обязательно отражающее те основные свойства, которые интересуют исследователя. Практически в каждой теме курса биофизики рассматриваются разнообразные модели, например, жидкостно-мозаичная модель мембраны, модель формирования потенциала действия (модель Ходжкина-Хаксли), модель скользящих нитей при описании сокращения мышцы, модель кровеносной системы (модель Франка) и др.
Моделирование — это метод, при котором производится замена изучения некоторого сложного объекта (процесса, явления) исследованием его модели. На идее моделирования по существу базируется любой метод научного исследования как теоретический, так и экспериментальный.
В биофизике, биологии и медицине часто применяют физические, биологические, математические модели. Также распространено аналоговое моделирование. Основные виды моделей:
1) Физическая модель имеет физическую природу, часто ту же, что и исследуемый объект. Например, течение крови по сосудам моделируется движением жидкости по трубам (жестким или эластичным). При моделировании электрических процессов в сердце его рассматривают как электрический токовый диполь. Для изучения процессов проницаемости ионов через биологические мембраны реальная мембрана заменяется искусственной (например, липосомой). Физические устройства, временно заменяющие органы живого организма, также можно отнести к физическим моделям: искусственная почка – модель почки, кардиостимулятор - модель процессов в синусовом узле сердца, аппарат искусственного дыхания - модель легких;
2) Биологические модели представляют собой биологические объекты, удобные для экспериментальных исследований, на которых изучаются свойства, закономерности биофизических процессов в реальных сложных объектах. Например, закономерности возникновения и распространения потенциала действия в нервных волокнах были изучены только после нахождения такой удачной биологической модели, как гигантский аксон кальмара. Опыт Уссинга, доказывающий существование активного транспорта, был проведен на биологической модели – коже лягушки, которая моделировала свойство биологической мембраны осуществлять активный транспорт;
3) Математические модели – описание процессов в реальном объекте с помощью математических уравнений, как правило, дифференциальных. Для реализации математических моделей в настоящее время широко используются компьютеры. С помощью ЭВМ проводят эксперименты по исследованию формирования патологии, развития эпидемий и т.д. Изменяя коэффициенты или вводя новые члены в дифференциальные уравнения, можно учитывать те или иные свойства моделируемого объекта или теоретически создавать объекты с новыми свойствами, так, например, получать лекарственные препараты более эффективного действия. С помощью ЭВМ можно решать сложные уравнения и прогнозировать поведение системы: течение заболевания, эффективность лечения, действие фармацевтического препарата.
Если процессы в модели имеют другую физическую природу, чем оригинал, но описываются таким же математическим аппаратом (как правило, одинаковыми дифференциальными уравнениями), то такая модель называется аналоговой. Например, аналоговой моделью сосудистой системы является электрическая цепь из сопротивлений, емкостей и индуктивностей.
Основные требования, которым должна отвечать модель.
1. Адекватность - соответствие модели объекту, то есть модель должна с заданной степенью точности воспроизводить закономерности изучаемых явлений.
2. Должны быть установлены границы применимости модели, то есть четко заданы условия, при которых выбранная модель адекватна изучаемому объекту. Границы применимости определяются теми допущениями, которые делаются при составлении модели. Как правило, чем больше допущений, тем уже границы применимости. Так, например, липосома является адекватной моделью биологической мембраны, если изучается проницаемость липидного бислоя мембран для различных веществ. Если же цель исследования - электрогенез в клетках, то в этом случае липосома не адекватная модель, границы ее применимости не удовлетворяют целям исследования.
Основные этапы моделирования можно свести к следующим:
1. Первичный сбор информации. Исследователь должен получить как можно больше информации о разнообразных характеристиках реального объекта: его свойствах, происходящих в нем процессах, закономерностях поведения при различных внешних условиях.
2. Постановка задачи. Формулируется цель исследования, основные его задачи, определяется, какие новые знания в результате проведенного исследования хочет получить исследователь. Этот этап часто является одним из наиболее важных и трудоемких.
3. Обоснование основных допущений. Другими словами, упрощается реальный объект, выделяются из его характеристик не существенные для целей исследования, которыми можно пренебречь.
4. Создание модели, ее исследование.
5. Проверка адекватности модели реальному объекту. Указание границ применимости модели.
В биологии и медицине важное значение имеют модели роста численности популяции и фармакокинетическая модель.
Для описания кинетики изменения концентрации введенного в организм лекарственного препарата предлагается так называемая фармакокинетическая модель. Поставим перед собой конкретную цель найти законы изменения концентрации лекарственного препарата при различных способах и параметрах его введения и выведения. В реальности ввод и вывод лекарства сопровождаются большим числом разнообразных процессов. Это процессы всасывания в кровеносное русло при внесосудистом введении, перенос лекарства из крови к органам, удаление препарата из крови почками и др.
Основные допущения: 1. Не будем рассматривать систему органов, через которые последовательно проходит лекарство. Исключим многостадийность процессов ввода, переноса, вывода лекарственного вещества. 2. Не будем учитывать молекулярные механизмы процессов (например, проницаемость вещества, химические превращения). 3. Будем рассматривать только скорость процессов ввода и вывода лекарственного вещества. На рис.6.3.1 показано, как измененяется во времени концентрация лекарства (c(t)) при различных способах его введения.
Рис. 6.3.1. Фармакокинетические модели для различных способов введения лекарственного препарата: однократное (а), непрерывное (б) и комбинированное (в) и графики соответствующих им временных зависимостей концентрации лекарственного препарата в организме. m0 – масса вводимого лекарства, Q – скорость непрерывного введения лекарства (инфузия), Р – скорость выведения лекарства Вопросы и задания для самоподготовки 1. В чем сущность метода моделирования? Какие преимущества имеет этот метод?
2. Какие типы моделей вы знаете?
3. Назовите основные этапы математического моделирования.
4. Опишите основные этапы моделирования на примере фармакокинетической модели.
5. Опишите фармакокинетические модели для различных способов введения лекарственного препарата: а)однократного; б) непрерывного; в) комбинированного. Нарисуйте графики соответствующих им временных зависимостей концентрации препарата в организме. Напишите соответствующие уравнения.
6. Приведите примеры использования достижений биофизики в фармации и медицине.
Рекомендуемая литература 1. Ремизов А.Н. Медицинская и биологическая физика : учеб. для вузов / А.Н. Ремизов, А.Г. Максина, А.Я. Потапенко. – М., 2003. – С. 150Биофизика : учеб. для вузов / В.Ф. Антонов [и др.]. – М., 1999. – С.
163-167; 175-180.
3. Биофизика : учеб. для вузов / Ю.А. Владимиров [и др.]. – М., 1983.
– С. 88-94.
4. Романовский Ю.М. Математическое моделирование в биофизике.
Введение в теоретическую биофизику / Ю.М. Романовский, Н.В.
Степанова, Д.С. Чернавский. – М. : ИКН, 2004. – 472 с.
5. Конспект лекций.
«